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1、迎春花,花色呈现黄色。可以用金黄、鹅黄、嫩黄、淡黄、鲜黄、黄澄澄、浅黄、明黄来形容。白居易形容迎春花是“金英翠萼带春寒”,刘敞形容为“黄花翠蔓无人愿”,韩琦形容为“带雪冲寒折嫩黄”。
2、迎春花(学名:Jasminum nudiflorum Lindl. ):别名迎春、黄素馨、金腰带,落叶灌木丛生。株高30-500厘米。小枝细长直立或拱形下垂,呈纷披状。3小叶复叶交互对生,叶卵形至矩圆形。花单生在去年生的枝条上,先于叶开放,有清香,花色呈现黄色,外染红晕。可以用金黄、鹅黄、嫩黄、淡黄、鲜黄、黄澄澄、浅黄、明黄等词来形容它。因其在百花之中开花最早,花后即迎来百花齐放的春天而得名。
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每一个人都有一双羡慕、嫉妒眼,看着别人的优点,心里会非常嫉妒,而这样的你的自尊心会严重的受到破坏,但上天是公平的,每一个人多有自己的优点、都十分优秀看你是否去发现。有的人到了50岁去发现,而有些人一辈子也没发现,而有些人10几岁便发现了。
我们班就有一位才子。
她正是我们的中队长——张琪。她不但成绩优异,古筝也过了9级,拉丁舞也跳得十分好。我们班有许多人都羡慕她。我也不例外。一次中队活动,她用自己的“绝活”——古筝,征服了现场的所有人,也受到外校老师的好评。
回到家中,我便对妈妈说,我也想学习古筝,但学可以,必须答应妈妈3个要求,1、不能半途而废,2、每天必须练,3、必须认真学习,听了要求,我答应了,于是我去学了。
第一天去学,十分轻松,只见老师拿来一本厚厚的古筝书,书名是《新编古筝教程修订本(一)》,我十分好奇的看了看书的内容:古筝是中国最古老的弹拔乐器,早在公元前237年的战国时期,古筝已流行于陕西,它是以音而命名的乐器,因弹奏起来“zhengzheng”作响,故称之为古筝。
在我的不懈努力和老师的辛勤教导,我已经学会了《汉宫秋月》、《平湖秋月》、《苏武牧羊》、《竹排歌》……一日,老师给妈妈打电话想我去考四级,妈妈答应了并和我一起去报名。
为了能考过,老师让我天天谈那三首考级曲子,我板着手指头算了算,考级是7月份,而现在才3月,还要谈四个月。“长天啊!大地啊!天天谈那三首曲子,我都要崩溃了!”
今年夏天热得十分早,6月便有35摄氏度,我天天练琴,妈妈便在一旁为我打扇,一练就一个小时,妈妈一分钟打两次扇,一共要120次,为了考级考过,妈妈付出了多少汗水,不顾自己,而为我凉爽。
时间如流水般过去了,考级的日子一天天来临,七月十四日,我去一下艺校考级,考级时,我以熟练、优美的音乐打动了评委,并顺利考过。
关键词:硝化杆菌(Nitrobacter);培养基;培养条件;优化
中图分类号:Q939.96 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2013)15-3628-04
氮素是水体污染源的主要成分之一,水体的脱氮技术已经成为人们关注与研究的热点[1]。与传统的物理化学脱氮工艺相比,生物脱氮具有成本低、效率高、无二次污染等优势。现今采用最多的生物脱氮工艺为硝化―反硝化工艺,其中的硝化工艺由硝化细菌(Nitrifying bacteria)完成[2]。硝化细菌分为自养型硝化细菌和异养型硝化细菌2类,异养型硝化细菌仅占很少一部分,自养型硝化细菌是生物脱氮过程中起硝化作用的主要菌群,其硝化速率直接影响污水处理系统的硝化效果和生物脱氮效率[3]。