蛋白酶体

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蛋白酶体范文第1篇

【关键词】 类风湿关节炎；20S蛋白酶体；泛素-蛋白酶体途径；炎症

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis ，RA）是一种以对称性、侵蚀性关节滑膜炎为特征的慢性、系统性自身免疫疾病， 炎症为RA发病机制的中心环节。泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway ， UPP）是真核细胞内重要的非溶酶体蛋白降解途径， 20S蛋白酶体是UPP中具有蛋白酶催化活性的核心颗粒。UPP通过调控多种炎症调节蛋白， 在炎症过程中发挥着重要作用[1]。研究显示RA患者血清蛋白酶体及其自身抗体浓度升高， 蛋白酶体抑制剂可缓解关节炎大鼠病情进展[2]， 提示蛋白酶体参与了RA的发生、发展。关节滑膜中炎症浸润细胞主要来源于外周血细胞[3]， 循环单核细胞在RA发病机制中具重要作用[4，5]。RA患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMC）是否存在蛋白酶体表达及功能异常目前尚未见报道， 本课题通过检测RA患者20S蛋白酶体蛋白表达水平， 对该问题进行了初步探讨。

1 研究对象与方法

1. 1 研究对象 临床确诊的RA患者30例， 来自西安交通大学第一附属医院风湿科住院患者， RA诊断参照1987年美国风湿病协会分类诊断标准。健康对照28例， 来自西安交通大学第一附属医院体检中心健康体检人员， 排除自身免疫病性疾病。两组研究对象均排除心、脑、肝、肾疾病；急、慢性感染；恶性肿瘤等疾病。

1. 2 研究方法

1. 2. 1 一般临床资料 记录所有研究对象性别、年龄， RA患者记录病程， 检测类风湿因子、C-反应蛋白（C-reactive protein， CRP）、红细胞沉降率（ehythrocyte sedimention rate， ESR）、自身抗体， 计算发病时的疾病活动性评分DAS28。

1. 2. 2 PBMC的分离与纯化 取受试者空腹外周静脉血5 ml， 加肝素钠抗凝（3.8 μl/ml）。采用淋巴细胞分离液（上海华精）密度梯度法分离PBMC。

1. 2. 3 20S蛋白酶体C2亚基蛋白表达测定 采用Western印迹法测定PBMC中20S蛋白酶体C2亚基蛋白表达水平。RIPA裂解液裂解PBMC， 吸取上清液获细胞蛋白裂解液。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 电转印至NC膜。5%BSA封闭液， 37℃封闭NC膜1 h。分别加入稀释的一抗：proteasome 20S C2 Rabbit Ab （1：1000， Abcam）， Rabbit Anti-β-actin（1：400， 北京博奥森）， 4℃过夜。TBST洗膜5 min×3次， 加入稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1：8000， 北京博奥森）， 37℃孵育2 h。TBST洗膜5 min×3次。等比例混合ECL发光液（Pierce Biotechnology）， NC膜孵育5 min， 曝光， 凝胶成像分析系统成像保存。所得图像导入Quantity One生物医学图像分析系统进行图像分析处理， 蛋白含量以条带的积分光密度值表示。目的条带和内参照β-actin条带IOD值的比值为目的片段的光密度比值， 表示检测蛋白的相对表达量。

1. 2. 4 统计学方法 计量资料以均数 ± 标准差（ x-±s）表示， 正态分布资料两组间差异采用独立样本 t检验， 两变量相关分析采用Pearson相关分析。非正态分布资料采用秩和检验， 两变量相关分析采用Spearman秩相关分析。所有数据处理采用SPSS 16.0统计软件， P

2 结果

2. 1 一般临床资料 RA患者30例（男性3例， 女性27例）， 年龄 （46.67±11.97）岁， 病程（6.96±3.65）年， ESR （50.55±35.02）mm/h， CRP （27.82±23.10 ）mg/L， RF （90.72±74.60 ）IU/ml， DAS28评分（4.89±1.60）。健康对照30例（男性5例， 女性23例）， 年龄 （41.04±11.17）岁。RA与正常对照之间年龄差异无统计学意义。

2. 2 20S蛋白酶体C2亚基蛋白表达 20S蛋白酶体C2亚基蛋白表达水平用Western-Blot灰度值表示（图1）。RA患者PBMC中20S蛋白酶体C2亚基表达水平高于正常对照组[（2.92±1.41） VS （0.65±0.42）， P

2. 3 相关性分析 分别对RA患者20S蛋白酶体C2亚基表达与DAS28、CRP、ERS指标进行相关性分析， 结果显示RA患者蛋白酶体C2亚基表达水平与DAS28、CRP、ERS之间无显著相关性。

3 讨论

UPP是真核生物细胞中一种高效的蛋白分解途径， 具广泛的生物学作用。蛋白酶体是依赖ATP的蛋白水解酶复合物， 是真核细胞中分解内源性蛋白质的主要酶系统， 也是UPP的核心部分。蛋白酶体由20S蛋白酶体和调节颗粒组成， 主要降解一些短寿命的蛋白、变性蛋白、癌基因产物蛋白等， 对维持细胞稳态和生物学效应起到了重要作用， 也参与了免疫炎症反应的调节[1]。

