干细胞培养技术

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干细胞培养技术范文第1篇

【关键词】间充质干细胞；脂肪组织；细胞培养；SUI模型

【中图分类号】R691【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0125-01

压力性尿失禁(SUI)为女性的常见病和多发病，其发病率约为1 S%-6O%，多发生于老年人，因受经济、宗教、教育程度等因素的影响，其实际发生率比统计发病率更高。SVl的症状严重与否都不自接危及生命，但它给患者的日常上作、生活及社交活动造成一定程度的影响，甚至会严重影响患者的生活质量乃至家庭和睦。

1临床资料

注射疗法是将药物、化学制剂或自体组织等注入后尿道或膀肌颈内口粘膜下，使尿道腔变窄、拉长，延长功能性尿道的长度，提高尿道阻力，起到关闭尿道内口和后尿道的作用，从而达到有效控制排尿的口的。这一治疗方法对尿道内括约肌功能障碍、尿道内压降低同时尿道、膀肌无其他病变等压力性尿失禁患者有较好的效果。注射疗法主要优点在于.以在局部浸润麻醉下进行操作，大多数患者的手术均.IJ.以在门诊进行，适用于老年及不能耐一受大手术的患者。口前注射疗法的研究主要集中在选择不同的注射材料上，理想的注射材料应该在结构上完整，无毒、无免疫原性、无变应原性，近期内不会被分解，能长时间保持其支撑作用。口前使用的材料尚难达到上述要求，因此寻找一种取材方便、生物相容性好、安全无毒、疗效满意的注射材料十分必要。

方法：无菌技术下获取SD大鼠双侧腹股沟区脂肪垫，消化离心，长期培养的方法获取脂肪源性间充质干细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态变化，对培养细胞进行免疫细胞化学染色，鉴定其表面分子标志。SD大鼠24只分为3组，实验组（6只），对照组一（3只），对照组二（3只）。分别获取自体ADSCs，实验组进行荧光标记。然后实验组将荧光标记的ADSCs自体移植至尿道周围，对照组移植未并取尿道组织进行HE染色组织学分析。

2结果

原代培养显示培养的脂肪源性间充质干细胞2d左右开始壁,10d-14d左右可达90%融合,基本上为梭形成纤维样细胞形态,免疫细胞化学示 CD29阳性，CD34阴性。神经切断术后10天，除模型组和对照组一各有1只大鼠死亡外，均进行尿流动力学检测，三组手术前后ALLP分别为：对照组一为27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，对照二为29.5±4.9和27.4±72.3,模型组为24.8±3.8和14.7±3.0。模型组手术后ALLP明显降低，且组织学检查亦证明模型组大鼠尿道周围括约肌明显萎缩。

3讨论

本实验将荧光金标记的脂肪源性干细胞自体移植至大鼠的近端尿道周围，行冰冻切片，组织化学染色，荧光显微镜下观察.见荧光标记的细胞呈金黄色:后取组抗体免疫移植部位有较多的Desmin阳性的细胞，棕黄色，部分出现一定的方向性，未见明显炎症细胞浸润，说明己有细胞在局部存活并生长，提示能成为压力性尿失禁注射治疗的一种理想的注射材料，为将来进行细胞移植治疗压力性尿失禁提供了实验依据。

结论：①大鼠脂肪组织中含有丰富的多能干细胞。利用消化离心，长期培养的方法可获取大量的干细胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周围成活并生长分化。

参考文献

[1]梁月有.诊断女性压力性尿失禁的相关检查[J].新医学.2006,37（10）:687-689.

[2]王萌.尿道周围注射治疗女性压力性尿失禁的研究进展[J].国际泌尿系统杂志,2006,26（6）：798-802.

[3]姚启盛，叶章群，陈从波,等.骨胳肌肌源细胞自体移植在压力性尿失禁治疗中的价值[J].中华泌尿外科杂志，2006，26（12）:841-843.

干细胞培养技术范文第2篇

关键词：信息技术；妇幼保健院；政工干部培养

信息技术是伴随计算机和网络技术的发展而发展的，如今信息技术已经进入了发展的全盛时期，信息技术的发展对人们的生活、学习及工作方式产生了广泛而深刻的影响。在此背景之下，政工干部的培养工作也不免受到信息技术发展的影响，如何准确地把握信息技术发展水平及趋势对于政工干部培养产生的影响，科学利用信息技术的强大功能来提高政工干部培养的质量，是所有企事业单位需要思考的问题，妇幼保健院也不例外。

