九江八河

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九江八河范文第1篇

2、二龙戏珠,二人同心,二三其德,二八佳人

3、三阳开泰,三从四德,三山五岳,三头六臂

4、四面八方,四通八达,四海五湖,四平八稳

5、五光十色,五颜六色,五福临门,五洲四海

6、六六大顺,六月飞雪,六畜兴旺,六出奇计

7、七步之才,七步成诗,七日来复,七长八短

8、八珍玉食,八仙过海,八方呼应,八斗之才

9、九江八河,九九归一,九五之尊,九霄云外

九江八河范文第2篇

【摘要】 p300是一种具有组蛋白乙酰化酶活性的转录辅助因子，HDAC1是一种组蛋白去乙酰化酶。本研究查明姜黄素对B-NHL细胞株Raji细胞增殖的影响，并探讨这种影响与p300以及HDAC1转录调节表达的关系。 以不同浓度(6.25-50 μmol/L)的姜黄素作用于体外培养的Raji细胞，用MTT法检测细胞生长抑制率，Annexin-V-FITC/PI双标流式细胞术检测细胞的凋亡率和应用RT-PCR 和Western blot法检测Raji细胞中HDAC1和p300的mRNA表达和蛋白含量的变化。结果表明： 姜黄素对Raji细胞抑制作用呈明显的时效和量效关系。24小时的IC50为25 μmo/L；姜黄素能够诱导Raji细胞凋亡，凋亡率为14.38%-61.18%，并呈浓度依赖性。姜黄素明显抑制HDAC1和p300的活性和表达。在IC50浓度时，随着时间的延长，其p300和HDAC1 mRNA表达和蛋白含量逐渐降低，呈时间依赖性，与对照组相比有显著性(P

【关键词】 B淋巴瘤

Regulatory Effect of Curcumin on p300 and HDAC1 in B-NHL Cells

Abstract The purpose of this study was to investigate the effect of curcumin on proliferation of B-NHL Raji cell line and explore the relationship between this effect and regulatory expression of p300 and HDAC1 transcription.The in vitro cultured Raji cells were treated with curcumin at various concentrations (6.25-50 μmol/L) and at different time points (0，6，12，24 and 48 hours)，the inhibitory ratio of cell growth was measured by MTT assay，the cell apoptosis rate was detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining，the changes of p300 and HDAC1 mRNA expression and protein level in Raji cells were determined by RT-PCR and Western blot.The results showed that the curcumin could inhibit Raji cell proliferation in significant time-and concentration-dependent manners，IC50 at 24 hours was 25 μmol/L; the curcumin could induce apoptosis of Raji cells in concentration-dependent manner，apoptosis rate was 14.38%-61.18%.The curcumin significantly inhibited activity and expression of p300 and HDAC1.At IC50 concentration，expression of p300 and HDAC1 mRNA and protein level decreased with time-dependent manner，difference between tested and control groups was significant (P

Key words curcumin; B-NHL; Raji cell; p300; HDAC1

姜黄素(curcumin，Cur)是从姜黄根茎中提取的一种酚性色素，其药理作用特性有抗炎、抗肿瘤、抗动脉硬化、抗病毒等。体外研究表明，姜黄素抑制癌细胞增殖和诱导凋亡是通过多条通路和调节多种肿瘤表面标记因子实现的，而且其作用靶点可以从DNA、mRNA到蛋白质水平［1］。

p300是一种重要的组蛋白乙酰基转移酶，它能乙酰化核心组蛋白N末端的赖氨酸残基使核小体组蛋白与DNA的结合稳定性下降，进而使转录机器与染色体的结合成为可能［2］。在细胞中可与多种基因转录活化因子结合而形成辅化因子复合体。除乙酰化作用外，p300还可以在转录起始复合体的形成中起支架或桥梁的作用［2］。目前研究表明，在多种肿瘤中p300可发生多种形式的基因突变，提示

p300具有促进基因转录的作用［3］。

组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)在真核细胞基因的转录调控中发挥重要的作用，调节核内蛋白质的乙酰化水平与基因转录。近年来研究发现，HAT/HDAC活性紊乱会使基因表达失控，从而导致癌症的发生［4］。

本研究查明姜黄素对Raji细胞组蛋白去乙酰化酶HDAC1的作用，观察转录共激活因子p300的表达情况，探讨姜黄素抗肿瘤的分子机制。

材料和方法

材料

药物

姜黄素，购自Sigma公司，纯度>99%，溶解于二甲亚砜（DMSO），分装备用。

细胞系

B细胞淋巴瘤细胞株Raji细胞购自上海科学院细胞中心。在含有10%的胎牛血清、青霉素100 U/ml及链霉素100 U/ml的RPMI 1640培养液中37℃、5% CO2条件下培养。每48小时换液传代1次。取生长良好、细胞活性大于98%的细胞进行实验。

主要试剂

RPMI 1640培养液(Gibco产品)，胎牛血清(中山凌飞公司产品)，溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT，Sigma产品) 组蛋白去乙酰化酶HDAC1抗体，p300抗体均购自Santa Cruze公司，其中HDAC1为鼠抗人单克隆抗体，p300为兔抗人多克隆抗体，羊抗鼠及兔抗鼠二抗和Bio-Rad蛋白定量试剂盒、TRIzoL均购自晶美公司。