UPP与疾病关系的探讨是目前研究的热点， 其功能异常与多种人类疾病相关， 包括自身免疫病和炎症[6]。研究发现， 在系统性红斑狼疮（SLE）、原发性干燥综合症（PSS）、强直性脊柱炎（AS）、类风湿性关节炎（RA）、多发性肌炎/皮肌炎（PM/DM）等多种结缔组织病中存在着蛋白酶体的异常[7， 8]。上述研究主要集中在血清蛋白酶体或其抗体的检测。

RA关节滑膜中炎症浸润细胞主要来源于外周血白细胞， PBMC可反映整体的炎症状态[9]， 而UPP通过调控多种炎症调节蛋白在炎症过程中发挥着重要作用。因此， 观察RA患者PBMC中蛋白酶体的变化对于探讨蛋白酶体在RA 发病机制的作用具有重要意义。本研究首次发现RA患者PBMC中20S蛋白酶体C2亚基表达水平显著高于正常人群， 具统计学差异。该结果进一步证实了蛋白酶体与RA的发生具有密切联系， 但其在RA发病机制中的具体作用还有待进一步研究。

随着对UPP病理生理作用的深入研究， 蛋白酶体抑制剂的临床应用和开发受到日益重视。蛋白酶体抑制剂bortezomib已经用于对多发性骨髓瘤的临床治疗， 并显示了其有效性。基于蛋白酶体抑制剂强大的抗炎、抑制细胞增殖及促进凋亡的作用， 有学者提出其在RA等炎性疾病的治疗中具有良好的应用前景[2， 5]。体外和动物实验证实蛋白酶体抑制剂可抑制活化的T细胞释放炎症因子[10]缓解关节炎大鼠的病情进展[2]， 但是否可真正应用于临床患者还需要大量的研究。本研究为应用蛋白酶体抑制剂治疗RA提供了一定的理论依据。

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蛋白酶体范文第2篇

[关键词]Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶；多配体蛋白聚糖；损伤愈合；牙周组织

[中图分类号]Q 51[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.01.027

Role of syndecan -4 and a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif -1 in wound healingQin Yanyan, Wang Dan, Lin Chongtao.（Dept. of Periodontics, Hospital of Stomatology, Jilin University, Changchun 130021, China）

[Abstract]Syndecan-4, a newly discovered peptide, which distributes in many tissues, mediates a variety of physiological responses. A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif-1（ADAMTS-1）, a novel metalloproteinase, is widely expressed in mammals and invertebrates cells. ADAMTS-1 plays a key role in physiology and pathology process such as maintaining coagulation system steady, organ formation, inflammation, reproduction. Many studies have shown that syndecan-4 and ADAMTS-1 are involved in the wound healing, and found that ADAMTS-1 is uniquely cleave the transmembrane proteoglycan syndecan-4. This review is about the structure, properties of the syndecan-4 and ADAMTS-1, and the role of them in wound healing. The purpose is to provide a theoretical basis for periodontal regeneration.

[Key words]a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif；syndecan；wound healing；periodontal tissue

组织的损伤愈合，伴随着基质的合成和降解。组织损伤之后，局部释放的大量的多配体蛋白聚糖，调控着细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）、细胞与细胞间的信号交流，介导成纤维细胞的增殖和迁移，促进伤口愈合[1]。降解ECM的蛋白酶在组织的损伤愈合过程中也起着关键性的作用。迄今为止，多配体蛋白聚糖-4和Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif，ADAMTS）-1在创伤愈合过程中的作用备受关注。

1多配体蛋白聚糖

1.1多配体聚糖家族的结构和性质

多配体蛋白聚糖与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPG）属同一家族成员，亦由核心蛋白和糖胺聚糖侧链组成。多配体蛋白聚糖属于跨膜蛋白聚糖，其核心蛋白由N-末端的胞外区以及C-末端的胞内区和跨膜区组成。N-末端的胞外区除与葡糖氨链、硫酸软骨素和硫酸肝素连接之外，还可以与碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）或者其他生长因子相结合，从而活化细胞表面的HSPG，促进细胞的分裂增生。C-末端的胞内区和跨膜区含有4个酪氨酸残端，这些是磷酸化位点。多配体蛋白聚糖的胞外区是其功能结构区，易变化，而胞内区和跨膜区高度保守。胞内区主要与细胞骨架中含肌动蛋白的微丝结合，参与细胞的移动和黏附过程[2]。多配体蛋白聚糖家族有1～4个成员，多配体蛋白聚糖-4分布广泛，而多配体蛋白聚糖-1、2、3分别主要分布于上皮细胞、成纤维细胞和神经细胞[3]。

多配体蛋白聚糖通过硫酸肝素链（heparan sulfate，HS）与多种细胞外配体相互作用，如多肽生长因子、ECM和蛋白质水解酶等[4]。HS可为多配体蛋白聚糖与细胞外配体结合提供多个结合位点[5]，故通过HS，多配体蛋白聚糖可直接参与多种生理过程。

