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1 材料与方法
1.1主要材料和仪器粪肠球菌标准株ATCC (广 东环凯生物科技有限公司),木犀草素标准品(上海 金穗生物科技有限公司,产品批号20150301, HPLC>98%),脑心浸液琼脂培养基、脑心浸液肉 汤(杭州天和微生物试剂有限公司),噻唑兰、 MTT (上海金穗生物科技有限公司),二甲基亚砜 (天津致远化工有限公司),引物(上海生工生物工 程有限公司),Biometra PCR 仪(BIOME-TRA, 德国),SMARTSPECTMPLUS超微量分光光度计 (美国),琼脂糖(西班牙),PBS缓冲液(博士德 生物)。
1.2 方法
1.2 1菌悬液的制备首先取粪肠球菌标准株接种 于装有BHI液体培养基的试管中37 °C摇床厌氧复 苏24 h。将复苏后的粪肠球菌划线接种于BHI琼脂 培养基中,放置在37 C恒温培养箱里厌氧培养 24 h。挑取24 h后固体培养基上的单个菌落放置于 装有BHI液体培养基的试管中,37 C摇床里培养 24 h;最后利用麦氏比浊法配制菌悬液并使其浓度 达到 0. 5 McFarland (1X108 个细胞/mL)。
1. 2 2药液的制备取木犀草素标准品用二甲基亚 砜溶解使其浓度达到16 mg/mL,过滤后,利用对倍 稀释法将木犀草素稀释成8、4、2、1和0. 5 mg/mL 的浓度,备用。
1. 2 3木犀草素对粪肠球菌生物被膜的抑菌性的研 究用灭菌后96孔板,向每孔中放50 pL的粪肠球 菌菌悬液和150 pL的BHI液体培养基,封口膜密 封,37 C条件下厌氧培养24 h (激光共聚焦)观 察,待成功建立粪肠球菌生物被膜模型,严格贴壁 去除原液体,同时随机分7组包括5个实验组、 1个阴性对照组、1个空白对照组;分别向实验组中 加入100 PL的浓度为8、4、2、1和0. 5 mg/mL的 木犀草素药液,阴性对照组含有液体培养基和菌悬 液,空白对照组只含有BHI液体培养基;将96孔 板放于培养箱中37 C条件下厌氧培养12 h。12 h 后无菌PBS冲洗2〜3次去除药液。每孔中加入20 PL MTT药液(浓度为5 mg/mL),37 C避光培 养4h。每孔放100 PL的二甲基亚砜溶液,摇床震荡 15 min;待结晶体消失后,全自动酶标仪分别检测490 nm的吸光度(A值)。如下公式计算:抑菌率= (阴性对照组A值一实验组A值)/ (阴性对照组A值一空白对照组A值)X100%。
1. 2 4 CLSM观察不同浓度木犀草素对粪肠球菌 生物被膜的影响将经高压灭菌后的20 mm X 20 mm的盖玻片放在6孔板中,分别在盖玻片表面 滴加300 PL的粪肠球菌菌悬液,再沿6孔板的侧壁 向其中小心加入3 mL的BHI液体培养基,封口膜 封口,37 C恒温培养箱厌氧条件下培养24 h。经共 聚焦检测确定生物被膜模型建立成功后,去除原培 养液同时将其随机分为6组(5个实验组和1个阴 性对照组),分别向5个实验组中加入浓度为8、4、 5、1、0. 5 mg/mL的木犀草素药液,阴性对照组中 不加药液,封口膜封口,继续厌氧培养12 h。12 h 后去除液体。PBS小心冲洗2〜3次去除表面浮游的 细菌;然后滴加2.5%的戊二醛固定10 min,再次 用PBS缓冲液小心冲洗2〜3次后,分别在生物被 膜表面滴加150 pL染色剂(AO、EB等份混合后0 = 20稀释成工作液),暗室室温孵育15 min后,用 CLSM观察生物被膜中死菌与活菌的密度及其比例 (镜下活菌呈绿色,死菌呈红色)。
