纳米粉体

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纳米粉体范文第1篇

关键词：纳米粉体，α-Fe2O3，力学性能

 

众所周知，氧化铁具有许多优异的性能，在催化、磁性存储、气敏、生物医学等领域具有广泛的应用[1-3]。近年来，纳米氧化铁的制备已经取得了很大的进展，各种粒径均匀、形貌可控的纳米氧化铁的研究已陆续被报道[4,5]。氧化铁有多种存在形式，如α-Fe2O3、β-Fe2O3、γ-Fe2O3、ε-Fe2O3、Fe3O4等，它们在性能上有较大差异。

水热法是一种重要的合成技术，具有环境友好、相对低温、产物纯度高以及所得颗粒分散性好、粒径分布窄、晶型好等优点，逐渐成为一种重要的制备纳米材料的新技术。论文参考。本研究以氯化铁和氨水作为原料，通过水热反应，粒径约为80nm左右的球形α-Fe2O3纳米粉体。

1. 实验部分

1.1 试剂和仪器

试剂：FeCl3·6H2O，NH3·H2O。以上试剂均为分析纯，国药集团上海化学试剂公司。

仪器：H-800透射电子显微镜，日本；D/Max-RB X-射线衍射仪，日本；马弗炉，上海贺德试验设备有限公司；Spectrum 400红外光谱仪，美国。论文参考。

1.2 实验方法

称取一定量的FeCl3·6H2O，配制成1.5mol/L的溶液，向该溶液中缓慢地滴加氨水，得红褐色的凝胶状样品。将该样品放入内衬为聚四氟乙烯的高压釜中，在120℃下反应1min后冷却至室温。其中的沉淀物用蒸馏水洗涤数次后，在80℃干燥5h，得氧化铁前驱体FeOOH。将前驱体于不同的温度下煅烧，即可得α-Fe2O3纳米粉体。

1.3样品表征

应用D/Max-RB X-射线衍射仪对样品物相进行表征，其条件为：Cu靶，Kα射线，λ=1.541Å，管电压40kV，管电流100mA，扫描速度4°/min，扫描范围(2θ)20-75°；应用H-800透射电子显微镜对样品的形貌和粒径大小进行了表征；应用Spectrum 400红外光谱仪对样品进行表征。

2. 结果与讨论

2.1 IR分析

图1是将前驱体煅烧到400℃时所得的超细氧化铁样品的IR图，显示了氧化铁的特征吸收峰。570cm-1的峰为Fe-O的伸缩振动，480cm-1的峰为Fe-O的弯曲振动。这一结果，与文献报道的球形α-Fe2O3纳米粉体的红外光谱相当。

图1. 400℃时样品的红外光谱

2.2 XRD、TEM分析

图2为前驱体在不同的温度下煅烧5h后所得的XRD图。从图中可以看出，200℃时前驱体已经完全分解成α-Fe2O3。在400℃其峰形与200℃时的峰相比更加尖锐，表明结晶度有所提高。根据Scherrer公式D=Kλ/βcosθ可计算出200、400℃时灼烧的样品的平均粒径分别为30、50nm。由此可见，随着温度的升高，所得的晶粒粒径逐步变大，这一结果也说明了较高的温度有利于晶粒的生长。

图2. 样品在不同温度下的XRD图

图3为在400℃时灼烧的样品的TEM图。论文参考。从图上可以看出，颗粒为球形，粒径大约在80nm左右，分散性较好，团聚不明显。

图3. 样品的TEM图

2.3 α-Fe2O3纳米粉体对聚乙烯的力学性能影响

为了考察α-Fe2O3对聚乙烯力学性能的影响，将α-Fe2O3（加入量为5%）与聚乙烯（PE）做成复合材料，具体过程如下：

在转矩流变仪中经过混合、压缩、均化，最后挤入成型。为了达到α-Fe2O3粉体在有机体中的均匀分布需要多次混合，因此，从挤出成型机上出来的复合料可再经过造粒机造粒，将这些复合的颗粒再转入到流变仪配料入口。这样反复多次，就可使得α-Fe2O3粉体在PE中均匀分布，最后形成以α-Fe2O3粉体作为增强体，以PE为基体的复合材料。取一定长度和直径的这种复合材料（长条形），通过万能仪测其拉伸强度，与相同形状的纯的PE对比，可以观察到经过增强以后PE的拉伸强度明显提高（图4）。实验数据可总结如下：