多配体蛋白聚糖在近质膜区有一酶切位点，在ECM酶的作用下使胞外区从细胞表面脱落[6]。胞外区的脱落是所有多配体蛋白聚糖正常生理活动的一部分。组织损伤后，上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞内多配体蛋白聚糖表达增加[7]。在组织损伤液中，多配体蛋白聚糖的胞外区脱落量增加[8]。敲除多配体蛋白聚糖基因的小鼠，其伤口不愈合或延迟[9]。由此可见，多配体蛋白聚糖在创伤愈合过程中起着非常重要的作用。

1.2多配体蛋白聚糖-4的结构和性质

多配体蛋白聚糖-4是一种跨膜蛋白聚糖，属于多配体蛋白聚糖家族成员，广泛存在于多系统组织细胞中，调控着多种生物学效应，在细胞表面的信号转导系统和控制细胞行为方面都起着重要的作用。譬如，在细胞与细胞间的相互作用、细胞与基质间的相互作用以及细胞支持、黏附、增殖、迁移、分化和形态形成方面皆起着重要的作用。左琦等[10]发现，多配体蛋白聚糖-4的表达在炎症反应、创伤愈合以及多种疾病状态中可出现变化。

1.2.1多配体蛋白聚糖-4的结构多配体蛋白聚糖-4为4个独立基因编码的具有组织特异性分布的Ⅰ型整合膜蛋白，相对分子质量约为2.4×104，含197个氨基酸序列，由一条长的无分支的糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）链与核心蛋白通过共价键连接。多配体蛋白聚糖-4为单链结构，由一个N-末端功能区，疏水的跨膜区和短的细胞内的C-末端构成。

1.2.1.1多配体蛋白聚糖-4的细胞外功能区多配体蛋白聚糖-4的N-末端为细胞外功能区，是 GAG附着处，可与多种胞外基质配体结合。多配体蛋白聚糖-4不仅能够和许多潜在的配体，包括生长因子和ECM等相互作用，其核心蛋白还可直接参与蛋白质-蛋白质之间相互作用。

1.2.1.2多配体蛋白聚糖-4的跨膜区和胞内区多配体蛋白聚糖-4的跨膜区与其他多配体蛋白聚糖相似且高度保守，可与其他的胞膜组分相互作用，特异性地参与细胞的二聚化作用。多配体蛋白聚糖-4的胞内区短而且序列固定，可以分为近膜区域（C1区）、远膜区（C2区）和可变区（Ⅴ区）。其中，C1区与多配体蛋白聚糖-4的二聚化作用与细胞内蛋白质的结合有关。C2区可与突触后密集区-95/盘大蛋白/密闭小带-1（postsynaptic density-95/disc large protein/zonula occluden-1，PDZ）结构域相互作用。位于C1区与C2区之间的Ⅴ区则有高度的特异性，可特异性地结合磷脂酰肌醇磷酸-2和蛋白激酶C，对其参与的寡聚化作用有着重要的影响[10-12]。

1.2.2多配体蛋白聚糖-4的性质在损伤组织中，成纤维细胞和内皮细胞高度表达多配体蛋白聚糖-4和1，伤口渗出液中也存在着这两种分子的可溶性胞外成分。多配体蛋白聚糖-4和1可作为诸多细胞因子的结合位点，对伤口修复进行调控。其中，多配体蛋白聚糖-4作用更突出，多配体蛋白聚糖-4通过GAG与纤连蛋白的肝素结合点相互作用，影响黏附于纤连蛋白上的成纤维细胞的迁移和基质的沉着，促成纤维细胞反应最优化，有利于伤口愈合更佳[1，13]。

当组织修复发生变异时，多配体蛋白聚糖家族表达常发生改变。不表达多配体蛋白聚糖-4鼠出现愈合受损。在瘢痕组织中，多配体蛋白聚糖-4的表达高于其周围正常皮肤组织。多配体蛋白聚糖-1表达缺失或减少，可能使细胞的生长和分化发生紊乱，导致成纤维细胞大量增殖[1]。

2ADAMTS-1

2.1ADAMTS-1家族

ADAMTS-1是一类新的锌离子依赖性的金属蛋白酶家族，广泛地存在于哺乳动物和无脊椎动物身体之内。ADAMTS家族共有19个成员，在保持凝血系统的稳态、器官生成、炎症和生育能力方面起着重要的作用。ADAMTS与基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、Ⅰ型解聚蛋白和金属蛋白酶（a disintegrin and metalloprotei-nase，ADAM）同属金属蛋白酶家族，但在结构组成、组织细胞分布、底物作用的特异性和酶活性的调节方面，三者间有明显的差别[14]。

2.2ADAMTS-1的结构和性质

ADAMTS-1定位于人类染色体21q21～q22，其功能蛋白包括前金属蛋白酶、金属蛋白酶、解聚蛋白样结构域以及血小板反应蛋白（thrombospondin，TSP）-Ⅰ同源域、间隔区和C-末端TSP亚基。ADAMTS-1是ADAMTS金属蛋白酶家族的第一个成员，与家族其他蛋白一样具有血小板反应蛋白基序，能与ECM结合，因此ADAMTS-1可分泌到ECM中并与之结合，从而参与ECM蛋白的调节[15]。ADAMTS-1的表达受诸因素影响：致炎细胞因子肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和内毒素均可诱导其表达，转化生长因子-2β则可下调其表达[14]。