1. 2 5木犀草素对粪肠球菌的毒力因子影响的研究0. 2 5. 1分组处理和PCR扩增选取适应浓度的木 犀草素(8、4、2和0 mg/mL),分别加入到配制好的 粪肠球菌菌悬液中。置于37 C厌氧条件下培养24h 后,分别取1 mL样本按Total RNA提取试剂盒 (RNAISO TM Plus)要求提取其总RNA;并用RNA PCR KIT (AMV) VER 3 0试剂盒反转录合成cDNA。 同时用由上海生工生物合成设计的3对引物(见表1), 按PCR反应试剂盒说明,通过PCR仪,对粪肠球菌毒 力因子gelE、ebpA、esp进行PCR扩增。扩增后的 PCR产物,置一20 C冷冻冰箱,备用。0. 2 5. 2琼脂糖凝胶电泳及其分析取0. 6g的琼脂糖粉末与40 mL1XTAE电泳缓冲液混合,加热 至全部溶解后,再向其中加入0. 4 PL的EB,混合 后,沿侧壁缓慢使液体流入胶板中,冷却制成凝胶。 将样本(8 pL PCR扩增产物+ 2 pL的6XLoading buffer混合液)滴加入凝胶小孔中,于120 V, 30 min 条 件 下 进 行 电 泳 。 电 泳 30 min 后 , 取 下 凝 胶 置于UVI成像仪上。观察结果并进行拍照,最后利 用软件进行分析。
1.3统计学分析所有数据均采用SPSS 17. 0统计 软件进行整理和统计。计量资料采用均数士标准差 (王±0表示。两组间计量资料的比较采用z检验。 P<0. 05为差异有统计学意义。
2 结果
2 1不同浓度木犀草素对粪肠球菌生物被膜的抑制 率不同浓度的木犀草素作用于粪肠球菌生物被膜 24 h后,运用MTT法测各组的A值并计算木犀草 素的抑囷率;最后的结果显示:在0. 5〜8 mg/mL 的浓度区间随着药物浓度的增加其抑菌能力也增强。 木犀草素的浓度为0. 5 mg/mL时其抑菌率为 40. 02%。当达到8 mg/mL时抑菌率为90. 55%。 并且各组的抑菌率分别与阴性对照组相比差异均有 统计学意义(P〈0. 05)(见表2)。
表2不同浓度木犀草素对粪肠球菌生物被膜的抑制率 随着药物浓度依次增加各条带的亮度逐渐变暗。(2) 当药物浓度达到8 mg/mL时各毒力因子的条带基本 消失。(3)各组别与阴性对照组两两比较,差异有 统计学意义(P〈0. 05),见表3。说明木犀草素不 同程度的抑制了粪肠球菌毒力因子gelE、esp、 ebpA的表达;并且随着药物浓度的增加其抑制效果 逐渐增加。
2 2木犀草素对粪肠球菌生物被膜的影响不同浓 度的木犀草素作用于粪肠球菌生物被膜, 通 过 AO 和EB染色后,CLSM镜下观察活菌和死菌的密度 及其比例。在0. 5〜8 mg/mL浓度区间内CLSM观 察到死菌的数量逐渐增加。说明木犀草素对粪肠球 菌生物被膜的生长活性有抑制作用(见图1)。