方法

细胞培养

将Raji细胞接种于含10%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在5% CO2、37℃、饱和湿度下培养，每2天换液1次，取对数生长期的细胞进行实验，分别用不同浓度的姜黄素处理细胞，未加药组为对照组。根据MTT法测得的姜黄素对Raji细胞作用的IC50为25 μmol/L，并用IC50浓度的姜黄素作用0、6、12、24及48小时，检测HDAC1和p300蛋白及mRNA的变化。

细胞体外生长活性检测

采用溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)比色法，取对数生长期的Raji细胞进行实验，将不同浓度的姜黄素6.25-50 μmol/L加入10% FCS的RPMI 1640完全培养液中，调细胞浓度为5×105/ml，接种于96孔板，每种药物浓度为一组，每个浓度设3个平行孔，置5% CO2、37℃培养箱培养不同时间(0、6、12、24及48小时)后，每孔加MTT 20 μl，培养4小时，弃MTT，每孔加二甲亚砜150 μl，充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔A值。肿瘤细胞的生长抑制率=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100%。

细胞凋亡的流式细胞仪检测

用Annexin-V-FITC及PI双标流式细胞仪检测细胞凋亡，分为实验组和阴性对照组。分别加入终浓度为6.25-25 μmol/L的姜黄素作用于24小时，用70%乙醇4℃固定24小时，PBS缓冲液洗去固定液，离心去上清。用缓冲液37℃孵育60分钟，195 μl细胞悬液加5 μl Annexin-V-FITC。混匀，室温放置10分钟。用缓冲液洗涤细胞1次，在190 μl缓冲液重悬，然后再加10 μl 20 μg碘化丙锭。上流式细胞仪检测。

p300及HDAC1 mRNA表达的RT-PCR检测

细胞总RNA抽提及RT-PCR　步骤按TrizoL (Gibco公司)试剂盒说明书进行，所提取的总RNA溶解后用紫外分光光度仪测RNA纯度和浓度(A260/A280>1.8)。在GenBank检索基因cDNA序列，自行设计PCR引物，由上海生物工程公司合成。p300引物序列(上游引物: 5′-GGGCTCAACCGACAA GAC-3′，下游引物: 5′-GGAGGCAGAGGCAATCAA-3′，扩增产物为259 bp。β-actin引物序列上游引物:5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′；下游引物: 5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，扩增产物为312 bp。PCR扩增条件为：94℃ 30秒，94℃ 变性1分钟，57℃复性 30秒，72℃ 50秒，72℃延伸10分钟，共进行35个循环。HDAC1引物序列(上游引物: 5′-AGTGCGGTGGTCTTACA GTG-3′，下游引物: 5′-TCTCCCTCCTCTTCAGAATCG-3′，扩增产物为500 bp。β-actin上游引物:5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG3-′；下游引物: 5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，扩增产物为316 bp。PCR扩增条件为：94℃ 5分钟，94℃ 变性1分钟，50℃复性 1分钟，72℃ 延伸1分钟，共进行32个循环。产物用1%的琼脂糖胶，进行检测。用数码凝胶图象分析系统（Kodak EDAS290）作条带密度扫描，结果以目的条带与对应的β-actin密度值表示。

转贴于

细胞蛋白质样品制备及蛋白定量

经处理后的细胞立即弃去培养液，洗涤，离心。加预冷的细胞裂解液(0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris HCl，pH 7.6，0.001 mol/L EDTA，100 μg/ml PMSF，2 μg/ml leupeptin) 0.1 ml，裂解30分钟，然后10 000×g离心10分钟，取上清备用。以上所有操作均在4℃下进行。测定蛋白，并调各组蛋白浓度一致。

Western blot检测

按文献[5］报道的Western blot方法检测p300，HDAC1其中一抗为鼠抗，二抗用辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG，经化学发光法，X线曝光显影，软件进行扫描定量，每个浓度组重复3次，取均值代表测定结果。

统计学分析

应用Excel 2000软件作方差分析和t检验。

结果

Raji细胞生长抑制率的测定

姜黄素以时间剂量依赖性方式抑制Raji细胞增殖，6、12、24和48小时后，细胞抑制率分别如下：6.25 μmol/L时为(1.25±0.7)%、(6.79±0.9)%、(18.25±1.0)%、(23.15±1.9)%；12.5 μmol/L时为(4.28±0.6)%、(15.24±1.4)%、(30.25±2.0)%、(40.12±1.0)%；25 μmol/L时为(10.25±1.1)%、(29.14±2.3)%、(51.25±2.8)%、(63.58±2.9)%；50 μmol/L时为(17.25±2.0)%、(45.78±2.7)%、（63.58±3.5)%、(78.63±3.6)%，差异有显著性意义(P