ADAMTS-1与HS结合之后加速肿瘤转移[16]。Krampert等[17]在研究中发现：在损伤的皮肤组织中，ADAMTS-1的质量浓度增高；ADAMTS-1在损伤愈合的早期由巨噬细胞分泌，后期由成纤维细胞和上皮细胞分泌；ADAMTS-1在高质量时与bFGF结合，干扰其信号传递并抑制细胞迁移；在糖尿病小鼠模型损伤组织中，ADAMTS-1的质量浓度增加更加明显，可能与糖尿病患者伤口不易愈合有关。

2.3ADAMTS-1的功能

1）ADAMTS-1为分泌型蛋白：ADAMTS-1可通过降解ECM蛋白，例如多能聚糖、短蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖参与多种生理和病理生理过程；2）ADAMTS-1的抑制血管新生功能：A－DATMS-1可通过抑制血管的生成，参与抑制肿瘤的发生发展；3）DMATS-1的双重功能：在皮肤损伤愈合的过程中，ADMATS-1在低水平时可以通过降解基质蛋白促进内皮和成纤维细胞迁移，其高表达时则结合到成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）-2，抑制内皮细胞和成纤维细胞的迁移[17]。

3多配体蛋白聚糖-4与ADAMTS-1

膜相关的金属蛋白酶与多配体聚糖-1、4的脱落有关[6]，MMP-7和膜型-1-基质金属蛋白酶与多配体聚糖-1的脱落有关[18]。除了MMP，ADAM家族也同样地参与多配体聚糖胞外区的脱落[19]。ADAMTS家族是与多配体聚糖-4胞外区脱落有关的酶，ADAMTS-1特异性地作用于多配体蛋聚糖-4，使其胞外区脱落[20]。这种脱落过程与经激动剂作用脱落的方式相似，可被细胞密度诱导且与细胞密度成正相关。跨膜蛋白胞外区脱落有助于维持ECM的平衡，可提供液态的生理活性因子，诱导细胞行为发生重要变化。

4多配体蛋白聚糖-4与牙周组织

多配体蛋白聚糖是FGF的辅助受体，可令FGF在局部高质量浓度聚集，促进FGF受体二聚化，随后受体的胞内区发生自磷酸化。这个过程将引起信号级联反应，信号传到细胞核激活基因的表达。bFGF生物学效应受多配体蛋白聚糖-4的控制，多配体蛋白聚糖-4的过表达能够加强bFGF的信号传导，而且增强牙周膜细胞（periodontal ligament cell，PDLC）对bFGF的反应，促进其细胞的增殖和迁移[21-22]。

Shimabukuro等[3]发现在含bFGF的人PDLC培养液中，多配体蛋白聚糖-4的质量分数明显增加，细胞表面的多配体蛋白聚糖-4明显减少，多配体蛋白聚糖-4的mRNA无明显变化，多配体蛋白聚糖合成酶的量未增加，多配体蛋白聚糖-1、2、3未出现有意义的变化。他们认为，bFGF促进PDLC的增殖和迁移与多配体蛋白聚糖-4关系密切，且培养液中增多的多配体蛋白聚糖-4是细胞表面脱落造成的，但是其机制尚不清楚。有关ADAMTS-1是否参与了PDLC表面多配体蛋白聚糖-4的脱落，国内外尚未见报道。

5结束语

目前，多配体蛋白聚糖-4和ADAMTS-1的研究方兴未艾，但其在组织损伤修复中的具体功能及相互作用尚不清楚。随着对多配体蛋白聚糖-4和ADAMTS-1研究的进一步深入，把多配体蛋白聚糖-4和ADAMTS-1引入牙周组织的修复再生中，将为探究bFGF促进PDLC增殖和迁移的机制提供新的思路和楔入点。

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蛋白酶体范文第3篇

目的考察中性蛋白复合酶法提取大枣多糖的工艺，并验证大枣多糖的部分药理作用。方法对不同提取方法作对比；以多糖的得率和纯度为指标，对效果较佳的中性蛋白复合酶提法安排正交实验，筛选提取工艺；最后进行动物实验。结果确定中性蛋白复合酶法提取的最佳工艺为：酶液浓度0.15%，pH 7.5，提取温度37℃；大枣多糖的药理实验表明大枣多糖属无毒级，大枣多糖大、中、小剂量对S180小鼠巨噬细胞吞噬率均有不同程度的提高作用。结论中性蛋白复合酶法提取大枣多糖工艺有效可行。

【关键词】 大枣多糖； 中性蛋白复合酶 ； 提取； 药理实验

Abstract：ObjectiveTo study the extraction technology for polysaccharide by compound neutral protease from Ziziphus jujuba， and to test the pharmacological function of the polysaccharide .MethodsDifferent methods of polysaccharide extraction were compared .As for the best method ，the compound neutral protease extraction ， the orthogonal experiments were established to hunt its technology. Finally， the pharmacological experiments were carried out. ResultsThe optimum conditions were to add 0.15% neutral protease on the pH of 7.5 with 37℃. The ultimate pharmacologic experiments about Zizyphus jujuba polysaccharide showed that it had no toxicity and it could elevate the macrophage phagocytosis of S180 tumor mice.ConclusionThe way of the compound neutral protease extraction is effective and reasonable .

