凝胶色谱法

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凝胶色谱法范文第1篇

[关键词]凝胶色谱法 测定 头孢美唑钠 聚合物

中图分类号：TH23 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）10-0332-01

头孢美唑钠是一种半合成抗生素，其属于第三代头孢菌素，在临床治疗中有着广泛的应用，在临床应用中发现，这一药物的抗菌性比较强，而且有着良好的药效。通过测定实验发现，为了提高头孢美唑钠的药效，必须控制好其生产的质量，控制高分子杂质的产生，这样可以防止患者的服用这一药物时出现过敏反应，还可以降低药物的毒性，防止药品医疗事故的发生。本文通过建立凝胶色谱法测定头孢美唑钠中聚合物的方法，提高了药品质量检测结果的可靠性，对药品生产安全也有着保障作用。

一、仪器与试药

1、仪器

KGF-02型高分子聚合物测定仪（上海金达生化仪器厂）；WHSOO}JSB伍豪色谱土作站（上海伍豪信息科技有限公司）；色谱柱（40一120 μm葡聚糖凝胶G 10为填料）；玻璃柱（内径1.3一1. 6 cm，柱高30一40 cm） ； BP211 D型分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

2、药品与试剂

头孢美唑钠对照品（批号：MZW S0901，质量分数：91.7%）；注射用头孢美唑钠（批号：090101，090102，090103深圳立健药业股份有限公司）；Naz HPOQ ， NaHz PO、均为分析纯；纯化水为公司自制；葡聚糖凝胶（Sephadex） G-0、蓝色葡聚糖2000（Amersham Bioscience公司）。

二、方法与结果

1、溶液的制备

1.1对照溶液的制备

实验人员首先需要称取适量头孢美唑钠原料，然后加入纯化水进行溶解，将其制备为1mL溶液含0.2mg头孢美唑的对照溶液。这一过程主要是定量稀释，对精确度有着较高的要求。

1.2供试品溶液的制备

采用精密的仪器，称取0.2g注射用头孢美唑钠，然后将其置于10mL的容量瓶中，再加入一定量的纯化水进行稀释，达到规定的刻度后做摇匀处理。这一过程要求研究人员必须规范操作。

2、色谱条件

色谱柱为葡聚糖凝胶G-10柱（40一120μm，柱内径1.3一1. 6 cm，柱高30一40 cm）；流动相A为pH7. 0的0. 02 mol/L磷酸盐缓冲液[0. 02 mol/LNaz HPOQ -0. 02 mol / L NaH2 PO4（体积比61： 39 ） ]，流动相B为纯化水；流速为1.5 mL/min；检测波长为254 nm；进样量为200μL。

3、系统适用性试验

精密称取蓝色葡聚糖2000适量，加纯化水定量稀释成质量浓度为0. 1 mg/mL的溶液，精密量取200 μL，注入液相色谱仪，分别以流动相A，B进行测定，记录色谱图。按蓝色葡聚糖2000峰计算理论塔板数应不低于700，拖尾因子应小于2. 0。在2种流动相系统中蓝色葡聚糖2000的保留时间的比值应在0. 93一1. 07之间，对照溶液主峰、供试品溶液中聚合物峰与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间的比值均应在0. 93一1. 07之间。称取注射用头孢美唑钠约0. 2 g，置10 mL容量瓶中，用1 mg/mL的蓝色葡聚糖2000溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取200μL注入液相色谱仪，用流动相A进行测定，记录色谱图。聚合物峰高与单体间，及聚合物之间的谷高比（分离度R）应大于2.0。另以流动相B为流动相，精密量取对照溶液200μL，连续测定5次，峰面积RSD值应不大于5. 0% 。见图1、表1（其中A表示蓝色葡聚糖2000在流动相A中，B表示蓝色葡聚糖2000在流动相B中，C表示对照溶液在流动相B中，D表示供试品溶液在流动相A中）。

4、注射用头孢美唑钠中聚合物的测定

取注射用头孢美唑钠约0. 2 g，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀。立即精密量取200 μL注入液相色谱仪，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图。另精密量取对照溶液200 μL注入液相色谱仪，以流动相B为流动相进行测定，记录色谱图。

5、定量限的测定

分别取头孢美唑钠对照品适量，精密称定，加水稀释制成系列质量浓度的对照溶液。分别精密量取上述溶液200 μL注入液相色谱仪，以流动相B为流动相依法进行测定，以信噪比10： 1为指标，测得定量限为0.034μg/mL。