一、信息技术发展对妇幼保健院政工干部培养的影响

1.信息技术发展对政工干部素质提出了更高的要求

信息技术的发展使得信息化素质成为政工干部的基本素质之一，妇幼保健院的政工干部也不例外。信息化素质是指主体所拥有的各种信息品质，包括信息智慧、信息道德、信息意识、信息觉悟、信息潜能和信息心理等内容。信息化素质能让政工干部跟上时展的潮流，掌握最新的信息技术，也能让政工干部认识到信息的重要性而自觉地利用信息提高工作质量，培养政工干部终身学习意识。妇幼保健院作为医疗体系的一部分，一些医疗技术和医疗设备更新速度很快，政工干部必须具备较高的信息化素质才能捕捉到这些信息。具体来说，信息技术的发展要求妇幼保健院的政工干部全面提高自身素质，学好信息知识、掌握信息技能的同时，还要学习政工理论知识、医疗专业知识及人文社科知识等，培养政工干部的领导管理能力、沟通交流能力等。

2.信息技术发展对政工干部素质培养提供了新的条件

信息技术的发展改变了传统的信息的载体形式，拓宽了信息传播的渠道，极大地缩短了信息传播所需要的时间，使个人获得信息的成本大大降低，为政工干部的培养创造了有利的条件。首先，政工干部学习、沟通渠道更广。妇幼保健院可以在政工干部的培养课程中使用各种计算机辅助教学方式，它使课程内容更加生动有趣，能更好地激发政工干部的学习兴趣；依靠网络教学的方式还可以让政工干部充分利用网上丰富的信息资源，相互交流学习；此外政工干部还可以合理安排自己的学习时间，选择自己的学习方式，培养方式更加个性化。其次，政工干部利用信息的方式发生了改变。过去妇幼保健院的政工干部获取信息主要靠阅读各种纸质材料，现在政工干部阅读的载体扩展到网络信息，从文字扩展到图像、声音、三维等；在表达方式上实现了从直接手写到键盘输入、扫描等，包括直接复制或者删减其他文件；在计算方式上也不再需要人工计算，利用计算机准确又迅速减轻了政工干部数据统计分析的负担。

3.信息技术发展对政工干部素质培养带来的问题

首先，信息鸿沟现象比较严重。在妇幼保健院的政工部门中，政工干部的能力有高有低，在掌握和使用现代信息技术方面也存在较大差异，这给政工干部的信息培养课程增加了不小的难度。其次，网络信息量过于庞大。信息技术的发展使得，各种信息都能在网络上迅速传播，过量的信息会使人们很难找到自己所需要的信息，造成信息利用效率的下降，其中一些有害的信息更是严重影响政工干部的培养工作。

二、提高妇幼保健院政工干部培养质量的对策

1.定期完善政工干部培养方案

信息技术的发展变化是日新月异的，妇幼保健院要保证政工干部的培养紧跟时代的步伐就必须根据时代的变化对培养方案和教学计划进行全面的调整和修订，但是不能改变的是要始终强调培养信息化素质的重要性。培养方案的完善和修改可以从以下几方面入手：教学目标、教学内容、教学课程专题、教师师资、教学材料和教学组织形式等，要突出强调信息化素质的地位。

2.精心设计培养的专题体系

妇幼保健院政工干部培养的基本平台就是课程专题，怎样设计合理的课程专题也成为政工干部培养工作的难题，可以明确的是必须要依据信息技术的发展对各类政工干部知识能力素质的客观要求来建立课程专题体系，同时也要根据不同教学对象的性质、层次和类型做出调整。要根据政工干部的培养目标确定专题的类别和课时比例，各类专题都有围绕解决新时期思想政治教育工作来设计，专题设置和内容都要做到内容精干、素材新颖、实在管用，不仅要包括信息化知识和技术的课程，还要有其他方面的课题。

3.打造政工干部培养的环境条件保障体系

妇幼保健院可以从以下几个方面来支持政工部门的信息化工作。首先，配置完备的教学设施设备，包括计算机及网络、多功能教室等。其次，建设多样的信息化教学信息资源子系统，例如数字化图书馆信息资源、课程网络信息资源、教学管理信息资源等。

总之，为了让信息技术的发展更好地为妇幼保健院的政工干部培养工作服务，需要站在全局的高度将信息技术理论和方法应用到培养的全过程中，需要对政工干部培养的形式、内容、方法进行深刻变革，以提高政工干部培养的效率，全面提高政工干部信息化素质培养的质量和效益。

参考文献：

[1]周军、夏婷婷，论信息技术发展对政工干部培养影响及其对策，中国信息界，2012（05）

[2]梁晨，努力提高政工干部的信息素质，经济研究导刊，2010（08）

干细胞培养技术范文第3篇

2010年诺贝尔生物医学奖授予英国生理学家罗伯特•爱德华兹，以表彰他在“体外受精”技术领域做出的开创性贡献。

1978年，罗伯特•爱德华教授和同事一起成功地使第一例试管婴儿诞生，从此开创了生殖医学领域的新纪元。试管婴儿在20多年前也曾被世界舆论界视为洪水猛兽而大加抨击，但时至今日，这项技术已经被全世界绝大多数国家承认，堪称医学史上的一大奇迹。迄今为止，全球已有上百万试管婴儿诞生。

