牛血清白蛋白

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牛血清白蛋白范文第1篇

目的研究龙葵对大鼠实验性肾炎的药理作用。方法采用静脉注射小牛血清白蛋白造成大鼠肾炎模型，按体重给予龙葵提取物35 d，观察龙葵给药后大鼠各项指标的变化。结果龙葵提取物可使给药组动物24 h尿蛋白排出明显减少，血清尿素氮及血清肌酐含量显著降低，大鼠肾小管内的蛋白管型大小和数量明显减少，灶性出血明显少于模型组。结论龙葵提取物对小牛血清白蛋白所致大鼠实验性肾炎有明显的防治作用。

【关键词】 龙葵提取物 大鼠 实验性肾炎

慢性肾炎在临床上是一种多发病、常见病，较难治愈，临床上以蛋白尿为常用诊断指标，而目前仍以激素及免疫抑制剂为主要治疗手段。近年来，以中医药治疗慢性肾炎已成为研究的热点。龙葵为茄科茄属植物龙葵Solanum nigrum L.的全草，含有多种化学成分及药理作用，药源广泛，易于采集，具有相当重要的生产及研究价值。本实验采用小牛血清白蛋白所致的大鼠实验性肾炎模型来观察龙葵提取物的药理作用，现将结果报道如下。

1 材料与仪器

1.1 动物SD大鼠，各半，清洁级，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：SCXK（沪）2007-0005。

1.2 试药龙葵提取物(0.2 g/丸)：含生药2.278 g/g，批号20071115，江苏省中医药研究院制剂室提供；济生肾气丸：6 g/丸，国药准字Z12020082，批号20070106，天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂。加蒸馏水研匀，配成适宜浓度的混悬液备用；小牛血清白蛋白：1g/瓶，批号20070601，上海生物化学公司进口分装；尿蛋白试剂盒（批号20070625）、肌酐试剂盒（批号20070606）、尿素氮试剂盒（批号20070606）由南京建成生物工程公司生产。

1.3 仪器 贝克曼DU-640紫外分光光度计，美国产；HH-60型快速恒温数显水浴箱，常州国华电器有限公司生产；大鼠代谢笼：苏州实验动物笼具厂生产；Axioskop 2 plus 高级生物显微镜及Axiovision 图象分析处理系统：德国ZEISS公司生产。

2 方法与结果［1～3］

大鼠60只，各半，体重180～220 g，随机分为6组，即：正常组、模型组、济生肾气丸组(2.5 g生药/kg)、龙葵提取物高(2.5 g生药/kg)、中(1.25 g生药/kg)、低剂量组(0.75 g生药/kg)。大鼠按组开始给药，正常组及模型组均灌胃给予同体积的蒸馏水，共给药35 d。于第14天，除正常组外，其余大鼠均一次性尾静脉注射小牛血清白蛋白1 g/kg。给药35 d后，将大鼠置于代谢笼，收集24 h尿，并测定尿蛋白含量，同时采血分离血清，测定血清中肌酐、尿素氮浓度。最后将大鼠处死，两侧肾脏固定于10%甲醛中，作病理组织学检查，病变程度由-、+、++、+++分别计为1，2，3，4分，并由Axiovision 图象分析系统记录和分析病理组织学图片。实验结果均采用组间t检验进行统计。实验结果见表1～2。

由表1～2可见，模型组大鼠24 h尿蛋白排出量明显高于正常组，血清肌酐及血清尿素氮含量均比正常组有显著增高，而24 h尿量未见明显变化。本品给药组大鼠24 h尿蛋白排出量比模型组明显减少，血清肌酐及血清尿素氮水平均显著降低。病理镜检可见，模型组大鼠肾小球数目约17～20个/10×10视野，皮质及髓质内部分肾小管内见片状红染透明的蛋白管型，肾间质内可见灶性出血，偶见皮质内小管周围小灶性淋巴浆细胞浸润。而给药组大鼠肾小管内的蛋白管型大小和数量明显减少，灶性出血明显少于模型组。

表1 龙葵提取物对小牛血清白蛋白肾炎模型大鼠尿蛋白及血清生化指标的影响（略）

与模型组比较，*P

表2 龙葵提取物对小牛血清白蛋白肾炎模型大鼠病理指标的影响（略）

与模型组比较，*P

3 讨论

本实验采用小牛血清白蛋白所致的大鼠实验性肾炎模型来观察龙葵提取物的药理作用。实验结果表明，龙葵提取物能显著减少小牛血清白蛋白肾炎模型大鼠的尿蛋白排出，降低血清肌酐和血清尿素氮水平。病理结果显示，模型组与正常对照组比较，其肾小球数无明显变化，但蛋白管型及出血灶明显高于正常对照组，而龙葵提取物各给药组蛋白管型明显减少，出血灶明显减少。上述结果表明，龙葵提取物对小牛血清白蛋白引起的大鼠实验性肾炎有较显著的改善作用。这也从实验方面为龙葵应用于临床提供了理论依据。

参考文献

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牛血清白蛋白范文第2篇

关键词：有机牦牛；背最长肌；冷藏肉；生鲜肉；蛋白质组学

肉类产品食用品质的大幅下降引发了人们对现代肉品品质及其评价标准的深入思考，寻找一种科学的肉品品质评价方法并对其品质进行控制已成为国内外研究的热点。肉品品质的形成机理与肉质性状高度相关，而几乎所有的肉质性状都受到复杂的基因和蛋白质调控。已有的研究主要集中在对猪肉等肉质进行感官、理化特性和组织学特性的评价，尚未见到应用差异蛋白质组学方法对青藏高原有机牦牛宰后生鲜肉及冷藏肉品质的形成机理、评价和控制进行研究的报道。

