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近年来有关黄芪的抗肿瘤作用研究较多,但对其抗肿瘤作用以及作用机制等方面的综合性综述较为罕见,因此,本文就黄芪的抗肿瘤作用研究近况及相关作用机制作一综述,以期为其进一步的研究和开发提供参考。
1 黄芪抗肿瘤活性成分
黄芪多糖(-Astragalus polysaccharide,APS)在免疫、抗肿瘤、保肝等方面具有重要的药理作用。研究表明[3],应用APS 2.5、5、10、20mg/kg肌肉注射的4组剂量对小鼠移植性肿瘤S-肝癌(Heps)均有明显抑制作用。APS与IL-2联合应用可明显提高LAK对靶细胞的杀伤率,单用IL-2对靶细胞的杀伤率均为31%,而与APS联合应用对靶细胞的杀伤率可达峰值(P
2 黄芪抗肿瘤作用机制
近年来,国内对黄芪抗肿瘤作用的研究较为活跃。目前认为黄芪抗肿瘤作用机制有多个方面,包括增强机体免疫功能、直接抑瘤作用、促进肿瘤细胞的凋亡、抗肿瘤血管生成、影响机体的氨基酸代谢等。因此,黄芪在抗肿瘤治疗时的应用比较广泛,常为辅助用药[14-29]。
黄芪抗肿瘤作用主要集中在其含有的多糖类成分,其抗肿瘤作用主要表现在对免疫系统的作用。
2.1 对体液免疫的作用。
据报道[29-37],黄芪对正常机体的抗体生成功能有明显促进作用,可提高小鼠的血清IgG含量。临床应用黄芪及黄芪为主的复方治疗观察表明,可使脾虚患者的IgG水平升高,使慢性肝炎患者IgG由治疗前高水平下降到正常范围,并可使感冒易感者鼻腔分泌液中的分泌型免疫球蛋白(SlgA)含量升高。黄芪水提液可使肝炎患者的总补体和各补体含量升高。除多糖外,蛋白大分子、氨基酸、生物碱类均有促进抗体生成作用。
2.2 对T细胞的影响。
据报道[29-37],中药黄芪对阻塞性黄疽大鼠血中T细胞含量有明显调节作用。建立阻塞性黄疽大鼠模型,腹腔注射黄芪(每日250mg/kg)两周,测定血中T细胞表型CD3、CD4、CD8含量和IL-2水平,并与对照组比较。结果表明,胆总管接扎3周后大鼠血中T细胞表型含量均有明显下降,其中CD4减少相对明显,IL-2亦明显下降。腹腔注射黄芪两周可使大鼠CD3、CD4、CD8升高接近正常,纠正IL-2产生的受抑状态。
3 抗肿瘤药物的研究进展
近10年来,伴随着药学和生命科学研究的飞速进展,恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正渐被阐明。以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶(蛋白酪氨酸激酶、芳香化酶、拓朴异构酶Ⅰ等)作为药物筛选靶点,发现选择性作用于特定靶位的高效、低毒、特异性强的新型抗肿瘤药,即分子靶向药(Moleculartargeteddrugs)和抗体靶向药(Antibodytargeteddrugs),已成为当今抗肿瘤药研发的重要方向。
用中医治疗肿瘤,挽救被病魔逼得走投无路的病人。金华艾克医院的医疗特色决定了它明确的市场定位,更让许多几乎绝望的病人又有了生存的转机。
艾克现象
一天100多人来抓药
创建于1999年的金华艾克医院不仅是浙江省建立最早的民营医院,还是华东地区仅有的中医抗肿瘤医院。医院现在的年门诊量在3万人以上,并在武汉开设了一家建筑面积达5000平方米的分院(武汉艾克中医院),不久他们还要在杭州、上海落户。
院长孙尚见从当年磐安供销社的中药采购员起步,一直到现在拥有浙江省特色疗法协作网理事、浙江省抗癌协会癌症康复委员会副会长、杭州市癌症康复委员会名誉会长等多个头衔,这里头颇有些传奇色彩。
今年5月起,孙尚见院长每周二都在杭州西湖区红十字会医院坐诊。第一次来了40多位病人,实际抓药的患者不到50%,更多的还在半信半疑地观望。现在,每次来挂号的超过100人,孙医生要带上两个助手帮忙抄处方、写病历才能看得完,而且看了病不拿药的几乎没有。
孙尚见和他自成一派的中医疗法赢得了患者的信任,也获得了业内的肯定。浙江省中医药学会会长、浙江省政协常委张承烈说:“肿瘤不是易治之症,也不是不治之症,而是难治之症。像孙尚见这样的医生,治好了不少肿瘤病人,我们要充分肯定他。”
解读艾克
中医能够治疗肿瘤
艾克医院和院长孙尚见的成功,必须要有一个基本的大前提,即从医学原理上讲,中医能够治疗肿瘤。以此为科学基础,艾克医院又摸索出了一套独特的疗法。孙院长说,医院已经积累了肝肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、肠肿瘤、乳腺肿瘤、白血病等各种肿瘤的验方(被证实有疗效的经验处方),几乎每个病种都有一到两个。
经验加上创新,这应该就是艾克医院能够越做越大的秘诀。
强调整体观
西医以原子论为基础,认为肿瘤是细胞的异常增生。中医则倾向于将人看成一个有机的整体,认为肿瘤的形成不仅仅是局部的有形肿块,而是全身的气血运行受阻给排毒系统造成障碍,从而导致免疫系统下降所致。因而在临床上局部肿块虽可切除得很干净,手术很成功,可过半年、一年后又发生了肿块复发、转移甚至扩散的不良后果。
因此,跟所有中医一样,孙院长主张用整体观念看待肿瘤,从解郁、软坚、破瘀、排毒的药物中寻找治疗肿瘤的有效药物。他还将自己的心得写成一本名为《中草药治疗癌症的奥秘》的书,探讨肿瘤的发生、发展、转移的相关因素和内在联系,中草药治肿瘤的原则,中草药对肿瘤的作用机理等。浙江省中医学会会长、国家级名老中医何任教授为该书作序并题写书名。
