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“免疫调节”是高中生物人教版必修模块3《稳态与环境》第二章“动物和人体生命活动的调节”中的第二节内容。本节是在学生已经了解了神经调节和体液调节的相关知识之后,通过对免疫系统组成和功能的学习,特别是对体液免疫和细胞免疫过程的分析探讨,引导学生理解免疫调节对人体维持内环境的稳态具有非常重要的作用。同时学习本章有利于学生形成健康的生活方式。
二、学情分析
学生在初中已学过免疫学的知识基础,知道人体的三道防线,初步了解了免疫的功能。但对于特异性免疫的过程、免疫失调引发的疾病、免疫学应用方面缺乏认识。免疫学知识与生活联系紧密,学生对这一节的内容有着浓厚的兴趣。
三、教学目标
1.知识目标
(1)说出免疫系统的组成。
(2)说出人体的三道防线。
(3)概述体液免疫和细胞免疫的大致过程并说出两者的关系。
2.能力目标
通过创设体液免疫和细胞免疫的流程图,培养读图、析图能力。
3.情感、态度与价值观目标
树立关爱生命、关爱健康,并认识到科学发展与人类健康的重要性。
四、教学重点和难点
1.教学重点
体液免疫和细胞免疫的过程。
2.教学难点
体液免疫和细胞免疫的过程。
五、教学过程
导入:PPT展示埃博拉病毒的图片和埃博拉患者的图片,同时介绍感染埃博拉病毒的症状,传播途径:体液传播,致死率:50%,(4级),艾滋病(3级),分子组成:RNA病毒(单链容易变异)(创设情境引出免疫系统的重要性,同时让学生学会关爱生命,关爱艾滋病,珍惜生活)。
(一)免疫系统的组成
指导学生阅读教材第35页,展示以下问题:
(1)免疫系统包括哪三个部分?
(2)免疫器官有哪些?
(3)免疫细胞有哪些?T细胞和B细胞成熟的场所相同吗?
(4)免疫物质有哪些?
指导学生归纳免疫系统各部分的组成和功能,并展示口腔中的扁桃体,骨髓和淋巴结图,介绍扁桃体在医学诊断上的作用,展示吞噬细胞吞噬病菌的图,将溶菌酶与溶酶体对比,介绍溶菌酶的产生过程。指导学生一起回忆免疫系统的组成(加深记忆),介绍免疫系统的功能(防卫、监控和清除)。
(二)免疫系统的防卫功能
人体的三道防线:
PPT展示皮肤和呼吸道纤毛图片,向学生介绍人体的第一道防线(皮肤、粘膜及分泌物)。
PPT展示溶菌酶和吞噬细胞杀菌的图片,引出人体的第二道防线(体液中的杀菌物质和吞噬细胞)向学生说明(泪液、汗液、尿液、消化液等与外界相通的不是体液)。
(提问)第一、第二道防线的作用特点?
(过渡)如果病原体较多,毒性较强,前两道防线难以抵挡,那就要依靠第三道防线,第三道防线如何起作用?
展示资料:甲型H1N1病毒引出抗体(病人体内出现的特殊蛋白质)。
(提问)(1)病人体内出现的这种特殊蛋白质是什么,它有何作用?
(2)从免疫学的角度来说,这里的“甲流病毒”属于什么?未受甲流病毒感染的正常人体不会出现那种特殊蛋白质,这说明什么?(抗原,抗体――具有特异性)
指导学生明白抗原与抗体的概念(结合课本)。
(过渡)靠第三道防线来消灭病原体,第三道防线如何起作用?(介绍体液免疫和细胞免疫):
1.体液免疫
展示课本中体液免疫示意图,并将各种免疫细胞名称用方框隐藏,引导学生阅读课本P37体液免疫知识。引导学生回答下列问题:
(1)在方框中填写合适的文字。
(2)淋巴因子的作用?
(3)抗体的合成与分泌相关的细胞器。
(4)为什么普通流感疫苗需要每年都打而人患过麻疹后会获得终身免疫?
补充引起免疫应答的是细菌表面的抗原决定簇。
(5)布置学生完成体液免疫的示意图(填空)。
体液核心概念辨析小结
①作战武器――抗体(蛋白质)化学本质:蛋白质(分泌蛋白)、(提问)a.抗体的合成过程穿过几层磷脂分子层?b.抗体如何被吸收?
②作战对象―抗原(不一定是蛋白质),核心作用:抗原决定簇
a.概念:能引起特异性免疫反应的物质叫抗原;
b.举例:病毒、细菌等病原体表面的蛋白质。
③浆细胞―分泌特异性抗体
(提问)为什么流感疫苗每年都打,天花只打一次(与记忆细胞有关)?