本研究以同一饲养环境和屠宰条件，宰后以不同贮藏温度（4、18 ℃）、不同贮藏时间（0、24 h）的生鲜和冷藏有机牦牛肉作为研究对象，以差异蛋白质组学技术为研究平台，筛选与分析生鲜和冷藏的有机牦牛背最长肌肌肉的差异蛋白质，为进一步探讨有机牦牛肌肉加工过程蛋白质的降解规律提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青藏高原有机牦牛背最长肌肌肉组织取自青海省河南县有机牦牛背最长肌（第七根胸椎到最后一根胸椎），保存备用。

2D裂解液、蛋白质定量试剂盒、IPG缓冲液 美国Bio-Rad公司；尿素、硫脲、3-[（3-胆酰胺丙基）-二乙胺]-1-丙磺酸（3-（3-cholamidopropyl）dimethylammoniopropanesulfonic acid，CHAPS）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、Tris-HCl、甘油、碘乙酰胺、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、甘氨酸 美国Sigma公司；

其余试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

双向凝胶电泳系统、固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）干胶条、Image Master 2D Platinum凝胶成像系统 美国GE公司；PD Quest软件 美国

Bio-Rad公司；5800基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight to time of fight，MALDI-TOF-TOF） 美国AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

生鲜（宰后18 ℃、0 h）和冷藏（宰后4 ℃、24 h）有机牦牛背最长肌肌肉样品每份取约0.5 g，加入1 mL 2D裂解液，匀浆（4 m/s、匀浆15 s、停顿2 min），匀浆间隙放于冰上冷却，重复操作3 次[1]。再对匀浆液进行冰浴超声破碎（100 W、超声10 s、间歇15 s），重复操作10 次，13 400 r/min条件下离心15 min，取上清液。

1.3.2 蛋白质定量

采用Bradford法进行蛋白质定量，于-80 ℃保存备用。

1.3.3 双向电泳

取总蛋白提取物100 μg，上样量为450 μL，pH 3～10非线性IPG胶条17 cm进行等电聚焦电泳，条件为：30 V、12h，500 V、1 h，1 000 V、1 h，8 000 V、8 h，500 V、4 h。等电聚焦结束后采用12.5%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）胶进行垂直电泳，条件为：15 mA/胶、30 min，30 mA/胶至溴酚蓝离胶下沿0.5 cm。垂直电泳结束采用银染法进行凝胶染色。

1.3.4 图像采集

采用Image Master 2D Platinum凝胶成像系统对凝胶进行灰度扫描。所获得扫描图像通过PD Quest分析软件进行差异蛋白质组分析。

1.3.5 质谱分析及蛋白质数据库检索

采用5800 MALDI-TOF/TOF质谱仪对差异蛋白进行质谱检测。生物质谱的操作过程：切胶胶内酶解

ZipTip脱盐抽提酶解肽段MALDI-TOF-TOF质谱测试数据分析蛋白质鉴定。利用Mascot软件搜索Uniport、Swiss-Port数据库寻找匹配的相关蛋白质。

2 结果与分析

2.1 Bradford定量

采用Bradford方法利用Nano Photometer P360超微量分光光度计对生鲜和冷藏有机牦牛背最长肌肌肉全蛋白质提取量进行测定。以1 mg/mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液制作标准曲线，以蛋白质含量（mg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，得出y=0.003x-0.020（R2=0.988）。由标准曲线公式可知，标准曲线线性关系良好，可以用于实验蛋白质含量的测定。

2.2 双向电泳

经双向电泳及银染后获得生鲜和冷藏有机牦牛背最长肌肌肉全蛋白双向电泳图谱（图1）及差异蛋白在2-DE图谱中的位置（图2）。匹配后利用PD Quest软件分析筛选差异点，实验结果显示双向电泳图谱具有较高的重复性，匹配率为75%。

通过PD Quest软件对蛋白图谱进行分析，生鲜和冷藏有机牦牛背最长肌肌肉组织的双向电泳凝胶的平均蛋白点数分别为1 840±181和2 034±86，其中具有统计学意义（P

2.3 质谱分析

选取PD Quest软件检测相对含量差异3 倍或3 倍以上的蛋白质点，手动取出凝胶上差异的蛋白质斑点（共计36 个蛋白质点），装入1.5 mL离心管中超纯水冲洗干净后进行MALDI-TOF-TOF质谱检测，结果得到7 个匹配有意义的差异蛋白质质谱鉴定结果（表1）。其中，生鲜有机牦牛背最长肌肌肉比冷藏的磷酸丙糖异构酶和热休克蛋白β-6含量上调，其余含量下调。

3 讨 论

运用蛋白质组学技术对动物肌肉贮藏过程中蛋白质组分变化的研究是目前研究的热点之一。几乎所有动物肌肉组织的蛋白质表达谱都有研究，针对青藏高原特有物种――有机牦牛，仅有少量关于感官、系水力、嫩度等理化性质方面的研究资料[2-3]，而对宰后生鲜肉及冷鲜肉品质的形成机理、评价和控制方面的研究则鲜见报道。有机牦牛肉品质是影响其商品价值的重要因素之一，因其具有复杂而多元的特性，所以研究屠宰后生鲜和冷鲜牦牛肉蛋白质变化的生理生化机制及其对嫩度等肉质性状的作用，对于探讨有机牦牛肉肌肉生长与肉品品质间的相关性以及货架期的生化反应特点具有重要的意义。