6、稳定性试验

取同一批注射用头孢美唑钠（批号：090101）约0. 2 g，精密称定，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别于0，1，2，4 h精密吸取200 μL注入液相色谱仪，以流动相A为流动相进行测定，结果聚合物峰面积的RSD值为15. 62%，表明供试品溶液中聚合物的峰面积随放置时一间的延长而增大，因此应在供试品溶液配制后立即进样测定。

三、讨论

在不同的酸碱条件下，头孢菌素发生聚合反应的难易程度不同，一般在强碱与强酸条件下，注射用头孢美唑钠较易发生聚合反应，会生成一定量聚合物，本文采用凝胶色谱法对这一聚合物进行了测定，通过分析注射用头孢美唑钠的高分子聚合物含量，可以为头孢美唑钠的质量检验提供依据。由于头孢菌素在碱性以及酸性条件下会发生聚合反应，所以，在测定的过程中，选用了pH值为7的磷酸盐缓冲液作为流动相。

分子排阻色谱法是一种有效的药物检测方法，其对头孢高分子杂质有着较好的检测效果。在本次实验中，由于头孢美唑钠高分子聚合物对照品不宜获取，而且实验样品中高聚物的数量也比较少，为了提高实验的准确性，需要在配制检测分离度时，加入一定量的葡萄糖，这可以增加聚合物峰值面积，加入量的具体数值可依实际情况稳定，要保证聚合物峰面积达到规定值的2倍左右。通过实验证明，头孢美唑钠聚合物的分离度、拖尾因子以及保留时间符合药品适用性的要求。本次实验采用了封闭式凝胶柱，流相的流速达到了1.5mL/min，在洗脱处理后，聚合物既满足分离的质量要求，也提高了分离的效率，缩短了分析时间。

注射用头孢美唑钠聚合物的形成具有动态性，聚合物样品中高分子杂质的数量与溶液放置的时间有着较大关系，一般放置的时间越长，聚合物的质量分数越大，所以，为了保证测定的准确性，研究人员需要掌握好时间，这样才能提高测定结果的可靠性。当供试品溶液配制中得到聚合物后，一定要及时测定。另外，在测定的过程中，测定方法的选用需要参考《中国药典》的 相关检测要求，一定要考虑高分子杂质的影响。本次试验与研究表明：凝胶色谱法测定注射用头孢美唑钠聚合物，具有操作简单、灵敏度高、可控性强等优点，可以有效提高头孢美唑钠聚合物的质量控制水平。

参考文献

[1] 边原，何林，夏祺悦. 反相高效液相色谱法测定注射用头孢美唑钠的含量[J]. 中国药业. 2010（05）

[2] 蔡尾玉，黄凯文. 高效液相色谱法测定注射用头孢美唑钠中头孢美唑含量[J]. 中国民族民间医药. 2012（04）

凝胶色谱法范文第2篇

植物油是人类生活的必需消费品，其质量安全直接关系到消费者的身体健康。我国规定了棉籽油、花生油、大豆油及菜籽油中拟除虫菊酯类和有机磷类农药的残留限量（005～05 mg/kg）＼[1＼]。目前，对于植物油的农药多残留检测前处理方法主要是采用液液萃取（LLE）＼[2＼]，结合固相萃取（SPE）＼[3，4＼]，凝胶色谱（GPC）＼[5＼]或基质固相分散（MSPD）＼[6＼]进行。随着前处理技术的发展，新的前处理技术被应用到植物油中农药残留的检测中，如在线GPC系统＼[7，8＼]及QuEChERS法＼[9～12＼]。这类方法的出现，使得样品前处理变得简单，有时甚至不需进行前处理。但也存在如基质干扰较严重＼[7，8＼]、检出限偏高＼[7＼]、处理时间长＼[9～12＼]等问题。

本研究将QuEChERS方法结合在线GPCGCMS系统用于检测植物油中的多农药残留，将毒鼠强以及多种中高毒农药纳入到研究范围，与已报道的方法＼[9～13＼]相比，采用QuEChERS法处理样品时不需调节pH值，无需进行冷冻除脂，且所需样品量少，进一步减小溶剂消耗； 在线GPCGCMS系统中的GPC部分可以很好地弥补QuEChERS法去除干扰物质不彻底的问题，利用大体积进样（LVI）技术，可将GCMS的灵敏度进一步提高，而且能够抑制部分基质效应。本方法具有较高的灵敏度及精密度，较低的分析成本，可用于葵花油、大豆油和玉米油中34种农药残留快速筛查与检测。