(提问)抗原――抗体结合完体液免疫就结束了吗?
④吞噬细胞――打扫战场(补充)糖类物质抗原直接刺激B细胞。
补充介绍二次免疫:记忆细胞对抗原十分敏感,能“记住”入侵的抗原。对抗原的记忆可保持数月甚至终生。(疫苗的原理)
(过渡)体液免疫抗体都会把抗原消灭吗?病毒躲入碉堡中――靠细胞免疫。
2.细胞免疫
展示细胞免疫示意图,提出问题,引导学生带着阅读教材第36页图2-16及第37页第一段。并思考下列问题:
(1)效应T细胞的来源。
(2)参与细胞免疫过程的免疫细胞有?(吞噬细胞、T细胞、效应T细胞)
(3)效应T细胞有没有接触抗原?
(4)效应T细胞会使正常的宿主细胞裂解吗?怎么区分?
(5)细胞免疫的结果是什么?
最后抗原是如何被消灭的?引导学生共同构建细胞免疫概念图。
将碉堡炸掉――效应T细胞(使靶细胞裂解,抗原被削落,抗原――抗体结合)。
没有效应T细胞病毒将大量增殖,联系前面的艾滋病使学生加深对艾滋病的认识。
六、小结
引导学生总结本节课的最主要内容,构建知识网络。我们所处的环境中有大量的病菌,人体依靠免疫系统防卫功能,使我们的机体能有效地防御病原体,那么,免疫系统的防卫功能是不是越强大越好呢?我们下节课来学习。
七、教学反思
本节设计理念:通过设置问题串引导学生一步步地探究得出结论,充分发挥学生的自主性和教师的主导作用,同时由于本节课出现了很多新名词,对于学生来说很陌生,也较难理解,通过形象的比喻加深学生对概念的理解。
【关键词】 牛大力多糖;环磷酰胺;荷瘤;免疫调节
Abstract: Objective To investigate immunoregulatory activity of polysaccharide of Niudali (NDLS) on immunosuppressed mice.Methods The models of immunosuppressed mice were established by treating with cyclophosphamide and tumor-bearing. Different doses of NDLS were orally administered to the mice. MTT method was used to observe the proliferation of lymphocytes and the function of macrophages in abdominal activity was also measured. Spectrophotometry was adopted to evaluate the ability of plaque forming cells.Results NDLS enhanced the function of macrophage, increase the amount of plaque forming cells, and promote the proliferation of lymphocytes. Conclusion NDLS can enhance the immunofunction of immunosuppressed mice.
Key words: polysaccharide of Niudali; cyclophosphamide; tumor-bearing; immunoregulation
牛大力为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤(Millettia specisoa Champ),以根入药,始载《花草药性备要》全年可采。以秋季挖根为佳。其性平,味甘,归肺、肾经。具有补虚润肺、强筋活络的功能,药理研究表明其对实验小鼠B淋巴细胞分泌特异抗体及T淋巴细胞产生白介素-2具有免疫调节作用[1]。但是对于牛大力的化学成分及其生物活性少有报道,本实验研究了牛大力多糖(NDLS)对环磷酰胺(Cy)和荷瘤所致免疫功能低下小鼠的免疫调节作用,以期为牛大力的开发研究提供基础依据。
1 材料与方法
1.1 药物 牛大力经南方医科大学中医药学院中药鉴定教研室陈兴兴鉴定,用无菌生理盐水配成所需浓度。
1.2 试剂与仪器 (1)试剂:1640培养液、MTT、ConA均为Hyclone公司产品。Cy为上海第十二制药厂产品。(2)仪器:DG3022型酶联免疫检测仪,华东电子仪器厂;721型分光光度计,上海第三分析仪器厂生产;5%CO2培养箱(WJ-3A),上海跃进医疗器械厂。
1.3 动物 KIH种小白鼠50只,体重18~22 g,由南方医科大学实验动物中心提供,雌雄各半。
1.4 实验方法