被誉为“试管婴儿之父”的英国剑桥大学教授罗伯特•爱德华说：“克隆单纯从技术上讲非常简单，就是把卵细胞中DNA去掉，然后将体细胞中的DNA移入其中。这在世界上任何一个试管婴儿实验室中都可以完成，困难在于如何降低克隆的危险。”

本文以此热点问题作为命题材料，对2011年高考生物试题进行单项预测。预测材料及其涉及的知识、试题如下：

1．试管婴儿

【知识链接】要做好有关“试管婴儿”的试题，除了书本上的知识外，还要掌握“试管婴儿”技术的有关知识。“试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的和卵细胞取出在试管中完全受精，并在试管中培养使其发育到囊胚期，再将胚胎移入女性子宫内使其发育成胎儿。

体外受精步骤包括：的采集与培养、卵母细胞的获取与培养、体外受精等操作技术。具体过程如下图:

哺乳动物胚胎发育的过程大体概括如下图：

例1 下列关于关试管婴儿的说法，不正确的是（）

A. 从良种母牛体内采集的卵母细胞都需要进行体外培养

B. 从良种公牛采集的需进行获能处理

C. 早期胚胎移植的意义在于提高优良母畜的繁殖率

D. 早期胚胎指的是由受精卵发育至原肠胚时期的胚

解析：本题考查了试管婴儿的相关知识。根据体外受精和胚胎发育过程图解可知，早期胚胎指的是由受精卵发育至囊胚时的胚。

答案：D

例2 据2008年1月17日《干细胞》杂志报道，某科学家使用了进行试管受精的年轻女性捐献的卵子，以及2名志愿者的皮肤成纤维细胞，成功克隆出了5个人体胚胎，进而可以开发出有研究价值的干细胞。请回答：

（1）上述过程中主要应用到的两项动物细胞工程技术为；若将某经过修饰的基因导入其中的部分胚胎干细胞，常用的方法是。

（2）在使用合成培养基进行胚胎干细胞培养时，通常需要加入等天然成分；在细胞培养时，要保证被培养的细胞处于一定的气体环境，所需要的气体主要有 。

（3）科学家欲进行胚胎分割移植，则应该选择发育良好、形态正常的或囊胚，将其移入盛有操作液的培养皿中，然后用分割针进行分割。

答案：（1）动物细胞培养、细胞核移植显微注射技术（法）

（2）血清（血清、血浆） 氧气和二氧化碳 （3）桑葚胚

2．克隆人研究

【知识链接】克隆人的基本原理是动物细胞核的全能性，包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植。其基本过程为：

细胞核移植技术中注入去核卵母细胞中的不是供体细胞核，而是整个细胞，伴随着两细胞融合，体现细胞膜的结构特点：具有一定的流动性。该技术形成重组细胞继而发育成一个新个体，体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。

例3 下图为克隆人的示意图，据图回答：

（1）图中所涉及的现代生物技术有、和

等。

（2）下列有关胚胎移植的叙述正确的有（）

A.冲卵指的是从子宫中冲出胚胎，而非冲出卵子

B.只有供、受体生理环境高度一致，移入受体的胚胎才能被接受，并继续发育

C.供体和受体要进行免疫检查，防止发生免疫排斥反应

D.不同动物其胚胎移植的时间不同，人的胚胎移植最好在四个细胞阶段进行

（3）图中两个婴儿长大后，外貌、性格和其他特征与原型男人相同，这说明 具有全能性。

（4）使用培养基进行胚胎干细胞培养时，通常要加入等天然成分，除了保证被培养细胞处于无菌、无毒及充足氧气的环境中，还需要保证细胞生活所需的；早期胚胎发育在阶段以前的细胞是全能细胞。

（5）图中从“内细胞团到胚胎干细胞”的培养过程中，必须用处理内细胞团，使之分散成单个细胞。干细胞形成组织、器官必须要进行 和 。

（6）在体外培养胚胎干细胞能否获得动物器官?

。为什么？

解析：（1）该图利用了细胞核移植、动物细胞培养、胚胎分割移植等技术。（2）冲卵一般是指是胚胎收集中的冲卵――胚胎、早期胚胎。供体和受体只有保证具有相同的生理状态，才能保证胚胎的正常发育。（3）克隆过程说明动物细胞核具有全能性。（4）动物细胞培养液的成分包括葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。（5）动物细胞培养过程常用胰蛋白酶处理组织，以使之分散成单个细胞。（6）胚胎干细胞在体外培养条件下一般只能增殖进行细胞分裂，不能发生细胞分化。

答案：（1）核移植 胚胎移植 细胞培养（另外写细胞融合、胚胎分割也对，写了三个则给满分）（2）ABD（3）动物体细胞核 （4）血清 温度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 细胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干细胞在体外培养条件下可以增殖而不发生分化