用药就像“打牌”
创办医院时,国内用中医方法来治疗肿瘤的门诊和医院,孙院长都尽可能去深入了解和研究。医院有一个主任医师组成的专家组,专门研究别人的长处,结果发现扶正祛邪法、以毒攻毒法都各有优点和局限。比如以毒攻毒法,见效是快,但复发也快,副作用比较大,试了一段时间后,孙院长就放弃了。
接诊了十多万病例后,艾克医院终于形成了自己独特的治疗方法,用攻下败毒、排毒法来驱除病人体内的邪气。药还是那些药,但孙院长认为,这就像打牌一样,要根据不同病人的不同情况,运用医生的智慧,合理搭配,布最好的局。
敢于闯
肿瘤有很多超出人们想象的东西,甚至是经典的医学书上都不曾提及的。艾克医院在确保安全的前提下,该大胆用药时毫不犹豫,也在不少领域起到了出其不意的效果。
比如肺肿瘤患者咳血,肝肿瘤患者消化道出血,如果仅仅用止血药,就是止不住。因为肿瘤出血大多属于瘀血出血或血热妄行出血,艾克医院就大胆采用了活血止血、凉血止血的药,所以血还是止住了。该院还在实践中摸索出了通过治肺来治疗肝硬化腹水、通过治肝来使白血病病人康复的经验。
中药消除肿块
许多人认为中医只能在治疗某些慢性病上有效,但孙院长认为,中药中的软坚药和解郁药对于促进肿瘤的软化以致消失大有帮助作用。软坚药可以使肿块变软,它是以一种绳锯木断、慢慢消磨的作用方式,把肿块变软,变软的肿块经过破瘀活血药的破散作用易于把肿块消散掉。
另外,肿瘤病人特别是肝癌、乳腺癌等与病人长期的精神抑郁、心情不畅有关,因为郁怒伤肝,气滞则导致血瘀,血瘀日久聚毒而成癌。所以,艾克医院几乎每个药方中都有解郁药物,并以此作为开启肿瘤治疗是否见效的一把钥匙。
自创抗肿瘤药物
在被誉为“中草药之乡”的浙江磐安县,一种名为金丝吊葫芦的中药一直被当地人看作是仙草。但它对生长环境要求也非常苛刻,只在浙江、广西、江西等省的一些山区有少量的分布。它必须生长在海拔700米的深山密林和悬崖峭壁的背阴面,上面要有散射光,旁边要有细水渗出,下面要有树叶覆盖,常年气温保持在18℃左右。不要肥田沃土,不要施肥锄草,一年只长一寸。
孙尚见院长从移栽野生金丝吊葫芦开始,最终完成了人工仿天然绿色栽培的金丝吊葫芦,并证明其功效与野生的金丝吊葫芦相等。浙江艾克野生植物有限公司联合香港艾克生物科技有限公司、浙江中医学院共同研发成功的以金丝吊葫芦为主要成分的金丝地甲胶囊也已经问世。
2003年5月,上海生命科学研究院实验证实,金丝地甲对“抑制Lewis肺肿瘤细胞、SMMC-7721肝肿瘤细胞、HL-60人淋巴母细胞性白血病细胞、SCG一7901胃肿瘤细胞、HCT-116结肠肿瘤细胞生长的抑制有明显效果。这个结论,和早些时候国家卫生部、浙江省疾控中心的鉴定结果也能相互印证。
用地道的药材
为了保证药材的疗效,艾克医院建立了强大的采购网络。处方中的鳖甲全部是从农村一家一家收购来的野生鳖;用来宁心益胃的紫芝只用浙江、江苏、江西这一带的,福建以南的坚决不用。
白花蛇舌草清热解毒的效果比较好,正宗的产地就在浙江。艾克医院有一支专门采集、收购、加工白花蛇舌草的队伍,田埂边、路边的全部不要,只要山里面没有污染的白花蛇舌草。孙院长说,浙江每年差不多2/3的野生白花蛇舌草是被他们收购的。医院还总结了一套加工白花蛇舌草的独特方法,白花蛇舌草饮片全部是绿色的,疗效很好。还有清肝用的夏枯草。如果过早采集是青色的,药性会过于寒凉;过迟采集,又变成黑色的,效果较差。只有红色的夏枯草药效才最好,但采集的合适季节只有半个月,艾克医院的夏枯草则全都选用这个时候的。
艾克忠告
小心你的生活方式
无论医学如何高明,得病总是一件不愉快的事。孙尚见院长治癌14年,他认为精神因素(中医称为“七情内伤”)、劳累过度(中医称为“过劳”)、不合理的饮食习惯(比如天天饮酒等),这三大因素是致病的罪魁祸首。
抑郁容易得病
艾克医院把解郁药放入每个处方中,正是因为不解决精神上的因素,不消除情绪上的紧张,中草药要挪动、软化甚至消除肿瘤都更不容易。解郁是切入点,治病要治本,治本要求“因”,而“因”就是来自人们的心理压力。中医认为,血的运行是靠气的推动,如果气结、气乱,就不能很好地推动血的运行,就会出现病理状态:气滞血瘀。这是诱发癌症的原因之一。
不要吃得太精细
最新研究表明:约50%的癌症与饮食因素有关,三分之一的癌症都是人们“吃”出来的。主食吃得精细了,粗粮、杂粮等食入过少,缺乏纤维素,导致大肠癌发病率升高;高脂肪、高蛋白的摄入过多已成为乳腺癌、结直肠癌发病率上升的重要原因;约有75%的头颈部癌是由饮酒和吸烟造成的;另外喜食偏硬、过热、过烫、刺激性(烈酒、胡椒、醋、辣椒)食物及酸菜,可诱发食管癌;有暴饮暴食习惯、喜好甜食和油腻者是胰腺癌的高发人群。
学会自我减压
中医认为,如果过度劳累、免疫力下降,邪气就会入侵,从空气吸入的、体内残留的毒就不能排出体外,毒聚日久即成癌症。长期超负荷工作,渐渐积淀成一层又一层的潜在致病因素,致使许多人因劳累而疾病缠身。这种疲劳症大都表现为:浑身乏力、睡眠不稳、记忆力减退、经常头痛、腰酸背痛、食欲不振、视觉紊乱、关节疼痛等。但到医院去检查,却又没有明显的病症。可是这种“疲劳”是比较严重的隐疾,如果不用心采取一些有效的措施加以防范、改善,时间长了就会酿成大祸。因此,大家都要学会自我调节,适当的时候给自己减压,保证身体健康才是根本。
是否具有癌症性格
现代肿瘤学的研究证明,大多数肿瘤病人都有一种“癌症性格”。心理学家设立了一个问题答询表:
1.你感到很强的愤怒时,能否把它表达出来?