1.4.1 分组及给药 KIH种小鼠50只,体重18~22 g,雌雄各半,随机分为对照组、模型组、NDLS低中高剂量组(100、200、400 mg/kg),每组10只。对照组、模型组给予同容量的生理盐水,每天1次,连续10 d。
1.4.2 造模[2] 于给药第4天 ip 60mg/kg Cy,建立免疫低下小鼠模型。无菌条件下抽取接种7 d 小鼠的腹水,用灭菌生理盐水1:3稀释,接种小鼠足趾皮下,0.2 ml/只,于接种后第2天开始给药,10 d 后处死小鼠,建立荷瘤小鼠模型。
1.4.3 抗体形成细胞(PFC)的测定[3~4] 采用溶血分光光度法,于给药第4天 ip 5%新鲜无菌绵羊红细胞(SRBC)悬液0.2 ml 进行免疫,末次给药后1 h 处死小鼠,制备脾细胞悬液,取1×107脾细胞悬液、1:10豚鼠血清和0.2% SRBC各1 ml 混匀,37 ℃ 水浴1 h,离心取上清,用721分光光度计在560 nm 处测吸光度。
1.4.4 淋巴细胞转化实验[5] 给药结束后处死动物,无菌取脾,制备脾细胞悬液。将同一组细胞悬液混合,调细胞浓度为5×106/ml,取150
μl 细胞悬液加入96孔培养板,并加入50 μl ConA(终浓度2 μg/ml),置37 ℃ 5% CO2培养箱培养48 h,弃上清,加MTT 10 μl 孵育4 h,每孔加酸化异丙醇100 μl,用酶标仪在570 nm 处测定吸光度。
1.4.5 腹腔巨噬细胞吞噬功能实验 无菌抽取荷瘤小鼠腹腔液,离心洗涤2次,用培养液将细胞浓度调至1.5×106/ml,于96孔板加细胞悬液200 μl,置37 ℃ 5% CO2培养箱过夜,取出,弃上清,每孔各加0.073%的中性红50 μl,继续培养30 min,弃中性红,用预温的PBS洗2次,再加细胞裂解剂,用酶标仪在540 nm 处测定吸光度。
1.5 统计学方法 统计分析采用SPSS13.0软件,结果以均数±标准差表示,经方差齐性检验后行单因素方差分析,方差齐性时,采用LSD方法进行组间多重比较;方差不齐时,采用DunnettT3方法进行组间多重比较,以P
2 结果
2.1 牛大力多糖对Cy处理小鼠脾淋巴细胞增殖能力与PFC的影响 实验结果表明牛大力多糖可明显提高Cy处理小鼠脾淋巴细胞无丝裂原的OD值、ConA的OD值和PFC的OD值,且与剂量呈正相关,详见表1。表1 牛大力多糖对Cy处理小鼠脾淋巴细胞增殖能力与PFC的影响
2.2 牛大力多糖对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖能力与PFC的影响 实验结果表明牛大力多糖可明显提高荷瘤小鼠脾淋巴细胞无丝裂原的OD值、ConA的OD值和PFC的OD值,且与剂量呈正相关,详见表2。表2 牛大力多糖对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖能力与PFC的影响
2.3 牛大力多糖对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的影响 实验结果表明牛大力多糖可明显提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力,且与剂量呈正相关,详见表3。表3 牛大力多糖对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的影响
3 讨论
机体的免疫功能与肿瘤的发生发展有密切关系。当宿主免疫功能低下或受抑制时,肿瘤发生率增高,而在肿瘤进行性生长时肿瘤患者的免疫功能受抑制,二者也互为因果[6]。
植物多糖具有显著的免疫活性,尤其是在抗肿瘤方面疗效明确。Cy为较强的免疫抑制剂,它对多种免疫活性细胞均有抑制作用。肿瘤患者常伴有免疫功能低下及免疫器官萎缩。目前认为,机体的免疫功能降低有利于肿瘤的形成和发展。因此,本实验采用Cy和荷瘤的方法制备免疫功能低下的动物模型。结果显示,对照组和模型组实验指标差异具有统计学意义,说明本实验成功复制了实验动物模型。实验研究表明,NDLS可促进免疫抑制小鼠的IgM抗体的生成,增加抗体形成细胞的数量,促进B淋巴细胞增殖及分泌。NDLS对免疫抑制小鼠和由ConA诱导的脾T淋巴细胞转化能力低下的现象均有明显增强无丝裂原作用,并呈浓度依赖性的双向作用。
机体免疫状态失常是肿瘤发生与发展的重要因素, 免疫功能抑制或紊乱,使肿瘤细胞能够逃避机体免疫系统对其的杀伤作用。肿瘤细胞分泌的可溶性免疫抑制因子可诱导免疫抑制细胞活化,进一步削弱机体整体的免疫功能, 因此肿瘤患者多表现不同程度的免疫功能减弱。目前已知针对多种病毒、肿瘤的细胞免疫是机体的重要防御因素[7~8]。提高肿瘤病人的免疫机能是肿瘤免疫治疗的重要方面,此项研究为牛大力多糖提高肿瘤患者免疫功能提供了实验依据。该药具有药源充足、疗效显著、毒副作用小及不易产生耐药性等优点,具有广阔的应用前景。
参考文献