纳米粉体范文第2篇

1．1纳米材料的鉴别和表征

目前，由于不断有研究工作揭示出与纳米材料相关的风险。企业为规避监管，可能不会宣称其产品使用了纳米材料或者在产品的生产过程中应用了纳米技术。因为国家食品药品监督管理总局早在2006年就将纳米产品从Ⅱ类升级为Ⅲ类，并对其安全性和有效性进行审慎的考察。因此，企业并不以纳米技术作为其产品的主要宣传点，在这类情况中，由于纳米物质具有某些优异性能，或者在生产工艺中需要采用纳米技术，从而可能产生一批没有贴纳米标签的，实质上的纳米产品。对于此类产品，在技术审评工作中，首先要求审评人员具备一定的专业知识，能够从企业递交的注册资料中准确判断产品中是否有纳米物质成分，或者在生产中采用了纳米技术。为了准确鉴别医疗器械中是否使用了纳米材料，证明等同性非常重要。化学成分的相似性并不足以证明纳米材料的等同性，因为纳米材料是否呈现出特定性质可能取决于纳米材料的化学成分和形状，和(或)纳米材料的来源(供货方)。当判定了产品确实是纳米产品之后，对于其安全性和有效性的把握，需要具备必要的纳米表征手段知识。对含有纳米材料的医疗器械的生物学效应的试验和评价要求对纳米材料进行全面表征。因为纳米材料的毒性，不仅取决于其化学成分，也与其粒度(粒度分布)、长径比、形状、表面形貌、表面电势、表面化学、亲水(疏水性)、团聚(聚集)态等因素密切相关。因此，对于某些产品，可能需要根据扫描电镜、透射电镜、原子力显微镜、电感耦合等离子质谱等表征手段所获得的图像和数据来判断其安全性和有效性。应该根据纳米材料的类型和形式，以及器械的预期用途来选取表征方法。对特定物理化学参数的表征通常可采取多种方法。单一的表征方法可能无法提供对于参数的准确评估(例如:粒度分布、表面成分)。在该类情况下，如果可行，可能需要采取补充方法来对需要表征的性质进行充分评估，即采用两种独立的表征方法。需要特别注意的是，用不同的方法获取的有关特定性质的结果不能直接进行对比。例如，正如指导性文件所指出的，对于粒径测定，应至少采用两种显微镜技术(例如:透射电镜和激光扫描共聚焦显微镜)。为了对使用纳米技术的医疗器械进行可靠的表征，需要毒理学、物理学、化学、工程学和其他专业领域的专家之间的跨专业合作。

1．2纳米材料剂量

用于毒理学研究的剂量水平通常是以质量浓度为基础。然而，纳米材料的多个属性可能会影响其毒理性质。普遍认为，除了质量浓度以外，还应使用包括表面积和数量浓度在内的其他参数来充分表征纳米材料剂量。在确定用于纳米材料体外研究的毒理学相关的剂量时，应该考虑可分沉淀物的可能性。小纳米颗粒(例如:水动力学直径＜40nm)与培养细胞层之间的接触主要取决于扩散和对流力。由于沉降力的额外影响，在细胞培养基中形成的稍大的纳米材料和纳米材料聚集体的沉淀速度更快。这些因素，以及与蛋白质和培养基其他成分的相互作用，可能会影响直接接触培养细胞的颗粒的数量。应该根据具体情况评价可分沉淀物出现的可能性。若有必要，应开展对于体外细胞剂量的分析性或计算性评估。目前，对介质中的剂量(分散/溶液浓度)或实际的纳米颗粒细胞摄入/接触量是否应该被用于剂量本身的表达还存在争议。

1．3纳米材料参照样品

试验结果的可靠性在一定程度上取决于是否可获得适合的参照样品。参照样品指拥有一项或多项特性参数、具有足够可重复性的已经确认的材料。可利用该材料或物质对仪器进行校准，评估测量方法或为材料赋值。纳米尺度参照样品的最初研发重点在于将其用于校准试验仪器，而不是作为生物响应基准进行参照样品研发。开发一种广泛接受的参照样品，包括在适合不同的试验系统的阳性对照与阴性对照纳米颗粒方面达成共识，已经成为纳米材料风险评估的一个关键性要求。虽然参照样品对于评估医疗器械中应用的纳米材料至关重要，但是因为存在实际困难，研发进度还是很慢。认识到纳米材料代表性样本的可用性对于纳米物质安全试验的可重复性和可靠性至关重要。ISO/TC229nm技术委员会已提出使用“代表性试验材料”，并且正对其进行讨论。代表性试验材料的拟议定义为“来自同一批的物质，在其一个或多个特定性质方面具有同质性和稳定性，被认为适合于开发用于针对除已表现出的同质性和稳定性以外的性质的试验方法”。目前这种方法已被应用于OECD人造纳米材料工作组的纳米材料安全性试验合作项目，该项目使用欧洲委员会联合研究中心代表性纳米材料库中的代表性纳米材料来进行。