硝化过程通常由氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing Bacteria,AOB)先将氨氮转化为亚硝酸盐,然后由亚硝酸氧化细菌(Nitrite-oxidizing Bacteria,NOB)将亚硝酸盐转化为硝酸盐[4]。与自养型AOB一样,自养型NOB具有生长速度慢、自然条件下数量低等特点,这一方面使NOB的研究较为困难,另一方面也制约了其工业化生产和应用。因此,研究加快NOB生长速度的培养方法显得尤为重要[5,6]。本研究以一株亚硝酸氧化细菌y3-2[7]为出发菌株,对其培养基和培养条件进行了优化,并采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time quantitative PCR detecting system, qPCR)计数的方法对其菌液浓度进行计数,以期获得能快速培养硝化杆菌y3-2的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 试验用菌种硝化杆菌y3-2由农业微生物学国家重点实验室发酵工程分室分离纯化保藏,经16 S rDNA鉴定为硝化杆菌属(Nitrobacter)细菌。
1.1.2 优化前培养基及培养条件 优化前初始培养基:MgSO4・7H2O 0.12 g/L、NaH2PO4・2H2O 1.16 g/L、K2HPO4・3H2O 0.33 g/L、MnSO4・H2O 0.007 6 g/L、(NH4)6Mo7O24・4H2O 50 μg/L、无水NaCO3 0.5 g/L、NaNO2 1.0 g/L、pH 7.5,121 ℃、30 min灭菌。优化前的培养条件为250 mL三角瓶加入50 mL培养基,200 r/min、30 ℃恒温培养。
1.1.3 试剂 亚硝酸盐和硝酸盐定性检测试剂[8]:Griess试剂、盐酸溶液、氨基磺酸铵溶液、二苯胺―硫酸试剂,细菌基因组DNA提取试剂盒和Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,硝化杆菌qPCR标准样品为农业微生物学国家重点实验室发酵工程分室自制。
1.2 方法
1.2.1 培养基的优化
1)单因素试验。设计单因素试验分别考察培养基中CaCO3、Na2CO3和NaNO2浓度对试验菌株生长的影响。①CaCO3浓度。Na2CO3浓度1.5 g/L,NaNO2浓度0.5 g/L,CaCO3浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、5.0 g/L。②Na2CO3浓度。CaCO3浓度0.5 g/L,NaNO2浓度0.5 g/L,Na2CO3浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/L。③NaNO2浓度。CaCO3浓度0.5 g/L,Na2CO3浓度1.5 g/L,NaNO2浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L。每个单因素试验设置3个平行,每天定性检测NO2-、NO3-含量,观察NO3-生成情况,记录NO2-完全硝化所需时间,并对细菌进行计数。
2)正交试验。设置三因素三水平正交试验考察CaCO3、Na2CO3和NaNO2浓度对细菌生长的影响,每个试验设置2次重复。