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【关键词】
脑性瘫痪;免疫治疗;淋巴细胞亚群
An analysis on clinical effect of immuno-therapy on children with cerebral palsy
LUO Xiang-yang,CEN Dan-yang,LI Dong-fang,et al.Department of Pediatrics,The Second Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510120,China
【Abstract】 Objective To observe the clinical effect of immuno-therapy on children with cerebral palsy.Methods Sixty three children with cerebral palsy were divided randomly into treatment group and control group treated with routine methods.Besides the routine method,immuno-therapy was applied to treatment group.Lymphocyte subsets were determined both pre-therapy and post-therapy.Results Th/Ts,CD19+B,CD20+B were significantly increased in both treatment group and control group before treatment,compared with healthy group.Post-therapy,Th/Ts,CD19+B,CD20+B in treatment group were decreased,but that in control group were still maintained on high level.Three months after therapy,the effective rates in treatment group was 90.48%,in control group 85.71%and there was significant difference(P
【Key words】
Cerebral palsy;Immuno-therapy;Lymphocyte subsets
作者单位:510120广州,中山大学附属第二医院儿科
脑性瘫痪(cerebral palsy,CP)是儿童时期造成运动功能残疾的主要疾病之一,迄今尚无特效的治疗方法。目前大多采用综合康复的治疗方法,其疗效尚非理想。针对脑性瘫痪的发病机制进行相应的治疗可能在一定程度上进一步提高临床治疗效果。本课题组在临床观察到一些儿童神经疾患的发生可能与免疫异常有关,在部分脑性瘫痪患儿也存在淋巴细胞亚群的异常,而应用免疫调节治疗取得了初步疗效,现报告如下。
1 临床资料
1.1 一般资料 本组脑瘫患儿63例,男35例、女28例,年龄最小6个月,最大8岁,平均就诊年龄1岁11个月。临床表现和分型:痉挛型49例,手足徐动型3例,共济失调型3例,肌张力低下型2例,混合型6例。根据运动功能障碍部位分有:双侧瘫17例、四肢瘫17例、偏瘫15例、截瘫7例、单瘫7例。19例有父母吸烟和/或酗酒史,15例有父母过敏体质,10例母孕早期有先兆流产病史,10例有新生儿窒息史,4例有宫内感染史,4例有核黄疸史。
1.2 临床分组 设计分组时考虑到免疫调节治疗组需进一步分为免疫异常组和免疫正常组,故免疫调节治疗组的入组数需2倍于对照组,在此条件下随机将63例分到免疫调节治疗组和对照组。最终免疫调节组42例,对照组21例。
1.3 免疫指标检查 所有入组患儿均在治疗前和治疗后3周作T淋巴细胞亚群CD3+、Th/Ts、细胞和CD16+CD56+细胞,和B淋巴细胞亚群CD19+、CD20+检测,并同时作血清免疫球蛋白水平检测。淋巴细胞亚群采用FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司)检测。血清免疫球蛋白水平检测使用日立7060型全自动生化分析仪采用免疫比浊法检测,试剂盒由四川迈克公司提供。设健康体检儿童20例为健康组测定免疫指标,健康组年龄、性别均与病例组匹配,近期均无感染史、无自身免疫性疾病史和其他疾病史。
2 治疗方法
2.1 对照组
2.1.1 药物治疗 予肌注神经营养因子,9000 u/d,10 d一疗程。配合应用多种维生素、钙剂及丹参等,肌张力增高者加用安坦。