Key words：Jujuba polysaccharide; Compound neutral protease ; Extraction; Pharmacology experiment

大枣为鼠李科植物枣Zizyphus jujuba Mill 的成熟果实［1］，营养丰富，是传统的中药，其主要成分有多糖，蛋白质，氨基酸，维生素，生物碱，皂苷及矿物质等［2］。多糖能提高机体的免疫功能，是理想的免疫增强剂，同时对正常细胞没有毒副作用［3］。从大枣中提取多糖及其药理作用研究已有文献报道［4，5］。

传统高温水提法易造成大枣多糖的生物活性降低，而且能耗大；溶剂萃取法则存在溶剂使用成本高，回收困难及产品溶剂残留等问题。大多数含有丰富多糖的植物，细胞粗大且壁厚，使得多糖难以从细胞中扩散出来，采用复合酶协同作用于植物提取过程，可以促进多糖的溶出，过程条件温和，目标产物活性高，极大地提高多糖的提取率以及纯度［6］。

大枣中的蛋白质对大枣多糖的提取分离造成一定的影响，大枣多糖普遍存在于原生质中，而原生质又处于细胞壁和细胞间质的包裹下，鉴于这些特点，若选用含有蛋白酶、纤维素酶、果胶酶的复合酶液来参与反应，就可以减少传质阻力，提高有效成分的提取率。

1 器材与方法

1.1 材料 大枣购于陕北延安市场，选用质地优良的干品粉碎。

1.2 试剂 中性蛋白复合酶液，酶活2 500 u·g-1，酶液中含有少量纤维素酶、淀粉酶，由宁夏夏盛实业集团有限公司提供。

1.3 仪器DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市英峪予华仪器厂；LD4-2低速离心机：北京低速离心机厂；722型可见光分光光度计：上海第三分析仪器厂；HI 98107 酸碱度测试笔：美国哈纳仪器公司；RE-52AA旋转蒸发仪器：上海嘉鹏科技公司；DZF-6020型真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。

1.4 分析方法多糖检测方法为苯酚硫酸法；数据处理法为加权平均法。

2 结果

2.1 不同提取方法的对比因为不同溶剂对大枣实体及其多糖的作用不同，所以用不同溶剂进行提取具有不同的结果。定量称取烘干枣粉20 g，采用添加总质量浓度1%果胶酶复合液（pH为7），纤维素复合酶液（pH为7），中性蛋白复合酶液（pH为7），40℃下提取2 h，共进行两次提取，并以传统水提法为参照，确立最佳提取方法，结果见表1。

表1 不同提取液的提取结果（略）

由提取结果可看出，果胶复合酶，纤维素复合酶参与提取与传统水提相比效果不是很显著，果胶酶得到较好的得率，但纯度反而下降，就是因为果胶酶在水解大枣中果胶质的同时又进而水解掉一部分多糖。而纤维素酶则在水解大枣纤维素使其结构变得松散的同时又直接将大枣中的糖蛋白和蛋白聚糖水解掉，直接导致得率下降。因此在大枣多糖提取中主要应用以上两种酶时并不能达到预期效果。中性蛋白复合酶参与提取效果显著，主要是因为中性蛋白酶对大枣中的游离蛋白质具有水解作用，且目标性强。鉴于上结果，本研究采用中性蛋白复合酶作为大枣多糖的提取剂。

2.2 中性蛋白复合酶最佳提取条件正交实验称取烘干枣粉20 g共9份，按正交设计表条件进行提取，提取液浓缩1∶3，体积分数80%醇沉，低温灭酶后，二次单纯采用去离子水提取2h，得多糖用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，真空干燥。利用正交实验对酶添加量、pH、温度等因素进行考察。实验因素水平见表2，最佳提取条件正交实验结果见表3。由极差结果得，3个因素对大枣多糖中性蛋白复合酶法提取的影响顺序为：B＞C＞A，由实验结果确立主要影响因素参数为B3C2A3，即最佳提取条件为：中性蛋白酶对底物质量浓度0.15%，加酶温度37℃，反应pH值7.5。

表2 正交实验因素水平（略）

表3 中性蛋白复合酶最佳提取条件正交实验结果（略）

2.3 大枣多糖的药理实验取实验最佳工艺所得大枣多糖，经精制沉淀后，用于以下药理实验。

2.3.1 大枣多糖急性毒性实验取ICR品系小鼠40只，雌雄各半，分为两大组；A组20只，B组20只，给予B组灌胃大枣多糖（药物以生理盐水稀释，最大质量浓度45% ）。每20 g体重灌胃0.4 ml，每隔4 h重复1次，共3次，观察动物死亡数和死亡时间。给与A组灌胃等剂量生理盐水。结果未见动物死亡，亦未见动物有其他反应。表明动物最大耐受量在27.0 g·kg-1以上，相当于原生药675 g·kg-1，属无毒级。

