免疫抑制剂
前言：想要写出一篇令人眼前一亮的文章吗？我们特意为您整理了5篇免疫抑制剂范文，相信会为您的写作带来帮助，发现更多的写作思路和灵感。
免疫抑制剂范文第1篇
目前，器官移植已达到相当成功的水平，这与免疫抑制剂，特别是环孢素A（CsA）在临床应用是分不开的。但是CsA存在着毒副作用大，治疗窗窄等问题，因此人们一直在寻找和开发新型免疫抑制剂。
FTY720（以下简称FTY），化学名2-amino-2[2-(4-octylphenyl)ethy-1]-1，3 propanediol hydrochloride，是一种新合成的免疫抑制剂。它是将冬虫夏草抽提物中具有免疫抑制作用的成份ISP-Ⅰ进行结构改造而成。该药研制成功至今虽然只有三四年的时间，但它已经显示出显著的免疫抑制效果和独特的作用。下面就该药的特点，综述相关文献。
1 显著的免疫抑制作用
1.1 在各种移植模型中的应用
至今，FTY已在各种动物同种异体移植模型中进行了试用，效果良好，其中有大鼠皮肤移植、心脏移植[1]、肝移植、小肠移植、肢体移植和犬肾移植。除了同种异体移植模型外，FTY还可延长异种移植物的存活[2]。给药方式大多是从手术当日起，口服数天至14天，剂量由0.1-10mg/kg/d不等，各种模型的实验结果显示FTY有如下特点：
①明显延长移植物存活，存活时间与药物剂量正相关，②强烈的免疫抑制效果，当达以相同的延长移植物存活时间时，FTY的剂量仅为CsA的1/20，③FYT既可预防急性排斥发生，也可逆转已经发生的排斥反应。
另外，我们最近的一项研究显示，术前3天至术后14天给予FTY（3mg/kg/d）可使大鼠同种异体心脏移植物长期存活。除此之外，FTY还可阻止自身免疫性Ⅰ型糖尿病的发生。
1.2 诱导免疫耐受
总体上，对FTY在免疫耐受诱导中的意义研究还不多。注射同种异体嵌合蛋白折同时给予短时FTY可以诱导同种异体心脏移植物的长期存活，若将长期存活受者的淋巴细胞转移给另外一个受者，则可诱导该受者对同基因供者的免疫耐受，IL-2不能逆转耐受状态[3]。在给予胸腺内注射供者脾细胞的同时给予FTY可延长供者移植物的存活[4]。我们的一项实验表明，FTY与供者脾细胞合用可诱导供者特异性免疫耐受，若与从地塞来松处理过的供鼠分离的脾细胞联合应用则更能增强免疫耐受的诱导效果[5，6]。
1.3 与其它免疫抑制的协同作用
与CsA的协同作用 亚治疗剂量的CsA（3mg/kg）与FTY联合应用可明显延长移植物存活时间（即使FTY的剂量只有0.1mg/kg）。Hoshino 报道，当FTY3mg/kg联合应用时，7只同种异体心脏移植受鼠中有6只移植物长期存活。FTY的使用不影响CsA的谷值，所以并非靠提高CsA的血药浓度来提高疗效的。我们知道，两种药物间的相互作用可由组合系数（Combination Index CI）来衡量。CI值＜1表示两者协同，CI值=1表示两者相加，CI值＞1表示两者拮抗。在大鼠心脏移植模型中，1mg/kgCsA与0.1mg/kgFTY的CI值=0.15，高度协同[7]。上述结果基本上是在啮齿类动物中的研究结果，而最近对一组灵长类动物的研究也发现FTY可以增强CsA的免疫抑制效果，延长移植的存活时间[8]。
与FK506和雷帕霉素的协同作用除了与CsA的协同作用外，已证明，FTY与雷帕霉素（Rapa）有协同作用，而且FTY/CsA/Rapa三联疗法的协同作用更强[7]。FTY与FK506能否协同作用仍存在争论，Wang等认为FTY与FK506没有协同作用，而Hoshino和Xu等则认为两者之间存在协同作用[7，9，10]。
2 独特的药 理作用
2.1 与CsA不同的药理作用
如同药理作用不同的抗生素可以产生协同作用一样，FTY与CsA有协同作用的原因之一也是因其有与CsA完全不同的药理作用。当在体外用ConA刺激大鼠脾细胞时，1000nM的FTY对IL-2的产生没有抑制作用，而这一浓度下的CsA已经可以完全IL-2的生成。当分别用同种异体抗原、ConA、IL-2刺激大鼠脾细胞，CsA可抑制前两种刺激所引起的细胞增生反应，但不能抑制 IL-2的刺激。FTY则不同，它可以抑制包括IL-2在内的所有这三种刺激引起的细胞增生。FTY减少移植物中T细胞的浸润，以及抑制移植物内CD3 mRNA和细胞毒性分穿孔蛋白、颗粒酶以及以FasLmRNA的表达[1，11，12]。而且毒性分子尤其是FasL的表达抑制与移植物存活有密切关系，提示FTY减少了移植物中的细胞毒性T细胞（CTL）。我们知道，CsA产生免疫抑制的主要药理作用是抑制编码IL-2的基因的表达，而FTY并没有对IL-2的调控作用。对于它是通过什么机制减少了外周淋巴细胞和移植物中的CTL目前仍不清楚。
2.2 诱导淋巴细胞凋亡
大鼠脾细胞与FTY共育后，出现典型的凋亡特征：表面微绒毛消失、染色质浓集、凋亡小体形成、DNA梯形条带等。人淋巴细胞体外用FTY处理后也出现相似表达，并且细胞内Bcl-2蛋白表达下调，Bax上调[13]。
MRL lpr/lpr小鼠的Fas基因缺失，而MRL野生型小鼠没有该缺陷。当它们的淋巴细胞与抗-Fas抗体共育时，只有野生型出现细胞凋亡；与FTY共育时，MRL lpr/lpr和野生型均出现与药物浓度正相关的细胞死亡，两者之间无差异。用10mg/kg FTY喂饲这两种小鼠时，它们的外周淋巴明显下降，两者无差异[13]。这一结果表明FTY诱导凋亡不依赖Fas-FasL途径。
Jurkat淋巴瘤细胞bcl-2基因过表达，对FTY存在抗性，而bcl-2表达正常的Jurkat淋巴瘤的新型瘤株（neo-type），就不存在FTY抗性。人单个核细胞经FTY处理1小时后，细胞内Bax蛋白显著上升，而2小时后Bcl-2蛋白明显下降，细胞存活率低。这提示FTY可能通过影响bcl-2/bax比值，诱导细胞凋亡。
HL-60是人淋巴母细胞瘤株，其培养液中加入1～8uM FTY，1分钟后可观测到细胞内Ca++明显上调。用过量的EGTA鳌合细胞外Ca++，对这一效应没有影响，而Thapsigargin可以抑制这一效应。已知Thapsigargin通过抑制Ca++-ATP酶抑制细胞内Ca++储存池的转运。当用磷脂酶C的抑制剂U73122处理细胞后，完全抑制了FTY引起的细胞内Ca++浓度升高，同时也抑制了细胞的凋亡[14]。这说明FTY可通过激活磷脂酶C，引起细胞内Ca++的释放，继而诱发凋亡。FTY激活磷脂酶C导致细胞内Ca++上升和调节bcl-2/bax 比值是相对独立的两个作用还是同一作用的上、下游效应还有待进一步阐明。
有趣的是，最近发现FTY对淋巴细胞的凋亡有双相调节作用，FTY可以增强超抗原引起的成熟淋巴细胞凋亡，而胸腺中的负选择（胸腺细胞凋亡）却受到FTY的抑制，表明FTY的作用可能是加速了成熟T淋巴细胞的凋亡，同时提示未成熟和成熟淋巴细胞的细胞凋亡机制是不同的[15]。
2.3 加速外周循环的成熟淋巴细胞归巢
尽管最初的研究发现FTY可诱导淋巴细胞的凋亡和体内外周血淋巴细胞的减少。但仍有一些现象难以用凋亡的诱导进行解释。如FTY诱导细胞凋亡的研究主要是体外实验，而体内实验并未发现大量的凋亡细胞。其中一个解释是凋亡细胞可能在体内很快被体内的吞噬系统吞噬。我们的一项实验表明，将FTY诱导的凋亡细胞与脾细胞共温育，发现可抑制脾脏中T细胞的活化，由于另外一个细胞凋亡诱导剂（CHX）具有同样的效果，提示细胞凋亡后被受者的吞噬系统吞噬后可能介导了FTY的免疫抑制效果[16]。另外一个难以解释的现象是FTY的有效剂量很低，0.05mg/kg即有免 疫抑制效果，5mg/kg剂量的FTY仅使血浓度达到200ng/ml(0.58umol/L)，而体外实验中诱导细胞凋亡需要1umol/L以上的浓度。由此，一些作者寻找FTY的其它作用机制。Chiba观察到[17，18]，口服小剂量FTY（0.1mg/kg）后，大鼠外周血脾脏及胸导管内淋巴细胞明显减少的同时，外周淋巴结肠系淋巴及派尔结中的淋巴细胞显著增加，将标记后的淋巴细胞静脉输入后，证实FTY可以加速外周淋巴细胞归巢至PLN、MLN和PP，并与用药剂量正相关，如用抗CD62L、CD49D和CD11a处理淋巴细胞，而后静脉输入，归巢被完全阻断，这提示FTY加速外周淋巴细胞归巢是通过归巢受体（homing releptors）介导的。