2.你是否不管什么事都尽可能把它做好,连怨言也没有?
3.你是否认为自己是个很好的人?
4.你是否在很多时候都觉得自己没有价值?是不是常常感到孤独、被别人排斥?
5.你是否正在全力做你想做的事?你满意自己的社交关系吗?你对于常常能发挥人的潜力相当乐观吗?
6.如果现在有人告诉你,你只能再活6个月,你会不会把正在做的事情继续下去?
7.如果有人告诉你,你的病已到了晚期,你会不会有某种解脱感?
【摘要】 目的 探索中药复方921粗提物抗肿瘤药效的作用机理。方法 用大分子生物合成法、细胞周期法、Western Blot法,检测中药复方921粗提物在体外对人前列腺癌细胞PC-3M生长抑制作用。结果 中药复方921粗提物对肿瘤细胞的DNA合成有抑制作用,经72 h作用后能将细胞阻滞于S期,并能诱导S期相关蛋白CyclinA表达下调。结论 921方抗肿瘤作用的机理可能与抑制肿瘤细胞DNA合成、诱导CyclinA蛋白表达下调并进而导致细胞周期S期阻滞有关。
【关键词】 中药复方921;抗肿瘤;机理研究
Key words:the extracts of prescription 921;anticancer activity;mechanism study
921方[1]由龙葵、猪苓、莪术、女贞子、王不留行、补骨脂组成。在前期的实验中发现,其具有一定的体内和体外抗肿瘤药效[2],且毒性较小。为进一步了解其抗肿瘤作用机理,对其进行实验研究。
1 实验材料
1.1 药物
中药复方921,将莪术提取挥发油,药渣和猪苓、龙葵混合,水提并浓缩至稠膏;另取补骨脂、王不留行、女贞子用乙醇提取至稠膏;二者合并,混合、干燥、粉碎,制成颗粒,喷加入挥发油,密封包装,于阴凉干燥处保存。
1.2 细胞株、试剂
前列腺癌PC-3M细胞株,北京大学泌尿外科研究所传代保存;RPMI 1640培养基、胰酶,均为GIBCO产品;小牛血清,杭州四季青公司产品。3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、3H-尿嘧啶核苷(3H-UR)、3H-亮氨酸(3H-Leu)均为中国原子能研究院产品。丽春红S(poncean S)、SDS Na(十二烷基磺酸钠)、DTT、过硫酸胺(APS)、TEMED、聚丙烯酰胺(Acrylamide)、小牛血清白蛋白(BSA)、Tween 20均为美国Sigma公司产品。NP-40、考马斯亮蓝G250为FLUKA公司产品。考马斯亮蓝R-250,英国进口分装、中国医药公司北京采购供应站供应。Triton X-100由香港FARCO公司提供。苯甲基磺酰氟(Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride,PMSF)为宝灵曼公司进口产品。琼脂糖(Agarose)为Promega公司产品。三羟甲基氨基甲烷(Tris)为Gibco公司进口。
1.3 仪器
Beckman LS-9800型液闪计数仪。COULTER EPICS-XL型流式细胞光度仪、碘化丙啶(propidium iodide;PI)均为美国Sigma公司产品。
2 实验方法
2.1 DNA、RNA和蛋白质等大分子生物合成检测
取对数生长期的人前列腺癌细胞PC-3M,消化计数制成2×105/mL的细胞悬液,按每孔100 μL接种于96孔板,置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。随后,加入100 μL含不同浓度药液和溶剂对照的培养基,同时设空白对照组(不加细胞),每组平行3孔,置于培养箱继续培养12、24 h。在终止作用前4 h,每孔加入3H-TdR、3H-UR和3H-Leu,终浓度为1 μCi/孔。4 h后吸出含同位素标记的溶液,每孔加入0.25%胰酶60 μL,于37 ℃消化30 min。用自动细胞收集器将每孔细胞分别收集于玻璃纤维膜上,蒸馏水冲洗20次,取出膜,置于红外烤箱中80 ℃干烤15 min,剪下膜片,分别置于经相应标记的液闪瓶中(内装4 mL闪烁剂、0.4%PPO和0.01%POPOP的二甲苯溶液),暗处放置15 min后,用液闪计数仪测定每个样品的cpm值。