据报道，动物屠宰后肌肉细胞在一定时间内开始死亡，并根据细胞类型发生一系列独特、复杂的分子变化。动物血液循环终止后供氧停止，且不能去除新陈代谢产物，肌内糖原酵解导致乳酸积累，pH值降低，进而导致肌肉持水能力降低及钙离子释放，肌球蛋白与肌动蛋白间形成交联桥[4]。本研究发现了7 种在生鲜牦牛肉和冷藏牦牛肉背最长肌中含量有显著差异的蛋白质，其中TPI及KRT4蛋白、肌球蛋白-6、AKI4蛋白质是糖酵解和三羧酸循环的关键蛋白质。在有机牦牛肉中TPI和HSP β-6含量上调，肌球蛋白-6和AKI4含量下调，其原因可能是宰后肌肉为满足ATP供应而提高了厌氧能量代谢，这些差异蛋白质与肉品性状显著相关。Jia等[5]应用蛋白质组学方法研究牛过度生长的现象，结果表明肌肉生长抑制素基因上有11 对碱基缺失导致了13 种肌肉蛋白质发生了改变，包括收缩蛋白和代谢蛋白，这些蛋白质大部分是来自有收缩性的器官组织，并能够加快肌纤维的收缩功能，这与本研究结果相似。另外Lomiwes等[6]利用蛋白质组分析屠宰后猪肌肉的变化情况，采集了刚屠宰至屠宰后48 h肌肉的蛋白质组样品，这些肌肉蛋白质为5～200 kD不等，pH值为4～9，结果发现蛋白质组模式发生了15 种显著变化。Kim[7]、毛衍伟[8]等指出羊的双肌臀突变导致臀部肌肉异常发达主要是由于18号染色体的突变，导致钙激活中性蛋白酶抑制蛋白的活性增强了2～3 倍。

近几年通过蛋白质组学的研究，揭示了结构蛋白、糖酵解酶和热休克蛋白/伴生蛋白在肌肉嫩化中的作用[9-11]。

研究发现，根据嫩度将牛背最长肌分组，使用荧光差异双向电泳技术分析其蛋白质组后发现，表达存在差异的蛋白包括糖酵解酶和结构蛋白，高嫩度牛肉样品的肌浆蛋白质组分中肌球蛋白轻链的量相对较高，可以作为预测牛肉蛋白水解和最终嫩度的标记蛋白质[12-14]。

Dutaud等[15]研究表明，安格斯牛肉宰后成熟过程中3 种蛋白表达量降低可能由于发生了等电点沉淀，推测有机牦牛肉成熟过程中表达量降低可能由于pH值的降低，发生等电点沉淀所造成。

综上所述，通过双向凝胶电泳结合生物质谱技术测定生鲜和冷藏有机牦牛背最长肌肌肉差异蛋白质，初步筛选出生鲜肉与冷藏肉的差异表达蛋白质，涉及糖酵解蛋白、热应激蛋白、结构蛋白等，说明这些蛋白在有机牦牛肉贮藏过程中对肉品质的影响发挥了重要的作用。

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牛血清白蛋白范文第3篇

【关键词】 肾小球肾炎；动物模型；造模机制；造模方法

肾小球肾炎是由多种病理类型的原发性肾小球疾病发展而来的，以血尿、蛋白尿、高血压和水肿为主要临床表现的慢性疾病。目前认为肾小球肾炎是一种自身免疫反应性疾病，通过免疫作用而造成肾脏损害。

1 Heymann肾炎模型

本模型是通过针对自身抗原的免疫复合物（IC）诱发而成，故称其为自身免疫复合物性肾炎（autologous immunecomplex，AIC）。Heymann肾炎模型根据是否由同种动物提供抗体分为主动型和被动型两种模型。主动型Heymann肾炎模型机制:动物由自体抗肾抗体或自体抗原抗体复合物刺激引起肾小球基膜产生免疫反应形成肾炎。被动型Heymann肾炎模型机制：用甲种动物的肾皮质匀浆免疫乙种动物，使后者产生抗甲种动物的抗肾血清（抗肾抗体），然后将这种抗肾血清注射给健康的甲种动物，而使其产生肾炎。主动型Heymann肾炎，孙永宁［1］用大鼠肾皮质匀浆加弗氏完全佐剂制备乳化液，同种大鼠腹腔注射次乳化液，2 ml/只，每周注射1次，共注射7次。现研究常用模型为被动型Heymann肾炎模型。其具体造模方法［2］为大鼠后足垫注射含6.5 mg免疫γ球蛋白的完全弗氏佐剂0.25 ml后，由大鼠尾静脉注射1.0 ml兔抗FXIA抗血清，qd，共2天，造模完成。这一实验模型与人类原发性膜性肾病非常相似，其特征为弥漫性基膜增厚伴钉突形成。