2.3.2 大枣多糖对S180实体瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响取ICR品系小鼠50只。将接种7 d的S180实体瘤腹水型小鼠，消毒腹部皮肤，断头处死，抽取腹水，稀释3倍后，接种于各小鼠左侧腋下，皮下接种，每只0.2 ml。接种后第2天，称重 ，按体重分层随即将小鼠分为A，B，C，D，E 5组，A组为S180实体瘤对照组，B，C，D组分别为大、中、小剂量大枣多糖组，E组为环磷酰胺组。分组后开始给药，A组以生理盐水灌胃，B，C，D组分别按剂量为675，225和75 mg·kg-1的大枣多糖药液灌胃；E组灌胃剂量为每只0.6 mg（30 mg·kg-1）。以上各组均连续用药7 d。

于第7天前72 h腹腔注射0.5%无菌淀粉盐水0.1 ml/只，于第7天再注射淀粉溶液1次，1 h后腹腔注射0.5%鸡红细胞0.1 ml/只，6 h后脱臼处死小鼠，取腹腔液涂片染色镜检。油镜下计数200个巨噬细胞，观察吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数目。结果以吞噬率表示。结果见表4。

表4 大枣多糖对S180实体瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响（略）

结果表明，大枣多糖大、中、小剂量对S180小鼠巨噬细胞吞噬率均有不同程度的提高作用，其中大、中剂量组有显著作用，有效剂量为225 mg·kg-1，小剂量组提高不明显。

3 讨论

纯酶自身成本较高，酶的介入会直接增加大枣多糖提取的成本费用，而这种复合粗酶使用成本较低，其中还含有少量的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、这些酶相互之间可以产生协同作用，无疑对大枣多糖的提取十分有利。其中的主要成分中性蛋白酶主要可以使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解掉，那么，原有的除蛋白工艺步骤可以省略，进而简化了提取工艺，同时也可以达到一个较好的提取效果。

【参考文献】

［1］ 中国医学院药物研究所.中药志，第3册［M］.北京:人民卫生出版社，1993:135.

［2］ 李淑子，张 本.大枣的化学和药理研究概况［J］.中草药，1983，14（10）：39.

［3］ 冉 靓，杨晓声，王伯初，等.抗氧化多糖的研究进展［J］.时珍国医国药，2006，17（4）:494.

［4］ 王 健，龚兴国.多糖的抗肿瘤及免疫调节研究进展［J］.中国生化药物杂志，2001，22（1）:52.

蛋白酶体范文第4篇

炎症是机体最常见的一种病理状态。因此科研工作者们相继从转录及转录后水平开展了大量炎症状态对CYP450的调节研究。20世纪80年代以来，美国Emory大学EdwardT.Morgan教授和他的科研团队致力于研究感染和炎症反应对CYP450的影响。其研究结果显示，感染和炎症条件下，人、大鼠和小鼠肝脏、肾脏和脑组织的细胞色素P450酶表达和活性改变显著。例如给小鼠腹腔注射脂多糖（LPS），LPS能够通过细胞的表面受体激活巨噬细胞，分泌大量促炎性细胞因子，继而对多种CYP450亚型呈现抑制作用。给大鼠分别腹腔注射IL-6和TNFγ后，CYP2C11、CYP2E1和CYP3A2的mRNA表达均下降。分别以人原代肝细胞和大鼠原代肝细胞等为实验对象，用促炎性细胞因子IL-1β和IL-6、TNFα和细胞进行共孵育，发现1A2、2A5、2B1、2B6、2B9、2B10、2C11、2C29、2E1、3A2、3A4、3A11和4A10等CYP的蛋白表达量或活性都显著降低，其中尤以对CYP2B6的影响非常显著，提示炎症能使经CYP2B6途径药物如环磷酰胺、依法韦仑和安非他酮等的体内代谢率显著下降，消除半衰期延长，导致体内药物蓄积而发生严重不良反应[15-19]。

2炎症状态对CYP2B6活性影响的机制研究

研究者对炎症状态下CYP450活性改变的机制也进行了一系列研究，以往的研究更多地关注炎性细胞因子对CYP450的mRNA表达等转录水平的影响，后来大量实验结果证实，炎性细胞因子在对CYP450mRNA表达无影响的情况下，依然可以降低肝药酶活性，提示转录后修饰在此过程中也扮演了重要的角色。

2.1NO在炎症状态对CYP2B6活性改变中的作用

NOS包括神经元型一氧化氮合酶（nNOS）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）三种亚型，感染和炎症主要增加iNOS的表达。CYP2B6在大鼠肝细胞主要以CYP2B1形式存在，与人肝细胞CYP2B6的基因有76%的相似。笔者近年来系统研究了炎性细胞因子IL-1β对大鼠CYP2B1的下调作用及其机制。实验结果证实，IL-1β与大鼠原代肝细胞共孵育，可显著诱导iNOS的蛋白表达，增加NO的生成，并进而使CYP2B1蛋白质半胱氨酸的巯基亚硝基化，易于被泛素-蛋白酶体识别而快速降解[21-22]，提示NO和泛素-蛋白酶体系统在炎症对CYP2B6的影响中起到了至关重要的作用，从转录后蛋白降解的水平阐述了IL-1β抑制CYP2B1的机制。

