三角形的特性

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三角形的特性范文第1篇

“三角形的特性”是人教版四年级下册的内容，是在学生已经认识三角形的基础上进行教学的。品读了两位教师的”三角形的特性”教学设计后，深深地感受到了两位教师深厚的文化底蕴，丰实的数学素养，鲜明的教学个性，令人回味无穷。虽是同一教学内容，由于老师的不同，所设计课的结构、风格及所采取的教学方法和策略都不尽相同，呈现给我们的是独具匠心、各具特色的两节课。两节课“同中求异、异中求同”，教师的教学个性彰显无疑。

这部分教学内容属于“图形与几何”领域，张翠颖老师和李欣两位老师通过对课标的学习，都精心地设计了“三角形的特性”一课。有幸的是我亲自聆听了张老师的这节课，并与张老师交换了意见。两位老师都是始终围绕着以“问题情境——实践探究——解释、应用”的基本模式来开展自主探究、动手实践、合作交流的数学教学活动。让学生经历“数学化”的学习过程。遵循学生的认知规律，注重学生已有的生活经验，尊重学生对问题的独到见解，关注学生的感受、体验。力争把数学课堂还原给学生，使学生真正成为数学学习活动的主人。感受到了她们相同的思想方法和理念，同时也能感受到不同的设计和风格。

一、联系生活，提出质疑

在导入部分两位老师都设计了情境教学，并采取了出示大致相同的生活图片如塔吊、斜拉桥、自行车等图片让学生观察，从而揭示出三角形来。联系生活实际，借助学生已有的生活经验，让学生再找出生活中还有哪些物体上有三角形。同时提出问题：这些物体为什么要做成三角形的呢？数学教学必须从学生熟悉的生活情境和感兴趣的事物出发，为他们提供参与的机会，为他们创设一个发展的空间。以此激发学生的求知欲，让他们在生活中通过观察去发现问题，并提出问题。在导入部分，两位老师的教学设计可以看出情境和思路都是相同的。关于“同课异构”的话题曾经也有人提过“同材异构”“同标异构”，主要体现“异构”，在这里的设计为什么是大致相同的呢？可以说这样的设计充分地体现出了课标中“四能”中的前两方面能力，为下面落实后两方面能力做铺垫。虽然设计大致相同，但是方法和风格还是各有不同。

二、合作探究，分析问题

数学学习是学生获取知识的过程，是自我建构的过程。本节课中，两位精心设计探究活动，引导学生自主探究，努力改善学生的学习方式，使他们全身心地投入到数学活动中，在活动中产生深刻的体验，从而更好地掌握知识。这节课知识点多，包括三角形的概念、底和高的概念、各部分名称，还有三角形的重要特性：稳定性，及其在生活中的应用。从课题看，特性无疑是重点。而底和高的概念、及高的作法是难点，势必会耽误大量时间。如何在一堂课中完成教学任务？

张翠颖老师和李欣老师都采取了自主探究合作交流的方法，留给学生足够的时间与空间，首先让学生独立思考，再采取合作交流的方式。使学生建立空间观念，建立几何直观的思想，由具体直观形象思维到抽象思维，最后总结概括出三角形的定义及底和高的概念。在集体操作过程中，两位老师的教学方法各不相同：

张翠颖老师大胆地采取倒叙的设计。通过对教材的深入理解，结合学生的实际情况，教学中设计了许多操作和探究活动，并根据学生的活动设计把教材例1和例2的内容进行了重组。教学中把例1中认识三角形的底和高这部分教学内容后移，把例1中认识三角形的特征和例2三角形的特性安排在一起教学，并设计了一系列的操作活动，使学生在画一画、看一看、找一找、拉一拉、想一想、说一说等活动中认识三角形的特征、了解三角形的特性及在实际生活中的应用。在探究过程中，让3名学生伸开双臂围成三角形，张老师首先让学生理解三角形定义，然后直接明确三角形的表示方法，再探究三角形的底和高。这样做更容易在三角形中找出对应的底和高。