2.1.2 物理治疗 用中频电刺激仪治疗,每个部位1次/d,每次20 min,10 d一疗程。
2.1.3 功能训练 用Bobath治疗技法,进行抬头-翻身-坐-爬-跪-站-走的方式训练,配合按摩治疗。1次/d,每次15~20 min,10 d一疗程。
2.2 免疫调节组 在接受对照组的治疗的基础上,增加免疫调节治疗:薄芝糖肽注射液,6个月~6岁:2 ml/d,6~8岁:4 ml/d,加5%葡萄糖注射液50~100 ml,静脉滴注,1次/d,10 d一疗程。
2.3 疗效标准 目前尚无统一标准,我们结合临床及相关文献拟定以下标准[1],在治疗3个月后进行疗效评定:①正常化:瘫痪肢体功能恢复,原始反射及病理反射消失,腱反射和肌张力正常,运动功能与同龄儿大致相同;②显效:瘫痪肢体功能部分恢复,原始反射及病理反射消失,腱反射和肌张力大致正常,运动功能改善,但存在一定缺陷;③好转:肌力增加达1级以上,原始反射及病理反射仍有残留,腱反射和肌张力有改善,运动功能改善,但存在明显缺陷;④无效:肌力增加不足1级,原始反射及病理反射仍存在,腱反射和肌张力无改善,运动功能无改善。
3 结果
3.1 免疫指标改变
3.1.1 治疗前各组间免疫指标比较 与健康组相比,治疗前免疫调节组和对照组Th/Ts、CD19+B、CD20+B细胞比例均增高,差异有显著性(P
3.1.2 治疗后免疫调节组和治疗对照组免疫指标的变化 治疗后免疫调节组Th/Ts、CD19+B、CD20+B较治疗前显著下降(P
注:经t检验,1)与健康组比较,P
3.2 疗效比较
3.2.1 免疫调节组与对照组比较 免疫调节组和对照组经治疗后3个月评估,有效率分别为90.48%和85.71%,经χ2检验差异有显著统计学意义(P
3.2.2 免疫调节组中,免疫异常组与免疫正常组疗效比较 进一步根据CD19+B细胞的检验值对免疫调节组分为免疫异常组和免疫正常组,其中免疫异常组25例,免疫正常组17例。经免疫调节治疗后3个月进行疗效比较,免疫异常组的有效率为96.00%,而免疫正常组的有为82.35%,经χ2检验差异有显著统计学意义(P
注:χ2=9.69,P
注:χ2=8.98,P
4 讨论
4.1 脑性瘫痪的治疗时机 脑性瘫痪是一种病理过程发生在母孕期或出生后28 d内的脑部疾患,是一组多种病因引起的儿童运动障碍综合症,临床上尚无一种特效的治疗方法。因此,目前国内医疗机构均应用包括针灸在内的物理康复和药物相结合的综合治疗方法,早期治疗常能取得较好的治疗效果。张巧凤等[1]人报道的脑瘫治疗有效率达95.2%~96.3%,本组的治疗有效率仅为88.89%,这可能与治疗的时机和观察时程不同有关,前者的治疗选在极早期,其治疗年龄为1~6个月,最后疗效评价时间是治疗6个月后;而本组患儿的治疗时机未作限定,是随机的,从6个月至8岁,平均为1岁11个月,而评价的时间是在治疗后3个月。可见对脑瘫患儿及早发现、及早治疗的重要性。现多数学者认为,脑瘫患儿最好能在6个月前得到系统的治疗[1,2]。
4.2 免疫调节治疗脑性瘫痪的作用 由于脑瘫的病因是多样复杂的,临床上有必要针对不同的病因及病理制定不同的对因治疗方法。脑白质发育不良是脑缺氧缺血、脑出血、脑代谢异常等病因的共同病理结局。本课题组曾针对脑瘫患儿存在的脑白质发育不良的病理改变,在临床上应用糖皮质激素进行治疗,取得良好的效果[3]。近年来,本课题组发现:免疫异常在神经系统疾病的发病在中有着重要而广泛的意义。在癫痫患儿,治疗前CD19+、CD20+B细胞百分率有不同程度的升高,予以丙种球蛋白治疗后下降至正常范围,复发时其再度升高,予以相似处理后仍可降至正常[4],这在一定程度上反映了自身免疫改变对神经疾病发病的影响。Hagberg H 也报道了细胞因子和免疫因子在脑损害中的作用[5]。本组患儿与健康组比较,治疗前免疫调节组和对照组Th/Ts、CD19+B、CD20+B细胞比例均增高,但血清免疫球蛋白均无异常,提示脑瘫患儿存在免疫功能紊乱,而且主要表现上游B细胞的功能紊乱。国内临床研究显示,薄芝糖肽具有免疫调节作用[6]。本组应用薄芝糖肽注射液对该组脑瘫患儿进行治疗并进行疗效观察。结果显示,治疗后免疫调节组Th/Ts、CD19+B、CD20+B细胞比例,降至正常,各项指标与健康组无显著性差异;而对照组Th/Ts、CD19+B、CD20+B仍维持较高水平。免疫调节组与对照组比较,有效率分别为90.48%和85.71%,比较两组的正常化、显效、有效和无效的构成,差异有统计学意义(P
参 考 文 献
[1] 张巧凤,马廉,史雪川,等.中西医结合康复对小儿脑性瘫痪早期干预的临床疗效评价.中国实用医药,2009,4(3):8-10.
[2] 薛丽馥,徐晓颖,史成华.早期康复对小儿脑性瘫痪功能障碍的影响.中国临床康复,2002,6(1):88-89.