1.2.2 培养条件的优化 采用优化后的培养基培养菌株,设置单因素试验考察培养温度、pH和转速对菌株生长的影响。①温度。将种龄为48 h的新鲜菌液以5%的接种量接种到装有50 mL培养基的250 mL三角瓶中(后面摇瓶试验接种方法一致),分别在15、20、25、28、30、35 ℃下恒温培养,pH控制在7.0~7.5,转速设为200 r/min,记录NO2-完全硝化所需时间及菌落数;选择适宜的温度范围进行正交试验。②pH。培养基pH控制为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,培养温度为28 ℃,转速设为200 r/min。记录NO2-完全硝化所需时间及菌落数。③转速。将活化后的菌种接种到三角瓶中,28 ℃恒温培养,pH 8.0,转速分别为50、100、150、200、250 r/min,记录NO2-完全硝化时间及最终菌落数。每个单因素试验设置3组平行。
1.2.3 分析方法 亚硝酸盐定性检测使用Griess试剂法;硝酸盐定性检测使用二苯胺-硫酸试剂法[8];菌液浓度定量分析:首先提取收集菌液的基因组DNA,然后使用Real-time PCR定量计数方法进行计数[9],qPCR反应体系总体积为20 μL,含有Real Master Mix/20×SYBR solution 9 μL、FGPS872(5′-TTTTTTGAGATTTGCTAG-3′)1 μL(终浓度100 nmol/L)、FGPS1269(5′-CTAAAACTCAAAGGAATT
GA-3′)1 μL(终浓度100 nmol/L),DNA模板1 μL,超纯水8 μL。Real-time PCR反应程序为:95 ℃预变性4 min;95 ℃变性20 s,50 ℃退火20 s,68 ℃延伸40 s,共循环40次;最后一步设置自动制作溶解曲线。通过计算机对样品PCR结果和标准样品PCR结果进行对比分析,计算出扩增基因片段的拷贝数,从而推算出样品中的菌体含量。
2 结果与分析
2.1 培养基的优化结果
2.1.1 不同CaCO3浓度对y3-2生长及硝化作用的影响 近年来多项研究表明NOB具有附着生长的特点,有研究者通过此特点对NOB进行固定化,从而提高NOB的硝化效率[10],本研究以CaCO3为添加物,提供y3-2生长的附着位点,考察其对y3-2生长的促进作用,结果如图1所示。由图1可以看出,CaCO3对y3-2的生长具有明显的促进作用,其浓度为0.5 g/L时促进作用最佳,菌液终浓度达8.0×108 CFU/mL,而未添加CaCO3的对照组菌液浓度不足1.0×108 CFU/mL。此外,CaCO3添加浓度为0.5 g/L时,硝化速度也明显加快,NO2-完全硝化仅需5 d,而对照组需要9 d。
2.1.2 不同Na2CO3浓度对y3-2生长及硝化作用的影响 Na2CO3浓度对y3-2生长和硝化作用的影响结果如图2所示。由图2可知,Na2CO3浓度为1.0~3.0 g/L时NOB具有良好的生长势,其中1.0 g/L试验组细菌生长情况最好,菌液终浓度最高,且完全硝化NO2-仅需5 d;当Na2CO3浓度小于1.0 g/L时,y3-2生长速度很慢,原因是过低的碳源浓度使y3-2生长不充分,生物量较低。在氮源浓度一定的情况下,碳源浓度过高致使培养液中碳氮比(C/N)过高,会导致细菌对氮源的代谢利用发生异常,从而细菌繁殖缓慢,因此Na2CO3浓度高于3.0 g/L时菌液中终浓度较低,NO2-完全转化所需时间也延长。