李欣老师在三个探究活动中采取了出示学习汇报单，请学生以小组为单位自主学习的方式。通过做（摆）三角形、画三角、判断三条线段围成的是不是三角形，明确了什么是三角形。这个过程中让学生明确探究要求，按步骤去合作探究，通过具体实例来完成三角形的定义。明确强调由三条线段围成的图形叫做三角形。之后再探究三角形的底和高，按照循序渐进由浅入深的逻辑进行教学。

关于三角形高的教学，两位老师的设计也不尽相同。张老师是采取了对应的方法，并突出了直角三角形的两条高，同时拓展到钝角三角形高的画法。李老师是通过对比、判断的形式明确三角形的高，并且要求会画三角形的高。

形象直观、突破难点。在探究三角形稳定性时，张老师结合导入时提出的问题“为什么这些物体要做成三角形的呢”，加以合理的解释说明，突出了三角形的稳定性这一难点，更确切地说是三角形的牢固性和稳固性。李老师利用对比的方法，利用学具让学生动手操作通过拉一拉的形式发现三角形比四边形更稳固，直观形象地理解了三角形的稳定性。

同样是探究，而探究的要求、形式却不相同，体现出了两位老师的教学思路及教学风格的独到之处，却达到了同样的目的和效果。

三、回归生活，解决问题

两位教师在教授新知之后都设计了不同的拓展练习。把当堂所学习的知识当堂消化，并且联系生活运用到生活中去，解决一些简单的实际问题。张老师设计了椅子太摇晃了，怎样才能固定住呢？让学生来解决这个生活中的实际问题。李老师提出了自行车车架运用了三角形的稳定性原理的问题。同时两位教师都列举了关于三角形具有稳定性的一些生活实例，以此让学生更好地理解数学来源于生活并服务于生活。更加清晰地看到学习数学的重要性和学习数学的目的。

两位教师的课堂教学让我们清楚地看到了不同的教师对同一教材内容的不同处理，不同的教学策略所产生的不同教学效果。不同的教师在设计“三角形的特性”的教学时还要从实际出发，进行合理的创编教材，把教材进行重组。因此我们备课时重在“锁定”新课标、“吃透”教材、“聚焦”关键、“挖掘”智慧、多元解读，实现教无定法，贵在得法，形成独具特色的教学风格。

三角形的特性范文第2篇

等边三角形是特殊的等腰三角形。等边三角形（又称正三边形），为三边相等的三角形，其三个内角相等，均为60°，它是锐角三角形的一种。等边三角形也是最稳定的结构。等边三角形是特殊的等腰三角形，所以等边三角形拥有等腰三角形的一切性质。

三角形是由同一平面内不在同一直线上的三条线段‘首尾’顺次连接所组成的封闭图形，在数学、建筑学有应用。常见的三角形按边分有普通三角形（三条边都不相等），等腰三角（腰与底不等的等腰三角形、腰与底相等的等腰三角形即等边三角形）；按角分有直角三角形、锐角三角形、钝角三角形等，其中锐角三角形和钝角三角形统称斜三角形。

（来源：文章屋网 ）

三角形的特性范文第3篇

【关键词】淮剧;旦角;表演;特性;戏曲;剧种;人物

中图分类号：J812 文献标志码：A 文章编号：1007-0125（2015）10-0039-02

表演艺术是中国戏曲的中心与生命，没有表演艺术就只有纸上的戏曲剧本而没有真正的舞台上的戏曲艺术，这与西方戏剧形成明显的区别。对于这一点，京剧大师程砚秋先生论述得十分明确而又精辟：“我国传统表演艺术和西洋演剧的最大区别之一是，在舞台艺术的整体中，我们把表演提到至高无上的地位。西方虽然也有表演中心论，而且是主要学派，但终不能像中国学派这样把表演看作是唯一的。欧洲戏剧的发展规律是：时代的美学观点支配着剧本写作形式，剧本写作形式又在主要地支配着表演形式;戏曲却是：时代的美学观点支配着表演形式，表演形式在主要地支配着剧本的写作形式。”[1]