1．4纳米材料样品制备

纳米材料体积小，并且其物理化学特性可能发生改变，这使得与宏观(非纳米尺度)颗粒或化学物质的试验相比，纳米材料的样品制备会遇到重大的挑战。带来挑战的因素包括能加强纳米材料反应性的表面性质;聚集或团聚颗粒的形成;纳米颗粒在通过水合作用，部分溶解或其他过程的分散中发生的转变;以及低浓度水平污染物对纳米材料的物理化学性质和毒理性质的强烈潜在影响。如同其他类型的试验样品，纳米物体有可能吸附到容器表面。因此，确认标称浓度非常重要。对于研发针对含有纳米材料的医疗器械的可靠的样品制备方案来说，必须认识到这些问题。相比于使用常规材料的医疗器械，解决这些问题也许需要极大提高直接针对样品制备的研发力度，并制定处理策略。由于其独特的表面性质，纳米材料对用于样品制备的技术表现出极强的敏感性。颗粒之间以及颗粒与周围环境之间的相互作用会影响颗粒的分散。分散的纳米材料不一定呈现单分散颗粒的形式。呈聚集形式的单分散颗粒(由强结合或强融合的颗粒组成的颗粒)和呈团聚形式的非单分散颗粒(弱结合颗粒，聚集体，或两者的混合体)可以出现在以液体、粉末和气溶胶形式出现的纳米材料中，除非通过表面电荷或立体效应进行稳定化处理。因此，样品中纳米材料的分散状态和粒度分布可能随时间变化。这一属性对于制备浸提液和(或)储存溶液和剂量分散溶液有着非常重要的意义，pH值、离子强度或分子成分的轻微调整就可能显著改变颗粒分散度。基于该原因，受试品的稳定性对于在生物评价中获取具有代表性的和可重复性的结果来说显得尤为重要。纳米材料的样品制备可能包含对于制造商生产的或供应商提供的材料的表征，以及制备用于动物试验或体外实验的储存溶液和剂量溶液。制备细节可能根据给药途径和递送方法的不同而有所差别。

1．5纳米材料对于生物相容性研究试验的影响

将纳米材料用于试验系统时，必须认识到需要测定的一些性质可能会受到周围环境的影响，并且在很大程度上依赖于周围环境(例如:组织培养基、血液/血清、蛋白质存在)。与环境的相互作用可能导致纳米材料本身发生暂时性改变，如通过获得/脱落蛋白涂层，形成纳米颗粒团聚/聚集，或纳米材料其它方面的变化。由于这样的变化可能会影响纳米材料的特性，因此会影响纳米材料的毒性特征。因此，纳米材料应完全根据制造出来的形态/组成，以及最终用户所接收的形式(如果该形式包含自由纳米材料)进行表征。最后，还应该对最终产品中的纳米材料进行评价。对于生物安全性评价，需要将纳米材料分散在适当的介质中进行评价。这些介质与纳米材料之间的相互作用可严重影响到纳米材料在试验系统中的表现。应该在试验过程和试验结果评价过程中考虑该因素。纳米物体在生物环境中很容易将蛋白质迅速吸附在其表面，形成所谓的蛋白质“冕晕”。据报道，冕晕是由两层结构组成，内层是由强结合的蛋白质组成，而外层是由快速交换的分子组成。蛋白质冕晕并不是静态的，可能根据纳米材料所处环境的不同而发生改变。作为有机体内的异物，纳米材料的归宿为从被吸收、分布、代谢到排泄/消除。众所周知，纳米材料表现出与其对应的常规材料不同的物理化学特性(力学、化学、磁学、光学或电学特性)，因此，可以合理的期望纳米尺度材料会影响生物学行为，并且生物学行为会引发在细胞、亚细胞和生物分子层面(例如:基因和蛋白质)包括细胞摄取的各种不同反应。因此，与由常规材料引发的毒理学反应所不同的各种毒理学反应可能在接触到纳米材料后才会显现。应该注意的是，不仅蛋白质会以冕晕形式参与这个过程，而且脂质也会参与这个过程。因此，毒物动力学研究应被视作针对含有纳米材料的医疗器械开展的毒理学风险评估的一个部分。当接触到生物环境的时候，纳米材料会与蛋白质发生相互作用，这种相互作用的定量和定性水平取决于生理环境的性质(例如，血液、血浆、细胞质等)和纳米材料的特性。同样，当接触到试验介质的时候，纳米材料也会与周围环境发生相互作用并且/或者也会对环境产生干扰，这取决于其本身的性质和所接触的条件;跟相应的常规材料相比，它们可能会有不同的表现。因此，对于任何被设计用来对医疗器械进行生物学评价的试验方法，对其进行专门的验证是十分有必要的。试验方法的选择将取决于纳米材料的特性。在纳米材料的毒性试验中，有几个已知的风险因素应该避免。对纳米材料的毒性和最终结局了解的还不多，所以一些未知的隐患还会在将来逐渐显露出来。由于纳米材料的毒性试验存在许多不确定性，所以公开透明变得至关重要。潜在的生物相互作用不是直接取决于分子的浓度或数量，而是取决于纳米颗粒本身。在纳米毒理学中，剂量反应关系的单位可能不是传统意义的质量单位，而可能是以纳米颗粒的数量或者他们的总表面积来表示剂量。除了表征以外，还应该以文件的形式记录下实验条件的详细情况。

2纳米材料标准化工作

纳米粉体范文第3篇

【关键词】 肝炎病素 乙型 微RNAs 预测

0引言

MicroRNA是一类21～23 nt长的非编码单链小分子RNA，是由priRNA分子经过剪切成为70～90个碱基大小、具有发卡结构单链RNA的前体（premiRNA），再经Dicer酶加工生成［1］. MicroRNA广泛存在于真核生物中，迄今为止在人体中已经发现了至少320种MicroRNA分子. MicroRNA通过与mRNA的3′非编码区相互作用调控基因表达，在机体的生理及病理过程中发挥重要作用. 最近研究表明，一些病毒的基因组，如疱疹病毒、腺病毒、HIV，也能编码MicroRNA［2］. HBV基因组能否编码MicroRNA分子目前还不清楚. 本研究中，我们借助于预测软件VMir，对HBV全基因组进行正反两个方向的扫描，寻找HBV基因中编码microRNA前体分子，对HBV编码的microRNA分子进行初步预测，并通过Northern blot实验对其进行初步鉴定.