2 3不同浓度的木犀草素对粪肠球菌的毒力因子 gelE、esp、ebpA基因表达水平的影响最后的 PCR扩增产物进行电泳后的结果显示:(1)阴性对 照 组 时 毒 力 因 子 gelE、 esp、 ebpA 的 电 泳 条 带 最 亮,药物浓度为2mg/mL时其条带的亮度次之,但3讨论木犀草素是中药夏枯草(LuteoUn)的主要有 效成分之一。木犀草素属于黄酮类化合物,具有抗 菌、抗炎、保护心血管、解痉、祛痰、抑制酶活性、 免疫调节、抗氧化、抗辐射、利尿、利胆、抗肿瘤等等多种特性[4]。有研究报道夏枯草对肠道致病菌 和条件致病菌具有较强的抑制作用,但对于木犀草 素对粪肠球菌的作用尚没有研究,故本实验选取夏枯 草中的木犀草素成分作为研究对象,探讨其对粪肠球 菌的作用 。 实验最后的结果显示: 在0 5〜8 mg/mL,木犀草素对粪肠球菌生物被膜能起到抑制效果,并且 随着药物浓度的逐渐增加其抑菌效果也逐渐明显,当 浓度达8 mg/mL时,其抑菌效果最明显。
3.讨论
粪肠球菌在根管再治疗患者的根管中检出率高 且数量多,极易形成生物被膜,产生抗药性,使治 疗难度加大[6]。有研究报道:粪肠球菌极易在根管 内形成生物被膜可能与其毒力因子明胶酶(gelE)、 表面蛋白(Esp)和菌毛操纵子(ebpA)等有关系。 gelE:是细胞外锌金属蛋白酶的一种,可以酶解宿 主细胞壁和细胞间质的胶原蛋白[7],它的长度大概 为1 530个碱基,位于粪肠球菌染色体上。粪肠球 菌调节因子基因fe和3个启动子位于其上游,能 够影响明胶酶的表达水平。下游主要与其一起参与 宿主的组织损伤,是丝氨酸蛋白基因SprE。明胶酶 对组织的形成和重塑是通过胞外的降解作用来调节 的。经研究发现去除giE基因后,粪肠球菌形成生 物被膜的能力下降[8]。ebpA: ebp基因座主要影响 菌毛形成,而生物被膜形成的必要条件就是菌毛的 形成。bpA是粪肠球菌菌毛操纵子,常常发现于粪 肠球菌分离株中,影响着生物被膜和菌毛的形成[]。 有研究发现:与野生株比较,bpA表达水平和菌毛 蛋白生成量减少,生物被膜形成量也会跟着下 降[1°]。
1940年代中期,袁可嘉针对当时诗坛新诗流于“说教”、流于“感伤”的倾向,提出“新诗现代化”的观点,呼吁寻求诗的“新传统”,即“现实、象征、玄学的新的综合传统”。这一“新诗现代化”理论与西方现代主义诗歌传统、特别是艾略特的诗歌与文论有密切关系,正如袁可嘉提出的,“新诗现代化要求完全植基于现代人最大量意识状态的心理认识,接受以艾略特为核心的现代西洋诗的影响”。袁可嘉更把穆旦看作是新诗新传统追求中的领军人物,认为他在新诗“现代化”的追求上“比谁都做得彻底”“九叶”诗人之一唐祈则称穆旦是“40年代最早有意识地倾向现代主义的诗人”,并能把“艾略特的玄学的思维和奥登的心理探索结合起来”,形成自己特有的诗风。
探讨穆旦这位“新诗现代化”实践做得最为彻底的诗人其1940年代诗歌创作的现代主义追求,有必要先对袁可嘉提出的“新诗现代化”理论以及与之密切相关的西方现代主义思潮和诗歌传统做一些讨论。本文将从西方现代主义思潮中的非线性时间观人手,讨论时间观念变化对于西方现代主义文学的影响以及非线性时间观在袁可嘉诗歌理论中的体现。袁可嘉作为九叶诗派这“一群自觉的现代主义者”中主要的诗歌理论家,其“新诗现代化”理论倡导的是一种“中国式现代主义”,用以艾略特为中心的“现代西洋诗的经验作根据”,追求笔者所称的诗歌的“戏剧性综合”( dramatic syn-thesis ),而这里的“戏剧性”在笔者看来则包含了两层含义:一是注重诗歌与戏剧的关系,用袁可嘉自己的话说便是“新诗戏剧化”,以戏剧人诗或突出诗的戏剧性表现;二是强调对历史作颠覆性的反思。