从上述的一些实验证据得出FTY似乎有两个方面的作用，其一是诱导淋巴细胞凋亡，其二是诱导淋巴细胞归巢。要假设同一个药物同时具有这两个方面的作用是困难的。目前淍无直接的实验证据证明两者之间是否存在关系。
3 药物代谢动力学
目前在这方面的研究较少。FYT可用气相色谱进行检测。由于FTY溶于水和乙醇，因而有很高的生物利用度，在狗、大鼠和灵长类动物中的生物利用度分别大于60%、80%和40%。在血液中，血细胞的分布大于血浆。在狗和大鼠，口服FTY后的血浓度达峰时间约为8～9小时，而母药的半衰期分别为12和29小时。FTY与CsA联合应用对两者的血浓度都没有影响。母药的谷值浓度与口服剂量之间有线性关系。目前尚未发现有免疫抑制作用的代谢产物。在大便和尿中都发现了FTY的代谢产物，其中尿中的代谢产物比大便中的略低，这些提示FTY主要在肝脏代谢。
4 毒副作用低
4.1 高度的细胞选择性
大鼠一次性口服10mg/kg FTY，3小时以后外周血淋巴细胞降至服药前的18.3%，3天后降至谷底6.1%。此时外周血各种淋巴细胞的降低幅度存在显著差异。与服药前相比，T细胞降至2.3%，B细胞降至19.7%，CD4+细胞降至8.4%，CD8+细胞降至20%，单核细胞不变。而多核细胞数上升了3倍，CD4+、CD8+双阳性细胞上升（这是不是因为体内大量淋巴细胞凋亡后，巨噬细胞增生，以吞噬并清除这些凋亡细胞呢？）。脾脏T细胞明显减少，胸腺、肠系膜淋巴结的细胞数及各种细胞的比例无变化。将不同组织中的淋巴细胞在含有10uMFTY的培养液中培养3小时后，细胞存活率分别为：胸腺53.2%，脾脏37.2%，外周血42.7%[19]。Chiba[2]等给大鼠连续口服FTY0.1mg/kg/d，14天后，外周血中CD3+细胞明显减少，CD45RA+B细胞不受影响。骨髓细胞和胸腺细胞也不受影响。这些结果提示，FTY选择性作用于外周淋巴细胞，特别是CD4+T细胞。
4.2 对动物的影响
大鼠大剂量FTY（10mg/kg）服用15天，没有出现腹泻、呕吐、消瘦、感染而引起死亡[20]。也没有中毒性肾损伤，但体重增长受到抑制[2]。犬肾移植受者连续服药3个月，没有明显的副作用[20]。我们最近的一项研究表明，FTY的剂量在0.3～10mg/kg的范围内无论是单独应用或是与CsA联合应用，连续服药两周后，明显降低外周血淋巴细胞和脾脏淋巴细胞，对粒细胞、血红蛋白以及胸腺和骨髓均无明显影响。服药后2周外周血淋巴细胞的数量一直维持在较低的水平，而且在停药后维持4周左右恢复到服药前的水平，表明FTY对淋巴细胞的影响是可逆的，而CsA不能增强FTY减少淋巴细胞的作用。
4.3 减少CsA用量 FTY与CsA联合应用时，CsA的剂量只需达到亚临床剂量（3mg/kg）就可达到满意的治疗效果[2]，从而避免了CsA过量所可能引起的肝、肾毒性。
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5 结语
对FTY的研究虽然时间不长，但相关的研究已显示该免疫抑制剂有较好的前景。但也有许多问题有待澄清。如特异性地诱导T细胞凋亡的机制有待进一步阐明，FTY为何仅对T细胞有作用，而对其它细胞似乎没有影响呢？是T细胞内有特殊的“受体”或酶系吗？诱导细 胞凋亡和细胞归巢之间有何关系呢？两者对免疫系统的影响如何？单用或联合应用CsA可使移植物长期存活，那么这种效果是免疫抑制还是免疫耐受呢？对这些问题的深入探讨也许会给免疫学的研究和临床带来新思路或方法。
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免疫抑制剂范文第2篇
【关键词】 姜黄素; NF-?资B; 胰岛素; 抵抗 )
Abstract: 【Objective】 To investigate inhibitory effect of curcumin and its mechanism on insulin resistance. 【Methods】 Curcumin co-operated high fat diets were tested for the effect of curcumin on obesity induced insulin resistance in rodent model. Transcription factor I and circulating cytokines were also detected after curcumin treatment. 【Results】 (1) Curcumin inhibited TNF?琢-stimulated NF-?资B activation in Fao cells. (2)The fasting plasma glucose level was not obviously decreased after the treatment of curcumin, but the level of fasting insulin decreased by about 30%. Furthermore, the level of glucose tolerance curve dropped significantly. (3) The level of TNF?琢[(34.5±3.4)pg/mL vs (31.3±1.1) pg/mL] in circulation was not obviously changed, but the level of IL-1?茁 [(33.9±3.2) pg/mL vs (15.6±1.1) pg/mL] and IL-6 [(72.1±9.8) pg/mL vs (47.2±5.3) pg/mL] was suppressed dramatically. (4) IRS-1 tyrosine phosphorylation levels stimulated by insulin obviously increased, but the phosphorylation level of insulin receptor did not change. Being parallel with tyrosine phosphorylation levels of IRS-1, the phosphorylation levels of P85 and AKT increased accordingly. Significantly improved insulin sensitivity was observed in groups with curcumin. 【Conclusion】 Curcumin inhibits NF-?资B dependent inflammatory pathway and reverses obesity-induced insulin resistance.