3．生物技术中的伦理问题

【知识链接】生物技术引发的伦理问题包括克隆技术引发的伦理问题、试管婴儿引发的伦理问题、基因检测引发的伦理问题。中国政府对于克隆技术的态度是禁止生殖性克隆人，不反对治疗性克隆人；对于试管婴儿的态度，中国卫生部的规定是实施体外受精、胚胎移植及衍生技术必须获得卫生部的批准证书。

例4下图所示为人类“治疗性克隆”的大致过程。请回答下列问题：

（1）图中①为 细胞，过程A是目前实现体细胞克隆的关键技术，该技术称为 。

（2）图中③能诱导分化出神经细胞、血细胞、肌肉细胞，其根本原因是 的结果。这样培育得到的组织器官进行自体移植的最大好处是 。

（3）若应用转基因技术治疗遗传性糖尿病，可将健康人的控制胰岛素合成的基因导入结构④中的

，原因是这些细胞 。

（4）在用PCR技术扩增胰岛素基因时，缓冲溶液中必须加入的物质有：、分别与两条模板链结合的两种引物、 以及四种脱氧核苷酸。DNA的合成方向总是从子链的延伸。

（5）我国政府禁止生殖性克隆，但不反对治疗性克隆研究。为什么要反对生殖性克隆（即克隆人）呢？请你写出一条理由： 。

解析：从图可以看才出，治疗性克隆是将患者的体细胞的核与卵细胞的细胞质进行重组， 形成重组细胞，将重组细胞经过培养得到囊胚，取囊胚内细胞团培养得到不同组织器官，可用于进行自体移植，不会产生免疫排斥反应。

答案：（1）次级卵母（卵） 核移植

（2）基因选择性表达不会产生排异（免疫排斥）反应

（3）内细胞团分化程度极低（或具有全能性），可使外源基因在相应组织细胞表达

干细胞培养技术范文第4篇

【摘要】 目的 探索大鼠骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况。方法 采用全骨髓培养法体外培养细胞，贴壁筛选纯化骨髓间充质干细胞并进行体外培养、扩增，应用肝细胞生长因子(HGF)诱导分化出肝干细胞，鉴定后，经肝脏中叶注射入同种异体正常组和暴发性肝衰竭组大鼠体内，于移植后的第1、2、4周取受体肝脏移植原位（注射部位)、邻位（距注射部位0.5 cm)组织，应用PCR技术检测性别决定因子基因片段，研究肝干细胞在大鼠肝脏内定居情况。结果 经肝脏注射移植的肝干细胞在正常组和肝损伤组的肝脏内均能定居，且定居的细胞数量上肝损伤组明显多于正常组。结论 经肝脏注射移植的骨髓源性肝干细胞可以定居于肝脏内，且定于肝脏的干细胞数量与肝脏是否损伤密切相关。

【关键词】 骨髓间充质干细胞；肝干细胞；细胞移植

骨髓间充质干细胞(MSCs) 具有多向分化潜能，可以在体外诱导分化出肝干细胞，此种骨髓源性肝干细胞可以为肝组织移植工程提供新的细胞来源。近年来的研究主要集中于体外诱导MSCs为肝干细胞，此种细胞具备了肝细胞的形态，在体外能够表现出一定的肝细胞功能〔1〕，但对骨髓源性肝干细胞在体内的定居和定位能力情况尚不明确。本实验通过对大鼠MSCs进行体外培养，诱导、分化出肝干细胞，同时建立暴发性大鼠肝衰竭模型，探讨骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况。

1 材料与方法

1.1 材料

低糖DMEM培养基(Invitrogen)、Percoll(Pharmacia，比重1.077 g/L)(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶2(Sigma)、肝细胞生长因子（HGF)(CYTOALAB公司)、细胞培养箱(Forma公司)；纯系SD大鼠、3周龄、体重100～120 g(供体大鼠)和成年纯系SD雌性大鼠、体重180～220 g(受体大鼠)，由吉林大学实验动物中心提供。

1.2 骨髓源性肝干细胞培养

1.2.1 MSCs分离、培养及定向肝干细胞的诱导分化

从供体SD大鼠股骨提取骨髓细胞。用比重1.073的Percoll分离液行MSCs分离，加含抗生素及10%小牛血清的IMDM培养和扩增，取第3代MSCs加入HGF(20 μg/L)诱导定向肝干细胞分化。

1.2.2 诱导后的骨髓源性肝干细胞鉴定

用ELASA法检测细胞培养液中的甲胎蛋白（AFP)、白蛋白（ALB)。用免疫组化法检测细胞中细胞角化蛋白（CK)18、CK19和波形蛋白（Vimentin)的表达。