1材料和方法

1.1材料预测软件VMir由加利福尼亚大学Grundhoff AT教授惠赠. HBV全基因序列检索自Genebank，序列号为NC_003977，adr型. HepG2和HepG2.2.15细胞均购自ATCC. HepG2细胞培养选用含100 mL/L胎牛血清（Hyclone）RPMI 1640培养液（Gibco）. HepG2.2.15细胞选用含相同血清浓度的培养液，另外加入终浓度380 mg/L的G418 (Sigma). 上述两种细胞均在37℃的含50 mL/L CO2孵箱中培养. Trizol购自Invitrogen公司. Northen blot所用尼龙膜购自Ambion公司. ［γ32P］ ATP购自北京福瑞生物工程公司.

1.2方法

1.2.1预测软件VMir工作原理VMir是由Grundhoff AT等［3-4］创建的一种病毒编码MicroRNA前体分子预测方法. 工作原理为：病毒基因序列以500 nt为一个窗口，10 nt递进扫描；RNAfold算法预测窗口内的发卡结构；限定发卡结构长度，按照以下规则评分：每个互补的碱基对奖励2分；末端环状结构超过17个碱基时，每超一个，减1分；对于对称性隆起，减去碱基数×1(碱基数≤4)或碱基数×1.5(碱基数﹥4) ；对于非对称性隆起，减去碱基数×2. 经上述处理，每个发卡结构得到一基数，再乘以系数Ip得到最终分值. 再进一步限定分值及其窗口出现频率（一般限定最低分值为115，窗口值即在不同窗口中出现的频率为35，因在该条件下成功预测概率为98%［4］），最终得到病毒基因编码的microRNA前体分子. 该方法已经成功预测出KSHV（卡普西肉瘤相关病毒）、EBV（EB病毒）等编码的microRNA前体分子.

1.2.2利用VMir预测HBV编码的microRNA前体分子将HBV全基因序列(NC_003977)导入VMir软件，设定窗口大小为500 nt，递进单位为10 nt，发卡结构长度设为100 nt，对HBV基因组中能够形成发卡结构的序列进行初筛. 然后，设定以每个序列最低得分为115，其窗口值最低为35，得到HBV可能编码的microRNA前体分子.

1.2.3预测前体分子的初步验证我们选用Northern blot方法对经VMir软件筛选到的候选分子进行初步验证. 所用探针序列为候选microRNA分子的反相互补序列，用T4多聚核苷酸激酶末端标记放射性标记γ32P. 以稳定表达HBV的HepG2.2.15为研究对象，以HepG2细胞作为对照，按照试剂说明书，利用Trizol试剂提取总RNA. 取40 μg总RNA进行150 g/L TBE尿素凝胶电泳；再经半干转运至尼龙膜后，利用上述标记探针杂交、放射自显影. 如果经VMir预测到的候选分子是HBV基因编码的microRNA前体分子，那么来自于HepG2.2.15细胞的总RNA与探针杂交后，应出现两条特异性的条带：分子量较大的一条为microRNA前体分子，较小的一条为成熟的microRNA分子. 因为microRNA前体分子在Dicer酶作用下产生成熟的microRNA分子，而剩余的核苷酸将迅速被降解，故一般只有两条特异性条带. 而来源于HepG2细胞的总RNA与探针杂交后则没有特异性条带产生.

2结果

2.1HBV基因组中microRNA前体分子预测将HBV基因序列导入VMir软件后，设定窗口大小为500 nt，以10 nt为递进单位，寻找HBV基因中的发卡结构序列. 共查找到56个寡核苷酸分子，其中在正向序列中有25条（MD1～25），反向序列31条（MR1～31）. 然后分别设定窗口值和最低分值为35和115，筛选出HBV最有可能编码的microRNA分子前体序列，最终得到了三个候选分子，即MD6， MD17和MR31(表1). 上述3个序列经RNAfold程序分析，得到二级结构（图1），表明这三条序列能形成典型的发卡样结构. 总之，从这三条序列的评分、窗口值及其二级结构，都提示他们可能是HBV基因组编码的microRNA前体分子；提示HBV同EBV， KSHV相似，也可能编制病毒来源的microRNA分子. 表1 HBV基因组中的候选

2.2microRNA前体分子的初步验证为了进一步证实MD6，MD17和MR31三个候选分子是否为HBV基因组编码的microRNA前体分子. 我们分别以MD6， MD17和MR31的反向互补的核苷酸序列，即TGGTAATAGAG GTAAAAAGGGACTCAAGATGTTGTACAGACTTGGCCCCCAATACCACATCATCCA，TCAA TGTCCATGCCCCAAAGCCACCCAAGGCACAGCTTGGAGGCTTGAACAGTAGGACATGAA CATGA和CCTCCTTTCCTCACATTCATTTACAGGAGGACATTATTAATAGATGTCAACAAT ATGTGGGCCCTCTGACAGTTAATGAAAAAAGGAGA作为探针，末端标记γ32P放射标记，分别HepG2细胞和稳定表达HBV病毒颗粒HepG2.2.15细胞的总RNA为杂交模板进行Northern blot实验. HepG2.2.15细胞总RNA只有与MD17互补的探针杂交后产生两条特异性的条带（图1C），而与MD6（图1A）和MR31（图1B）互补的探针杂交则没有特异性条带产生. 因此，提示MD17(TCATGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGC TGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGA)可能为HBV基因编码的miroRNA前体分子.