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[4] 李平甘,杨练红,罗向阳.免疫球蛋白对Landau-Kleffner综合征疗效分析.岭南急诊医学杂志,2008,13(4):257-259.
关键词:艾灸;红细胞免疫;药物
中图分类号:R2-03;R245.8
文献标识码:A
文章编号:1673-7717(2008)03-0540-02
Analysis of RBC Immunologic Function by Moxibustion
TIAN Yue-feng1,2,JIN Cong-ni1,LI Lei-yong3,WANG Jun2
(1.Shanxi Institute of Acupuncture and Moxibustion,Taiyuan 030006,Shanxi,China;2.Shanxi University of TCM,
Taiyuan 030024,Shanxi,China;3.The Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030000,Shanxi,China)
Abstract:It is proved that moxibustion has functions of prevention and hyjiene. More works have been made from regulating RBC immunologic function by moxibustion. Based on these,we explore the effect of combination of Chinese herbs in RBC immunologic function. The analysis would provide new study idea for clinic.
Keywords:moxibustion;RBC immunologic;Chinese herbs
1930年Duke发现锥虫在抗血清及补体存在时可黏附到人类红细胞膜上,并发现不同人红细胞对锥虫的黏附能力不同。1953年Nelson发现调理过的梅毒螺旋体及肺炎双球菌也可结合到人类红细胞膜上,并称之为免疫黏附。1963年Nishioka证实这种免疫黏附现象是通过人红细胞膜C3受体(补体受体I型,CR1)而实现的。1981年美国生殖免疫学家Siegel在前人研究的基础上发现红细胞有多种免疫功能,提出了“红细胞免疫系统”的新概念,冲破了传统上划分血细胞功能的“界限”,更新了人们对红细胞功能的认识,促进了红细胞免疫研究工作的迅速发展。
隔药饼灸是一种药物与穴位相结合的温热刺激,能激活机体的免疫系统,调节机体免疫防御功能。红细胞是人体数量最多的免疫细胞,有识别、黏附、浓缩、杀伤抗原、清除循环免疫复合物,防止机体组织中沉积损伤致病的能力,参与机体的免疫调控。近年来人们在此灸法对机体红细胞免疫影响方面开展了大量的研究工作。
1 机体红细胞免疫作用
1981年Siegel[1]提出红细胞免疫系统概念,引起国内外学者的极大关注。大量研究表明,红细胞不仅参与机体免疫反应,而且许多免疫功能是其他免疫细胞所无法替代的。对于红细胞免疫功能的研究主要集中在以下几个方面:(1)红细胞的免疫黏附功能:红细胞通过细胞膜上的I型补体受体(CR1)与免疫复合物(IC)中的补体C3b黏附,转运到网状内皮系统,达到IC的清除和抑制补体过度活化的目的,而红细胞本身不受到破坏,这是红细胞最主要的免疫功能。(2)红细胞对非特异免疫功能的影响:红细胞内含过氧化物岐化酶和过氧化氢酶,能清除吞噬细胞产生的氧自由基,对黏附在其细胞表面较小抗原起效应细胞样作用。存在于红细胞质内一种活性蛋白质,可显著增强NK细胞毒效应,为抗氧化剂家族中的重要成员,在抗肿瘤、感染以及保护机体重要的蛋白质与DNA等分子免遭氧化剂的损伤起重要作用。(3)红细胞对特异性免疫功能的影响:红细胞膜表面或胞质中存在多种与免疫有关的物质,如CR1、CR3、CD58、CD59、CD44、CD55、红细胞趋化因子受体、红细胞同种限制因子等。
2 艾灸对机体红细胞免疫作用的分析
2.1实验研究分析 在脾虚大鼠模型上,用无瘢痕麦粒灸脾俞(双)、胃俞(双)、足三里(双),结果RBC-C3b受体花环率升高,RBC- IC花环率降低,机制可能是灸法能促进胃肠的消化吸收功能,调节免疫功能,改善造血功能[2]。艾灸肾俞穴对实验性炎症(AA)大鼠研究提示AA大鼠炎性反应可抑制红细胞免疫的功能,而艾灸可使低下的RBC-C3b受体花环率升高,升高的RBC-IC花环率降低,表明艾灸通过调节全身的气血运行,促进细胞在血管中流动,使红细胞C3b受体黏附活性提高,清除循环免疫复合物加快,红细胞免疫功能增强[3]。对变态反应性关节炎(RA)大鼠用复方硫磺片依次灸大椎、双侧“脾俞”、“肝俞”、“肾俞”,发现复方硫磺片可改善RA大鼠低下的RBC-C3b受体和RBC-IC花环率,主要是由于复方硫磺片具有温经散寒、行气活血、通痹镇痛、恢复功能等效果,加上选取了具有强壮保健、扶正固本作用的大椎、肾俞以及促进气血生化、统摄气血的脾俞、肝俞等穴[4]。无烟灸小鼠神阙穴显著提高红细胞C3b受体花环形成转换率[5]。电针足三里穴测定大鼠红细胞免疫功能,显著提高了“足三里”组和免疫抑制模型组的RBC-C3bRR和RBC-ICR[6]。在不同灸治时程(5、15、 25min)对红细胞免疫功能影响的研究中,发现阴虚小鼠模型免疫功能状态低下,而灸“后足三里(双)”提高红细胞免疫功能以15min效果最好[7]。以小鼠肉瘤腹水型动物为模型,麦粒灸关元穴观察其对肉瘤小鼠红细胞免疫及调节功能的影响,提示麦粒灸关元穴能使肉瘤小鼠降低的红细胞C3b受体花环率明显升高,使升高的红细胞免疫复合物花环率明显降低,能使降低的红细胞免疫促进因子活性明显升高,使升高的红细胞免疫抑制因子活性明显降低,提示麦粒灸关元穴能增强其红细胞免疫及调节功能[8]。