2.2蛋白质修饰在炎症状态对CYP2B6活性改变中的作用

1992年，Stamler等[23]发现NO和活性氮（RNS）可以作用于蛋白质半胱氨酸的巯基（Cys-SH），生成S-亚硝基化基团（Cys-SNO），引起蛋白质的活性与功能的改变，并首次提出了蛋白质巯基的S-亚硝基化修饰概念[24]。Minamiyama等[25]研究发现，使用NO供体NOC7或过氧化亚硝酸盐（ONOO-）和肝微粒体共孵育，可以引起CYP450活性降低及游离巯基的减少。Roberts等[26]也发现IL-1可以使肾小球膜细胞中产生ONOO-，继而使CYP8A1和CYP2B1的活性下降，研究者猜测是由于ONOO-使CYP8A1和CYP2B1酪氨酸残基硝基化，降低了酶的催化活性。要深入阐明NO对蛋白质的亚硝基化修饰作用，需要有高灵敏度和特异性的检测方法。2001年，美国药理学家Jaffrey和Snyder等[27]建立了一种生物素转化的方法（Biotinswitch）来进行S-亚硝基化蛋白的检测。该方法经过不断的改进和完善，目前已得到国际公认[28]。Benhar等[29]成功利用该方法测定了人淋巴细胞中半胱天冬酶-3蛋白的亚硝基化修饰，并发现细胞质和线粒体中的硫氧还蛋白（thioredoxins，Trx）能够降低去亚硝基化的过程。除了亚硝基化外，NO和RNS还可以对半胱氨酸的巯基进行次磺酸化（Cys-SOH）等氧化修饰。研究显示，RNS可以使酪氨酸羟化酶的半胱氨酸次磺酸化，导致酶的活性下降[30]。GSNO能够对组织蛋白酶K的半胱氨酸进行次磺酸化修饰而改变酶的活性[31]。2008年，美国密歇根大学Reddie教授等[32]利用新合成的特异性探针化合物DAz-1，建立了一种新的次磺酸化蛋白检测方法，为研究蛋白质的氧化修饰机制开辟了广阔的前景。2008年，Lee等[33]用NO供体GNSO与大鼠肝微粒体体外共孵育，采用Biotinswitch法检测到经S-亚硝基化修饰的CYP2B1，并发现泛素化CYP2B1蛋白明显增加，表明NO能够对CYP2B1蛋白进行亚硝基化修饰，并促进其和泛素连接；实验还发现另一NO供体NOC18和HeLa细胞共孵育，能够引起CYP2B1蛋白量下降，蛋白酶体（proteasome）抑制剂MG132可以明显抑制这一过程，但溶酶体酶抑制剂和Ca2+依赖性蛋白酶抑制剂对CYP2B1蛋白的降解无影响，说明NO作用下CYP2B1的降解通过泛素-蛋白酶体途径进行。

2.3泛素-蛋白酶体通路在炎症状态对CYP2B6活性改变中的作用

泛素-蛋白酶体通路（Ub-proteasomesystem，UPS）是除溶酶体途径、Ca2+依赖性蛋白酶途径之外的另一种细胞内蛋白质选择性降解的重要途径，这一发现获得了2004年诺贝尔化学奖。该通路由泛素、蛋白酶体以及一系列相关的泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3组成[34]。泛素是一种小分子球蛋白，能作为“标签”结合到其他蛋白质上，蛋白质被亚硝基化或者次磺酸化修饰后易被泛素连接酶E3识别，使之成为蛋白酶体水解的底物。蛋白酶体是具有多亚基和多相催化活性的蛋白酶复合体，是催化泛素与底物蛋白偶联体降解的关键酶，调节着细胞内蛋白的水平和功能[35]。笔者近年研究发现，单纯使用外源性NO供体药物NOC18同样可以使大鼠原代肝细胞CYP2B1蛋白表达量下降，但降解过程比IL-1所致的CYP2B1蛋白量下降缓慢。有文献报道IL-1可以诱导烧伤大鼠趾长伸肌中免疫蛋白酶体的蛋白水解活性和表达[36]。由此我们推测，IL-1可能通过直接增强大鼠原代肝细胞蛋白酶体的活性或表达，加速了CYP2B1的蛋白降解。最近，我们利用特异性荧光多肽底物初步测定了IL-1对大鼠原代肝细胞蛋白酶体活性的影响，实验结果显示，IL-1能提高蛋白酶体的糜蛋白样（chymotrypsin-like，CT-L）活性。另外，IL-1能够诱导蛋白酶体重要的蛋白水解亚单位LMP2的表达，从而从蛋白酶体途径揭示了炎性细胞因子降低CYP2B1活性的机制[20]。