Key words: curcumin, NF-?资B, insulin, resistance
姜黄(Curcuma longa L.)是常用中药,临床上用于活血、行气、通经、止痛。姜黄素(curcumin)是一种黄素,从姜黄中提取得到的主要有效成分。近年来,大量研究发现它具有免疫调节、抗氧化、抗炎及抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等生理和药理作用[1-4]。在实验室资料中姜黄素是良好的免疫调节剂,并有结果提示姜黄素可以抑制宿主抗移植物反应,而且提高受体动物的存活率[5,6]。在实验研究中,炎症又与胰岛素抵抗密切相关[7,8]。炎症被证实是代谢综合征的共同土壤,联想到许多抗炎药物如阿司匹林可以逆转胰岛素抵抗,本文尝试利用姜黄素治疗肥胖合并极度胰岛素抵抗的炎症模型,并对姜黄素逆转胰岛素抵抗的机制作初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 姜黄素 购于印度亚洲公司(纯度99%)。
1.1.2 动物 Obob雄性小鼠16只,8周龄、空腹体质量(33~38 g),购自南京国家模式动物中心,用含脂肪6.4%的标准饲料饲养,实验前1周纪录小鼠的饲料摄取、空腹血糖、空腹胰岛素水平及体量等。
1.1.3 FAO细胞 购自 The American Type Culture Collection(ATCC)。
1.1.4 试剂 IR、IRS-1、AKT、P85 多克隆抗体由Steven Shoelson实验室(Joslin Diabetes Center, Harvard)提供。FBS TNF?琢、胰岛素购自Sigma, St. Louis USA, I-?资B?琢 抗体,IKK?酌抗体,购于 Santa Cruz, CA, GST-I-?资B(1-54) 底物由Boston Biologicals, Wellesley, MA合成。
1.2 方 法
1.2.1 体外细胞实验 FAO细胞使用培养液 DMEM(购自 Gibco公司),细胞置于37 ℃,5%CO2的培养箱中培养。在10 cm 培养皿用10 mL DMEM+10%FBS含有高浓度葡萄糖(25 mmol/L)的培养液中培养至80%重叠率,经5 mL 0.1%BSA孵育16 h后接受不同浓度(0~40 umol/L)的姜黄素预处理,然后接受鼠TNF?琢 10 nmol/L刺激处理,于20 min后用预冷的PBS终止,并收集细胞,用于制作蛋白匀浆,备用, I-?资B?琢的水平用免疫印迹的灰度表示。NF-?资B的活性用20 min内试验细胞和对照细胞I-?资B?琢灰度差值表示。
1.2.2 动物实验 利用食物参入法制成含2%姜黄素的颗粒饲料(Lab Diets, 5008),低温保存。动物饲养环境为中央通气,层流环境,恒温(23 ℃)、恒湿,12 h明暗光照循环,24 h随意饮食环境. 动物购入后第5天开始接受口服葡萄糖耐量试验,并留取空腹血浆作血浆胰岛素水平,和其它循环因子的检查。在验证空腹血糖和胰岛素水平后动物被随机分成两组,并接受姜黄素治疗,对照组用颗粒饲料5008作为对照。每天记录动物的摄食量,每3周测量空腹血糖并留取空腹血浆1次, 第6周空腹状态下进行第2次口服葡萄糖耐量试验,并留取空腹血浆。试验后继续接受姜黄素治疗,第7周于空腹状态下接受5 U/kg胰岛素富强注射,注射后5 min整,用断颈法迅速处死动物, 留取肝脏经液氮过渡后在-80 ℃低温冰箱保存,作胰岛素信号分析之用。血浆多种循环炎症细胞因子的检查用Linco Research 的Luminex 试剂盒并采用Luminex 200 监测结果。
1.2.3 免疫印迹 细胞或组织裂解液(30 mmol/L Hepes, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, pH 7.4。蛋白酶抑制剂由1 mmol/L PMSF, 3 ?滋mol/L aprotinin, 5 ?滋mol/L pepstatin, 10 ?滋mol/L leupeptin, 25 mmol/L Benzamidin, 2 mmol/L Na-vanadate, 5 mmol/L ?茁-glycerolphosphate, 10 mmol/L NaF, 1 mmol/L Ammonium Molybdate, 30 mmol/L tetrasodium pyrophosphate, 5 mmol/L EGTA)裂解细胞, SDS-聚丙烯酰胺凝胶(6%),蛋白加热变性后每孔加30 ?滋g, 电转移仪将蛋白转到PVDF膜。5%脱脂奶粉TBS-T缓冲液洗膜,加一抗, 4 ℃孵育过夜,TBS-T缓冲液洗膜,加过氧化物酶标记的IgG 抗体(购自Amersham USA),室温1 h,TBS-T缓冲液洗膜,加ECL 1 min,暗室显影2~3 min后冲洗胶片。凝胶成像分析系统摄像。
1.2.4 统计学分析 采用t检验。
2 结 果
2. 1 姜黄素抑制NF-?资B的量效和时效关系
Fao细胞在10 cm2 培养皿用10 mL在10% FBS+DMEM含有高浓度葡萄糖的培养液中培养至80%重叠,经5 mL 0.1% BSA孵育16 h后接受姜黄素预处理:剂量关系用梯度浓度如图1所示,时效曲线用30 μmol/L。预处理后接受鼠TNF 10 nmol/L刺激处理,于20 min后用预冷的FBS终止,并收集细胞,用于制作蛋白匀浆。用免疫印迹检测匀浆内I-?资?注?琢的水平。如图1A所示:20 μmol/L姜黄素20 min预处理能够抑制TNF刺激的I?资?注?琢的降解。从姜黄素的时效关系图1B可见,姜黄素有效剂量30 μmol/L对NF-κB的抑制作用在30~60 min时最强。
2. 2 姜黄素以逆转肥胖小鼠的胰岛素抵抗
经过6周姜黄素的治疗,小鼠的空腹血糖水平没有明显下降,但空腹胰岛素的水平下降约30%(图2),口服葡萄糖耐量曲线的水平也明显下降(图2A),曲线下面积的比较有明显差异(P< 0.01)。由空腹血糖和胰岛素水平计算的HOMA指数[用FBS(mmol/L) ×胰岛素(mmol/L)/22.5 计算]也呈明显降低(P< 0.05,图2C),提示小鼠对胰岛素抵抗的水平得到明显改善。
2. 3 姜黄素对循环细胞因子的影响