作为中国地方戏曲剧种之一的淮剧，同样以表演艺术为中心与生命，各行当均如此，旦角当然亦如此。

然而，淮剧旦角表演艺术本身，又是一项全方位、系列化、深层次、高水准的复杂系统工程，其中又以凸显艺术特性为重点。因为特性作为事物特有的性质，属于个性范畴，而一切艺术创造，重点也正在凸显艺术个性。

具体来说，淮剧旦角表演艺术的特性，应以戏曲特性、剧种特性、人物特性为重中之重。我们对此分别进行研究与论述。

一、戏曲特性

淮剧旦角表演艺术的第一大特性，是戏曲特性。

中国戏曲的表演艺术，与西方戏剧表演艺术的根本性区别，是艺术本质与艺术风格的写意性与写实性的区别。“写意是中国古代美学的一个重要命题，在戏曲表演艺术中主要表现为对时间空间限制的突破，以及动作、布景的虚拟。合在一起，就造成了一个与实际的生活形态相去甚远，艺术的韵律随着心意流荡的天地――当然，不会是一个逼真的幻境。”[2]

在写意的美学原则影响下，淮剧旦角的表演艺术与所有中国戏曲的所有行当的表演艺术一样，都以虚拟化、夸张化、程式化、歌舞化为主要艺术特性。

从本质上而言，写意特性就是民族特性的具体体现与张扬。而民族特性又是世界上所有国家、所有民族的所有艺术的生命与灵魂。19世纪俄国著名作家赫尔岑指出：“诗人和艺术家们在他们的真正的作品中总是充满民族性的。”[3]民族文化是一个民族的精神支柱和血脉，是民族思想的坚实根基。因此，淮剧旦角表演艺术，要从这一思想高度来认知并体现写意特性的神髓，要为弘扬民族文化而写意，而不是只为写意而写意。戏曲特性的实质就是民族特性。

二、剧种特性

淮剧旦角表演艺术的第二大特性，是剧种特性。

淮剧旦角表演，必须以淮剧本身的剧种特性为其题中应有之义。淮剧作为我国地方戏曲剧种之一，“旧称‘淮海小戏’‘小戏’……（南派）就其声腔的构建而言，它是沿着【自由调】曲牌为主体加以延伸拓展，音乐语调又夹在江、浙一带某些吴语语系的漩涡之中，故南派淮剧的音调多有富丽雕饰、精工细密的格调。北派是江苏盐阜、清、淮、宝及里下河广阔地带淮剧赖以生存的土家风派。北派淮剧土俗意味浓郁，其声腔多半是在【淮调】【拉调】曲牌的传统音乐框架上作衍变，这就为此派淮剧的音调奠定了充满田园野态、自然飘逸的情趣。淮剧始于清末，以地摊形式演出，后逐渐发展为舞台剧。曲调质朴优美，以‘拉魂腔’见长。伴奏乐器以板制三弦为主，因而俗称‘三拨子’。剧目以反映民间生活的小戏为多，传统戏有《打金枝》《孟丽君》《白虎堂》等。”[4]后来又编演大量现代戏，并创造出【十里好风光】等新曲调。

从本质上说，剧种特性就是地域特性，而地域文化则是民族文化的重要组成部分，地域文化特性愈鲜明，民族文化特性也就愈浓郁。正因为如此，鲁迅先生指出：“有地方色彩的，倒容易成为世界的，即为别国所注意。打出世界上去，即于中国之活动有利。”[5]中国文学史与艺术史上成功的精品与经典作品，无一不以鲜明的地域文化特色取胜，《诗经》的黄河文化、《楚辞》的荆楚文化、《红楼梦》的京味儿、《金瓶梅》的鲁味儿、老舍作品的京派文化、鲁迅作品的海派文化……如此等等，不胜枚举。

同样，所有的中国地方戏曲剧种，无一不以各自独有的地域文化特性为统领，例如川剧的川文化特性、晋剧的晋文化特性、豫剧的豫文化特性、闽剧的闽文化特性、湘剧的湘文化特性、桂剧的桂文化特性、滇剧的滇文化特性、吉剧的吉文化特性、越剧的越文化特性、赣剧的赣文化特性……如此等等，俯拾即是。