3展望

蛋白酶体范文第5篇

wwpgg的异构体在转录后水平还特别受到一些化合物的调节。这些化合物可以诱导wwpgg的降解，增加死亡受体介导的细胞凋亡的敏感性。wwpgg异构体是半衰期比较短的蛋白质，蛋白质或RNA合成抑制剂可降低它们的表达水平。wwpgg异构体的表达还受热激效应、E3泛素连接酶Itch激活的JNK通路以及泛素蛋白酶体途径所调节，这些调节是磷酸化依赖的或者非依赖的方式。wwpgg通过蛋白酶体降解途径比较复杂，可能因为wwpgg异构体不同的调节机制以及wwpgg异构体不同的转录后修饰。wwpggS对泛素化降解更敏感，可能由于其独特的C-末端尾巴。E3-泛素连接酶Itch是由JNK调控的，它可以使wwpgg结合上泛素化链而通过蛋白酶体途径进行降解。在FasL介导的细胞凋亡过程中，ROS也是通过蛋白酶体诱导wwpgg下调。NF-κB可通过抑制细胞中的ROS水平而抑制JNK活性，导致Itch连接酶活性的降低，从而稳定细胞中wwpgg的表达水平。wwpggL能被Itch泛素化，但wwpggL的泛素化并不需要CUL3，它也是一个E3连接酶，可以介导Caspase-8的泛素化。现已证明Itch是wwpggS的泛素化的关键调节者。wwpggL和wwpggS也可以不依赖于JNK的方式进行降解。wwpgg的蛋白水平也受磷酸化的重要调节。wwpggS的Ser193磷酸化可以抑制它的泛素化，从而稳定wwpggS在细胞中的表达水平而促进细胞的存活。wwpggL的Ser273可以被Akt以一种JNK和Itch依赖的方式磷酸化，这对于降低wwpgg的水平是非常重要的。相反，Akt能促进E3连接酶Itch的多泛素化和降解，从而稳定wwpggs的表达。在老鼠巨噬细胞中，蛋白激酶p38和c-Cbl可以使wwpggs特定氨基酸残基磷酸化，促进wwpggs和E3连接酶c-Cbl之间的相互作用。

2靶向wwpgg的癌症治疗

wwpgg的过表达可拮抗FasL和TRAIL的细胞，而抑制wwpgg可以克服这种抗性。因此靶向wwpgg，特别是与TRAIL或者传统化疗联合处理，可能是癌症治疗的有效方法。新陈代谢抑制剂，如蛋白质合成抑制剂cyclo-heximide、anisomycin和RNA合成抑制剂actinomycinD最初用来研究抑制wwpgg表达的分子机制。研究显示这几种化合物能够下调wwpgg。用5-FU进行化疗也能够下调结肠癌细胞系中wwpggS和wwpggL的表达水平。蛋白酶体抑制剂在许多不同的细胞系中被广泛研究，作用效果依赖于所研究的细胞系。在不同肿瘤细胞中，用Bortezomib或者小分子蛋白酶体抑制剂MG132处理之后可以增加或者降低wwpgg的表达水平，但Bortezomib和MG132都可以增加TRAIL诱导的细胞凋亡敏感性。DNA损伤试剂可以降低肿瘤细胞中wwpgg的表达水平，然而这种表达水平在不同类型的细胞中是不同的。一些化疗药物可使wwpgg表达水平升高，相反另外一些化疗试剂可以降低wwpgg表达水平。在卵巢癌细胞系中，Cisplatin可以使wwpgg以p53依赖的方式进行泛素化降解，主要是与p53、Itch形成一个三元复合体。三元复合体所导致的wwpggL/S的泛素化是由Akt信号通路控制的。在p53野生型结肠癌HCT116细胞中，oxaliplatin和CPT11都可以诱导wwpggS/L的表达下调;而在p53突变的HT29细胞中，oxliplatin和CPT11诱导wwpgg表达下调，并且药物处理之后的细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡更加敏感，表明细胞凋亡与p53的状态没有关系。在黑素瘤中Cisplatin能下调wwpggs的表达，但不是wwpggL;Cisplatin处理后，wwpggL脱磷酸化。在胶质瘤中wwpggL被CaMKII磷酸化之后可以促进wwpggL的在DISC中的募集而抑制Caspase-8结合，因此推断wwpgg的脱磷酸化会减弱它的抑制活性而促进细胞凋亡。组蛋白脱乙酰化酶抑制剂和拓扑异构酶Ⅰ抑制剂是新的癌症治疗药物，能够调节wwpgg的表达水平。TSA处理可以降低卵巢癌细胞中wwpgg的mRNA和蛋白质表达水平，但并不影响wwpggs的表达水平。EGFR信号通路抑制剂可以阻抑TSA对wwpggL的调节。在肝癌细胞系中，ITF2357和丙戊酸可以降低wwpgg的mRNA和蛋白质水平，但是研究并没有区分不同的异构体。另外，通过RNAi干扰直接抑制wwpgg的翻译可能是下调wwpgg的最专一的方法。但是在这些研究中，损伤或者修饰DNA的试剂靶向wwpgg可能会有一定困难，因为作用于wwpgg的效果在细胞类型之间是不同的，可能会影响两种或者一种wwpgg异构体。尽管在体外研究中，用RNAi干扰直接靶向wwpgg可以增加细胞对TRATL或者FasL诱导的凋亡更加敏感，然而在体内使用RNAi干扰技术有许多限制，因此在临床上抗用RNAi干扰方法靶向wwpgg可能还需要一段时间。

3展望