3讨论

microRNAs是一类非编码的小RNA分子，长度约为21～23 nt. 已经被鉴定的microRNAs据推测大都是由具有发夹结构、约70个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5′端磷酸基和3′羟基，定位于RNA前体的3′端或者5′端. 自从第一个miRNA (lin4和let7)分子在线虫中发现［5］，迄今为止在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出的microRNA数量已超过3500个［6］. microRNA通过与mRNA的3′非编码区的相互作用，参与基因的表达调控，在人类基因中至少有1/3受microRNAs调控，在生理和病理过程中均具有重要作用［7-8］.

同其人类、果蝇、植物等多种生物物种一样，许多类似于HBV的DNA病毒也能编码病毒基因组来源microRNAs，如疱疹病毒家族的非洲淋巴细胞瘤病毒、卡波济肉瘤相关疱疹病毒、人巨细胞病毒，多瘤病毒属的肉瘤病毒40、鼠多瘤病毒，均能编码病毒特异性的microRNAs分子；这些病毒编码的microRNAs分子通过调控宿主细胞中或病毒本身特定基因的表达，使宿主细胞内环境的有利于病毒的复制、传播，有利于病毒逃逸宿主的免疫系统，最终达到保护自己的目的［9-10］.

鉴于病毒编码的microRNAs在病毒生活周期中的重要意义，在某种程度上我们可以推测，HBV作为一种常见的影响人类健康的致病病毒，也可能编码自己的microRNAs分子. VMir是由Grundhoff AT等研发的一种用来预测病毒编码microRNAs的软件，他们已经通过大量实验证实该软件可以有效地预测病毒编码的microRNA前体分子，进而达到预测病毒编码microRNA分子的目的. 我们借助该预测软件，对HBV的基因进行扫描，以期得到HBV编码的microRNA前体分子. 经过筛选，最终我们得到了3条候选核苷酸序列，即MD6， MD17和MR31. 这3条寡核苷酸分子无论从其评分还是结构都符合microRNA前体分子的条件. 然后，我们分别以MD6，MD17和MR31的反向互补序列为探针，与HepG2.2.15细胞的总RNA杂交，以HepG2细胞的总RNA为阴性对照，进行Northern Blot实验. 结果提示，只有MD17特异性探针有两条特异性条带产生，因此提示MD17很有可能就是HBV编码microRNAs的前体分子. 在后续的实验中，我们将通过Northern blot， RNA酶保护实验等手段来进一步验证MD17分子，并在此基础上找到其编码的成熟microRNAs分子.

【参考文献】

［1］ Bartel DP. MicroRNAs: Genomics， biogenesis， mechanism， and function ［J］. Cell， 2004，116(3):281-297. ［2］ Qi P， Han JX， Lu YQ， et al. VirusEncoded microRNAs: Future Therapeutic Targets ［J］? Cell Mol Immunol， 2006，3(6):411-419.

［3］ Sullivan CS， Grundhoff AT， Tevethia S， et al. SV40encoded microRNAs regulate viral gene expression and reduce susceptibility to cytotoxic T cells ［J］. Nature， 2005，435(7042):682-686.

［4］ Grundhoff AT， Sullivan CS， Ganem D. A combined computational and microarraybased approach identifies novel microRNAs encoded by human gammaherpesviruses ［J］. RNA， 2006，12(5):733-750.

［5］ Lau NC， Lim LP， Weinstein EG， et al. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans ［J］. Science， 2001，294(4):858-862.

［6］ GriffithsJones S， Grocock RJ， van Dongen S， et al. miRBase: microRNA sequences， targets and gene nomenclature ［J］. Nucleic Acids Res， 2006，34(1):140-144.

［7］ Lewis BP， Burge CB， Bartel DP. Conserved seed pairing， often flanked by adenosines， indicates that thousands of human genes are microRNA targets ［J］. Cell， 2005，120(1):15-20.

［8］ Mack GS. MicroRNA gets down to business ［J］. Nat Biotechnol， 2007，25 (6): 631-638.