因此，淮剧旦角表演艺术，必须全力张扬淮剧的地域文化特性，凸显本剧种独有的艺术特性。

三、人物特性

淮剧旦角表演艺术的第三大特性，是人物特性。

淮剧旦角主要包括青衣、花旦两个行当。青衣扮演庄重的中青年女性人物，重唱功，又称“正旦”;花旦扮演天真活泼或放浪泼辣的青年妇女，重做功与念白。此外，还有刀马旦、武旦等。有些剧种，又将花旦细分为闺门旦、玩笑旦、刺杀旦、泼辣旦等等。

但是，所有这些行当分工，都不能形成类型化。淮剧旦角表演的“最高任务”，是在舞台上塑造出生动鲜活、个性鲜明的人物形象，是“演人不演行”，行当与各种功法（主要是唱、念、做、打“四功”与手、眼、身、法、步“五法”）只是手段而非目的。因此，衡量一个演员的艺术水准，主要看他创造舞台角色――人物形象的艺术能力。

在创造舞台人物形象时，重点是刻画人物独特的性格与特有的思想感情，做到倾情投入，做到以情带声、声情并茂，做到以情动人、以情感人。

有人说，“戏曲表演重形式轻体验”，其实这是一种误解与误判。中国戏曲表演从来都十分重视情感体验，梅兰芳大师说：“有人说，我在揪赵高胡子的时候，脸上好像笑又好像哭，问我是怎么表演出来的。我在台上演戏，无法看见那时候自己脸上的表情，这可能是因为我心里交织着两种极端矛盾的感情，一方面想用装疯逃避这险恶的环境;同时，把父亲硬叫成‘儿子’也是极不愿意做的事情，所以不自觉地流露出这种似笑似哭的感情来。”[6]

当然，戏曲表演还要做到体验与表现的有机统一，完美结合，不仅要体验人物的内心世界，而且还要创造出特定的外形予以表现，做到内部（心理）动作与外部（形体）动作的一体化。也就是说，要以人物情感统领各种舞台动作，将人物演活、演生动，演出特性来，演出彩儿来。

当然，要做到这一点，绝非轻而易举之事，必须刻苦钻研角色，真正进入到角色的内心世界。还要苦练基本功，以精湛的技艺和才艺作为塑造舞台人物形象的艺术凭借和智力支撑。

综上所述，淮剧旦角表演艺术的特性，以戏曲特性、剧种特性、人物特性三大特性为重中之重，而这三大特性又是互相渗透、互相影响、互相促进的三维互动的，是相辅相成、相得益彰的。

参考文献：

[1]程砚秋.程砚秋文集[M].北京：中国戏剧出版社，1959.38.

[2]余秋雨.戏剧理论史稿[M].上海：上海文艺出版社，1983.653.

[3]赫尔岑.往事与沉思[A].赫尔岑论文学[C].上海：上海文艺出版社，1962.27.

[4]上海艺术研究所等.中国戏曲曲艺词典[M].上海：上海辞书出版社，1981.186.

三角形的特性范文第4篇

一、研究介绍

笔者随机选取了数所幼儿园大、中、小班各年龄段的幼儿作为研究对象。在幼儿表演、教师单纯讲课、师幼互动、幼儿自主活动时，研究者若发现研究对象有干扰他人、交头接耳、做小动作、呆坐、东张西望、出怪声、走动等注意力分散行为时，就立即进行详细记录，包括行为发生的背景、发生的原因、行为的变化、行为的终止与结果等。

二、研究结果与分析

1.幼儿注意力分散的行为表现

调查数据显示，幼儿注意力分散的行为表现是多种多样的，其中，做小动作是幼儿最容易出现的注意力分散类型，大多数幼儿在课堂上都有玩衣服上的纽扣、带有彩灯的鞋等小动作。这表明，幼儿注意力集中的程度很低。观察中还发现，当幼儿出现注意力分散行为时，邻座的幼儿很容易受其影响。如有幼儿带来了卡通贴画，邻座的幼儿就可能和他一起看贴画、分贴画、抢贴画、贴贴画。