1.3 肝损伤动物模型的制作和分组

受体雌性SD大鼠20只，随机分为正常大鼠组和肝损伤组。肝损伤组用质量浓度10%D氨基半乳糖溶液一次腹腔内注射，剂量1 200 mg/kg体重。

1.4 同种异体大鼠骨髓源性肝干细胞移植

正常组大鼠和肝损伤组大鼠，分别以戊巴比妥麻醉，仰卧位固定，常规消毒、备皮、铺无菌巾，上腹正中切口，长约1 cm，于肝中叶以BD胰岛素注射器注射肝干细胞悬液0.4 ml（107/ml )，观察无出血后缝合伤口。

1.5 受体体内移植骨髓源性肝干细胞鉴定

应用PCR技术检测性别决定因子基因片段(sex determining region of the Y，Sry)。干细胞移植后1，2，4 w后取受体肝脏移植原位(注射部位)、邻位(距注射部位0.5 cm)组织，应用PCR技术检测〔2〕性别决定因子基因片段(Sry)。引物按文献〔3〕设计，由上海Casarry生物有限公司合成序列，外引物对SRY1/ SRY2扩增片段大小为317 bp，内引物对SRY3/SRY4扩增片段大小为121 bp。

2 结 果

2.1 骨髓源性肝干细胞的培养结果 大鼠MSCs经原代培养，细胞传代，诱导分化，细胞异形性较诱导前增加，表现为圆形、椭圆形细胞数量较诱导前明显增加，而梭形细胞数量减少，诱导培养10 d左右，细胞形态表现为圆形、椭圆形细胞为主，梭形细胞已极少见。免疫组化染色，二氨基联苯胺（DAB)显色，在倒置显微镜下，可见细胞形状显圆形或卵圆形，胞浆内出现棕黄色颗粒。CK18、CK19、Vimentin呈阳性表达。细胞培养液中AFP、ALB含量诱导前分别为(0.021±0.008) ng/ml和(0.72±0.14) g/L；诱导后分别为(0.403±0.042) ng/ml，(6.1±0.32) g/L。诱导后的AFP、ALB含量明显高于诱导前（P＜0.05)。表明经诱导的MSCs分化为肝干细胞。见图1。

2.2 肝损伤模型病理结果

D氨基半乳糖注射后，大鼠肝脏肝索紊乱，肝细胞肿胀变性、灶性及大片坏死，伴出血及炎性细胞浸润。见图2。

2.3 性别决定因子基因片段检测结果

肝损伤组：检测1 w时阴性，2 w时原位肝组织Sry阳性表达，邻位未表达，而4 w时原位及邻位组织检测到Sry表达，原位表达较2 w时增强，邻位较弱。正常肝脏组：1及2 w均未检测到表达，4 w时检测到原位微弱表达。见图3。

3 讨 论

MSCs具有多向分化潜能，特别是具有向肝脏干细胞、肝细胞及血管内皮细胞分化的潜能〔4〕，因而有望成为肝组织移植工程新的种子细胞来源。由于MSCs是成体干细胞，取材方便，可以来自患者自身，无排斥反应，故具有重要的临床应用价值。本实验根据文献报道〔5〕，使用HGF，使MSCs分化为肝干细胞，对骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况进行初步研究。

目前研究表明移植肝干细胞可存活于受体许多部位包括肝、脾、腹腔、胰腺、肺、肠系膜、肾及肾脂肪囊、腹膜后等部位〔2，6～8〕。肝脏由于其独特的营养环境、生理及解剖结构环境无疑是最理想的场所，可经门静脉输入或肝实质植入，该组实验采用肝脏植入方法，取得较好效果，说明此方法是安全可行的。本实验采用同种异体移植，应该考虑免疫排斥反应，但文献报道，纯化的MSCs具有独特的免疫原性，进行同种异体移植不需要预先应用免疫抑制剂，无免疫排斥反应，是良好的基因治疗靶细胞。

目前鉴定受体体内被移植后的肝干细胞有许多方法，其中较为常用的是以雄性动物为肝干细胞供体〔1〕，雌性动物接受细胞移植后，分化增殖的细胞 Y 染色体阳性，证明雌性受体内存活的细胞来自雄性供体细胞，这就可以清楚地将植入的细胞与原有的细胞区分开来，进一步研究移植作用，本实验采用雄性供体细胞为雌性受体移植，检测移植部位细胞的Y染色体表达情况，进而检测移植细胞是否定植。

实验结果显示，移植后2 w肝衰竭大鼠移植原位检测到表达，4 w表达明显增强，而且临近部位出现表达；正常大鼠在移植后4 w移植原位出现微弱表达。实验证实，骨髓源性肝干细胞在正常大鼠肝脏及肝损伤大鼠肝脏内均能定居，但在肝损伤大鼠肝脏内定居能力明显增强。考虑可能为大鼠肝损伤后，刺激机体分泌出各种促进肝细胞再生的生长因子，为移植细胞提供定居所需的微环境。文献报道，在正常大鼠体内，HGF等因子的活性是被抑制的，只有在肝损伤时，启动肝再生程序，这些因子才能被激活，引起肝细胞有丝分裂。

本文通过实验证实了大鼠骨髓源性肝干细胞移植后可以定居于受体肝脏内，而且在肝损伤后有利于干细胞移植的定居，这为下一步研究定居于肝内的骨髓源性肝干细胞的功能奠定了基础。

参考文献

1 李秉璐，曲 强，赵玉沛，等.人骨髓基质干细胞向肝细胞分化过程中白蛋白的表达研究〔J〕.中华外科杂志，2005；43（11)：7135.