23实验方法

对浓度为100 mg/L的13种农药标准品（甲拌磷、地虫硫磷、治螟磷、苯线磷、甲基对硫磷、对硫磷、特丁硫磷、乙基嘧啶磷、蝇毒磷、狄氏剂、异狄氏剂、克百威、氟虫腈等）各2支，毒鼠强取用1支，全部转移至50 mL容量瓶。对20种农药固体标准品（久效磷、杀螟硫磷、甲胺磷、氯唑磷、丁基嘧啶磷、亚胺硫磷、乙硫磷、杀扑磷、甲基立枯磷、伏杀磷、丙溴磷、乙拌磷、丙线磷、三氯杀螨醇、林丹、氰戊菊酯、p，p滴滴滴、p，p滴滴伊、o，p滴滴涕、p，p滴滴涕）每种称取10 mg，加入到10 mL容量瓶中，先用少量丙酮溶解，然后用正己烷定容， 配制成质量浓度均为1000 mg/L的储备液，吸取200 μL储备液转移到同一50 mL容量瓶中本研究采用氟胺氰菊酯和灭螨猛校准混合物（10 mg/L）进行时间定位（大多数农药分子量介于氟胺氰菊酯和灭螨猛之间），在22节GPC条件下，氟胺氰菊酯和灭螨猛保留时间相差小于2 min（图1）。本研究收集340～540 min馏分到200 μL定量环中，使得34种农药完全进入GCMS系统中进行分析检测。其它馏分由GPC排到系统外，由此可使样品中的杂质进一步去除，进而减小基质效应、降低分析背景、改善色谱峰形，且GPC系统克服了常规 GPC消耗溶剂量大、自动化差、操作繁琐等问题。

GPC系统与GCMS系统采用程序升温大体积进样口连接（PTVLVI），利用大体积进样技术，可将GCMS的灵敏度进一步提高， PTVLVI技术可以快速的加热或者冷却，减少热不稳定农药的分解，且较高的载气流速可以减少目标分析物在衬管中的停留时间，在一定程度上抑制基质效应。

32萃取剂及萃取方式的选择

按24节处理步骤，在3支10 mL玻璃试管中各加入040 g葵花油样品，并按01 μg/g加入标准溶液。比较了乙腈丙酮（1∶1， V/V）、正己烷饱和的乙腈及乙腈3种萃取剂的萃取效率。样品经不同萃取剂萃取后的净化效果见图2。结果表明，采用乙腈丙酮（1∶1， V/V）萃取时基质干扰严重，不适合作为此方法的萃取剂；

34基质效应

基质效应是农药分析需要考虑的问题＼[18＼]。本研究在采用纯溶剂配制的标准曲线进行定量时，除甲胺磷、治螟磷、林丹、氯唑磷、丁基嘧啶磷、甲基立枯磷、乙基嘧啶磷，其余24种农药（除p，p′DDE， p，p′DDD， p，p′DDT）均有不同程度的基质增强效应。采用欧盟DG SANCO＼[15＼]中的规定，利用不含农药的空白基质匹配制标准溶液，使之达到与样品中农药同等的响应。

4结论

本实验采用QuEChERS方法对葵花油样品前处理方法进行了优化，结合GPCGCMS建立了一套可同时测定葵花油、大豆油和玉米油中31种 （不包括p，p′DDE， p，p′DDD， p，p′DDT） 中高毒农药的快速筛查方法，检出限、定量限、回收率和相对标准偏差均能满足农药多残留检测方法的要求， p，p′DDE， p，p′DDD， p，p′DDT满足定性要求。采用QuEChERS法结合GPCGCMS在线联用，一方面GPC系统弥补了QuEChERS前处理方法去干扰物质不彻底的问题，提高了方法的灵敏度、分析结果的准确性，且在线GPC系统从进样到完成色谱柱冲洗仅需要使用10 mL有机溶剂，符合绿色化学的理念； 另一方面，采用QuEChERS法进行样品前处理，食品安全国家标准食品中农药最大残留限量 中华人民共和国国家标准 GB/T 27632012