Obob 小鼠治疗6周后的空腹血浆用Linco Research Luminex 试剂盒同时检测细胞因子IL-1?茁,IL-6 和 TNF?琢的水平。如图3所示:尽管循环胰岛素的水平明显下降,但TNF?琢 [(34.5±3.4)pg/mL vs (31.3±1.1) pg/mL]水平没有明显改变,与之对应,循环中IL-1?茁[(33.9±3.2)pg/mL vs (15.6±1.1) pg/mL] 和IL-6 [(72.1±9.8)pg/mL vs (47.2±5.3) pg/mL]水平明显被抑制(P< 0.05)。
2. 4 姜黄素为胰岛素信号的增效剂
经胰岛素刺激的肝脏组织在液氮下作粉碎并以1% Triton X100 RAPA(含有全部蛋白酶抑制剂,和蛋白磷酸酶抑制剂)缓冲液在冰点匀浆。经全速4 ℃离心30 min取上清液(1 mg 蛋白质)作IRS-1和 IR联合免疫沉淀。经上样缓冲液释放的沉淀目标蛋白质经6%的SDS-PAGE 分离,转移到PVDF膜上。用4G10、P85、 AKT抗体作免疫印迹。如图4所示:胰岛素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明显升高, 而胰岛素受体的磷酸化水平没有明显改变。与IRS-1酪氨酸的磷酸化水平平行,P85的磷酸化水平也明显升高,AKT的磷酸化的水平也明显升高。
3 讨 论
胰岛素抵抗(IR)及胰岛?茁细胞功能减退是2型糖尿病发病机理的重要环节[9],目前被认为是一个慢性非特异性炎症过程,胰岛素对胰岛素敏感组织作用的缺陷(肝脏、脂肪组织、骨骼肌)会导致慢性、低水平炎症状态的恶化,任何与慢性炎症有关的过程都会削弱胰岛素的作用,作为恶性循环,胰岛素抵抗又会使炎症恶化[10]。在抗炎药物对胰岛素抵抗有逆转作用的报道之后, 我们探索新的抗炎药物对胰岛素抵抗的治疗作用, 姜黄素是继阿司匹林后又一个具有类似协同作用的活性成分[11]。在姜黄素治疗6周后,尽管治疗组和对照组的体重没有明显改善,但小鼠空腹血糖的水平明显下降,而且胰岛素的水平也明显降低,提示胰岛素的敏感性明显升高,葡萄糖耐量曲线在治疗后也明显改善,说明小鼠整体对葡萄糖的处理能力明显升高,即obob 小鼠的胰岛素抵抗的水平得到明显改善。这些都进一步说明姜黄素治疗改善肥胖诱导的胰岛素抵抗。
研究证实NF-?资B是启动和控制炎症的主要核转录因子,在非激活条件下,NF-?资B和胞浆内一种被称为NF-?资B的抑制物(I-?资B)的蛋白质结合处于无功能状态。我们利用胰岛素敏感组织来源的细胞系FAO,验证了姜黄素能够抑制TNF?琢刺激的I?资B?琢的降解,继而抑制NF-?资B的活性, 我们推测在高度肥胖NF-?资B高度激活的肥胖小鼠obob 体内,姜黄素可能具有更加明显的改善代谢的作用。
在NF-?资B激活的模型上我们证实炎症激发的高水平循环细胞因子是系统性胰岛素抵抗的原因。采用细胞因子的中和抗体可以逆转胰岛素抵抗,在NF-?资B抑制型模型,胰岛素敏感性升高,而且循环中细胞因子的水平较低。在肥胖发生过程中,NF-?资B 活性与动物的体重呈正相关。Obob 小鼠的肝脏,脂肪以及淋巴组织中NF-?资B的活性水平升高,循环细胞因子的水平增高,这些都说明炎症介质与胰岛素抵抗的关系。经姜黄素治疗的肥胖动物循环中细胞因子IL-1, IL-6水平均明显下降,由于IL-1和IL-6是NF-?资B活性调控的重要因子,因此,我们认为姜黄素在胞浆内有多个作用靶点,通过对上述细胞因子的抑制作用,影响NF-?资B 的活性,继而达到逆转胰岛素抵抗和改善胰岛素敏感性的作用。在肝脏组织的胰岛素信号检测中,胰岛素刺激的IRS-1 酪氨酸磷酸化的水平明显升高,AKT的活性也明显增强。这些结果都进一步说明肥胖小鼠胰岛素的敏感性在治疗后得到了改善,姜黄素能提高obob小鼠胰岛素的敏感性,姜黄素作为一个免疫调节剂用于抑制免疫排斥的同时,对系统性炎症也有抑制作用,可能是通过抑制NF-?资B来改善胰岛素敏感性的。
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免疫抑制剂范文第3篇
【关键词】甲状腺相关性眼病；免疫抑制剂；药物局部注射
【中图分类号】R581.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）01-0019-02
甲状腺相关性眼病是在成人中常见的眼眶疾病之一，属于一种自身的免疫性疾病，对于此种疾病的发病机制仍然没有明确规定，对于出现此种疾病的患者，容易伴发甲状腺机能紊乱疾病，从而在一定程度上加重患者的病情。此种疾病的主要临床表现为流泪、畏光、眼肿、视力下降等，从而对患者的正常生活和工作造成了严重的影响，制约了患者生活质量的提高[1]。因此，对于此种疾病，临床医生要及时给予患者对症治疗，以促进患者病情的改善，降低患者发生病残的机率，实现其生活质量的提高。当前，随着医学技术的不断发展，临床上治疗此种疾病的方法越来越多，其中，采用免疫抑制剂静脉冲击联合药物局部注射治疗的效果尤为显著[2]。现在选取我院收治的甲状腺相关性眼病患者，对其采用此种方法治疗的情况进行回顾性分析，并将回顾结果报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料 选取在2007年5月-2012年8月间到我院诊治的76例甲状腺相关性眼病患者，其中，男性40例，年龄在23-59岁之间，平均年龄为38.1岁，女性36例，年龄在26-67岁之间，平均年龄为39.7岁，所有患者均经临床诊断为甲状腺相关性眼病，需要进行及时的对症治疗。将76例患者随机分为两组，观察组38例，对照组38例，观察组患者采用免疫抑制剂静脉冲击联合药物局部注射治疗，对照组患者采用单纯的免疫抑制剂静脉冲击治疗，跟踪观察两组患者的治疗过程，并将所得实验数据记录。
1.2 方法
1.2.1 诊断标准 患者表现出典型的甲亢症状，而且具有甲亢病史，甲状腺均出现不同程度的重大，并伴有眼部疼痛、畏光、流泪、水肿、充血等症状。对所有患者的临床症状和体征进行详细询问并记录，同时采用专业诊断仪对患者进行诊断，以确诊患者的病情[3]。