2.1.3 不同NaNO2浓度对y3-2生长的影响 NO2-是NOB生长与繁殖过程中唯一的氮源,它是控制NOB生长的重要因素,不同NO2-浓度对y3-2生长的影响结果如图3所示。由图3可知,NaNO2浓度为0.5~4.0 g/L时对NOB生长有明显的促进作用,0.5 g/L时y3-2生长速率最快,NaNO2为4.0 g/L时菌液终浓度最大,约为2.0×109 CFU/mL;但随着NaNO2浓度进一步升高,y3-2的生长被抑制,且完全硝化NO2-的时间也逐渐延长。这是因为NO2-浓度过低使细菌缺乏充分的底物来进行繁殖,而浓度过高时会对y3-2产生抑制,这种抑制可能是过高浓度的NO2-的毒害作用或是一种盐胁迫。
2.1.4 正交试验结果 正交试验结果见表2。由极差分析可知,各因素中对菌液终浓度的影响由大到小依次为CaCO3浓度、Na2CO3浓度、NaNO2浓度。最佳试验组合为A2B1C1,即培养基中含有CaCO3浓度0.5 g/L、Na2CO3浓度1.0 g/L、NaNO2浓度0.5 g/L。在此条件下进行4次重复试验,得到的平均菌液终浓度为4.31×109 CFU/mL,高于所有正交试验组合的结果。
2.2 培养条件优化的结果
2.2.1 温度对y3-2生长和硝化作用的影响 有文献报道NOB在15~30 ℃具有较好的生长状态和硝化活性[11]。y3-2在不同培养温度下的生长及硝化NO2-的情况见图4。从图4可以看出,菌液终浓度随培养温度的升高呈先升高后降低的变化趋势,28 ℃时y3-2的菌液终浓度最高,此时完全硝化0.5 g/L NaNO2所需时间为4 d。
2.2.2 pH对y3-2生长和硝化作用的影响 pH不同会导致菌株酶活力的变化,从而使菌体生长和代谢能力发生改变[12],传统研究认为pH在6.5~8.0适宜NOB生长,在pH 8.0~8.5范围内NOB硝化效率最高[13]。pH对y3-2生长和硝化作用的影响见图5。从图5可以看出,pH为8.0时菌液浓度可达1.68×109 CFU/mL,明显高于其他处理,说明y3-2的最适培养pH为8.0,此时完全硝化0.5 g/L NaNO2所需时间为4 d。
2.2.3 摇床转速对y3-2生长和硝化作用的影响 NOB是好氧性细菌,溶氧量对其生长有着重要的影响,一般而言溶氧需控制在2 mg/L以上[14]。在一定温度下溶氧是装液比(培养基装液量/三角瓶体积)和摇瓶转速的函数,如果装液比固定则转速将直接影响培养基中的溶氧量。y3-2在不同转速下的生长情况见图6,从图6可以看出,菌液终浓度随着转速的加快先快速升高,当转速达到200 r/min及以上时菌液终浓度随转速加快而升高的趋势变得平缓,说明转速达到200 r/min时溶液中的溶氧量已达到细菌最快生长所需的条件,再增大转速也无益于提高细胞浓度,反而消耗过多的能源,增大培养成本。
3 小结与讨论
本研究针对一株硝化杆菌y3-2进行了培养基和培养条件的优化,优化后培养液中的菌液终浓度达到了4.31×109 CFU/mL,并且培养时间从初始的7 d缩短至4 d,减少了接近一半的培养周期,为亚硝酸氧化细菌的工业化生产奠定了一定的基础。优化后的培养基中Na2CO3浓度为1.0 g/L、NaNO2浓度为0.5 g/L,优化后的培养条件为28 ℃恒温培养、pH 8.0、摇床转速200 r/min。另外,本试验还探讨了添加硝化细菌生长附着物CaCO3之后对细菌培养的影响,并确定CaCO3浓度为0.5 g/L时最有利于y3-2的生长。
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也许是刚到冬天不久,天气似乎并不是那样冷,只是偶尔寒风吹过面庞时,脸上有些轻微的刺痛;却无意中发现一课课树不久前依然风华正茂,而今已变成一个个孤单落寞的守望者,一片片象征幸运女神的三叶草不知不觉被压得沉重而阴郁。也许冬天,是个生命滞留的季节吧!