纳米粉体范文第4篇

[关键词] 川芎嗪； 尼莫地平； 双载药纳米粒； 药动学； 脑内分布

Pharmacokinetics and brain distribution of NMD/TMPnanoparticles

HE Wenjie1， HONG Qian1， LIANG Jing1， HE Xiaowei2， ZHU Fengjia1*

（1. Zhejiang Hospital， Hangzhou 310012， China；

2. The First Hospital Affiliated to Huzhou Teachers′ University， Huzhou 313000， China）

[Abstract] This study aims to prepare nimodipine/tetramethylpyrazineloaded poly（D， Llactidecoglycolide） dualdrug nanoparticles （NMD/TMPNPs） and investigate pharmacokinetics and brain distribution to evaluate the possibility of enhancing the drug effect of dualdrug nanoparticles. NMD/TMPNPs were prepared via W/O/W emulsion solvent evaporation. Entrapment efficiency and drug loading of NMD/TMPNPs were investigated by ultracentrifugation， and drug release behavior in vitro was studied by dialysis method. The pharmacokinetic and brain distribution were studied in SD mice administered intravenously with NMD/TMPNPs in comparison with NMDsuspension， NMD/TMPsuspension and NMDNPs， （NMDNPs+TMP）suspension. According to the results， the entrapment efficiency and drug loading of NMD were （79.71±0.73）%， （1.74±0.02）%， those of TMP were （40.26±1.51）% and （4.38±0.16）%. The nanoparticles showed the property of sustained release. On the basis of the major parameters for in vivo pharmacokinetic and brain distribution， t1/2β of NMDsuspension， NMD/TMPsuspension and NMDNPs， （NMDNPs+TMP）suspension， NMD/TMPNPs were （1.097±0.146）， （1.055±0.06）， （1.950±0.140）， （1.860±0.096）， （2.497±0.475） h， CL were （0.778±0.098）， （1.133±0.111）， （0.247±0.023）， （0.497±0.040）， （0.297±0.024） h・L-1， AUC0t in rat plasma were （514.218±60.383）， （352.916±33.691）， （1 618.429±240.198）， （804.110±75.804）， （1 349.058±215.497） μg・h・L-1， respectively， and AUC0t in brain were 0.301 9， 0.624 8， 1.068 6， 1.313 0， 1.046 5 mg・h・L-1， respectively. According to the in vivo study， the pharmacokinetic behavior of NMD were markedly prolonged by adding TMP or prepared dualdrug nanoparticles.

[Key words] nimodipine； tetramethylpyrazine； dualdrug nanoparticle； pharmacokinetics； brain distribution

doi：10.4268/cjcmm20162227

川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）为一类具有多药耐药逆转（multidrug resistance，MDR）调节功能的吡嗪类生物碱，具有疏通血脉、促进血行、消散淤血的功效，临床上多用于扩张脑血管、抑制血小管平滑肌痉挛等。文献表明川芎嗪具有限制Pglycoprotein（Pgp）底物外排的作用[1]，可通过抑制Pgp的ATP酶活性来抑制Pgp的功能[23]。尼莫地平（nimodipine，NMD）为一类二氢吡啶类钙离子拮抗剂，临床上多用于治疗脑血管疾病[4]，但其作为Pgp的底物，易受血脑屏障（bloodbrain barrier，BBB）上Pgp外排作用影响，致使其脑内浓度较低[5]。因此将TMP与NMD合用，有望提高NMD脑内浓度，但NMD和TMP简单合用，一方面由于TMP血浆清除率较高[6]且易被脑组织清除[7]，限制了其抑制Pgp功能的作用；另一方面，短时间内TMP浓度过高易导致脑内NMD浓度过高，对正常细胞或组织产生毒性[8]，故本试验拟制备川芎嗪/尼莫地平双载药纳米粒合用两药，并考察川芎嗪对尼莫地平体内过程的影响。

1 材料

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）； Labconco冷冻干燥机（美国Labconco公司）；TGL16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；VORTEX5型涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；减压干燥器（上海精宏实验设备有限公司）。

聚乙二醇（聚乳酸羟基乙酸）（济南岱罡生物工程有限公司，相对分子质量18 000）；尼莫地平对照品（中国食品药品检定研究院，批号10027020002）；尼莫地平原料药（湖北恒硕药业有限公司，纯度98%，批号20130625）；盐酸川芎嗪对照品（中国食品药品检定研究院，批号110817201006）；盐酸川芎嗪原药（南通飞宇生物有限公司，纯度98%，批号FY17610610）；甲醇（美国Honeywell Burdick&Jackson公司）；肝素钠（中国江苏常州千红生化制药股份有限公司，批号110921）；水合氯醛（上海强顺化学试剂有限公司，批号20090401）；生理盐水（石家庄鹏海制药有限公司，批号1208122040）；乙腈（天津市四友精细化学品有限公司，批号30333203514）；乙醚（中国杭州化学试剂有限公司，批号20100421）；正己烷（上海凌峰化学试剂有限公司，批号20131023）；其他试剂均为分析纯。

清洁级SD大鼠（220±10） g，浙江中医药大学实验动物中心提供，动物使用编号SCXK（浙20080036）。所有动物试验均按照浙江大学动物饲养和使用指南进行。

2 方法与结果

2.1 尼莫地平/川芎嗪双载药纳米粒的制备

2.1.1 双载药纳米粒的制备方法 称取1 mg NMD和40 mg mPEGPLGA溶于乙酸乙酯中构成有机相，称取5 mg TMP溶于水中构成内水相，称取适量PVA溶于水中构成外水相（调节pH为9.0），称取适量PVA溶于水中构成分散相。将内水相加入到有机相中超声获得初乳，将初乳迅速加入至外水相中超声获得复乳，将复乳滴加到分散相中搅拌即得到NMD/TMPNPs。