2 原位免疫复合物性

肾炎模型该模型的特点是在肾小球基膜上直接形成免疫复合物。由细菌感染合并异种免疫蛋白联合作用造成模型。杨宏等［3］制作家兔原位免疫复合物肾小球肾炎模型:将大肠杆菌毒素和阳离子化牛血清白蛋白（BSA）溶于0.15 mol/L、pH值为7.2的磷酸缓冲液（PBS）溶液中，最终浓度为每1 ml溶液中含1 μg大肠杆菌毒素和1 mg牛血清白蛋白，每只兔经耳缘静脉注射2 ml预免疫，7天后开始正式免疫造模:每只免疫兔每天经耳缘静脉给予阳离子化牛血清白蛋白20 mg（预先溶于PBS溶液中），共7周。肾脏组织学检查显膜性肾小球肾炎的典型病变，故一般认为，膜性肾炎病理模型是原位免疫复合物性肾炎模型的典型病理代表。

3 马杉肾炎

此模型［4］又称Masugi肾炎、肾毒血清性肾炎、大鼠抗肾小球基膜（GBM）肾炎。其基本原理［5］是以A种动物的肾小球基膜作为抗原，与完全佐剂一起注射到B种动物身上，使之产生抗A种动物的肾小球基膜抗体，将含有此种抗体的B种动物血清给A种动物静脉注射，A种动物经过一定的潜伏期之后尿中出现明显蛋白，伴肾小球增生，终至新月体形成与完全纤维化改变，是利用异体抗GBM抗体直接诱导后产生的具有典型的人类新月体性肾炎病理变化的动物模型［6］。毕柳等［7］报道，英国Kazuhiro等用牛肾小球基膜免疫Wistar大鼠造成实验性自身免疫抗肾小球基膜肾小球肾炎。伍小波等［8］用鼠肾皮质匀浆每周3次，每次10 ml免疫大耳白兔，在最后加强免疫后第11天，从兔耳缘静脉采血测效价，利用双向琼脂扩散法测定兔抗大鼠GBM-Ab的效价为1∶16，收获血清-30 ℃保存备用。正常兔IgG加等量完全弗氏佐剂皮下注射SD大鼠进行预免疫，预免疫后第7天和第8天后从大鼠尾静脉注射稀释一倍兔血清，剂量1 ml/只，连续两天为致病免疫。本模型的优点［9］是造模简单、阳性率高、重复性好，常被用于多发性肾炎的研究。缺点是病情反应较重，易导致部分动物中途死亡，同时在人的肾炎中，与这种模型相似的发病机制的病例很少，仅限肺出血-肾炎综合征（Goodpasture综合征）。

4 系膜增殖性

肾炎（MsPGN）模型机制有以下两种，由细菌感染合并异种免疫蛋白联合作用造成模型及单纯异种免疫蛋白造成模型。朱声永等［10］复制家兔膜增殖型肾炎模型（按北京医科大学第一附属医院肾炎研究室介绍的方法复制），预免疫:每只家兔背部皮下注射牛血清白蛋白1 mg，每周1次，连续3次。第4周时每只家兔耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素1 μg，共1次。正式免疫:第3周开始每只家兔耳缘静脉注射牛血清白蛋白25 mg，每日1次，每周6次，共6周，并于最后1周中血清白蛋白剂量加倍注射。按照吴衡生法［11］制备兔模型，每只兔第1天从耳静脉一次性注射牛血清白蛋白250 mg/kg。第4周分别从兔耳静脉抽血做各项检查。第8周后处死动物，做肾脏病理检查，此病理改变与人类MsPGN极相似。由于兔模型费用昂贵，石志超等［12］制备大鼠血清白蛋白模型，即每只大鼠尾静脉注射1 g/kg结晶性小牛血清白蛋白，7天造模成功。目前，国际上普遍采用抗Thy-1抗体诱导的肾炎模型研究人类系膜增殖性肾小球肾炎的发病机制。“抗Thy-1抗体肾炎模型”可用抗Thy-1多克隆抗体或抗Thy-1单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）经静脉注射大鼠而建立。如蒋文功等［13］对单克隆抗体OX-7诱导的系膜增殖性肾小球肾炎大鼠模型的研究，经大鼠尾静脉单独注射单克隆抗体OX-7（1 mg/kg），第7天模型制作成功。抗Thy-1单抗引起的肾病可能于1周后缓解，故冯媛等［14］用单侧肾切除后3天按5 mg/kg体重静脉注射磷酸盐缓冲溶液溶解的Thy-1单抗1-22-3法造模。单纯性MsPGN模型制作方法简便易行，且病变稳定可靠，重复性好，因此越来越受到人们的重视。

5 血清病肾炎

模型它是一种经典的免疫复合物肾病模型，包括急性血清病肾炎和慢性血清病肾炎两类：急性模型由一次性大剂量注入牛血清白蛋白抗原，使动物的免疫系统产生抗BSA抗体，并和循环中剩余的抗原结合，形成循环免疫复合物（CIC）滞留于肾脏。丁秋兰等［15］按Dixon方法首先将牛血清白蛋白用生理盐水溶解。按250 mg/ml剂量1次家兔耳静脉注射，即成功制作急性兔肾毒血清性实验模型。慢性模型由多次注入牛血清白蛋白（每日1次），使动物体内抗原持续对免疫系统形成刺激，随着血清中抗BSA抗体的增多，可溶性CIC在循环中出现，分别沉积在肾小球毛细血管壁或系膜区，形成肾小球肾炎。杨解人等［16］选用新西兰大耳白兔，耳缘静脉注射C-BSA 10 mg，1次/d，共5周，第6周剂量加倍的方法成功制作家兔C-BSA肾炎模型。由于慢性血清病肾炎复制周期长、阳性率低，而急性血清病肾炎较慢性血清病肾炎模型方便省时且抗原消耗少，因而得到更为广泛的应用。