2.2 细胞周期检测方法
取处于对数生长期的PC-3M肿瘤细胞,制成浓度为3×105/100 mL培养瓶的细胞悬液。24 h后分成4组,分别为对照组和高、中、低(贮存母液稀释度:1∶5、1∶10、1∶20)不同药物剂量组。分别于加药后24、48、72、96 h,收集贴壁和悬浮细胞,离心后用4 ℃预冷1×PBS洗涤,再离心,经预冷1×PBS溶解后加入70%乙醇5mL固定过夜。离心去乙醇,用预冷1×PBS溶解,再次离心并溶解于0.5 mL Propidium iodide染液(PI 2 μg/mL,RNase 1 mg/mL,Glucose 1 mg/mL,PBS 1 mL)中。置于4 ℃暗处染色反应1 h。随后经300目筛过滤后上样,进行流式细胞仪检测。
2.3 Western Blot杂交分析蛋白表达方法
用921方稀释液1∶5、1∶10、1∶20的不同浓度,分别作用于生长期细胞72 h,提取收集全部细胞,提取总蛋白,用G-250法测定蛋白含量,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,并用半干电转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,随后用TTBS在4 ℃封闭非特异结合位点过夜,经一抗孵育、漂洗,二抗孵育后,与Western显色底物在室温下反应10 min,用BCIP/NBT显色系统显示(Promega),数码相机照相。
3 结果
3.1 对前列腺癌细胞DNA、RNA和蛋白质等大分子生物合成的影响
921方对前列腺癌细胞株PC-3M的DNA合成有抑制作用,并呈现出作用时间和作用剂量依赖性(见表1),而对细胞的RNA和蛋白的合成则无显著影响。921方对前列腺癌细胞的生长抑制作用可能与抑制细胞内DNA等大分子的有效生物合成途径有关。表1 921方对前列腺癌细胞PC-3M的DNA合成抑制率(略)
3.2 对前列腺癌细胞株PC-3M细胞周期的影响
921方体外加药,在不同稀释度、不同作用时间时均体现出S期阻滞作用,并具有剂量依赖性的增加细胞S期比例,尤其经921方1∶5稀释度作用72 h后,甚至使得G2/M期细胞缺失,使得细胞完全阻滞在S期。这与前述的DNA合成抑制有一定联系。以此推测,药物可能通过影响S期中的某些重要功能分子而起到S期阻滞作用。结果见表2。表2 921方对体外PC-3M细胞周期分布的影响(略)
3.3 921方对S期相关蛋白CyclinA、CyclinB、p21、p27表达的影响
Western Blot分析表明,921方对CyclinA的蛋白表达有明显的抑制性影响,并呈现出一定的量效关系,中剂量对p21蛋白的表达也有一定影响,但对p27和CyclinB则影响不大(见图1)。结果显示,药物对前列腺癌细胞PC-3M的S期阻滞作用,可能通过诱导S期相关蛋白CyclinA的表达下调而起作用。
3 讨论
921方抗肿瘤作用的机理可能与抑制肿瘤细胞DNA合成、诱导CyclinA蛋白表达下调并进而导致细胞周期S期阻滞有关。细胞周期分为G1、S、G2、M共4个期,S期的主要特征是DNA的合成与复制,与S期相关的重要分子有许多,如DNA聚合酶、组蛋白、CyclinA、CyclinB、cdk1、cdk2、E2F、pRB、p27、p21、p107等,其中细胞周期蛋白和其激酶、抑酶常形成为一功能复合物,并发挥重要作用。CyclinA蛋白是一种细胞周期蛋白,在细胞进入S期后表达显著增高,并与cdk2和p27结合成复合物[3],在S期中发挥重要作用。而在S-G2期转换中,CyclinA则转而与cdk1结合,并继续发挥作用。大部分影响细胞周期的药物都是通过影响细胞的CDKs或CIKs等蛋白激酶而起作用,而921方是通过何种途径诱导CyclinA表达下调,尚有待深入。
参考文献
[1] 厉将斌,王 沛,那彦群,等.中医药诊治前列腺癌的经验和思路[J].中国中西医结合杂志,2002,22(6):425.