2.幼儿在什么样的活动中容易注意力分散

调查显示，幼儿在进行师幼互动时最容易注意力分散。教师在提问时，有的幼儿在拉其他幼儿的衣服，跟其他幼儿说话；在朗读环节，有的幼儿东张西望，有的幼儿在翻看其他页。幼儿自主阅读和教师单纯讲授的过程中，幼儿出现注意力分散的次数也较多，主要表现为呆坐和干扰他人。在幼儿上台表演期间，留在座位上的幼儿容易注意力分散。

3.教师对幼儿注意力分散行为的处理

幼儿出现注意力分散行为之后，不同老师的关注程度及采取的办法不尽相同。从统计图可以看出，幼儿出现注意力分散行为后多依靠自主恢复，也就是幼儿自己玩一会儿之后会觉得没意思了，便会停止注意力分散行为。相对而言，教师主动引导的比例不高，部分教师看到幼儿出现溜号时甚至不予理睬。

4.幼儿注意力分散行为的性别差异

研究表明，在出现注意力分散行为的孩子中，男孩的比例（占55.9%）要比女孩的比例（占44.1%）高。据观察显示，男孩的注意力分散行为多表现为左顾右盼和干扰他人，而女孩则表现为做小动作和呆坐。

三、教育建议

幼儿时期是注意力发展的敏感时期。教师应结合幼儿不同年龄段的特点，在实施各种活动时，科学设计活动，注重教学策略，使幼儿注意力能够集中。

1.把握教学时间，延长幼儿有意注意的时长

小班幼儿一般只能稳定地集中注意力3～5分钟，中班幼儿可达10分钟，大班幼儿可达15分钟。幼儿教师应根据幼儿不同的年龄段，把握好教学时间，注重教学效率。

2.教师应给予每个幼儿足够的关注

观察中发现，那些坐在角落或者位置靠边的幼儿出现注意力分散的情况最多。教师应对这些幼儿给予较多的关注，并加以引导。同时，教师要关注晨检环节，对幼儿自带新奇小玩具、小卡片、小亮片等行为加以限制，必要时可代为保管这些物品。这样，可避免幼儿受到物品的干扰和刺激而导致注意力分散，也可适当减少安全隐患。

3.善于抛出问题，获得积极回应

教师应以参与者的身份，努力为幼儿营造一个有趣、轻松的课堂环境。在各类的活动中，教师要避免直接给幼儿提供正确的答案，应增强活动的趣味性，善于创设问题情境，多采用提问的形式，鼓励幼儿假设与猜想，让幼儿自主选择，积极融入活动之中。

4.避免过多地打扰幼儿

在幼儿集中注意力从事某项有意义的活动时，教师应注意调整自己的言行举止，避免打扰幼儿，分散他们的注意力。如幼儿集中注意力画画时，教师应给予幼儿足够的空间和时间，让他们自主地去想象、探究、发现，而不能过多地边走边讲或干涉某个幼儿，影响他们的思路。

5.科学提供对幼儿有意义、使幼儿感兴趣的材料

教师为幼儿提供适宜、适量、美观、隐含教育价值的材料，可以让他们通过操作材料获得情感、认知和技能等方面的发展，但材料的投放应注意其中的教育因素。比如，在建构活动中，如果投放的材料太少，孩子不仅不能满足完整拼搭某种物体的愿望，还可能因为担心自己仅有的积木被别人抢去，而把注意力转移到如何保护自己的材料上。而如果投放的材料太多，则会让孩子们无所适从，他们一会儿玩玩这个，一会儿碰碰那个，根本无法注意力集中地进行某项工作。一般而言，幼儿年龄越小，投放的活动材料的品种应越少，但单类材料的数量应适当多一些；材料需周期性地加以丰富和更新；准备的材料给予孩子创造的空间越大，孩子玩的兴趣就越大，注意力也就越集中。

6.教师在讲课时应注意音调的变化和音量的调节

教师在活动组织的环节中，应避免出现平淡、无变化的语音、语调，因为单调的声音容易使人昏昏欲睡。为此，在进行讲述时，教师可结合讲述内容不断变化语音、语调，甚至可以模仿各种小动物的声音，并加上肢体动作，生动有趣地组织活动，吸引幼儿积极参与。