2 高英堂，马梦兰，刘 敏.人类Sry基因用于产前诊断的初步研究〔J〕.中华妇产科杂志，1997；32（11)：6524.

3 Tashiro H，Fukuda Y，Kimura A，et al.Assessment of microchimerism in rat liver transplantation by polymerase chain reaction〔J〕.Hepatology，1996；23（4):82834.

4 Schwartz RE，Reyes M，Koodie L，et al.Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocytelike cells〔J〕.J Clin Invest，2002；109（10):1291302.

5 张刚庆，方驰华，池达智.肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究〔J〕.中华外科杂志，2005；43（11)：71620.

6 Fox IJ，Chowdhury JR.Hepatocyte transplantation〔J〕.Am J Transplant，2004；6:713.

干细胞培养技术范文第5篇

[关键词]表皮干细胞；酶消化法；组织工程皮肤；分离；培养

[中图分类号]R318 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2011）01-0079-04

Improved culture method of Human epidermal stem cell and tissue engineering skin construction

ZHANG Yan-gang, HU Da-hai, ZHANG Zhan-feng,CAI Wei-xia, ZHU Hua-yu, SHE Tao

(Department of Burn and Skin Surgery, Burns Center of PLA, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 701132,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo improve the traditional methods of dissociation and culture of the human epidermal stem cells (hESCs) and provide more productive and more active seed cells for tissue engineering skin construction.MethodsCell morphology was observed by inverted microscope, MTT law growth curve. Immunocytochemistry was used to observe the expression of β1 integrin and keratin 19 (CK19) on epidermal stem cells. Compare the morphological features of tissue engineered skin constructed with the seed cells which were obtained by two methods.Results Trypan blue staining displays the number of hESCs dissociated by modified method is(92.25±15.61)significantly elevated compared with traditional method (68.50±26.91)(P＜0.01),and the proportion of living cells 94%±0.01% increased significantly compared with traditional method(75%±0.04%)(P＜0.05).The result of immunocytochemistry showed that the expression of β1 integrin and keratin 19(CK19) was positive, which were markers of hESCs. HE staining showed that, by using the improved method, the number of multiple epidermal layers was 5～6 on tissue engineering, and cells of epidermal in the basal partwere arranged. In contrast, the number of multiple epidermal layers was 3～4, and the cells of epidermal in basal part arranged in scattered by using the traditional method. ConclusionHuman epidermal stem cells in a larger amount and better vitality can be obtained by using a modified enzyme digestion method, which form basis of construction of skin tissue engineering.

Key words:human epidermal stem cells; enzyme digestion; tissue engineering skin; dissociating; culturing

近年来仿照皮肤的生理结构，人们构建各种组织工程皮肤，有望解决皮源短缺及预后瘢痕的问题，其种子细胞主要是表皮干细胞、成纤维细胞等。因此，表皮干细胞的分离、培养就成了必须面对的问题，在以往的报道中[1-4]，有关hESCs的培养常采用中性蛋白酶（Dispase）消化过夜分离表皮层、再以0.25%胰蛋白酶37℃消化10～15 min分离表皮干细胞，但实际应用中发现该方法存在细胞活力差，产率低等缺点。本研究中我们采用改良后的方法分离培养hESCs并和常规的培养方法加以比较，旨在建立一种更为高效的分离培养表皮干细胞的方法。

1材料和方法

1.1 实验材料和主要仪器：取小儿包皮组织（2～6岁），(来自西京医院泌尿外科包皮环切术，均取得患者家属知情同意)。DispaseⅡ酶（Gibco）；Trypsin（Gibco）；DMEM (Hyclone)；胎牛血清（FBS，杭州四季青）；角质形成细胞无血清培养基(K-SFM，Gibco)；表皮生长因子（epidemal growth factor, EGF）和牛垂体提取物（bovine pituitary extract, BPE）(Gibco)；人胎盘Ⅳ型胶原(Sigma)，MTT (Gibco)；DMSO (西安化学试剂厂)；多聚甲醛(西安化学试剂厂)；小鼠抗人β1整合素（鼠单抗IgG）、CK19（鼠单抗IgG） (北京中杉金桥生物技术公司）；鼠尾胶原（自制）；台盼蓝；倒置荧光显微镜（Olympus）；M680型酶标仪（伯乐公司）。