6 氨基核苷肾病模型

此模型又名嘌呤霉素肾病，属于肾毒性药物导致肾损伤造成的肾炎模型。现常用［17，18］注射盐酸阿霉素（ADR）、氯化汞、灌服碳酸锂等制造模型。彭蕴茹等［19］用盐酸阿霉素复制模型，大鼠一次性尾静脉注射盐酸阿霉素7.5 mg/kg，于第10天获得满意造模效果。

7 其他肾炎模型

如IgA肾病模型、局灶性节段性肾小球硬化模型、狼疮性肾炎模型等。20世纪70年代末Rifai等用牛血清白蛋白（BSA）作为载体交联二硝基苯酚（DNP）［6］；20世纪80年代初Isaacs等用带不同电荷的右旋糖酐经腹腔静脉注射，结果均诱发小鼠IgA肾病。刘志红等［20］每周一次，连续3周给大鼠静脉注射葡萄球菌肠毒素B（SEB）0.4 mg/kg成功地复制出IgA肾病模型。局灶性节段性肾小球硬化模型（嘌呤霉素＋一侧肾切除＋嘌呤霉素法，或5/6肾切除等）。狼疮性肾炎模型包括自发性肾炎小鼠模型及慢性移植物抗宿主病模型。这些肾炎模型由于临床病理类型的发病较少见或模型制作的繁琐复杂性而应用较少。综上所述，肾小球肾炎动物模型的研究已经越来越细致和深入。其中马杉肾小球肾炎模型因与人的发病机制相近，研究相对成熟和完善；而嘌呤霉素肾病肾小球肾炎模型的研究相对复杂和不易操作；阳离子牛血清白蛋白引起的肾炎模型的研究以其简便、高效与病理相似性而被广泛应用。另外，肾炎模型近十余年无新的研究进展，只是对原有模型的复制，如何找出既省时又经济的模型更有利于肾炎机制的阐述，也成为实验研究的迫切问题。

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牛血清白蛋白范文第4篇

关键词：大豆茎叶；蛋白质含量；考马斯亮蓝染色法

中图分类号：TS63 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）20-4610-03

蛋白质是一项质量和资源评价的重要指标[1]，用一种快速、准确、方便的方法来检测蛋白质含量是必不可少的。近年来，许多学者用考马斯亮蓝染色法和其他方法对蛋白质含量进行了测定[2-9]。蛋白质中的酰胺基团与考马斯亮蓝染料中的阴离子结合使溶液显蓝色，测定效果可通过测定显色稳定性等多个性状指标进行全面客观地评价。本试验采用盆栽大豆，对大豆的茎叶蛋白质含量与大豆产量进行考察，通过分析它们之间的影响与关系，为今后大豆育种工作提供试验方法。

1 材料与方法

1.1 材料

供试样品为大豆茎叶（实验室自制）。

牛血清白蛋白（进口分装），购于上海亿欣生物科技有限公司；考马斯亮蓝G-250（进口分装），购于中国医药（集团）上海化学试剂公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器

SHB-IIIS循环水式多用真空泵和抽滤装置（郑州长城科工贸有限公司）、EL303型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；Cary50紫外分光光度计（美国瓦里安有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质标准溶液的配制 准确称取牛血清白蛋白100.0 mg，用去离子水定容至100 mL，即为

1 mg/mL蛋白质标准液，4 ℃保存待用。

1.3.2 考马斯亮蓝G-250溶液的制备 称取考马斯亮蓝G-250 100.0 mg于研钵中，取体积分数为95%的乙醇（下同）50 mL，从中取约10 mL加入研钵，将考马斯亮蓝G-250研成粉并溶解；轻轻将上层液体转入500 mL烧杯中，再取10 mL乙醇溶液于研钵中研磨，同法收集，重复洗涤3次。最后用20 mL乙醇分次洗涤研钵，合并液体于烧杯中。取体积分数为85%浓磷酸100 mL分次加入烧杯再转入

1 L容量瓶，定容，抽滤，得考马斯亮蓝G-250溶液。

1.3.3 标准曲线的绘制 分别吸取0.2～1.0 mL标准蛋白质溶液于10 mL试管中，各管补加0.15 mol/L NaCl溶液至1 mL，各取0.1 mL于新试管中并加入5 mL考马斯亮蓝 G-250溶液，摇匀，放置 2 min，于595 nm 处测定其吸光度[7]。

1.3.4 样品中蛋白质含量的测定 取样品溶液0.1 mL，按上述方法测定其吸光度，再根据标准曲线方程计算出样品的蛋白质含量[8]。

2 结果

2.1 标准曲线回归方程的建立

用紫外分光光度计，以0.15 mol/L的NaCl溶液作空白对照，在595 nm处测定对照品溶液吸光度。以吸光度为纵坐标，蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线见图1。

通过测定不同浓度牛血清白蛋白的吸光度得其线性回归方程式：Y=0.478 3X+0.070 3，R2=0.999 3。

2.2 样品蛋白质含量测定结果

按蛋白质含量测定方法，同时做3个重复，大豆茎的吸光度为0.434 2、0.440 2和0.437 5 a.u.，大豆叶的吸光度为0.611 4、0.611 0和0.612 1 a.u.。计算大豆茎的蛋白质含量为7.608%、7.734%和7.677%，平均含量为7.673%；大豆叶的蛋白质含量为11.313%、11.305%和11.328%，平均含量为11.315%。