三角形的特性范文第5篇

【摘要】

目的：比较三种不同荧光标记的短双链RNA(siRNA)体外转染特性. 方法：利用脂质体LipofectamieTM2000转染三种荧光标记siRNA入小鼠胚胎成纤维细胞系NIH 3T3，流式细胞仪观察转染效率，普通倒置荧光显微镜观察其淬灭情况，激光共聚焦显微镜观察其在细胞内的分布情况. 结果：相同转染条件下三种荧光siRNA进入细胞的速度，细胞内的定位不同，转染效率不同，三种荧光标记的抗淬灭能力也不同. 结论：荧光标记siRNA可以起到良好的示踪作用. 用荧光标记siRNA作为无荧光siRNA的分布和转染效率参照时，要考虑到所选用荧光标记siRNA与无荧光标记siRNA的差异.

【关键词】 荧光标记；siRNA；转染

【Abstract】 AIM: To compare the transfection character of three different fluorescently labeled small interfering RNA (siRNA) in vitro. METHODS: Three fluorescently labeled siRNA were transfected with LipofectamieTM2000 into NIH 3T3 cells for monitoring their transfection efficiency with flow cytometry， tracking their delivery with confocal microscopy and checking their photostability with fluorescent microscope. RESULTS: These three fluorescently labeled siRNA varied in intracellular distribution， transfection efficiency and quench speed. CONCLUSION: The fluorescence labeled siRNA helps to tracking the delivery of siRNA in cells. The difference between fluorescently labeled siRNA and unlabeled siRNA should be considered when the fluorescently labeled siRNA is used to study the distribution and transfection efficiency of siRNA.

【Keywords】 fluorescence label；small interfering RNA；transfection

0 引言

化学合成的siRNA可以高效特异地抑制靶基因的表达，不仅是分析基因功能的有力工具且有望成为新型药物［1］，但递送效率低和体内有效性问题仍然是其应用的瓶颈，因此，深入研究其在体内的分布和动力学过程已逐步受到重视［2］. 利用荧光显微镜、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等方法检测荧光标记siRNA［3］，观察其摄取、分布及代谢情况，借以推断无荧光标记siRNA的转染效率和分布. 然而目前虽有多种商品化无沉默效应的荧光标记siRNA可供选择，但它们的分布和转染效率是否一致尚少见报道. 本研究比较三种常用荧光标记siRNA利用脂质体转染时转染效率、荧光淬灭情况和细胞内分布特点，以探讨应用荧光标记siRNA时需注意的问题.

1 材料和方法

1.1 材料

三种荧光siRNA分别为：BLOCKiTTM荧光寡聚物(序列未公开)购自Invitrogen公司；FAM notarget siRNA(正义链5′UUCUCCGAACGUGUCACGU3′，FAM标记于5′端)购自广州锐博公司；Alexa Fluor 546阴性对照siRNA(靶序列 5′AATTCTCCGAACGTGTCACGT3′，正义链3′端3标记Alexa Fluor 546)购自Qiagen公司. 前两种为即用型，后一种按照说明书方法加入退火缓冲液，90℃变性并退火，分装后避光保存于-20℃. 三种荧光siRNA的储备液浓度均为20 μmol/L. 小鼠胚胎纤维细胞系NIH3T3由中山大学实验动物中心细胞库冻存；高糖DMEM培养基和DPBS购自Gibco BRL公司；胎牛血清购自杭州四季青工程材料研究所；脂质体LipofectamineTM 2000，OptiMEM低血清培养基购自Invitrogen公司；Hochest33342购自美国Sigma公司，其他生化试剂均为进口或国产分析纯试剂.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染

NIH3T3细胞常规培养于含100 mL/L胎牛血清无抗生素高糖DMEM培养基，每孔4×104个细胞接种24孔板，24 h后细胞的汇合度达40％. 用LipofectamineTM 2000转染荧光siRNA，按照说明书操作进行. 不同浓度转染效率时siRNA各组终浓度分别为0.5，5，40，120 nmol/L，LipofectamineTM 2000均为1 μL. siRNA进入细胞速度时转染复合物孵育时间分别为1，2，4，6和24 h，siRNA浓度均为40 nmol/L，每组不同时间重复3次；观察淬灭情况和共聚焦观察细胞内分布时采用40 nmol/L，观察时间为4 h.