2.2临床研究分析 对老年肾虚患者用麦粒灸,取肺俞、脾俞、足三里、大椎、关元,发现老年肾虚患者红细胞免疫功能低下严重,灸后RBC-C3b、RBC-IC百分率均显著提高,表明艾灸具有提高老年阴虚患者的RBC免疫黏附活性,调整机体免疫状态的作用[9]。麦粒灸天枢、脾俞、阴陵泉、足三里、百会等穴,发现麦粒灸可提高脾虚泄泻患者RBC-C3b受体花环率,降低RBC-IC花环率[10]。对正在接受放射治疗的宫颈癌患者施灸可明显提高RBC-C3bR花环形成率,增强其免疫黏附肿瘤细胞,进而清除的功能[11]。
3 隔药饼灸对机体红细胞免疫作用的分析
老年人免疫功能下降的同时红细胞免疫功能也受到影响,取膻中、中脘、神阙、关元、足三里、大椎、脾俞、肾俞,用黄芪、当归按5:1比例研成细末,黄酒调匀制成药饼。施灸后,RBC-C3花环率明显增高,血清中RFER亦升高。说明隔药饼灸能纠正红细胞免疫调控失衡状态,有利于红细胞的运送和免疫复合物的清除[12]。用附子饼灸老年人足三里、气海、命门穴,使老年人红细胞免疫功能得到明显加强,红细胞C3b受体花环率及红细胞免疫复合物花环率灸后明显提高,红细胞免疫黏附抑制因子减少,促进因子增多[13]。
隔药饼灸疗法近年来在临床研究和实验研究方面均有很大的进展,特别是应用现代科学技术和现代医学的实验方法,使其作用机理日益明了。隔药饼灸红细胞免疫是一个新的研究领域,其基础理论与应用研究都在不断深化,有关新的红细胞免疫物质还会不断发现,红细胞免疫学理论体系正在逐渐形成和完善。目前艾灸及隔药饼灸对机体红细胞免疫功能的调节作用主要集中在红细胞免疫黏附功能的研究上,选用的药物及穴位虽不尽相同,但对机体红细胞免疫的调节作用是肯定的,而其调节机制的研究尚待深入开展,这也为艾灸增强人体免疫力,延缓衰老的研究提供了一个可持续开拓的空间。
参考文献
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【摘要】 目的 壳寡糖对小鼠肿瘤生长和转移的抑制作用以及壳寡糖对培养的巨噬细胞相关的细胞因子表达的。 接种肿瘤的小鼠尾静脉注射壳寡糖,观察壳寡糖对肿瘤的生长和抑制作用。用相对定量的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测壳寡糖对巨噬细胞相关细胞因子转录和翻译水平的影响。结果 壳寡糖对S180肉瘤的抑瘤率为35.02%(P<0.001),对Lewis肺癌的转移灶的影响:实验组(2.1±1.73),对照组(4.0±2.14),两组比较,P<0.05。巨噬细胞加入壳寡糖作用24h后,细胞因子的表达明显增强(P<0.01)。结论 壳寡糖具有良好抑制肿瘤生长和转移的作用。壳寡糖可增强巨噬细胞相关的细胞因子表达。
【关键词】 壳寡糖;肿瘤;巨噬细胞;细胞因子
【Abstract】 Objective To study the influence of oligochitosan in inhibiting growth and metastasis of tumor in rats, and in expression of cytokines associated with macrophage. Methods Inhibition of growth of tumor was observed after oligochitosan injected into rats through tail vein,the influence in transcription and translation of cytokines associated with macrophage was measured by RT-PCR and ELISA techniques.Results Inhibition rate of sarcoma S180 was 35.02%(P<0.001) after injection of oligochitosan. influence in metastasis of Lewis lung cancer(P<0.05):experiment group(2.1±1.73),controlled group(4.0±2.14). 24hs after oligochitosan added to macrophage,expression of cytokine increased significantly(P<0.01). Conclusion Oligochitosan can inhibit growth and metastasis of tumor,and enhance expression of cytokines associated with macrophage.