2Anagnostopoulos C， Miliadis G E Talanta， 2013， 112： 1-10

3Muhamad H， Zainudin B H， Abu Bakar N K Food Chem， 2012， 134（4）： 2489-2496

4Chee B Y， Chiew L C Eur J Lipid Sci， 2012， 114（12）： 1358-1361

5Hoh E， Lehotay S J， Mastovska K， Ngo H L， Vetter W， Pangallo K C， Reddy C M Environ Sci Technol， 2009， 43（9）： 3240-3247

6García Reyes J F， Ferrer C， Thurman E M， FernndezAlba A R， Ferrer I J Agric Food Chem， 2006， 54（18）： 6493-6500

7Díaz Plaza E M， Cortés J M， Vzquez A， Villén J J Chromatogr A， 2007， 1174（1）： 145-150

8Jongenotter B， Janssen H LCGC， 2002， 15（6）： 338-357

9Jiang Y， Li Y， Jiang Y， Li J， Pan C J Agric Food Chem， 2012， 60（20）： 5089-5098

10Sobhanzadeh E， Bakar N K A， Abas M R B， Nemati K Environ Monit Assess， 2012， 184（9）： 5821-5828

11Park J Y， Yang A， Park J H， ElAty A MA， Oh J H， Do J A， Kwon K， Shim K H， Choi O J， Shim J H J Korean Chem Soc， 2012， 55（4）： 541-549

12DONG Jing， PAN YuXiang， ZHU LiPing， SUN Jun， PAN ShouQi Journal of Instrumental Analysis， 2008， 27（1）： 66-69

董 静， 潘玉香， 朱莉萍， 孙 军， 潘守奇 分析测试学报， 2008， 27（1）： 66-69

13YU YanBin， LIU ZongXing， TAN PiGong， L ChunYing， HOU YanZhuo Chinese J AnalChem， 2013， 41（8）： 1259-1263

于彦彬， 谭丕功， 刘宗兴， 吕春莹， 侯彦卓 分析化学， 2013， 41（8）： 1259-1263

14Hercegov A， Dmtrov M， Krulicov D， Matisov E J Sep Sci， 2006， 29（8）： 1102-1109

15European Commission Document No SANCO/12495/2011 Method Validation and Quality Control Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed http： //eceuropaeu/food/plant/plant_protection_products/guidance_documents/docs/qualcontrol_enpdf

16WANG LianZhu， ZHOU Yu， CHEN Yong， WANG RuiLong， LIN ZiXu， LIN DeJuan， ZHEN ShaoHui Chinese Journal of Chromatography， 2012， 30（2）： 146-153

王连珠， 周 昱， 陈 泳， 王瑞龙， 林子旭， 林德娟， 郑少惠 色谱， 2012， 30（2）： 146-153

17Polgr L， Kmellr B， GarcíaReyes J F， Fodor P Anal Methods， 2012， 4（4）： 1142-1148

18Fenik J， Tankiewicz M， Biziuk M TrAC， Trends Anal Chem， 2011， 30（6）： 814-826

19Lehotay S J， Kok A D， Hiemstra M， Bodegraven P V J AOAC Int ， 2005， 88（2）： 595-614

20Li L， Xu Y， Pan C， Zhou Z， Jiang S， Liu F J AOAC Int， 2007， 90（5）： 1387-1394

21García Reyes J F， Ferrer C， Gómez Ramos M J， Fernndez Alba A R， MolinaDíaz A TrAC， Trends Anal Chem， 2007， 26（3）： 239-251

凝胶色谱法范文第3篇

关键词：高效液相色谱法 发展 优势 劣势 发展 应用

高效液相色谱法使用的流动相是液体，应用高压输液装置，将具有不同极性的单一溶剂或者不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相压进装有固定相的色谱柱中，各种成分在柱内分离以后，然后进入检测器被检验，最后对试样进行分析。

一、高效液相色谱法的发展

1.高效液相色谱法的历史

色谱分析法的一个分支就是高效液相色谱法，在20世纪60年代末期，以气相色谱法和经典液相色谱发为基础，形成的一种新的分离和分析技术。到了1960年，随着气相色谱法理论和实践的不断发展，同时光学、机械、电子等技术也在不断发展，液相色谱法逐渐被相关学者使用。到了20世纪60年代末，高效液相色谱发就应用高压泵和化学键合固定相。