1.2.2 流式细胞仪检测

荧光siRNA转染效率各组细胞用DPBS冲洗2次，0.25 g/L胰蛋白酶消化，用DPBS制成150 μL单细胞悬液，冰上运输，BD FACSAria流式细胞仪检测，CellQuest软件记录分析.

1.2.3 普通荧光显微镜观察淬灭情况和细胞内分布模式

转染后6 h后将24孔板直接置于倒置荧光显微镜(Leica DMIRE)载物台上观察，cold CCD数码相机Leica Qwin软件照相. 拍第一张照片时间记为0 min，分别于3 min和5 min后不改动成像参数同一位置再拍摄两张，观察荧光淬灭情况.

1.2.4 激光共聚焦显微镜观察［4］细胞铺板时24孔板中放灭菌圆形盖玻片，转染后6 h培养液中加入Hoechst 33342(终浓度5 mg/L)孵育10 min染核，用DPBS洗3遍后，取出爬片，-20℃预冷丙酮固定10 min，PBS洗3遍，抗淬灭水性封片剂封片. Zeiss LSM 510 META共聚焦显微镜40倍物镜下观察，BLOCKiTTM荧光寡聚物和FAM notarget siRNA使用488 nm激发光和515～540 nm滤片检测；Alexa Fluor 546阴性对照siRNA使用568 nm激发光和575～640 nm检测滤片.

统计学处理： 采用SPSS 13. 0统计软件处理，χ2分析转染效率差异，P

2 结果

2.1 FCM检测荧光siRNA转染效率

每一样品收集2×104个细胞，设定一个单细胞区域P1用于荧光分析. 以未转染的细胞作为空白对照，设定阳性细胞区(P2区)使阴性对照P区细胞数不超过0.1%(图1A). 40 nmol/L siRNA转染4 h时转染效率Alexa Fluor 546阴性对照siRNA的转染效率为(62.7±2.4)%， BLOCKiTTM荧光寡聚物的转染效率为(85.1±5.2)%， FAM notarget siRNA的转染效率为(69.4±3.6)%. χ2分析示Alexa Fluor 546阴性对照siRNA的转染效率显著低于BLOCKiTTM荧光寡聚物(P=0.037)，BLOCKiTTM荧光寡聚物的转染效率显著高于FAM notarget siRNA的转染效率(P=0.017)，Alexa Fluor 546阴性对照siRNA的转染效率低于FAM notarget siRNA BLOCKiTTM荧光寡聚物(P=0.000). 随着siRNA浓度增加(图1B)和转染复合物孵育时间延长(图1C)，三种荧光标记siRNA的转染效率增加， 6 h和24 h转染效率相差不大， 唯FAM notarget siRNA 24 h转染效率为(59.3±2.5)%. BLOCKiTTM荧光寡聚物在0.5 nmol/L和5 nmol/L浓度时，转染效率就达FAMsiRNA (27.9±2.5)%和(77.3±3.7)%，孵育1 h和2 h转染效率达(54.1±4.9)%和(78.2±3.6)%，高于其它两种(P=0.000).

2.2 普通荧光显微镜观察淬灭情况和细胞内分布模式

三种荧光siRNA在普通荧光显微镜下的荧光模式不同. Alexa Fluor 546阴性对照siRNA倾向于以较大颗粒分布在核周胞浆内(图2A， B， C， D)；BLOCKiTTM荧光寡聚物胞浆、胞核中都有，在胞核中的荧光强度很高(图2E， F， G， H)；FAM notarget siRNA为细小点状荧光信号，分布于胞浆和胞核中(图2I， J， K， L). 用荧光显微镜照射3 min(图2C， G， K)和5 min(图2D， H， L)发现Alexa Fluor 546阴性对照siRNA抗淬灭能力最高，BLOCKiTTM荧光寡聚物居中，FAM notarget siRNA最低，3 min已几乎完全淬灭. BLOCKiTTM荧光寡聚物胞浆中的荧光信号先淬灭，而后是胞核中的. 无siRNA只加LipofectamineTM 2000转染试剂的细胞未见荧光(结果未显示).