2.1.2 双载药纳米粒的质量评价 经2.1.1工艺制备的NMD/TMPNPs外观呈类圆形，表面光滑，粒径小（176 nm左右），粒径分布窄（PDI

2.1.3 双载药纳米粒的体外释放考察 本试验采取透析法考察其体外释放特性。NMD/TMPNPs体外释放过程中NMD和TMP均符合Weibull方程，分别为Q=0.504t-1.898 4（R2=0.987 6）和Q=0.513 5t-1.608 9（R2=0.988 4）。其体外释放曲线见图1。

2.2 体内尼莫地平的含量测定

2.2.1 色谱条件 Thermo Hypersil Gold C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇水（62∶38），流速1.0 mL・min-1；柱温30 ℃；检测波长238nm；进样体积20 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取适量NMD，TMP于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得NMD/TMP对照品溶液。

2.2.3 血浆样品处理方法 精密移取血浆样品200 μL置2 mL具塞离心管中，加入乙腈800 μL，涡旋混合3 min，1万 r・min-1离心10 min，取上清液于40 ℃用氮气流吹干，残渣用200 μL甲醇溶解，充分涡旋振荡后1万 r・min-1离心10 min，取上清液20 μL进样分析。

2.2.4 脑组织样品处理方法 将脑组织按1∶4加入生理盐水，高速匀浆器8 000 r・min-1匀浆10 min，取匀浆100 μL于2 mL离心管中，加入乙醚正己烷（1∶1）1.5 mL，涡旋5 min，超声10 min后，5 000 r・min-1离心10 min，取上清液于2 mL离心管中用氮气流吹干，残渣用200 μL甲醇溶解，充分涡旋后1万 r・min-1离心10 min，取上清液20 μL进样分析。

2.2.5 血浆内NMD含量测定方法 标准曲线：精密称取减压干燥至恒重的NMD对照品适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配成质量浓度为1 427 mg・L-1的对照品溶液，临用前稀释至系列浓度。精密吸取空白血浆1 mL 7份，分别加入系列浓度的对照品溶液20 μL，涡旋混合，得质量浓度分别为0.356 7，0.713 5，1.783 7，3.567 5，7.135 0，17.837，35.675，71.350，142.70 mg・L-1的NMD系列血浆对照溶液，按2.2.3项下方法处理后进样测定，以峰面积（A）对血浆中NMD的浓度（C）进行线性回归，建立标准曲线方程。计算得血浆中NMD的标准曲线方程为A=73.823C-23.23（r=0.999 3），表明NMD血浆质量浓度在0.356 7～142.70 mg・L-1线性关系关系良好。

精密度：取低、中、高3个浓度供试品溶液进样测定，分别在日内测定5次，连续测定5 d（每天1次），计算日内和日间精密度。其日内精密度分别为4.7%，2.4%，2.9%，日间精密度分别为3.7%，2.9%，2.8%。

提取回收率：精密量取含NMD低、中、高3个浓度的NMD/TMP溶液，加入200 μL空白血浆中，涡旋2 min，混匀，配成质量浓度为50.00，100.00，200.00 μg・L-1的血浆样品，按2.2.3项下方法处理后进样分析；另配制含NMD低、中、高3个相同浓度的NMD/TMP对照品溶液，不加空白血浆，直接挥干进样测定，计算血浆样品经处理后的峰面积与对照溶液峰面积的比值，每个浓度平行测定3次。其提取回收率为（69.33±5.24）%，（72.88±6.99）%，（72.53±2.03）%。

2.2.6 脑组织内NMD含量测定方法 脑组织标准曲线：精密称取减压干燥至恒重的NMD对照品适量，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配成质量浓度为15.00 mg・L-1的对照品溶液，临用前稀释至系列浓度。精密吸取空白组织匀浆100 μL 8份，分别加入系列浓度的对照品溶液20 μL，涡旋混合，得质量浓度分别为0.01，0.03，0.06，0.15，0.60，1.50，3.00，6.00 mg・L-1的NMD系列组织匀浆对照溶液，按2.2.4项下方法处理后进样测定，以峰面积（A）对组织中NMD的浓度（C）进行线性回归，建立标准曲线方程。计算得组织匀浆中NMD的标准曲线方程为A=110.32C+4.351 2（r=0.999 8），表明NMD组织匀浆质量浓度在0.01～6.00 mg・L-1线性关系良好。

精密度考察：取低、中、高3个浓度供试品溶液进样测定，分别在日内测定5次，连续测定5 d（每天1次），计算日内和日间精密度。其日内精密度分别为6.9%，4.2%，4.0%，日间精密度分别为4.0%，3.2%，3.1%。