1.2人表皮干细胞分离、培养：修剪皮下结缔组织，0.9% NaCl浸泡、清洗3遍，每次5～10min，0.05%醋酸氯已定+0.9% NaCl（1:2，体积比）浸泡5～8min，再次0.9% NaCl浸泡清洗3遍，每次10min，然后将上述组织块置于4℃ Dispase酶(0.25%)浸泡14～16h。以下为两种方法分离人表皮干细胞。

传统方法：取出皮片，0.9% NaCl反复清洗，分离表皮和真皮层，剪碎表皮为1.0mm×1.0mm，加0.25% Trypsin + 0.02% EDTA，37 ℃水浴10min加入含有10% FBS的DEME终止消化。反复吹吸至细胞悬浮，200目筛网过滤，1 000rpm离心5～10min，弃上清，收集细胞，用人表皮干细胞培养基重新悬浮细胞（10ml），吹打成单细胞悬液，台盼蓝染色。并接种于预先铺有Ⅳ型胶原的25cm2培养瓶内，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育10～15 min后，吸出培养液及未贴壁细胞，PBS洗2次，加入适量新鲜培养基（K-SFM，5ng/ml hEGF，30 μg/ml BPE）继续培养。

改良方法：取出皮片，0.9%氯化钠反复清洗，分离表皮和真皮层，将表皮置于小抗生素瓶后加0.125% Trypsin+ 0.01% EDTA3ml，弯头吸管快速搅拌2min，吸出并加入离心管（已经加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，再次重复消化一次，吸出后加入另一离心管（已经加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，将前后两次消化液体合并，离心（1 000rpm，5min），PBS10ml悬浮细胞，台盼蓝染色鉴定后，再次离心（1000rpm，5min），表皮干细胞培养基（K-SFM）悬浮细胞，接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶内，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育4～5min后，吸出培养液及未贴壁细胞，PBS洗2次,加入适量新鲜表皮细胞培养基培养（K-SFM，5ng/ml hEGF, 30μg/ml BPE）。

1.3表皮干细胞增殖：将两种方法分离出的hESCs分别作MTT比色试验。两组细胞均以1×105个/孔的密度接种预先铺有Ⅳ型胶原的24孔板内，每24h取3孔做MTT比色实验。根据每天记录的细胞数绘制细胞生长曲线图。

1.4 表皮干细胞鉴定：取二代表皮干细胞培养36 h，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗；0.1%Triton X-100孵育10min；PBS清洗3次，每次5min；3%H2O2去离子水孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶活性；2%山羊血清封闭20 min,加入CK19（1:50稀释）、整合素-β1（1:50稀释）一抗4 ℃过夜；PBS洗5次，滴加生物素化二抗工作液200μl，37℃孵育10min，PBS洗5次；滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液200μl, 37℃孵育10min，PBS洗5次；显色剂显色。

1.5构建组织工程皮肤：以两种不同方法分离、培养的hESCs为种子细胞，鼠尾胶原复合成纤维细胞作为支架材料构建组织工程皮肤。4ml 5×DMEM和14ml胶原于冰上混匀，用1mol/L NaOH调至中性后，加入2mlFBS（含2×106成纤维细胞）混匀，以3ml/孔加入Transwell小室内，放入37℃，5% CO2孵箱培育，待其凝固后加入10% FBS的DMEM，继续培养，24h后将2代hESCs以3×106/孔种植于鼠尾胶原表面，气-液面培养1周。

1.6 统计学分析：采用SPSS11.0软件进行统计处理，实验数据以x±s表示，两组间均数比较行两样本t的方差分析， P＜0.05为差异有显著性意义。

2结果

2.1 改良消化法和传统消化法细胞消化效率的比较：将同一块包皮组织等份分开，用两种方法同时分离表皮细胞，台盼蓝染色、细胞计数（总体积均为10ml），实验独立重复5次。

2.2改良法和传统法分离细胞形态学比较：采用Ⅳ型胶原粘附法分选表皮干细胞，改良法较传统法粘附细胞密度大，4h后大部分细胞贴壁良好，镜下可见细胞胞体小，核质比大，呈三角形或多边形。接种后第二天培养基中存在一定数量的漂浮细胞，但改良法漂浮细胞数明显少（图2）。3天后，有部分细胞形成较小克隆，胞体紧密相靠，胞膜互相衔接，呈典型“铺路石样”生长。

2.3改良法和传统法细胞增殖比较：两组细胞在第2天细胞数量有所下降，均在第4天时进入对数生长期，改良法细胞在对数期呈明显上升趋势，于第7天到达平台期，镜下观察细胞融合；传统法细胞对数期上升缓慢，第8天时细胞仍未融合。由此表明出改良法细胞活性较好生长较快（图3）。