根据现代药理学研究,主要有两大类抗肿瘤中药:一类是细胞毒药物,即对肿瘤细胞具有直接杀伤作用,主要含有天然抗肿瘤活性成分,可直接抑制肿瘤细胞的生长。第二类是具有免疫增强作用、生物反应调节剂样作用的药物,通过调节脏腑气血阴阳的失衡,改善机体全身的病理状态,增加机体自身的抗病力。有些中药的某类成分属于免疫促进剂,携带特定信息,易被遭受肿瘤细胞作用的机体正常组织所识别,使受损的免疫功能恢复至正常水平。这些中药通过作用于机体的调控物质,相当于中医所说的阴阳二象,针对患者免疫功能状态进行均衡调适,达到抗肿瘤的目的[1]。运用中医药进行抗肿瘤研究须遵循中医的整体观念与辩证论治,在探讨中医药抗肿瘤的具体规律时则须借助现代科技手段从微观方面加以阐述。当前,对中医药抗肿瘤作用的研究已经发展到细胞水平、分子水平甚至基因水平,现将不同中药的作用机制简述如下。
1 对肿瘤细胞的作用
1.1 诱导细胞分化 肿瘤细胞的诱导分化治疗是肿瘤治疗的研究热点之一,诱导肿瘤细胞向正常细胞分化作为一种潜在的治疗方法已经受到重视。丹参酮对人宫颈癌细胞株(ME180)具有较好的诱导分化作用,经处理后细胞形态向良性分化、生长缓慢、集落形成率明显降低,细胞RNA杂交发现c-myc、Ha-ras癌基因表达明显降低[2]。端粒酶是一种特殊的逆转录酶,为RNA和蛋白质的复合体,它可弥补染色体由于细胞分裂出现的末端进行性缩短,使细胞无限增殖,导致肿瘤发生,故而,可将端粒酶视为肿瘤细胞增殖的指标。苦参碱处理的人白血病细胞株K562,形态趋向红细胞系分化,同时端粒酶活性明显降低[3]。
1.2 促进细胞凋亡 促进肿瘤细胞凋亡是许多中药杀伤肿瘤细胞的重要途径之一。许多抗肿瘤中药对细胞周期有特异的阻断作用,这种作用受多种基因精确又复杂的相互调控,最终通过这些基因表达的蛋白质实现对细胞增殖表型的直接调节[4~6]。大多数抗肿瘤中药为细胞周期特异性药物,主要杀伤处于增殖期的细胞,特别是S期和M期细胞。还有的中药通过抑制DNA合成过程中所需的DNA 拓扑异构酶和DNA聚合酶活性,干扰DNA复制、抑制DNA合成,最终抑制肿瘤细胞生长。根据丹参酮抗肿瘤细胞的实验结果[2],丹参酮的抗肿瘤机制可能是抑制DNA聚合酶活性,阻止细胞进入S期,从而抑制肿瘤生长。抗肿瘤方剂(当归补血汤:黄芪、当归等)能明显诱导p53蛋白高度表达,当p53蛋白表达量增高到一定程度后,可以经过信息传递系统途径使细胞周期阻滞于分裂期[7]。大蒜油可促进人胃癌BGC-823细胞的抑癌基因p53表达,抑制细胞恶性增殖、诱导肿瘤细胞凋亡[8]。羊藿苷能使凋亡相关基因bcl-2、c-myc表达下降[9]。As2O3对bcl-2基因的表达,无论从RNA水平还是蛋白质水平都有下调作用,已被用于治疗急性早幼粒细胞白血病[10]。这些发现为应用促进细胞凋亡中药治疗恶性肿瘤提供了有利的依据。
1.3 调节细胞信号传导通路 机体内任何化学物质如激素、神经介质、生长因子以及各种药物分子,都不能直接进入细胞内部产生效应,而必须通过和细胞相关受体结合,经信号转换,把信息传递到靶部位产生作用。因此,从信号通路的角度研究中医药抗肿瘤机制,具有重要的理论意义和实际价值。黄姜素通过抑制蛋白质激酶、酪氨酸激酶活性以及花生四烯酸代谢,阻碍细胞的信号传导,从而触发肿瘤细胞凋亡。某些中药所含的槲皮素诱导肿瘤细胞凋亡的机制与蛋白激酶C(PKC)、cAMP等信号分子有关:PKC可拮抗糖皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡,槲皮素作为PKC的拮抗剂,能逆转这种作用。许多实验和事实表明,信号系统的信息传递与调节很可能是中西药对肿瘤细胞作用的共同物质基础之一[7]。
1.4 直接杀伤肿瘤细胞 许多中草药及其有效成分可通过抑制细胞增殖的物质基础,如DNA、微管和其他相关性酶,影响肿瘤细胞分型以及蛋白质合成,起到直接杀伤甚至杀灭肿瘤细胞的作用。DNA引物酶——多聚酶α以复合体形式存在于细胞核中,其功能是完成引物的合成及延长,肿瘤细胞内DNA复制十分活跃,此酶复合体的活性也明显高于正常细胞。绿茶提取物可与DNA引物酶——多聚酶α复合体非竞争性结合,改变酶的空间构象,减弱酶杀伤活性,达到杀灭肿瘤细胞的目的[11]。大蒜油对人胃癌BGC-823细胞也有直接破坏、杀伤的作用[8]。
1.5 逆转肿瘤细胞的多药耐药 肿瘤细胞对多种抗肿瘤药物产生交叉耐药性是造成肿瘤治疗失败的主要原因之一,而产生交叉耐药的根本原因在于肿瘤细胞内含有多药耐药基因,其编码的P-糖蛋白(Pgp)高表达是产生多药耐药(MDR)的主要机制。逆转MDR已成为治疗肿瘤的一个方向,也是个涵待解决的重要问题。在体外实验中有人从中药制剂筛选出Ans-11、Fww-13、Tul-17三种中药逆转剂,都能明显增强多药耐药细胞对抗肿瘤药物的敏感性,有效逆转Pgp高表达人卵巢肿瘤细胞SKVLB对长春花碱的耐药性。由于钙离子通道阻滞剂也具有逆转多药耐药作用,它们能与P170蛋白结合,使细胞内药物浓度增高,起到抗肿瘤作用,因此推测中药的抗多药耐药或许具有钙离子通道阻滞剂样作用[7]。
2 调节机体免疫功能状态