2.高效液相色谱法和其他色谱法的比较

2.1高效液相色谱法和经典液相色谱的比较

经典液相色谱法使用的是粗粒多孔固定相，将固定相装在口径大、较长的玻璃柱管内，流动相只能通过重力流过色谱柱，溶质在固定相的传质和扩散的速度都很慢，因为柱的入口压力很小，导致柱子的效果很差，在很大程度上增加了分析时间。而高效液相色谱法使用的固定相是全多孔微粒，将固定相装在口径小、短的不锈钢的柱子内，流动相通过高压输液泵进入了柱压很大的色谱柱中，在固定相中，溶质的传质和扩散速度都很快，所以在很多的时间内，柱子的效率和分离能力都很好。

2.2和气象色谱法的比较

高效液相色谱法和气象色谱法相比有很多的类似之处。气象色谱法的选择性很高、分析效率也不低，同时还具有很高的灵敏度和分析速度，可是这种分析方法只能对那些蒸气压低和沸点低的样品进行分析，对于那些高沸点的有机物、具有不高稳定性的化合物、高分子物质和生物活性物质来说，这种方法就行不通了。经过分析，只有20%的有机化合物可以使用气象色谱法进行分析。可是对高效液相色谱法来说，就能分离和分析剩余的80%的有机化合物。

二、高效液相色谱法的综合分析

1.高效液相色谱法的有适合劣势

高效液相色谱法和其它分析方法相比具有很高的分辨率，为了达到最佳的分离效果可以选择流动相和固定相；同时它的分析速度很快，一般只需要几分钟或者即使分钟；它还具有很高的重复性，使用的样品还可以回收；它使用的色谱柱还可以重复使用，非常环保；具有较高的自动化程度，在进行分析时，分析的精确度也很高。所以高效液相色谱法被广泛应用，尤其是对大部分的有机化合物进行分离和分析，在分离和分析高沸点、极性强、大分子、热稳定差的化合物时有很大的优势。

可是高效液相色谱法需要很高的压力，一般要达到150～350×102 KPa。同时如果流动相的配比在进样器、柱接头、连接管和检测池等发生任何变化，或者被分离的物质发生扩散或者滞留的现象都会加宽色谱峰，降低柱效率。

2.对高效液相色谱法的分类

由于分离机制不同，高效液相色谱法可分为以下几类。（1）吸附色谱。这种方法的固定相是固体吸附剂，流动相是不同极性溶剂，根据各个组分在吸附剂上的吸附能力不同对其进行分离。（2）分配色谱。这种方法的固定相是液体。因为每一个组分在固定相中的溶解能力不同，对试样中的组分进行分离。（3）亲和色谱。这种方法主要是对固定相的结合特性进行利用，然后将分子分离。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接和有待分离的物质有一定结合能力的分子，同时这种结合是可逆的，在对流动条件进行改变时，也能对其进行分离。（4）离子交换色谱。这种色谱的固定相是离子交换剂，将离子交换树脂上可电离的离子和流动相中的具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，因为这些离子和交换剂的亲和能力不同，就会分离开来。（5）体积排阻色谱。这种色谱的固定相是具有化学惰性的多孔性凝胶，固定相对各组分的体积阻滞作用不同，这样各组分就会发生分离。因为流动相的不同又可分为凝胶过滤色谱和凝胶渗透色谱。

三、高效液相色谱法的应用

1.高效液相色谱法的应用范围

对于那些高沸点不易挥发、热稳定性差的、高分子的、具有不同极性饿有机化合物，生物活性物质和各种天然的物质，高效液相色谱法都能对其进行分离和分析。这些物质在食品、合成药物、石油化工产品、生物化工产品等方面都有应用，其中在这些方面应用的无机物中占20%，在这些方面应用的有机物中占80%，特别是那些永久性气体、易挥发的、具有中等分子量的化合物都能进行分析。

2.高效液相色谱法应用的限制

首先高效液相色谱法使用的流动相是多种溶剂，同时使用这种方法进行分析需要的成本比气象色谱法高，对环境也会产生污染。特别是在进行不同浓度的操作时，还要对其进行洗脱，操作起来比气象色谱法复杂。同时，这种方法使用的检测器不是通用的，和气象色谱相比就处于劣势了。可是这几年蒸发激光散射检测器逐渐被应用，很有可能成为高效液相色谱法分析时一种通用的检测器。还有就是，高效液相色谱法是不可能取代气象色谱法的，因为对于组成复杂、具有多种沸程的石油产品来说，它需要柱效达到10万块塔板和毛细管气相分析发分析。最后，这种方法也无法取代中、低压柱色谱法。在柱压从200千帕升到到1兆帕时，具有生化活性的生化样品收到压力容易分解、变性。