【Key words】 oligochitosan; tumor;macrophage;cytokine
甲壳素是界丰富的生物资源之一,其部分脱乙酰化产物壳聚糖,具有抗肿瘤、免疫调节、抑菌等多种生理功能。但壳聚糖不溶于水,利用纤维素酶将其降解为壳寡糖,具有较好的水溶性易被人体吸收,本实验旨在研究壳寡糖对实验性小鼠S180肿瘤和Lewis肺癌的抑制作用以及壳寡糖对体外培养的巨噬细胞相关的细胞因子基因表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 壳寡糖 由浙大医学院分子生物学实验室制备。
1.1.2 动物来源 小鼠由浙江大学医学院动物中心提供,体重为18~20g。
1.1.3 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 由中科院上海细胞所提供。
1.1.4 标准DNA marker和ELISA实验试剂 由上海贝西公司提供。
1.2 方法
1.2.1 壳寡糖抗肿瘤作用实验方法 无菌取S180肉瘤和Lewis肺癌细胞,制成2×107细胞/ml的细胞悬液;皮下注射肿瘤液于ICR种小鼠(0.2ml/只),次日分组进行实验,每组10只ICR种小鼠。实验组尾静脉注射100mg/kg的壳寡糖,对照组注射生理盐水,停药次日处死小鼠,剥离实体瘤称重或观察转移病灶数,抑瘤率(%)。
1.2.2 壳寡糖对巨噬细胞相关细胞因子表达的影响实验方法 培养小鼠采用RT-PCR法和ELISA法研究壳寡糖对巨噬细胞IL-1、TNF-a和IL-18的基因表达的影响:实验组和对照组巨噬细胞分别提取RNA和收集上清液RT-PCR法检测mRNA水平基因表达的变化以及ELISA法检测蛋白表达量的变化。
1.3 统计学方法 各组值均采用均数±标准差(x±s)表示,组间采用t检验,P<0.05为统计学差异有显著性意义。
2 结果
2.1 壳寡糖抗肿瘤作用 壳寡糖对小鼠S180肉瘤生长的影响(见表1),从表中可以看出实验组的抑瘤率为35.02%(P<0.001),环磷酰胺组的抑瘤率为50.16%(P<0.001)。壳寡糖对Lewis肺癌的影响(见表2)实验组的转移灶为(2.1±1.73),对照组的转移灶为(4.0±2.14),P<0.05。综合表1和表2可以看出壳寡糖对肿瘤的生长和转移具有明显的抑制作用。
表1 壳寡糖对小鼠S180肉瘤生长的影响
表2 壳寡糖对小鼠Lewis肺癌转移的影响
2.2 壳寡糖对巨噬细胞相关细胞因子表达的影响
2.2.1 壳寡糖最适作用时间的确定 巨噬细胞贴壁后加入壳寡糖,在4、8、16、24、48h不同时间段通过RT-PCR法检测IL-1β、INF-α、IL-18的基因转录水平,结果显示24h达到高峰,故确定以24h为壳寡糖最适作用时间。
2.2.2 壳寡糖最适作用浓度的确定 小鼠巨噬细胞经培养贴壁后,按浓度10、20、30、40、60、80μg/ml的剂量加入壳寡糖继续培养,各组巨噬细胞样本经RT-PCR法结果见表3、4、5。
表3 不同浓度壳寡糖对巨噬细胞IL-1β基因转录水平的影响
注:以β-actin为内参照标准,各组均值以均数±标准差表示;*表示经t检验与对照组差异有显著性,P<0.05(n=4)
表4 不同浓度壳寡糖对巨噬细胞IL-18基因转录水平的影响
注:以β-actin为内参照标准,各组均值以均数±标准差表示;表示经t检验与对照组差异有显著性,P<0.05,*表示经t检验与对照组差异有显著性,P<0.01(n=4)
表5 不同浓度壳寡糖对巨噬细胞TNF-α基因转录水平的影响