机体免疫系统具有限制肿瘤细胞生长的能力,通过改变宿主对肿瘤的生物反应,调节机体细胞和体液免疫功能,在肿瘤治疗中已经受到医学界的关注。中药对荷瘤机体的免疫调节作用是较为重要的抗肿瘤机制之一。荷瘤状态下,T细胞功能不全和受抑制使机体抗肿瘤能力下降,表现为T细胞数量减少、功能改变、T细胞亚群比例失调。随着肿瘤生长,总T细胞和Th细胞进行性下降、Th/Ts下降,其中Th细胞下降与肿瘤生长加速、扩散相一致,Ts上升伴有肿瘤的转移和扩散。有些补益类中药能诱导细胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等释放,促进淋巴细胞转化、调整T细胞亚群比例、提高NK、LAK细胞活性、提高CTL的攻击力、增强肿瘤细胞的免疫原性,使其更易遭到攻击,并使之失去转移能力而崩解。例如六味地黄汤能保护血红蛋白、白细胞、血细胞板功能,保护NK细胞活性,增强T、B淋巴细胞转化,提高肿瘤细胞内cAMP含量,增强机体单核巨噬细胞系统的吞噬功能,促进脾淋巴细胞的增殖能力,提高血中淋巴细胞数量等[12];地黄多糖可拮抗肿瘤细胞对NK细胞活性的抑制作用,改善IL-2分泌,显著提高CTL细胞活性,有效阻止CD4+T、CD8+T细胞比值上升,使具有杀伤功能的CD8+亚群处于优势地位,发挥对肿瘤的杀伤效应[13]。
3 作用于肿瘤血管
肿瘤血管生长迅速、紊乱,且分布十分丰富,肿瘤细胞的增殖、转移都与血管生长关系密切,破坏肿瘤血管是抗肿瘤治疗的重要内容。红素(从雷公藤根部分离出的一个生物活性单体)可对新生血管从多方面产生抑制作用;抑制血管内皮细胞增殖,抑制血管内皮细胞形成血管的能力、抑制血管内皮细胞迁移等[14]。有的活血药可阻止肿瘤区纤维蛋白原沉积,利于药物或免疫活性物质进入肿瘤细胞内部,甚至可以直接使肿瘤细胞变性、坏死、改善肿瘤细胞乏氧状态,增强其对放、化疗的敏感性。虎杖、穿山甲可促进纤溶、抑制血小板聚集、改善微循环,使转移灶内新生毛细血管退化。国外关于抗肿瘤血管生成的研究已进入分子水平,而中医药对肿瘤血管作用的研究还不够深入[7]。
4 抗突变作用
致癌与致突变存在的密切关系,大多数致突变物质都具有致癌作用,比如强氧化性自由基损害正常细胞、导致细胞突变,就是肿瘤发生的原因之一。固金片(人参、田七、绞股蓝等药材组成的复方制剂)能促使超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽、过氧化物酶活性提高,抑制自由基造成的损伤,发挥抗肿瘤作用。姜黄素自然产生的酚和抗氧化剂对不同致癌因子、致突变因子都有抑制作用,可以增强DNA的稳定性,保护DNA免受氧化损伤[15]。
5 展望
中药的抗肿瘤作用越来越得到国际社会的承认,它的新进展很多,而且作用机制还有很多有待于去发现、探索。在已发现的抗肿瘤药物中,中药具有作用机制和化学结构独特、时间持久、多靶点、多途径、抗肿瘤谱广、毒副作用轻等优点,是多方向、多途径、交叉发挥抗肿瘤作用等特点,对于提高肿瘤患者的治疗成功率及改善肿瘤病人的生存质量、延长生命方面都有显著疗效。中药诱导肿瘤细胞凋亡是近年来国内外研究的热点之一,这些研究一方面可以揭示中药抗肿瘤的作用和机制,进而寻找到新的更有效的抗肿瘤药,提高恶性肿瘤的治愈率;另一方面也可以进一步提示肿瘤的发生与发展的机制,进而更有效地控制恶性肿瘤的发病率。然而,目前对中药抗肿瘤作用研究得还不够具体,对机制的阐明也欠深刻,应用范围还不明确,虽然对中药及复方抗肿瘤作用在分子生物学水平上进行了广泛的研究,但应该有计划、有目的的与手术治疗、放疗、化疗相结合,以期减少不良反应,提高远期疗效,使中药及复方对肿瘤的预防和治疗的某些方面发挥其独特的优势。总之,中药对肿瘤的治疗具有巨大的潜力和不可替代的优势,随着现代免疫学和分子生物学技术的发展,中药抗肿瘤的作用机制会被进一步揭示,我们应该积极采用国内外最有效的方法加深中药抗肿瘤机制的基础和临床研究,为中医药抗肿瘤研究创造更可喜的成绩。
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恶性转化是肿瘤发生的初始步骤。细胞发生恶变时,细胞表面的整合素发生构型或表达水平的改变,从而调节细胞内外的信号转导,进而影响细胞之间、细胞与ECM间的相互作用,并最终影响肿瘤细胞的生长、存活、分化及凋亡。原位增殖是肿瘤发展的前提条件。Fawzi Aoudjit等[1]发现,整合素通过与ECM作用激活胞内多条信号通路,促进肿瘤细胞的增殖,并引起化疗耐药性。肿瘤细胞从原发部位脱落、迁移至远部位的靶器官,整合素也起了不可忽略的作用。研究表明[2]:整合素使肿瘤细胞同质性黏附下降,异质性黏附增加。ECM是肿瘤侵袭的屏障,整合素可与MMP结合并正向调控MMP的表达,直接破坏和降解ECM,从而为肿瘤细胞的转移做充分准备。整合素还可以与肿瘤细胞表面的细胞黏附分子如ICAM结合,有利于肿瘤细胞逃避免疫攻击并促进肿瘤细胞与血管的黏附[3]。肿瘤血管生成不仅为肿瘤生长提供养分,也为肿瘤细胞的转移提供通道。内皮细胞中的整合素αvβ3与血管内皮细胞生长因子受体2 (vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)相互作用,共同促进肿瘤血管新生[4]。另外,整合素还可与纤维粘连蛋白黏附,促进细胞表达Bcl-2蛋白,从而抑制肿瘤细胞凋亡[5]。