早晨轻轻的推开门,忽然感觉眼前比往常亮了许多,才发现刚刚下了一夜的雪,洁白的地面把漆黑的星空反衬的格外明亮。“嗯,下雪了呢”心里默默的说道。时间似乎过的真很快,眼前还沉浮在让我失落的夏日,如今已成为白雪皑皑的一片。而天空依然挥洒着早已成为定格的六边形花瓣,一片,一片,落在我的头上,衣服上,手上……迷茫的践踏着厚实的积雪,仿佛感到让我重新回到思绪起点轻柔,软软的,留下一个个深深的脚印。
这是我生命的第十四个冬季,我很庆幸我被生在冬季之前,这样我每过一个冬季,我会感到我的生命又走过一载。一直吧冬天看作是自己生命的季节,即使冬天,万物静然。我不明白那些燕子为什么一到冬季就急着往南方跑,不能像我们人一样,冬天在北方生活惯了,习惯了漫天飞舞的大雪,就不再向往温暖的南方,而我喜欢这里,喜欢这里的冬天,因为我总认为:冬天有了大雪,那才叫做冬天。
这天下课后和同学们一起去玩了打雪仗,似乎很久没有重温过这样的游戏了,在此之前,我一直淡忘着大雪飞扬的浪漫,一直淡忘着儿时天真无邪的笑声,渐渐长大的我,总是被埋没在青春的压抑之中,于是,我需要这样的大雪,来找回那个陌生而熟悉的我,亲切那个我一直爱着的大雪。
还是一样的《皂罗袍》,一样的《游园惊梦》,一样的《拾画叫画》,一样的身段和眼神,但版本众多,各有千秋,让人诧异,为何只有昆曲、只有《牡丹亭》,会有如此多元的演出样态和营销方式?会以“XX版”为标签为卖点?
白先勇先生应该是此番《牡丹亭》热的始作俑者。不知他是否预料到如今《牡丹亭》的“姹紫嫣红开遍”,又是否满意如今的现状。为制作青春版《牡丹亭》,他一直四处托钵化缘,甚至自掏腰包。一般来说,一次全本演出的费用是二十至五十万人民币,在青春版《牡丹亭》过去的百余场巡演中,只有2004年8月参加北京国际音乐节的演出费是由政府出资的,但同年9月在杭州参加的第八届中国艺术节演出,其性质虽为商业演出,但由于高校演出票价低廉,故票款收入基本是杯水车薪,资金支持大部分只能依靠澳门何洪毅家族基金,作为此项基金的顾问,白先勇先生为青春版《牡丹亭》争取到了三年的资助。为了青春版《牡丹亭》能够走进大学校园,能够完成白先勇先生在大学生心目中埋下昆曲种子的心愿,私人基金会背后的支持也是功不可没。自2009年起,白先勇又争取到一家饮料公司的五百万人民币,启动了“北京大学白先勇昆曲传承计划”,共为期五年。
上海昆剧团的《牡丹亭》则显示了国家院团的优势。2008年岁末,命名为“主题演出”的《临川四梦》集体亮相,其中,菁粹版《牡丹亭》作为建团三十周年的重头戏,以“五代同堂传承昆曲名剧,四方精英贺演上昆经典”为票房号召力,一展上昆演艺实力之外,还特邀了“巾生魁首”汪世瑜和北昆优秀演员魏春荣加盟。今年在兰心大戏院的演出虽然演员阵容略有不同,但导演思维、剧本结构、舞台美术上与“菁粹版”几乎相差不大,同时蔡正仁、梁谷音、张洵澎的压阵也颇有票房号召力
自昆曲列合国首批人类非物质遗产之后,国家为抢救、保护和扶植这一古老剧种特设了经费,文化部、财政部更给予了挖掘整理剧目和普及性演出专项补贴。菁粹版《牡丹亭》在有“外援”阵容时的票价为六十至三百八十元,而完全由上昆演员担纲时票价则为三十至两百八十元,充分体现出“低门槛”票价就能看到高质量演出的国家院团所应有的姿态。
三山会馆的《梦幻・牡丹亭》和朱家角课植园内的《梦回・牡丹亭》均在上海世博会期间演出,两个造“梦”的《牡丹亭》都是由演出环境应运而生。
三山会馆的“梦幻”缘起丁盛和苏晨两位年轻的制作人,他们启用了尚没有走出校门的昆五班学生,由此,目前上海年龄最小的一批昆曲传承人开始了粉墨登场的演出实践。会馆内的《牡丹亭》设置了“昆宴”,陈列了赞助人提供的红木家具和瓷器,并申请到了二十万元的上海文化发展基金。尽管如此,就场地租金和演出成本而言,会馆版的资金回收才刚刚起步。