这两个层面的“戏剧性”都反映出袁可嘉把非线性时间观作为新诗现代化的基础,希望新诗一方面能突破直线的、单一的表达方式,形成多层次的诗歌结构,另一方面又能表现出突破线性时间观念的现代历史观。探讨这两个层面的“戏剧性”如何在穆旦诗歌中体现,便可比较深人地研究穆旦诗歌的现代性。笔者认为,穆旦诗歌的“戏剧性”一方面体现在他对于诗歌创作的非线性结构以及对在支离破碎的现实世界中被孤立、被囚禁、被异化的个人内心的多层次的、极富戏剧张力的刻画的追求;另一方面,穆旦诗歌更反映出他强烈的、颠覆线性时间观念的历史反思。过去、现在、将来不再是线性时间流上互不相干的不同时段,它们相互影响,让诗人对过去矛盾、对将来怀疑、对现在执着。
针对当时诗坛盛行的“说教”“感伤”之风,九叶诗人之一袁可嘉在1940年代中期提出了“新诗现代化”的观点,希望建立起新诗的新传统,而这种新传统他在多年后称之为“中国式现代主义”。如果说现代主义诗歌传统发源于西方,那么所谓“中国式现代主义”,正是一种将中西相结合的综合传统,袁可嘉称之为“现实、玄学、象征的新的综合传统”。这一“新诗现代化”的理论是建立在与西方现代主义思潮与文学相一致的非线性时间观上的,而非线时间观表现在文学中便是以非线性、多层次的结构代替线性叙事,并且更多地专注于具体多变的经历与感受以及个人多层次的意识状态,用袁可嘉的话说,便是“从抒情的进展到戏剧的”,达到新诗戏剧化。
唐•刘长卿《游休禅师双峰寺》
木落雁南渡,北风江上寒
唐•孟浩然《早寒江上有怀》
秋色无远近,出门尽寒山
唐•李白《赠庐司户》
雨色秋来寒,风严清江爽
唐•李白《酬裴侍御对雨感时见赠》
长风万里送秋雁,对此可以酣高楼
唐•李白《宣州谢朓楼饯别校书叔云》
人烟寒橘柚,秋色老梧桐
唐•李白《秋登宣城谢朓北楼》
高鸟黄云暮,寒蝉碧树秋
唐•杜甫《晚秋长沙蔡五侍御饮筵送殷六参军归沣州觐省》 信宿渔人还泛泛,清秋燕子故飞飞
唐•杜甫《秋兴八首》
翟塘峡口曲江头,万里风烟接素秋
唐•杜甫《秋兴八首》
远岸秋沙白,连山晚照红
唐•杜甫《秋野五首》
天上秋期近,人间月影清
唐•杜甫《月》
八月秋高风怒号,卷我屋上三重茅
唐•杜甫《茅屋为秋风所破歌》
长风吹白茅,野火烧枯桑
唐•岑参《至大梁却寄匡城主人》
秋风万里动,日暮黄云高
唐•岑参《巩北秋兴寄崔明允》 返照乱流明,寒空千嶂净
唐•钱起《杪秋南山西峰题准上人兰若》
万叶秋声里,千家落照时
唐•钱起《题苏公林亭》
宿雨朝来歇,空山秋气清
唐•李端《茂陵山行陪韦金部》
雨径绿芜合,霜园红叶多
唐•白居易《司马宅》
山明水净夜来霜,数树深红出浅黄
唐•刘禹锡《秋词二首》
试上高楼清入骨,岂知春*嗾人狂
刘禹锡《秋词二首》
多少绿荷
相倚恨,一时回首背西风
杜牧《 齐安郡中偶题二首》 红烛秋光冷画屏,轻罗小扇扑流萤
唐•杜牧《秋夕》
天阶夜色凉如水,卧看牵牛织女星
唐•杜牧《秋夕》
秋阴不散霜飞晚,留得枯荷听雨声
唐•李商隐《宿骆氏亭寄怀崔雍崔衮》
秋山野客醉醒时,百尺老松衔半月
唐•施肩吾《秋夜山居》:“去雁声遥人语绝,谁家素机织新雪。秋山野客醉醒时,百尺老松衔半月。”