1.2.2 治疗方法 首先给予所有患者常规治疗，对于患者出现的并发症进行对症及支持治疗，以有效改善患者的各项身体指标，并促进患者的生命体征维持在稳定状态。在给予患者常规治疗后，观察组患者采用免疫抑制剂静脉冲击联合药物局部注射治疗，给予患者口服甲亢药物治疗，同时对患者采用0.5g的甲波尼龙联合250ml的生理盐水、0.2g的环磷酰胺联合500ml的生理盐水进行静脉滴注治疗，每天1次，对患者持续治疗3天，然后间隔5-7天，再重复治疗，对患者持续治疗3-5个疗程，然后再给予患者间隔性的局部注射50mg的环磷酰胺、5mg的地塞米松、50mg的环孢素A治疗，每天1次，冲击结束后再对患者采用二丙酸倍他米松肌内注射治疗，共7mg，半个月进行1次，治疗一个月后改为每月1次，持续治疗2个月[4]。对照组患者仅采用免疫抑制剂静脉冲击疗法进行治疗，标准同观察组。对所有患者进行随访，持续6个月-2年，对患者的血常规、尿常规、肾功能、肝功能、电解质等指标进行跟踪观察，以评估患者病情的改善情况。
1.3 疗效标准 显效：患者的临床症状和体征明显消失，眼痛、水肿缓解，视力有较大程度的恢复，对于正常生活和工作影响较小。有效：患者的临床症状和体征有所消失，眼痛、水肿有所缓解，视力有一定程度的恢复，对于正常生活和工作有一定的影响。无效：患者的临床症状和体征没有消失，病情呈现出不断加重的趋势，对患者的正常生活和工作造成了严重影响[5]。
1.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计学软件对所得实验数据进行t检验，对于两组患者的年龄、性别进行统计学检验，差异较小，无统计学意义（P>0.05）。对于两组患者的治疗效果进行检验，差异显著，有统计学意义（P
2 结果
通过对所有患者实行一系列的治疗，其病情均得到了较大程度的改善，观察组38例患者中，显效22例，有效12例，无效4例，治疗有效率为89.5％，对照组38例患者中，显效16例，有效11例，无效11例，治疗有效率为71.1％。对观察组和对照组患者的临床治疗结果进行分析对比可知，观察组患者的治疗效果要显著优于对照组患者的治疗效果，对于患者病情的改善和生活质量的提高有着较大的帮助作用。见表1
3 讨论
甲状腺相关性眼病是在临床上较为常见和多发的一种眼科疾病，导致患者出现眼痛、视力下降、充血、水肿等临床症状和体征，致使患者需要承受较大的痛苦，严重的还会危及到患者的生命安全，从而制约到其生活质量的提高。对此，临床医生应当及时给予患者准确诊断，并对患者实行对症治疗，以促进患者病情的改善，降低患者的死亡率，实现其生活质量的提高[6]。
在本文的研究过程中，首先给予患者基础治疗，以有效改善患者的各项身体指标，并促进患者的生命体征维持在稳定状态。在此基础上，观察组患者采用免疫抑制剂静脉冲击联合药物局部注射治疗，效果显著，其中的甲波尼龙和地塞米松能够对机体细胞功能起到良好的抑制作用，同时可以对淋巴细胞在免疫活动中的影响起到破坏作用，从而缓解炎性介质对患者的影响，以逐步的改善患者的临床症状和体征，促进患者视力的快速恢复。此种治疗方法不仅对于患者的治疗效果显著，而且对于患者的副作用较小，从而能够有效提高患者的生活质量，减轻患者及其家庭的经济负担和精神压力。对照组患者采用单纯的免疫抑制剂静脉冲击治疗，虽然对于患者病情的改善也有一定的帮助，但效果较差，难以实现患者的快速康复。因此，免疫抑制剂联合药物治疗的方法值得在临床上推广应用。
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免疫抑制剂范文第4篇
【关键词】 姜黄素； NF-?资B； 胰岛素； 抵抗 )
Abstract： 【Objective】 To investigate inhibitory effect of curcumin and its mechanism on insulin resistance. 【Methods】 Curcumin co-operated high fat diets were tested for the effect of curcumin on obesity induced insulin resistance in rodent model. Transcription factor I and circulating cytokines were also detected after curcumin treatment. 【Results】 （1） Curcumin inhibited TNF?琢-stimulated NF-?资B activation in Fao cells. （2）The fasting plasma glucose level was not obviously decreased after the treatment of curcumin， but the level of fasting insulin decreased by about 30%. Furthermore， the level of glucose tolerance curve dropped significantly. （3） The level of TNF?琢［(34.5±3.4)pg/mL vs (31.3±1.1) pg/mL] in circulation was not obviously changed， but the level of IL-1?茁 [(33.9±3.2) pg/mL vs (15.6±1.1) pg/mL] and IL-6 [(72.1±9.8) pg/mL vs (47.2±5.3) pg/mL] was suppressed dramatically. （4） IRS-1 tyrosine phosphorylation levels stimulated by insulin obviously increased， but the phosphorylation level of insulin receptor did not change. Being parallel with tyrosine phosphorylation levels of IRS-1， the phosphorylation levels of P85 and AKT increased accordingly. Significantly improved insulin sensitivity was observed in groups with curcumin. 【Conclusion】 Curcumin inhibits NF-?资B dependent inflammatory pathway and reverses obesity-induced insulin resistance.