2.3 稳定性试验

量取同一样品溶液 1 mL，每隔 10 min 测定1次，观测其稳定性，结果见表1，表明在显色1 h 内吸光度稳定，RSD分别为0.04%和0.39%。

2.4 重复性试验

按上述方法，分别测定大豆茎和叶蛋白提取液的吸光度，检验该方法的重现性，结果见表2，RSD分别为0.83%和1.27%，小于5%，表明重现性较好。

2.5 精密度试验

准确吸取牛血清白蛋白溶液（1 mg/mL）0.5 mL进行精密度试验，连续测定其吸光度6次，其RSD为0.25%，小于5%，表明精密度较好，结果见表3。

2.6 回收率测定

取已配制好的1 mg/mL牛血清白蛋白溶液0.1 mL，加入1 mL大豆茎（或叶）样品溶液，然后再加入5 mL考马斯亮蓝染色液，摇匀，静置2 min左右，于595 nm处测定其吸光度，以不加牛血清白蛋白溶液作为空白对照，根据标准曲线算出相应浓度，然后计算加入样品蛋白的量，并计算回收率[9]，结果见表4。结果表明，该方法准确度较高，可满足大豆茎叶中蛋白含量的快速定量分析。

3 讨论

蛋白质分子均具有酰胺基团，棕红色的考马斯亮蓝G-250染料上的阴离子与蛋白质的酰胺基团结合，使溶液变为蓝色，由于溶液在595 nm处吸光度与蛋白质含量成正比，因此595 nm处测定吸光度，可计算出样品中蛋白质含量[6]。上述结果表明，考马斯亮蓝与蛋白质中的酰胺基团结合生成的蓝色非常稳定，在1 h之内吸光度值变化很小，重复性较好，精密度较高，同时该方法测定蛋白含量的回收率符合大豆茎叶蛋白质含量的测定要求。大豆茎蛋白质提取液中蛋白质含量在0.7～1.0 mg/mL范围内；大豆叶蛋白质提取液中蛋白质含量在1.1～2.0 mg/mL范围内，用考马斯亮蓝染色法测定大豆茎叶蛋白质的含量优于其他传统方法[10，11]。但另一方面，该法线性范围窄，低浓度样品易受影响，因此，在测定时所用试管须经酸浸泡，洗净后应经高温烘干。当样品浓度大于一定浓度时，须稀释测定，另外，可用乙醇和去离子水清洗比色皿上粘染的色素[12]。综上所述，该法准确率较高且简便灵敏，对设备要求低，受干扰小，适宜于测定大豆茎叶的蛋白质含量。

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牛血清白蛋白范文第5篇

[关键词] 丹参酮ⅡA；白蛋白纳米粒；处方优化；抗肿瘤

[Abstract] In this study， the tanshinone ⅡA loaded albumin nanoparticles were prepared by high pressure homogenization method. The formulation was optimized by central composite design-response surface method （CCD-RSM ）， with the particle size， encapsulation efficiency， and drug loading as indexes to investigate their in vitro anti-tumor effect. The results showed that the prepared nanoparticles had uniformly spherical morphology and uniform particle size distribution. The average particle size， encapsulation efficiency and drug loading of nanoparticles were about （175.7 ± 3.07） nm， 90.8%±1.47% and 5.52%±0.09%， respectively. Tanshinone ⅡA loaded albumin nanoparticles showed a more powerful antitumor effect than free tanshinone ⅡA for human promyelocytic leukemia NB4 cells. The preparation method of the drug-loaded albumin nanoparticles was simple and easy， and can significantly improve the solubility of tanshinone ⅡA， so it was helpful to extend its application in therapies against hematological malignancies.

[Key words] tanshinone ⅡA； albumin nanoparticles； formulation optimization； anti-tumor effect

丹参酮ⅡA是从中药丹参中提取的一种脂溶性成分，其在心脑血管疾病、抗菌消炎、抗氧化等方面具有确切药理作用[1]。研究发现，丹参酮ⅡA可抑制多种肿瘤细胞的生长，其对人早幼粒白血病细胞具有明显增殖抑制作用[2]。然而丹参酮ⅡA水溶性差（溶解度仅为2 mg・L-1），口服生物利用度低（

1 材料

丹参酮ⅡA（纯度>95%，南京狄尔格医药科技有限公司，批号D20150622A）；丹参酮ⅡA对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-15021504）；牛血清白蛋白（美国Amresco，纯度>98%）；RPMI 1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自美国Amresco公司；胆固醇（上海惠世生化试剂有限公司，批号151024）；精制蛋黄卵磷脂（德国Lipoid，批号510300-2153731/948）；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

高效液相色谱仪 Agilent 1100（美国安捷伦科技有限公司）；ALC-110.4型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；UV-2450紫外分光光度计（SHIMADZU 日本岛津公司）；Zetasizer Nano-ZS90粒度分析仪（英国Malvern）；拓普超纯水机（成都超纯科技有限公司）；EF-C5 高压均质机（加拿大Avestin公司）；HENC高速剪切仪（德尔特混合设备有限公司）；冷冻干燥机（美国Labconco公司）。