由上可见,整合素在肿瘤整个发生、发展过程中起着重要作用,以整合素为靶点的药物研究已成为肿瘤治疗的热点之一。当前的整合素靶向抗肿瘤药物按作用机制主要分为如下几类:抗肿瘤生长类药物、抗肿瘤转移类药物、抗血管生成类药物。
1?抗肿瘤生长类整合素阻断剂药物
1.1?去整合素
去整合素(disintegrins)为一类源自于出血性蛇毒的抗黏附蛋白质的总称,因其可强力拮抗整合素而得名。关于去整合素功能的研究,国内外已有的相关报道为:台湾的rhodostomin和accutin、韩国的salmosin和saxatilin、美国的contortrostatin等,这几种取自蛇毒的去整合素均有抑制血管新生、肿瘤转移与抑制血小板聚集等功效。我国的研究人员从旅顺白眉蝮蛇(Gloydius blomhoffi brevicaudus)中提取的去整合素Adinbitor可通过抑制Akt相关信号转导分子的作用而抑制SSMC7721细胞增殖和迁移,并促进其凋亡[6]。尽管去整合素独特的结构特征理论上可以治疗多种相关疾病,但从临床治疗考虑,还需要找到功能特异的去整合素。
1.2?Etaracizumab
Etaracizumab,又被称为MEDI-522或Abegrin,由美国MedImmune公司研究开发。它是将鼠抗人整合素αvβ3单克隆抗体LM609进行人源化而获得。由于整合素αvβ3在某些恶性肿瘤中高表达,如黑色素瘤、晚期神经胶质瘤和肾细胞癌,临床前体内外实验结果etaracizumab可通过直接抑制黑色素瘤生长和间接抑制血管新生起到良好的抑瘤效果。目前正在进行etaracizumab治疗高转移性黑色素瘤的Ⅱ期临床试验[7]。Etaracizumab还能直接作用于肿瘤细胞并通过抑制破骨细胞的黏附影响受损的骨质吸收,达到有效减少骨转移的作用[8]。
1.3?Volociximab
Volociximab 是一种嵌合的单克隆抗体,由美国Biogen Idec公司研发。它能够阻断纤连蛋白与整合素α5β1的结合,直接抑制肿瘤细胞生长,也可通过抑制内皮细胞增殖,诱导内皮细胞凋亡间接起到肿瘤抑制效果。目前volociximab的安全性评价、药动学和药效学实验均已完成,正在进行的Ⅱ期临床试验显示,volociximab对晚期卵巢癌患者呈现良好的安全性和耐受性[9],对其治疗多种实体瘤及与化药联用的效果的探索正在进行中[10]。见表1。
2?抗肿瘤转移类整合素阻断剂药物
2.1?S247
S247是含RGD序列的合成多肽。它是整合素αvβ3阻断剂,目前正处于临床前研究。BALB/c小鼠转移模型显示,S247可以抑制结肠癌肝转移,并诱导内皮细胞凋亡。体外实验显示,S247可抑制HUVEC(人脐静脉内皮细胞)生长和集落形成能力,并可抑制肿瘤细胞侵袭能力[11]。
2.2?PSK1404
PSK1404是整合素αvβ3的非肽性拮抗剂,它能通过抑制破骨细胞介导的骨质吸收有效减少肿瘤骨转移。由于MDA-MB-231细胞高表达整合素αvβ3,乳腺癌细胞骨转移模型中,PSK1404能有效抑制乳腺癌骨转移,并减少骨组织破坏和骨骼肿瘤负荷[12]。
2.3?CNTO95
CNTO95是完全人源化的且能够识别多个αv整合素的单克隆抗体,它能阻断整合素介导的细胞黏附和运动。体外研究表明CNTO95能通过降低细胞与vitronectin(玻连蛋白)的粘附能力抑制肿瘤细胞的侵袭能力,人工乳腺癌转移模型显示CNTO95能显着抑制MDA-MB-231细胞肺转移[13]。Ⅱ期临床试验治疗晚期黑色素瘤也表现出良好的安全性[14]。
2.4?ATN-161
ATN-161是不含有RGD序列的整合素抑制多肽,它可以与多种整合素的β亚基结合,在多个临床前研究模型中显示出良好的抗肿瘤活性。体外试验显示,ATN-161能抑制乳腺癌生长和转移。在结肠癌肝转移的小鼠模型研究中发现,较其他单一疗法,使用ATN-161与氟尿嘧啶(fluorouracil)联合治疗能明显减少肿瘤负荷和肝转移[8]。I期临床试验中,ATN-161抗肿瘤效果、耐受性及安全性均良好。目前,ATN-161正处于Ⅱ期临床研究阶段[15]。见表2。
3?抗血管生成类整合素阻断剂药物
血管新生在肿瘤的发展尤其是转移过程中至关重要,抗血管生成疗法已成为肿瘤治疗的热点之一。血管生成类抑制剂特别是内源性多肽,由于特异性强、安全性好、副作用小以及固相合成多肽技术的成熟而显示出良好的应用前景。
3.1?Cilengitide
Cilengitide(EMD121974)是环状含RGD序列的五肽,由EMD/Merck KGaA公司研究开发[16]。它是整合素αvβ3和αvβ5抑制剂,临床前实验证明可抑制内皮细胞增殖和迁移。Ⅱ期临床治疗多形性胶质母细胞瘤显示,无论是单一治疗还是与其它方法结合,Cilengitide抗肿瘤效果显着且安全性好。正在进行的治疗非小细胞肺癌和头颈部鳞状细胞癌的Ⅱ期临床试验也表现出良好的安全性。Ⅲ期临床试验也正在进行中,但还未见数据报道。基于良好的药效和安全性,Cilengitide必将得到广泛的应用。