Key words: curcumin， NF-?资B， insulin， resistance
姜黄（Curcuma longa L．）是常用中药，临床上用于活血、行气、通经、止痛。姜黄素（curcumin）是一种黄素，从姜黄中提取得到的主要有效成分。近年来，大量研究发现它具有免疫调节、抗氧化、抗炎及抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等生理和药理作用［1-4］。在实验室资料中姜黄素是良好的免疫调节剂，并有结果提示姜黄素可以抑制宿主抗移植物反应，而且提高受体动物的存活率[5，6]。在实验研究中，炎症又与胰岛素抵抗密切相关［7，8］。炎症被证实是代谢综合征的共同土壤，联想到许多抗炎药物如阿司匹林可以逆转胰岛素抵抗，本文尝试利用姜黄素治疗肥胖合并极度胰岛素抵抗的炎症模型，并对姜黄素逆转胰岛素抵抗的机制作初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 姜黄素 购于印度亚洲公司（纯度99%）。
1.1.2 动物 Obob雄性小鼠16只，8周龄、空腹体质量（33～38 g)，购自南京国家模式动物中心，用含脂肪6.4%的标准饲料饲养，实验前1周纪录小鼠的饲料摄取、空腹血糖、空腹胰岛素水平及体量等。
1.1.3 FAO细胞 购自 The American Type Culture Collection（ATCC）。
1.1.4 试剂 IR、IRS-1、AKT、P85 多克隆抗体由Steven Shoelson实验室（Joslin Diabetes Center， Harvard)提供。FBS TNF?琢、胰岛素购自Sigma， St. Louis USA， I-?资B?琢 抗体，IKK?酌抗体，购于 Santa Cruz， CA， GST-I-?资B(1-54) 底物由Boston Biologicals， Wellesley， MA合成。
1.2 方 法
1.2.1 体外细胞实验 FAO细胞使用培养液 DMEM（购自 Gibco公司），细胞置于37 ℃，5%CO2的培养箱中培养。在10 cm 培养皿用10 mL DMEM+10%FBS含有高浓度葡萄糖（25 mmol/L）的培养液中培养至80％重叠率，经5 mL 0.1％BSA孵育16 h后接受不同浓度（0～40 umol/L）的姜黄素预处理，然后接受鼠TNF?琢 10 nmol/L刺激处理，于20 min后用预冷的PBS终止，并收集细胞，用于制作蛋白匀浆，备用， I-?资B?琢的水平用免疫印迹的灰度表示。NF-?资B的活性用20 min内试验细胞和对照细胞I-?资B?琢灰度差值表示。
1.2.2 动物实验 利用食物参入法制成含2％姜黄素的颗粒饲料(Lab Diets， 5008)，低温保存。动物饲养环境为中央通气，层流环境，恒温(23 ℃)、恒湿，12 h明暗光照循环，24 h随意饮食环境. 动物购入后第5天开始接受口服葡萄糖耐量试验，并留取空腹血浆作血浆胰岛素水平，和其它循环因子的检查。在验证空腹血糖和胰岛素水平后动物被随机分成两组，并接受姜黄素治疗，对照组用颗粒饲料5008作为对照。每天记录动物的摄食量，每3周测量空腹血糖并留取空腹血浆1次， 第6周空腹状态下进行第2次口服葡萄糖耐量试验，并留取空腹血浆。试验后继续接受姜黄素治疗，第7周于空腹状态下接受5 U/kg胰岛素富强注射，注射后5 min整，用断颈法迅速处死动物， 留取肝脏经液氮过渡后在-80 ℃低温冰箱保存，作胰岛素信号分析之用。血浆多种循环炎症细胞因子的检查用Linco Research 的Luminex 试剂盒并采用Luminex 200 监测结果。
1.2.3 免疫印迹 细胞或组织裂解液（30 mmol/L Hepes， 150 mmol/L NaCl， 1% Triton X-100， pH 7.4。蛋白酶抑制剂由1 mmol/L PMSF， 3 ?滋mol/L aprotinin， 5 ?滋mol/L pepstatin， 10 ?滋mol/L leupeptin， 25 mmol/L Benzamidin， 2 mmol/L Na-vanadate， 5 mmol/L ?茁-glycerolphosphate， 10 mmol/L NaF， 1 mmol/L Ammonium Molybdate， 30 mmol/L tetrasodium pyrophosphate， 5 mmol/L EGTA）裂解细胞， SDS-聚丙烯酰胺凝胶（6%），蛋白加热变性后每孔加30 ?滋g， 电转移仪将蛋白转到PVDF膜。5%脱脂奶粉TBS-T缓冲液洗膜，加一抗， 4 ℃孵育过夜，TBS-T缓冲液洗膜，加过氧化物酶标记的IgG 抗体(购自Amersham USA)，室温1 h，TBS-T缓冲液洗膜，加ECL 1 min，暗室显影2～3 min后冲洗胶片。凝胶成像分析系统摄像。
1.2.4 统计学分析 采用t检验。
2 结 果
2. 1 姜黄素抑制NF-?资B的量效和时效关系
Fao细胞在10 cm2 培养皿用10 mL在10% FBS+DMEM含有高浓度葡萄糖的培养液中培养至80%重叠，经5 mL 0.1% BSA孵育16 h后接受姜黄素预处理：剂量关系用梯度浓度如图1所示，时效曲线用30 μmol/L。预处理后接受鼠TNF 10 nmol/L刺激处理，于20 min后用预冷的FBS终止，并收集细胞，用于制作蛋白匀浆。用免疫印迹检测匀浆内I-?资?注?琢的水平。如图1A所示：20 μmol/L姜黄素20 min预处理能够抑制TNF刺激的I?资?注?琢的降解。从姜黄素的时效关系图1B可见，姜黄素有效剂量30 μmol/L对NF-κB的抑制作用在30～60 min时最强。
2. 2 姜黄素以逆转肥胖小鼠的胰岛素抵抗
经过6周姜黄素的治疗，小鼠的空腹血糖水平没有明显下降，但空腹胰岛素的水平下降约30％（图2），口服葡萄糖耐量曲线的水平也明显下降（图2A），曲线下面积的比较有明显差异（P< 0.01）。由空腹血糖和胰岛素水平计算的HOMA指数［用FBS(mmol/L) ×胰岛素（mmol/L)/22.5 计算］也呈明显降低（P＜ 0.05，图2C），提示小鼠对胰岛素抵抗的水平得到明显改善。
2. 3 姜黄素对循环细胞因子的影响
Obob 小鼠治疗6周后的空腹血浆用Linco Research Luminex 试剂盒同时检测细胞因子IL-1?茁，IL-6 和 TNF?琢的水平。如图3所示：尽管循环胰岛素的水平明显下降，但TNF?琢 ［(34.5±3.4）pg/mL vs （31.3±1.1） pg/mL］水平没有明显改变，与之对应，循环中IL-1?茁［（33.9±3.2）pg/mL vs （15.6±1.1） pg/mL］ 和IL-6 ［(72.1±9.8)pg/mL vs （47.2±5.3） pg/mL］水平明显被抑制（P< 0.05）。
2. 4 姜黄素为胰岛素信号的增效剂
经胰岛素刺激的肝脏组织在液氮下作粉碎并以1％ Triton X100 RAPA（含有全部蛋白酶抑制剂，和蛋白磷酸酶抑制剂）缓冲液在冰点匀浆。经全速4 ℃离心30 min取上清液（1 mg 蛋白质）作IRS-1和 IR联合免疫沉淀。经上样缓冲液释放的沉淀目标蛋白质经6％的SDS-PAGE 分离，转移到PVDF膜上。用4G10、P85、 AKT抗体作免疫印迹。如图4所示：胰岛素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明显升高， 而胰岛素受体的磷酸化水平没有明显改变。与IRS-1酪氨酸的磷酸化水平平行，P85的磷酸化水平也明显升高，AKT的磷酸化的水平也明显升高。