2 方法与结果

2.1 丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒的制备

称取200 mg牛血清白蛋白（BSA）溶于20 mL超纯水中，超声溶解，作为水相；另称取20 mg丹参酮ⅡA 、40 mg胆固醇、40 mg蛋黄卵磷脂溶于0.9 mL的氯仿中，超声溶解，作为油相。在高速剪切仪的作用下，将油相缓慢地注入水相中，高速剪切8 min，制备得到粗乳，迅速将粗乳转移至高压均质机中，均质10次，在35 ℃下，减压真空除去氯仿，最终得到白蛋白纳米粒胶体溶液[6]。

2.2 丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒的药剂学特性表征

2.2.1 形态学观察 取适量丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒溶液，加水稀释后，滴加在覆盖碳膜的铜网上，用20 g・L-1磷钨酸负染样品后，自然晾干后于透射电镜下观察，结果见图1。由图1可见，纳米粒形态较为圆整，粒径较均匀。

2.2.2 粒径分布与Zeta电位 采用激光粒度分析仪对所制备的白蛋白纳米粒的粒径、分散系数（PDI）及Zeta电位进行测定，其平均粒径为（175.7±3.07） nm，PDI为（0.187±0.04），Zeta电位为（-22.2±0.62） mV（n=3）。

2.3 包封率和载药量的测定

2.3.1 色谱条件[7] 色谱柱Cosmonsil C18 烷基硅胶键合相（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相甲醇-水（75∶25）；柱温25 ℃；检测波长270 nm；流速1.0 mL・min-1；进样量20 μL；检测波长270 nm。方法的专属性良好；回归方程为Y=118.82X+69.15，r=0.999 9。丹参酮ⅡA在16～80 mg ・L-1与对应的色谱峰面积线性关系良好；精密度和重复性RSD分别为0.78%，0.67%；平均加样回收率为99.7%，RSD为1.2%。

2.3.2 白蛋白纳米粒样品的处理 精密量取按2.1项下制得的丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒1.0 mL于5 mL量瓶中，加入0.5 mL 0.01 mol・L-1盐酸，用无水乙醇定容，摇匀，超声5 min，0.22 μm微孔滤膜精滤，按2.3.1项下色谱条件测定峰面积，计算。

2.3.3 包封率和载药量的测定 参考文献[8]方法，取200 μL的丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒注入G25葡聚糖凝胶柱，用超纯水洗脱，待棕红色纳米粒洗脱至凝胶柱底端时，用离心管接收白蛋白纳米粒洗脱液，直至其完全被洗脱（约5 mL）。将上述纳米粒洗脱液按2.3.2项下方法处理，进样HPLC检测，即可测得被包封的药物量We，另取同等体积未过柱分离的白蛋白纳米粒，稀释至与总洗脱液相同的体积，再取稀释后的纳米粒按2.3.2项下方法处理，同法操作，即可得白蛋白纳米粒中药物总量Wt。将纳米粒在制备时的投药量记为Wa，血清白蛋白及药用辅料的总量为Wd。包封率（EE）公式为EE=（We/Wt）×100%；载药量（DLE）公式为DLE=（Wa×EE）/（Wa+Wd）×100%。

2.4 溶解度的测定

在2.1项下制备的丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒中加入3%的甘露醇，溶解后，转移至-80 ℃冰箱冷冻24 h，然后迅速转移至冷冻干燥机中冻干36 h，得到纳米粒冻干粉。将过量的丹参酮ⅡA和丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒冻干粉加入到5 mL水中，平行操作3次，超声后，于（37± 0.5） ℃恒温振摇24 h，平衡后，4 000 r・min-1离心10 min[9]。取上清液0.5 mL，按2.3.2项下方法，提取丹参酮ⅡA，进样测定。根据实验结果得出丹参酮ⅡA及其白蛋白纳米粒制剂在水中的溶解度分别为（2.31±0.03），（708±1.15） mg・L-1（n=3）。

2.5 制剂处方优化

2.5.1 星点设计-效应面法优化处方[10] 参考预实验中的单因素试验结果，将剪切时间设为8 min，均质次数设为10次，有机相体积设为0.9 mL，附加剂（胆固醇和蛋黄卵磷脂）的比例设为1∶1，采用星点设计-效应面法考察牛血清白蛋白质量（A）、附加剂质量（B）和丹参酮ⅡA质量（C）对载药白蛋白纳米粒粒径（Y1）、包封率（Y2）及载药量（Y3）的影。使用Design-Expert.V 8.0.6.1软件对3因素分别设定5水平，各因素水平见表1。以Y1，Y2和Y3共同作为评价指标，每个指标均标准化为“0～1”之间的“归一值（desirability，di）”。公式为OD=（d1d2……dk）1/k ，k为指标数。其中，对于取值越大越好的指标（如包封率、载药量）和取值越来越小的指标（如粒径）分别按公式dimax=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）和dimin=（Ymax-Yi）/（Ymax-Ymin）计算各指标的di[11]。实验安排及结果见表2。

2.5.2 模型拟合与方差分析 使用Design-Expert.V 8.0.6.1软件对上表数据进行二次多项式拟合，拟合方程为Y1=467.063 91-0.622 64A-2.743 66B-11.550 99C-0.003 012 5AB+0.015 35AC-方差分析结果显示，该二项式拟合模型F为4.37，PC>A，交互项AB，AC和BC对指标的影响均不显著，二次项A2影响不显著，而二项式B2和C2影响显著，由此可说明各因素间的交互作用较小。该二次项拟合模型拟合效果良好，且具有显著性，可作为丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒处方优化预测模型。