四、结束语

高效液相色谱法是在气象色谱和液相色谱的基础上发展的，同时发展也很快，因为这种方法操作简单，结果准确、效率高，当前，在各个方面的应用也非常广泛。可是这种方法也有缺陷，所以要不断的对其进行完善，使其变得更加快捷精准。

参考文献

[1] 冀晓磊； 陈如春； 黑均安，高效液相色谱分析应用心得[J]. CJFD收录刊，2006（04）

[2] 于世林.高效液相色谱方法及应用 [M].北京市：化学工业出版社 ，2005（04）.

[3] 张金专；华菲；张晔.高效液相色谱在火灾调查中的应用 [J]. 消防技术与产品信息，2005（10 ）.

[4] 王俊德；商振华；郁蕴璐.高效液相色谱法 [M]. 1992年03月第1版

凝胶色谱法范文第4篇

血红蛋白的提取和分离一般步骤为样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

1　样品处理

1.1　红细胞的洗涤

洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤3次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

1.2　血红蛋白的释放

在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白，加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。

2　粗分离

2.1　分离血红蛋白溶液

将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

2.2　透析

取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质。

3　纯化

利用凝胶色谱柱可对血红蛋白进行纯化(图1)。

4　纯度鉴定

使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5　血红蛋白的提取和分离操作问题分析

5.1　血红蛋白的提取

红细胞分层不明显，可能是洗涤次数少，未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

5.2　检测凝胶色谱柱的装填是否成功的方法

由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。

5.3　凝胶的装填标准：紧密、均匀

如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无数的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，扰乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。

5.4　沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的

这样操作不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物，排除凝胶内的空气。

5.5　G--75

“G”代表凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。

5.6　装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的

此操作的目的是使凝胶装填紧密。

5.7　实验过程加入柠檬酸钠

加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固；低速、短时离心防止白细胞沉淀；缓慢搅拌防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

5.8　检测血红蛋白的分离是否成功的方法

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

6　典型例题

【例1】在血红蛋白的提取和分离实验中，下列操作正确的是( )

A　分离红细胞时需去除上层透明的黄色血浆

B　红细胞释放出血红蛋白时只需加入蒸馏水

C　分离血红蛋白溶液是低速短时间离心

D　洗脱时，待红色蛋白质下移即开始收集流出液

思维启导：红细胞释放出血红蛋白除需加入蒸馏水，还需加入40％体积的甲苯；分离血红蛋白溶液是高速长时间离心；洗脱时，待红色蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。

参考答案：A。

【例2】下列有关提取和分离血红蛋白的程序，叙述错误的是( )

A　样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B　通过透析可能去除样品中相对分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取

C　可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化

D　可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

思维启导：首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，由此可知B的叙述错误。由玻璃纸制成的透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内，透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质。

参考答案：B。

【例3】红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：

(1)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。

①加入柠檬酸钠的目的是___________。

②以上所述的过程即是样品处理，它包括__________、_________、收集血红蛋白溶液。

(2)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。

①透析的目的是

②透析的原理是

(3)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

①样品纯化的目的是__________。

②血红蛋白有什么特点?

这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义?

思维启导：柠檬酸钠是一种抗凝剂，能够防止血液凝固。凝胶色谱柱中如果产生了气泡，气泡就会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

参考答案：

(1)①防止血液凝固

②红细胞的洗涤血红蛋白的释放

(2)①去除分子质量较小的杂质

②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内

(3)①通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去

凝胶色谱法范文第5篇

关键词：凝胶剂 欧前胡素 高效液相色谱法

中图分类号：R286 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）06（a）-0214-02

Determination of Imperatorin in Xiaoyantong Gel

ZHU Yanhua WANG Xinggan GUO Xin YAN Xueying

（Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang，150040）

Abstract：Objective：To establish a HPLC method for determination of imperatorin in Xiaoyantong gel.Methods：Mobile phase was methanol-water（55：45）.Detection wavelength：300nm.Flow rate：1.0mL min-1.Column temperature：30℃.Results：The content of imperatorin is determined by this method，while the linear relation was good.The average recovery was 99.53%.The RSD was 1.82%.Conclusions：This method is simple，accurate and can be used for determination of Xiaoyantong gel.