3.2?Tumstatin
Tumstatin是来自Ⅳ型胶原的非胶原结构域的28 kD的片段,它的作用靶点是整合素αvβ3。Tumstatin已被证明具有抗血管生成的活性,并且与贝伐单抗联用比单独使用时,对人肾细胞癌移植瘤显示出更好的抗肿瘤效果[17]。Tumstatin应用于人喉鳞状细胞癌也显示出显着的抗肿瘤效果,治疗组肿瘤组织坏死增多,血管密度显着降低[18]。目前,Tumstatin仍处于临床前研究阶段。
YSNS基序是Tumstatin中影响其生物活性的重要部分,YSNSG是在YSNS残基加上β-转角形成的稳定环肽,作用靶点是整合素β1。它在体外可以抑制内皮细胞及黑色素瘤细胞黏附和迁移,体内黑鼠黑色素瘤移植模型结果显示YSNSG可抑制肿瘤生长和血管新生[19]。YSNSG比tumstatin分子量小,结构稳定且活性好,有着巨大的应用前景。
3.3?Pentastatin
Pentastatin来源于Ⅳ型胶原,作用靶点是整合素αvβ3和αvβ1,能显着抑制内皮细胞增殖和迁移。裸鼠人乳腺癌和小细胞肺癌移植瘤模型结果也表明,Pentastatin可显着抑制肿瘤生长,降低肿瘤血管密度 [20]。Pentastatin是利用生物信息学方法分析血管生成抑制剂的同源性序列,筛选候选化合物而得到[21]。
3.4?其他血管生成抑制剂
还有许多整合素阻断剂处于临床前研究阶段,并具有广阔的应用前景。例如,含RGD的多肽HM-3和EDSM-Y,作用靶点为整合素αvβ3。含RGD-4C的多肽AP25,作用靶点为整合素αvβ3和α5β1。这三种多肽在体内外试验中都表现出显着的抗血管生成和抗肿瘤活性,且安全性好,毒副作用小。研究表明,这三种多肽均能显着抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移和管状结构的形成,且能抑制大鼠动脉环培养过程中毛细血管样管状结构的形成和鸡胚尿囊膜(CAM)的血管增生。在小鼠移植瘤模型中,它们均能有效抑制肿瘤生长,且与紫杉醇、顺铂等化疗药物相比细胞毒性明显减小。免疫组织化学结果表明,治疗组小鼠肿瘤组织出现大面积坏死,与对照组相比血管密度也明显降低[22-23]。目前,HM-3已完成所有的临床前研究,正在申报临床研究;EDSM-Y和AP25的临床前研究也在系统地进行中。另外,将HM-3用不同分子量的聚乙二醇(PEG)修饰后得到的PEG修饰的HM-3,在保留其原有抗血管生成活性的基础上大大延长了体内半衰期,使其抗肿瘤效果得到了进一步提高。相对于修饰前的HM-3,PEG(20k)-HM-3的体内半衰期延长了40余倍[24-26]。见表3。
4?以整合素为靶点的其他抗肿瘤药物及疗法
4.1?化学药物的靶向化
肿瘤化疗虽然具有一定疗效,但化学药物细胞毒性大,易产生耐药性,会引起肿瘤复发和转移,给肿瘤患者带来极大的痛苦。某些抗肿瘤药物偶联上RGD肽,通过与肿瘤血管内皮细胞表面上的整合素αvβ3的特异性结合,达到肿瘤靶向给药的目的,既减少了用药量,也大大降低了副作用。Cao等[27]对偶联上RGD的紫杉醇的研究表明,与紫杉醇相比,偶联上RGD的紫杉醇也能显着地抑制肿瘤细胞增殖,但副作用大大减小。
4.2?以整合素为靶点的中药研究
许多活血化瘀中药及其有效成分均具有抗肿瘤转移的作用,如川芎嗪、丹参素和隐丹参酮等,它们都是通过靶向整合素来发挥作用的。这提示:以整合素为靶点结合新药筛选技术,对活血化瘀中药进行抗肿瘤体内外活性筛选,有利于开发具有自主知识产权的抗肿瘤中药。开展以整合素为靶点的中药研究,对丰富发展我国的中医药理论具有十分重要的意义[28]。
4.3?整合素介导的基因治疗
从分子生物学的角度,恶性肿瘤的发生是某些基因突变使细胞生长失控所致,因此基因治疗是肿瘤治疗的最根本方法。将整合素作为基因治疗的靶点,针对整合素亚基设计特异性反义寡核苷酸降低肿瘤细胞相应的整合素表达,从而调节整合素介导的生物学作用,诱导肿瘤细胞和血管内皮细胞凋亡。同时,反义寡核苷酸还能增强肿瘤细胞的化疗敏感性。整合素介导的基因治疗是近年来肿瘤治疗的热点之一。
4.4?整合素介导的其他治疗
某些整合素在正常的内皮细胞不表达或者表达量少,在肿瘤细胞和血管内皮细胞表达明显升高。因此,可将整合素作为肿瘤的特异性标记物。将整合素配体与细胞毒素等连接后,可使细胞毒素直接靶向到肿瘤部位。用异基因的血管内皮细胞疫苗打破机体对自身血管内皮细胞的免疫耐受,诱导抗自身肿瘤血管的免疫反应,可破坏肿瘤新生血管,抑制肿瘤生长。可以设想将以上两种方法结合,利用整合素配合疫苗,可诱导机体对自身肿瘤的主动免疫应答,发挥预防和抗肿瘤的双重作用[29]。
5?结论
作为细胞间及细胞与细胞外基质的桥梁,整合素在血管生成和肿瘤细胞转化、生长、侵袭、转移及凋亡过程中起重要作用,为治疗肿瘤提供了新思路。本资料将整合素阻断剂类抗肿瘤药物分为抗肿瘤生长类药物、抗肿瘤转移类药物、抗血管生成类药物,只是按其主要作用机制简单的划分。事实上,一种整合素阻断剂往往具有多方面的抗肿瘤作用,这也是以整合素为靶点进行抗肿瘤治疗的重要原因之一。