老树呈秋色,空池浸月华
唐•刘得仁《池上宿》
秋宵月色胜春宵,万里霜天静寂寥
唐•戎昱《戏题秋月》
一夜绿荷霜剪破,赚他秋雨不成珠
唐•来鹄《偶题二首》
夜半酒醒人不觉,满池荷叶动秋风
唐•窦巩《秋夕》 菡萏香销翠叶残,西风愁起绿波间
南唐•李璟《浣溪沙》
碧云天,黄叶地,秋色连波,波上寒烟翠
宋•范仲淹《苏幕遮》
一年好景君须记,最是橙黄橘绿时
宋•苏轼《赠刘景文》
相逢不用忙归去,明日黄花蝶也愁
宋•苏轼《九日次韵王巩》
萧萧远树流林外,一半秋山带夕阳
宋•寇准《书河上亭壁》
秋景有时飞独鸟,夕阳无事起寒烟
宋•林速《孤山寺端上人房写望》
对潇潇暮雨洒江天,一番洗清秋
宋•柳永《八声甘州》
渐霜风凄紧,关河冷落,残照当搂。
宋•柳永《八声甘州》
是处红衰翠减,苒苒物华休。惟有长江水,无语东流
宋•柳永《八声甘州》
活动中我们首先通过观看幻灯片更直观得让幼儿感受清明节的气氛。同时配合教师讲解帮助幼儿了解清明的来历。
“清明节是我国传统节日,也是最重要的祭祀节日,是祭祖和扫墓的日子。扫墓俗称上坟,祭祀死者的一种活动。汉族和一些少数民族大多都是在清明节扫墓。清明最开始是一个很重要的节气,清明一到,气温升高,正是春耕春种的大好时节,故有“清明前后,种瓜种豆”、“植树造林,莫过清明”的农谚。
接下来通过多媒体课件和现场互动的方式让幼儿了解了清明节的丰富活动形式,如:扫墓烧纸、春耕、荡秋千 、蹴鞠、踏青、植树、放风筝等。
最后《清明》诗词欣赏以及每个班事先准备的一首杜牧诗(附后),表演给大家,把气氛推向了。
二百余名幼儿和二十余名老师沉浸在《清明》的情景中,时而朗诵,时而专注听讲,时而各班精彩展示,时而掌声此起彼伏……
通过此次活动幼儿了解“清明节”的来历、《清明》这首诗的意义,以及它的作者杜牧先生。通过学习他的诗集来怀念这位伟大的诗人,孩子在这种传统文化的熏陶下,感受着古诗词的魅力,纪念这位大诗人,活动圆满成功。
附:《清明》
(唐)杜牧
清明时节雨纷纷,路上行人欲断魂。
借问酒家何处有?牧童遥指杏花村。
《江南春绝句》
(唐)杜牧
千里莺啼绿映江,水村山郭酒旗风。
南朝四百八十寺,多少楼台烟雨中。
《秋夕》
(唐)杜牧
银烛秋光冷画屏,轻罗小扇扑流萤。
天阶夜色凉如水,卧看牵牛织女星。
《山行》
(唐)杜牧
远上寒山石径斜,白云生处有人家
停车坐爱枫林晚,霜叶红于二月花
《寄扬州韩绰判官》
(唐)杜牧
青山隐隐水迢迢,秋尽江南草未凋。
二十四桥明月夜,玉人何处教吹箫?
《惜春》
(唐)杜牧
春半年已除,其余强为有。
即此醉残花,便同尝腊酒。
怅望送春杯,殷勤扫花帚。
谁为驻东流,年年长在手?
《赠别》
(唐)杜牧
多情却似总无情, 唯觉樽前笑不成。
蜡烛有心还惜别,替人垂泪到天明。
《中秋》
(唐)杜牧
2、关于秋天景物描写的诗句有:
3、秋风萧瑟,洪波涌起。(曹操:《观沧海》)
4、解落三秋叶,能开二月花。(李峤:《风》)
5、春种一粒粟,秋收万颗子。(李绅:《悯农》)
6、常恐秋节至,焜黄华叶衰。(《汉乐府?长歌行》)
7、窗含西岭千秋雪,门泊东吴万里船。(杜甫:《绝句》)
8、湖光秋月两相和,潭面无风镜未磨。(刘禹锡:《望洞庭》)
9、自古逢秋悲寂寥,我言秋日胜春朝。(刘禹锡:《秋词》)
10、银烛秋光冷画屏,轻罗小扇扑流萤。(杜牧:《秋夕》)