3 讨 论
胰岛素抵抗（IR）及胰岛?茁细胞功能减退是2型糖尿病发病机理的重要环节［9］，目前被认为是一个慢性非特异性炎症过程，胰岛素对胰岛素敏感组织作用的缺陷（肝脏、脂肪组织、骨骼肌）会导致慢性、低水平炎症状态的恶化，任何与慢性炎症有关的过程都会削弱胰岛素的作用，作为恶性循环，胰岛素抵抗又会使炎症恶化[10]。在抗炎药物对胰岛素抵抗有逆转作用的报道之后， 我们探索新的抗炎药物对胰岛素抵抗的治疗作用， 姜黄素是继阿司匹林后又一个具有类似协同作用的活性成分[11]。在姜黄素治疗6周后，尽管治疗组和对照组的体重没有明显改善，但小鼠空腹血糖的水平明显下降，而且胰岛素的水平也明显降低，提示胰岛素的敏感性明显升高，葡萄糖耐量曲线在治疗后也明显改善，说明小鼠整体对葡萄糖的处理能力明显升高，即obob 小鼠的胰岛素抵抗的水平得到明显改善。这些都进一步说明姜黄素治疗改善肥胖诱导的胰岛素抵抗。
研究证实NF-?资B是启动和控制炎症的主要核转录因子，在非激活条件下，NF-?资B和胞浆内一种被称为NF-?资B的抑制物（I-?资B）的蛋白质结合处于无功能状态。我们利用胰岛素敏感组织来源的细胞系FAO，验证了姜黄素能够抑制TNF?琢刺激的I?资B?琢的降解，继而抑制NF-?资B的活性， 我们推测在高度肥胖NF-?资B高度激活的肥胖小鼠obob 体内，姜黄素可能具有更加明显的改善代谢的作用。
在NF-?资B激活的模型上我们证实炎症激发的高水平循环细胞因子是系统性胰岛素抵抗的原因。采用细胞因子的中和抗体可以逆转胰岛素抵抗，在NF-?资B抑制型模型，胰岛素敏感性升高，而且循环中细胞因子的水平较低。在肥胖发生过程中，NF-?资B 活性与动物的体重呈正相关。Obob 小鼠的肝脏，脂肪以及淋巴组织中NF-?资B的活性水平升高，循环细胞因子的水平增高，这些都说明炎症介质与胰岛素抵抗的关系。经姜黄素治疗的肥胖动物循环中细胞因子IL-1， IL-6水平均明显下降，由于IL-1和IL-6是NF-?资B活性调控的重要因子，因此，我们认为姜黄素在胞浆内有多个作用靶点，通过对上述细胞因子的抑制作用，影响NF-?资B 的活性，继而达到逆转胰岛素抵抗和改善胰岛素敏感性的作用。在肝脏组织的胰岛素信号检测中，胰岛素刺激的IRS-1 酪氨酸磷酸化的水平明显升高，AKT的活性也明显增强。这些结果都进一步说明肥胖小鼠胰岛素的敏感性在治疗后得到了改善，姜黄素能提高obob小鼠胰岛素的敏感性，姜黄素作为一个免疫调节剂用于抑制免疫排斥的同时，对系统性炎症也有抑制作用，可能是通过抑制NF-?资B来改善胰岛素敏感性的。
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免疫抑制剂范文第5篇
[关键词] 皮肤移植；免疫抑制；雷公藤内酯醇；作用机制
[中图分类号] R657.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（b）-0012-04
Immunosuppressive effect and mechanism of Triptolide on skin allografts in mice
LIANG Kuo1 LIU Shuang1 CUI Yeqing1 SUN Haichen1 LUO Bin1 WAN Suigui2 SUN Xuejing2 LI Fei1
1.Department of General Surgery， Xuanwu Hospital of Capital Medical University， Beijing 100053， China； 2.Department of Hematology， Xuanwu Hospital of Capital Medical University， Beijing 100053， China
[Abstract] Objective To investigate the immunosuppressive effect and the possible mechanism of Triptolide on skin allografts in murine model. Methods BALB/c mice to C57BL/6 mice skin allografting models were created. The recipients were divided into three groups. The mice in the treatment groups were injected intraperitoneally with Triptolide at 100 μg/kg （low-dose Triptolide group， L-Tri group） or 200 μg/kg （high-dose Triptolide group， H-Tri group） daily in the first 6 days （0-5 days）； while the mice in control group were given vehicles （1% Tween 80）. The median survival time of skin allografts in each group was monitored. The proportion of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells in spleen tissue were tested by flow cytometry. Results The median survival time of skin allografts in the control group， L-Tri group and H-Tri group were （8.3±1.2）， （12.4±1.9） d and （14.9±2.2） d respectively. The percentage of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells in spleen tissues of three groups were （5.6±0.8） %， （12.6±1.5）% and （16.1±2.1）% respectively. Compared with control group， the L-Tri group and H-Tri group show significantly prolonged skin allograft survival time （P < 0.05）， increased percentage of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells （P < 0.05）. Conclusion Tri can inhibit immune rejection， prolong the skin allograft survival time in mice. The anti-rejection effect of Tri may be attributed to the upregulation of regulatory T cells. In addition， the immunosuppressive effect of triptolide shows dose-dependent.