2.5.3 等高线图及效应面图综合分析 固定牛血清白蛋白质量、附加剂质量、药物质量3个因素中任意一个，考查其他2因素交互作用对OD值的影响，结果见图2。由图可知，在3个因素中，对于OD影响最大的是附加剂的质量，其次是药物质量，而白蛋白质量的影响相对很小。在一定范围内，随着附加剂质量的增加，OD呈非线性减小趋势，表现为曲面较陡；而随着白蛋白质量的增加，OD呈线性增加趋势，表现为曲面较平滑。

根据Design-Expert.V 8.0.6.1软件对试验结果进行系统分析，得出在拟定工艺条件下的丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒的最佳处方：牛血清白蛋白200 mg、附加剂的质量80 mg、丹参酮ⅡA质量20 mg。预测在此处方条件下制备的丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒的粒径为173.3 nm，包封率为90.1%，载药量为5.48%，OD为0.869。

2.5.4 方验证[12] 按照以上优化处方平行制备3批样品，结果见表4。由表4可见，实际所得白蛋白纳米粒的粒径与预测值相差（二者之差除以预测值）1.37%，包封率与预测值相差0.75%，载药量与预测值相差0.73%。结果表明，该模型可以准确的预测白蛋白纳米粒的质量特性参数。另制剂学特性表征均按照最优处方进行测定。

2.6 体外抗肿瘤活性评价

2.6.1 白蛋白纳米粒的细胞毒性 参考文献[13]方法，选择对数生长期的人早幼粒细胞白血病NB4细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，取100 μL的细胞悬液接种于96孔板，在96孔板孔中，分别加入100 μL细胞培养基以避免边缘效应，于37 ℃，5% CO2，饱和湿度的孵箱中培养12 h过夜。每孔加入经RPMI 1640培养基稀释的空白载体溶液（白蛋白浓度依次为200，100，50，25，5 mg・L-1，每个浓度设置3个复孔）40 μL，同时设置不加载体的对照组（含细胞）及调零孔（不含细胞），然后置孵箱中培养48 h。实验结束前4 h，每孔加入MTT液（5 g・L-1）20 μL，37 ℃培养4 h，每孔加入100 μL SDS，放置过夜后，置酶联免疫检测仪于570 nm测定各孔的吸光度（A），按公式“细胞存活率=实验组平均A值/对照组平均A值×100%”计算细胞存活率。结果为经不同浓度白蛋白纳米粒处理的细胞，其存活率为90%±0.84%（n=3），表明空白纳米粒对细胞几乎无毒性。

2.6.2 载药纳米粒的抗肿瘤作用 细胞铺板同2.5.1项。用培养基将载药白蛋白纳米粒稀释至50，25，12.5，6.25，3.12 mg・L-1（每个浓度设置3个复孔）加入96孔板中，后续操作同2.5.1项。同时用培养基将丹参酮ⅡA储备液稀释至与载药白蛋白纳米粒相同浓度作为对照考察，结果见图3。游离丹参酮ⅡA和载丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒对NB4细胞的杀伤作用均具有浓度依赖性，且载药白蛋白纳米粒的细胞毒性显著强于游离丹参酮ⅡA，IC50分别为（10.43±0.12），（5.69±0.04） mg・L-1（n=3）。

3 讨论

血清白蛋白是一种安全、无毒、生物相容、可降解的广泛存在于血液中的蛋白质，这些特性使其成为一种良好的载体材料[14]。目前制备白蛋白纳米粒的方法主要有超声乳化法、去溶剂化法以及蛋白结合技术。其中去溶剂化法是制备白蛋白纳米粒常用的方法，但作者在预实验中发现，丹参酮ⅡA在无水乙醇中溶解度差，无法形成载药纳米粒，故采用蛋白结合技术制备丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒。蛋白结合技术指的是在高速剪切力作用下，载药的有机溶剂以纳米液滴的形式分布于白蛋白水溶液中，在均质过程中产生的空穴和热效应，会引起血清白蛋白的二硫键桥联而形成纳米粒[15]。与去溶剂化法制备的白蛋白纳米粒相比，其制备工艺简单，包封率和载药量较高，可实现规模化生产。另在预实验中发现，加入一定量的蛋黄卵磷脂和胆固醇可显著降低纳米粒的粒径，这可能是由于它们的存在提供了亲脂性的微环境，增加了难溶性药物丹参酮ⅡA与白蛋白的结合作用[16]。由溶解度测定结果可知丹参酮ⅡA在水中的溶解度为2.31 mg・L-1，而以白蛋白纳米粒的制剂形式其溶解度可达到708 mg・L-1，与其水溶性相比提高了近300倍，较好地解决了丹参酮ⅡA的难溶性问题。在体外细胞实验中，载丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒较游离药物表现出更优的抑瘤效果，这可能是由于白蛋白纳米粒提高了丹参酮ⅡA的溶解度以及肿瘤细胞对白蛋白纳米粒具有较强的摄取能力，从而增加了丹参酮ⅡA在肿瘤细胞内的聚集，发挥药物的抗肿瘤功效[17]。

综上，本研究采用高压均质法制备得到的丹参酮ⅡA白蛋白纳米粒，不仅提高了其溶解度，还增强了其抗肿瘤药效，将有助于拓展丹参酮ⅡA在抗血液肿瘤方面的应用。

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