2.3 激光共聚焦显微镜观察三种荧光siRNA细胞内定位40 nmol/L各种siRNA转染后4 h，Alexa Fluor 546阴性对照siRNA为点状的荧光，多数位于近核胞浆中(图3A，D)；BLOCKiTTM荧光寡聚物(图3B，E)和FAM notarget siRNA(图3C，F)的模式相似，在核内和胞浆中都可见，部分呈荧光颗粒.

3　讨论

脂质体转染是体外导入化学合成siRNA的标准方法，siRNA体外转染实验报道中使用最多的转染试剂是LipofectamineTM 2000，对许多细胞可以获得很高的转染效率和基因沉默效率［3］，所以本研究也选用该试剂作为转染试剂比较三种荧光标记siRNA的体外转染特性.

本实验发现在相同的转染条件下，三种荧光siRNA的转染效率不同；BLOCKiTTM荧光寡聚物更易进入细胞，原因可能因为它的核糖骨架经过磷硫酰化修饰［5］，所以其进入细胞的速度明显增加. 转染6 h和24 h的效率相差不大，可见LipofectamineTM 2000推荐4 h和6 h更换转染复合物比较合理，但注意到Alexa Fluor 546阴性对照siRNA 4 h和6 h的转染效率相差仍比较明显，所以6 h更换转染复合物更加合适. FAM notarget siRNA 24 h转染效率降低为59.3%，原因可能是荧光素淬灭而非转染效率低.

关于淬灭情况：标记siRNA的荧光物质有许多种，最早有荧光素(fluorescein，FAM)，后来的藻红素(cy系列)，alexa系列的荧光稳定性和可选择波长更进了一步. 本研究三种荧光siRNA中荧光素FAM notarget siRNA采用的是FAM标记，BLOCKiTTM荧光寡聚物采用的FITC，似乎都为荧光素，但后者经磷硫酰化修饰，稳定性增强，所以其抗淬灭能力也有所增强. Alexa Fluor 546阴性对照siRNA采用的是Alexa fluor546，其中Alexa fluor546标记的siRNA的抗淬灭能力最强.

关于细胞内的定位：脂质体转染情况下，siRNA脂质体复合物首先沉积并粘附于细胞表面，然后通过胞吞作用进入细胞形成内含体，在胞浆中通过动力蛋白驱动定向运送到核周区，并迅速在核周区聚集［6］， 最后siRNA从脂质体复合物中释放出来才能发挥作用. 本研究中用共聚焦显微镜观察发现Alexa Fluor 546阴性对照siRNA几乎只以颗粒状分布于近核胞浆中，与Chiu等［3］报道的用LipofectamineTM 2000转染cy3标记的siRNA结果一致，而BLOCKiTTM荧光寡聚物和FAM notarget siRNA在核内和胞浆中都有，在胞浆中核周区可见大的荧光颗粒. 其中BLOCKiTTM荧光寡聚物的核定位考虑与其磷硫酰化修饰有关，而FAM notarget siRNA为正义链5′标记，其核定位可能为与其复合物中混合有单链siRNA有关. Ohrt等［7］显微注射荧光标记的siRNA入Hela细胞的胞浆中，发现双链siRNA不能进入细胞核，而单链siRNA有明显聚集于核内的倾向. 而Alexa Fluor 546阴性对照siRNA未于见核中可能因为siRNA还未从脂质体复合物中释放. 而siRNA从复合物中释放是与基因沉默效果相关的，是否说明荧光标记影响基因沉默效果还有待分析.

综上所述，选取合适的荧光标记siRNA作为转染效率评估指标和用于细胞内分布研究时，要注意荧光标记物对siRNA的影响，以及靶向目的基因的siRNA与所选用荧光标记的对照siRNA在化学修饰等因素方面的相似性.

参考文献

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