2.4改良法和传统法分离细胞的鉴定天对采用两种方法培养的hESCs行K19、β1整合素免疫染色，结果显示，95%以上细胞K19、β1整合素均呈阳性表达(图4)，且两种方获得的表皮干细胞生物学特性无显著差异。

2.5 改良法和传统法分离的细胞构建组织工程皮肤组织学比较：两种方法分离培养的hESCs分别构建出的组织工程皮肤均呈3层：由下到上为真皮层、表皮层、角质层。改良法细胞构建的组织工程皮肤表皮层厚，约5～6层，表皮和真皮交接处可见细胞排列整齐，形似基底细胞。传统法细胞构建的组织工程皮肤表皮层较薄，约3～4层，表皮真皮交接处未见类似基底细胞（图5）。

3 讨论

hESCs是皮肤组织的特异性干细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能。是皮肤发生、修复、重塑的关键性源泉[5]，以其作为种子细胞构建组织工程皮肤，可获得与生理皮肤相类似的组织结构。临床上大面积较深度烧伤往往导致表皮、真皮的损伤缺失，近年来，利用含有hESCs的组织工程皮肤覆盖创面取得一定的效果，而在其构建的过程中表皮干细胞的分离培养是必须面对的问题。

传统的方法中表皮层与真皮层分离后，用剪刀剪碎成1.0mm×1.0mm大小后进行胰蛋白酶消化，减碎的过程中暴露在组织边缘的细胞增多，而剪刀的挤压可对组织造成挤压损伤[6]，导致部分细胞壁损害进而细胞活力下降或死亡，在改良的方法中，直接进行胰酶消化避免了这一损伤情况的发生。在胰酶消化这一步，传统方法采用0.25%胰蛋白酶＋0.02% EDTA，37℃水浴，10min，而改良方法以0.125%＋0.01% EDTA胰蛋白酶也可以消化下来表皮干细胞，并且胰蛋白酶的含量低，减少了胰蛋白酶对细胞的损伤。当胰酶将细胞分泌的粘蛋白膜水解后，如还没有终止它的活性，此时胰酶就有可能进攻细胞内的某些蛋白质，造成它们的解离，进而诱发细胞凋亡[7]。胰酶浓度的降低也少了中和血清的用量，从而降低了血清对hESCs分化的影响[8]。对比传统方法，将37℃消化改为常温下消化，进一步降低胰酶的活性。为了进一步减少胰酶对细胞的损伤，再将传统方法的消化10min改良为2次消化，每次2min总计4min，每次消化后立即终止。以往的方法中，用来消化时，将剪碎的细胞置于胰酶中反复吹打，而吹打本身也会造成细胞损伤，且吹打容易产生泡沫加剧细胞损害，本改良方法中，只以吸管做搅动，充分均匀胰酶的消化作用又不会产生吹吸的作用，减少了细胞在反复吹打过程中的损伤。

将同一块包皮组织等份分开，用两种方法同时分离hESCs，台盼蓝染色结果表明：改良法的活细胞率明显大于传统法细胞，从形态上观察，细胞展开生长无差异。我们用两种方法培养的原代细胞绘制细胞生长曲线（图3），可以看出改良法细胞存活数量多，增殖速度快，细胞活性好，证明了改良法培养可以快速获得大量hESCs。研究表明，K19表达阳性的细胞多分布在毛囊隆突部和基底膜，且具有干细胞的慢周期性和强大的增殖特性，而终末分化的表皮细胞则表达K10。所以K19也被认为是表皮干细胞的特异性标志[9]。β1整合素不仅介导表皮干细胞与细胞外基质的黏附，也调控终末分化启动，β1整合素表达的降低会刺激表皮干细胞离开干细胞池，向上迁移成为终末分化细胞，因而认为β1整合素高表达可以是表皮干细胞的标志物之一[10-11]。我们将应用Ⅳ胶原快速贴壁的改良法细胞通过细胞免疫化学方法研究，显示改良法细胞K19、β1整合素呈阳性表达，证实了采用改良方法培养的细胞为hESCs。进一步分别采用两组细胞为种子细胞，鼠尾胶原为支架构建组织工程皮肤，组织切片HE染色显示改良组hESCs细胞构建的组织工程皮肤表皮层较厚，细胞复层多，表皮细胞复层层数为5～6层、基底细胞排列整齐，而传统组hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为3-4层、基底细胞排列散乱，表明应用改良组细胞更适宜构建组织工程皮肤（图5）。

表皮干细胞是一种在成年期还能维持较高的自我更新能力的细胞群，在正常状态下维持表皮的自我更新，当受到损伤刺激时，表皮干细胞可以参与皮肤损伤的修复[12]，本研究采用改良法分离培hESCs并与传统方法对比，显示出改良方法培养出的hESCs活力和增值能力更好，构建的组织工程皮肤具有更好的形态结构，为以表皮干细胞为种子细胞构建组织工程皮肤进一步奠定了基础。

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