[Key words] Skin transplantation； Immunosuppression； Triptolide； Mechanism
同种器官移植已成为治疗人类肾脏、心脏及肝脏等严重疾病的一种重要手段。但是，由于目前临床应用的免疫抑制剂长期使用时具有一定的毒副作用，因此研制开发新型、高效、低毒的免疫抑制剂，一直是临床关注的热点[1-2]。雷公藤内酯醇（Triptolide，Tri）是从我国传统中药雷公藤中分离出来的含有三个环氧基的二萜内酯化合物，具有较强的抗炎、抗肿瘤和免疫抑制作用[3-4]。动物实验证实其在心脏[5-6]、肾脏[7]、肝脏[8]、肺脏[9]、胰岛[10-11]等多种移植模型中均具有较好的抗排斥作用，是一种极有潜力的免疫抑制药物。但目前国内外学者对于Tri在移植中的抗排斥作用机制仍然存在较多争论[12]。本研究旨在通过观察Tri在小鼠同种异体皮肤移植中的抗排斥效果，初步探讨其可能的免疫作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
近交系雄性BALB/c小鼠（H-2d）8只为供体，雄性C57BL/6（H-2b）24只为受体，均为8～12周龄，体重22～25 g，购自北京维通利华公司。饲养于恒温（25～27℃）、恒定湿度（45%～55%）、无特定病原体（SPF级）环境中。
1.2 主要试剂
Tri购自中国药品生物制品检定所，吐温80购自北京思语伟业生物公司，链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、胶原酶Ⅴ购自Sigma公司，Ficoll 400购自瑞典Pharmacia公司，胎牛血清购自Gibco公司，免疫组化试剂购自迈新公司。藻红蛋白（PE）标记的抗小鼠Foxp3单克隆抗体（mAb）、异硫氰酸荧光素（ FITC）标记的抗小鼠CD4单克隆抗体（mAb）、别藻青蛋白（APC）标记的抗小鼠CD25单克隆抗体（mAb）等免疫荧光染料均购自eBioscience公司。
1.3 皮肤移植与分组
供体（BALB/c）脱椎法处死后，取尾部皮肤，剪成0.8 cm×0.8 cm大小的皮片置于无菌PBS中备用。C57BL/6受鼠给予4%水合氯醛腹腔注射（10 μL/g）麻醉。制备受鼠背部移植床，将供体皮片置于移植床，6-0丝线缝合固定，皮片表面敷盖凡士林油纱并用无菌纱布包扎覆盖，创可贴包扎固定，单笼饲养。3 d后去掉凡士林油纱和无菌纱布，逐日观察移植物排斥状况。以皮片结痂、变硬、坏死、缩小到初始测量尺寸的50%时，定义为移植皮肤被排斥标准[13]。术后分成对照组和治疗组[包括L-Tri组（100 μg/kg）和H-Tri组（200 μg/kg）]。治疗组术后连续6 d腹腔注射Tri，对照组给予等体积溶剂（1%吐温80）。
1.4 流式细胞术
移植术后第7天，分别制备各组小鼠的脾淋巴细胞悬液，将浓度调制5×106/mL。然后取1 mL细胞悬液加入FITC-抗CD4单抗（0.25 μg/106个细胞）和APC-抗CD25单抗（0.125 μg/106个细胞），室温共孵育15 min，Foxp3-PE标记参照试剂盒操作指南进行破膜标记。标记后的细胞用冷PBS缓冲液（pH 7.4）洗2次。1%多聚甲醛300 μL重悬固定，调整细胞浓度为1×106个/mL，取400 μL上FACScan流式细胞仪进行分析。每份标本均设同型对照，取2次检测结果均值进行统计学处理。以流式细胞仪双色、三色分析法分别分析CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞的比例。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件及Graphpad Prism 5.0软件进行数据处理，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Tri对移植皮肤存活时间的影响
对照组移植皮肤平均存活时间为（8.3±1.2）d，L-Tri组为（12.4±1.9）d，H-Tri组为（14.9±2.2）d；与对照组相比，L-Tri组和H-Tri组移植皮肤平均存活时间明显延长，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；与L-Tri组相比，H-Tri组移植皮肤平均存活时间明显延长，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。
A B
A：三组移植皮肤的生存曲线；B：三组移植皮肤的平均生存时间，*P < 0.05，**P < 0.01
图1 Tri对小鼠同种异体移植皮肤生存时间的影响
2.2 流式细胞检测结果
皮肤移植术后第7天，Tri处理组脾细胞CD4+ CD25+ Foxp3+ T reg的比例明显增加，H-Tri组为（16.1±2.1）%，明显高于L-Tri组[（12.6±1.5）%]（P=0.00），且两组均明显高于对照组[（5.6±0.8）%]（P=0.01）。见图2。
3 讨论
器官移植已经成为治疗终末期器官衰竭的最有效手段，但移植术后的免疫排斥反应却长期影响着移植效果和患者的生存质量，免疫抑制药物的合理应用是移植成败的关键。目前常用的免疫抑制剂的作用效果仍不十分理想，长期应用可造成肝、肾功能受损、感染风险增加、肿瘤发生率增加等一系列不良反应。因此，研究开发新型、低毒、高效的抗排斥药物，探索更为有效的免疫抑制方案仍然是当前迫切需要解决的问题[6]。
近几年的研究显示，Tri在体内、体外均具有较好的免疫抑制活性[14]，在器官移植领域有一定应用前景。在大鼠同种异体心脏移植模型中，Tri能够明显延长移植心脏的存活时间，并与他克莫司和环孢霉素均具有明显协同作用[5]。在小鼠同种异体心脏移植研究中，Tri能够延长移植心脏存活时间，并与雷帕霉素显示出了良好的协同作用[6]。有学者研究显示，在大鼠同种异体肾脏移植中，Tri同样能够明显延长移植肾脏的存活时间[7]。郑树森等[8]研究证实，雷公藤多苷能够轻度抑制大鼠异种原位肝移植排斥反应。He等[9]研究发现，Tri能够减轻移植肺脏的缺血再灌注损伤，改善移植肺功能。本研究将Tri应用于小鼠同种异体皮肤移植模型，观察到Tri能够抑制其免疫排斥反应，有效延长移植物的存活时间，并且随着Tri剂量的增加，其免疫抑制作用也明显增强，提示Tri的抗排斥作用与药物剂量有一定相关性。但Tri发挥免疫抑制作用的机制尚未完全阐明，国内外学者仍然存在较多的争论。
近年来研究显示，作为一种新的免疫抑制剂，Tri可抑制T细胞增殖，诱导T细胞和树突状细胞（DC）的凋亡，抑制抗原递呈细胞的抗原递呈，抑制DC表达主要组织相容性复合体Ⅰ类和Ⅱ类分子[15]，抑制IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α等细胞因子的产生[16]。CD4+ CD25+调节性T细胞是Sakaguchi 等于1995 年首先发现，存在于外周血及脾脏组织的CD4+ T细胞中的一类具有独特抑制功能的T细胞亚群。在小鼠体内占CD4+ T细胞的5%～10%，而在人体内只占2%～3%。近年来研究发现，CD4+ CD25+调节性T细胞作为一群具有免疫负调控功能的T细胞亚群，通过抑制其他免疫效应细胞的激活和增殖，对抑制移植排斥反应和诱导移植免疫耐受起重要作用[17-18]，而输注CD4+ CD25+调节性T细胞可以促进移植物存活[19]。在同种移植中，有研究证实，CD4+ CD25+调节性T细胞对于预防或纠正慢性移植物抗宿主反应（GVHD）有重要作用[20]。许多研究表明，CD4+ CD25+调节性T细胞亦可以影响巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、B细胞等的功能[6，21]。Foxp3（forkhead/winged helix transciption factor）作为叉头状转录因子，为CD4+CD25+ T细胞的发育和功能所必需[22]。Tri能够促进Foxp3+调节性T细胞的产生[23-24]。
本实验结果显示，给予皮肤移植小鼠应用不同剂量Tri，能够提高受体小鼠脾脏CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞的数量，延长移植皮肤的存活时间，并具有一定剂量依赖效应。由此推断，Tri可能通过增加移植受体CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞的数量，诱导免疫耐受，从而发挥延长移植物存活时间的作用。但Tri诱导CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞上调的分子机制目前尚不清楚，还需进一步研究。
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