Raji细胞凋亡率的变化

细胞凋亡率随姜黄素浓度增高而逐渐增加，两种浓度（12.5和25 μmol/L）的药物与对照组比较均能明显诱导细胞凋亡(P0.05)（附表）。Table. Apoptosis ratio of Raji cells (%) inducted by various concentration of curcumin at 24 hours（略）

姜黄素对Raji细胞p300及HDAC1 mRNA表达的影响

姜黄素IC50浓度时，光密度扫描显示第6小时的HDAC1和p300 mRNA表达已经下降，随着时间延长，表达逐渐降低，呈时间依赖性（图2）。

姜黄素对Raji细胞p300及HDAC1蛋白表达的影响

姜黄素IC50浓度处理Raji细胞6小时后p300和HDAC1蛋白表达开始下降，随着作用时间的延长，其表达呈时间依赖性降低(图3)。

讨 论

姜黄素(curcumin，cur) 系从中药姜黄中提取的酚性色素，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血脂等广泛的药理作用，最近美国国立肿瘤所(NCI)将其列为第三代防癌药物，进行临床研究。大量资料证明，姜黄素能直接抑制肿瘤细胞的长，并能诱导细胞的凋亡，其作用机制主要是调控癌基因和抑癌基因［6，7］。此外，姜黄素还能抑制人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和细胞有丝分裂的产生及抑制核转录因子NF-κB和AP-1的活性［8］。本实验通过细胞增殖实验研究姜黄素的抗肿瘤的机制，结果表明姜黄素能有效抑制Raji细胞增殖，诱导其发生凋亡，且呈明显的量效关系和时间依赖性，与文献报道一致［9］。

p300是一种具有组蛋白乙酰化酶活性的转录因子，对重要生物功能如细周期调控、细胞分化、凋亡等具有重要作用［10］。p300的一个特征是具有HAT的活性，通过募集p300相关辅助因子(PCAF)对靶组蛋白进行乙酰化，多种转录因子的乙酰化调节都与p300有关。Xiao等［11］发现，p300是HDAC抑制剂TSA诱导和SP1介导的P21WAF1转录所必需的，p300共转染可升高P21WAF1启动子活化，而且可以导致P21WAF1相关蛋白H3和H4高乙酰化。研究表明，在急性白血病、乳腺癌、肝癌和直肠癌中p300可发生多种形式的基因变异［3］。姜黄素作为一种新型、低效的抗癌药物，作用于生物体细胞时，细胞内的p300的表达水平如何变化？本研究结果发现，姜黄素 IC50浓度以时间依赖作用抑制Raji细胞p300的表达，最早在12小时时即显示对p300的抑制作用，48小时时抑制水平最高。RT-PCR检测发现，p300 mRNA和蛋白水平显著下降，提示姜黄素可能是通过下调p300 mRNA的表达及阻断其蛋白产物抑制细胞增殖，诱导其凋亡细胞，其发生的机制可能是通过阻断p300的转录激活，降低诱导基因表达，从而抑制肿瘤细胞生长。

组蛋白乙酰化/去乙酰化修饰是基因转录调控的关键机制之一。真核细胞内细胞内组蛋白乙酰化酶(histone acetylase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC1)活性的平衡调控核小体核心组蛋白的乙酰化水平及相关基因的转录活性。HAT/ HDAC1活性紊乱则会使基因表达失控，从而导致癌症的发生。白血病细胞中由于染色体异位募集HDAC，导致不适当的组蛋白去乙酰化而使基因表达受抑和白血病发生［12］。有研究表明，急性白血病细胞染色体移位产生融合基因PML-RARα和AML-ETO，两者编码产生的融合蛋白可以募集HDAC，抑制分化基因的转录和表达，细胞分化成熟受阻，导致恶性增殖。维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化时，可以使HDAC1从被募集位点解离，沉默基因得以表达，从而诱导细胞分化。抑制HDAC活性，也抑制了组蛋白的去乙酰化作用，核小体组蛋白乙酰化水平升高，染色体结构松弛有利于转录因子与DNA的结合，基因表达增强［13］。有研究表明，HDAC1可通过抑制hTERT mRNA的表达来下调端粒酶的活性，而端粒酶的活性与肿瘤细胞的永生化密切相关，进而证明HDAC1在肿瘤细胞中存在高表达［14］。本研究发现，姜黄素IC50浓度作用Raji细胞12小时可见HDAC1 mRNA及蛋白水平降低，而且持续48小时以上，说明组蛋白的去乙酰化得到阻止，可能是组蛋白乙酰化水平直接影响肿瘤的进程，而姜黄素可以诱导多种肿瘤细胞的生长停滞和分化，进而证明了组蛋白去乙酰化在肿瘤发生预防中的作用。这提示姜黄素抑制HDAC1的表达可能导致体内许多细胞增殖关键性基因转录降低。

本研究发现，姜黄素能够抑制p300及HDAC1的表达，而且呈时间依赖性，说明姜黄素是通过多种途径抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化和凋亡的。因此，我们认为姜黄素可以通过抑制p300及HDAC1活性，诱导组蛋白高乙酰化，调节基因表达，从而发挥抗癌效应，是一种新型抗肿瘤治疗的新的分子靶向药物。

【参考文献】

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