Key words：Gel Imperatorin HPLC

消炎痛凝胶剂是由白芷浸膏、薄荷脑等药组成。具有消炎止痛的功效，临床上主要用于治疗肌肉痛、关节痛、腰腿痛、跌打损伤及网球肘引起的肿痛。为了有效控制消炎痛凝胶剂的质量，参考相关文献[1-4]采用高效液相色谱法建立了其主要药味白芷中欧前胡素的含量测定方法，结果表明该方法准确可靠。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（LC-2010 AHT，日本岛津公司）；消炎痛凝胶剂（自制，批号：20130912、20130913、20130914、20130915、20130916）；欧前胡素对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号： 110826-201013）；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性试验

色谱柱：（250 nm×4.6 nm，5 ?m）；流动相：甲醇-水（55∶45）；检测波长：300 nm；流速：1.0 mL・min-1；柱温：30 ℃；理论塔板数不得低于2000。

2.2 对照品溶液的制备

取欧前胡素对照品，加甲醇制成每1 mL含100 ?g的溶液，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取凝胶剂约1g，精密称定，置具塞玻璃试管中，加0.1 mol・L-1盐酸0.1 mL，用甲醇定容至刻度，超声30 min，取出后补加甲醇至刻度，用0.45 ?m的微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品的溶液。

2.4 阴性溶液的制备

按处方比例称取除白芷浸膏外的其他药物，按照供试品溶液的制备方法制备阴性供试品溶液。

2.5 干扰试验

照上述色谱条件，分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液注入色谱仪，记录色谱图，欧前胡素对照品、供试品在9 min左右出现吸收峰，阴性样品无干扰。

2.6 线性关系考察

吸取欧前胡素对照品溶液，加入甲醇制备成浓度分别为0.8、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg・mL-1的溶液。分别进样10 ?L，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归处理得回归方程：A=1.6×105C-14356，R2=0.9995，表明欧前胡素在0.8～16 ?g范围内线性关系良好。

2.7 稳定性试验

取消炎痛凝胶剂（批号：20130912）按2.3项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，照上述色谱条件，分别在第0、12、24、36、48、60、72 h进样，每个时间点进样3次，测得峰面积积分值，RSD为2.2%。结果表明供试液在72 h内基本稳定。

2.8 精密度试验

取本品（批号：20130912）按2.3项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液液10 μL，进样6次，分别记录峰面积积分值，RSD为1.9%。结果表明此方法的日内精密度良好，符合含量测定的要求。

2.9 重复性试验

取本品（批号：20130912）按2.3项下供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液，照上述色谱条件重复测定3次，结果表明该法测定欧前胡素含量重复性良好，RSD为1.57%。

2.10 加样回收率试验

取已知含量的本品（批号：20130912）9份，每份约0.1g精密加入欧前胡素对照品1 mL，浓度分别为12 ?g・mL-1、10 ?g・mL-1、8 ?g・mL-1，每个浓度三份，按2.3项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，进行含量测定，并计算回收率。结果平均回收率为99.53%；RSD为1.82%，加样回收率符合要求，表明该方法准确。

2.11 样品的测定

按2.3项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，取供试品溶液和对照品溶液，分别进样，测定5批样品中异欧前胡素的含量，结果平均含量为0.1692 mg・g-1，RSD为0.18%（表1）。

3 讨论

3.1 流动相的选择

通过对乙腈-水，甲醇-水等多个流动相系统，以及甲醇-水的多个比例进行了考察，结果表明甲醇-水（55∶45）系统作为流动相，供试品色谱图中欧前胡素与其它峰能够达到很好的分离。因此选择该系统作为流动相。

3.2 提取溶剂的选择

试验中曾经选用丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇进行提取，结果以甲醇提取测得的含量较高且分离度好，乙醇提取测得的含量虽高，但有一些杂质峰的分离不好，故选用甲醇作为样品前处理溶剂。

3.3 超声提取时间选择

研究比较了超声提取10、20、30、40 min，结果表明超声30 min欧前胡素提取率高于10、20 min，并与40 min提取率基本相同，故本试验采取了超声30 min的方法。

参考文献

[1] 马开，秦文杰.HPLC测定痛可停胶囊中欧前胡素和异欧前胡素含量[J].中成药，2003，25（10）：801-803.

[2] 王洪志，李惠芬，周静，等.HPLC测定元胡止痛片中欧前胡素和异欧前胡素[J].中草药，2007，38（7）：1018-1019.