提取回收率考察：精密量取含NMD低、中、高3个浓度的NMD/TMP溶液，加入200 μL空白脑组织中，涡旋2 min，混匀，配成质量浓度为0.01，0.15，1.50 mg・L-1的血浆样品，按2.2.4项下方法处理后进样分析；另配制含NMD低、中、高3个相同浓度的NMD/TMP对照品溶液，不加空白血浆，直接挥干进样测定，计算血浆样品经处理后的峰面积与对照溶液峰面积的比值，每个浓度平行测定3次。其提取回收率为（72.38±6.04）%，（76.97±4.54）%，（78.26±2.66）%。

2.3 体内药动学研究

称取适量NMD和NMD/TMP原药粉末于10 mL量瓶中，用适量乙醇超声溶解，用0.9%生理盐水稀释至刻度，得NMD混悬液和NMD/TMP混悬液。称取适量NMDNPs和NMD/TMPNPs冻干粉于10 mL量瓶中，用适量0.9%生理盐水超声溶解并稀释至刻度，得NMDNPs和NMD/TMPNPs混悬液。称取适量NMDNPs和TMP原药粉末于10 mL量瓶中，用适量0.9%生理盐水超声溶解并稀释至刻度，得（NMDNPs+TMP）混悬液。

取健康SD大鼠30只，禁食12 h，自由饮水，随机分为5组，每组6只。按NMD 2 mg・kg-1单剂量尾静脉注射分别给予NMD混悬液、NMD/TMP混悬液、NMDNPs混悬液、NMD/TMPNPs混悬液和（NMDNPs+TMP）混悬液，给药后分别于5，15，30，60，120，240，360，480，600，720 min经股动脉取血0.5 mL，置肝素钠预处理的2 mL具塞离心管中， 6 000 r・min-1离心5 min，分离血浆后，置-80 ℃低温冰箱保存待测。每次取血后立即用注射器给予等量的0.9%生理盐水。

大鼠尾静脉注射NMD混悬液、NMD/TMP混悬液、NMDNPs混悬液、NMD/TMPNPs混悬液和（NMDNPs+TMP）混悬液后，平均血药浓度时间曲线见图2。数据经拟合后符合开放式二室模型，所得主要药动学参数见表1，并对其进行统计学分析。

2.4 脑组织分布研究

称取适量NMD原料药于10 mL量瓶中，用适量乙醇超声溶解后，加入0.9%生理盐水稀释至刻度，得NMD混悬液。称取适量NMD原料药和TMP原料药于10 mL量瓶中，用适量乙醇超声溶解后，加入0.9%生理盐水稀释至刻度，得NMD/TMP混悬液。称取适量NMDNPs和NMD/TMPNPs冻干粉于10 mL量瓶中，用适量0.9%生理盐水超声溶解并稀释至刻度，分别得NMDNPs混悬液和NMD/TMPNPs混悬液。称取适量NMDNPs冻干粉和TMP原料药溶于10 mL量瓶中，用适量0.9%生理盐水超声溶解并稀释至刻度，得（NMDNPs+TMP）混悬液。

取健康SD大鼠60只，禁食12 h，自由饮水，随机分为5组，每组12只，按NMD 2 mg・kg-1单剂量尾静脉注射分别给予NMD混悬液、NMD/TMP混悬液、NMDNPs，NMD/TMPNPs和（NMD/TMPNPs+TMP），给药后分别于0.25，2，4，6 h（每个时间点平行3只大鼠）颈椎脱臼处死，迅速取出脑组织用生理盐水冲洗，然后用滤纸吸干，置-80 ℃低温冰箱保存待测。

大鼠尾静脉注射NMD混悬液，NMD/TMP混悬液，NMDNPs，NMD/TMPNPs和（NMDNPs+TMP）后，按上述方法操作，并按2.2.6项下方法处理样品后进样分析。结果见图3，NMD混悬液，NMD/TMP混悬液，NMDNPs，NMD/TMPNPs和（NMDNPs+TMP）中脑内AUC0t分别为0.301 9，0.624 8，1.068 6，1.313 0，1.046 5 mg・h・L-1。

由图3可知，给药0.25 h时，NMD/TMPNPs组在脑内药物浓度达到最大值（0.713 2±0.070 3） mg・L-1；给药4 h时，（NMDNPs+TMP）组在脑内药物浓度达到最大值（0.343 4±0.148 2） mg・L-1；给药6 h时，NMDNPs组在脑内药物浓度达到最大值（0.345 2±0.025 9）mg・L-1；给药4 h时，在试验条件下NMD组和NMD/TMP组在脑内均未检测到药物。

3 讨论

药动学研究结果显示：与单用NMD组相比，两药联用组t1/2α显著降低（P

组织分布研究结果显示：与单药组比较，双药组入脑速度均更快，AUC0t均显著提高（P

[参考文献]

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纳米粉体范文第5篇

【关键词】 依那普利；替米沙坦；糖尿病早期肾病

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.11.609 文章编号：1004-7484（2013）-11-6631-02

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）患者最重要的合并症之一，在西方国家糖尿病肾病已成为ESRD的主要原因[1]。近几年我国的发病率亦呈上升趋势，已经成为终末期肾病（ESRD）的首要原因。在肾病早期进行干预治疗能阻止ESRD的发生。通过依那普利联合替米沙坦治疗对UAER等指标的改善，分析依那普利联合替米沙坦治疗早期DN的临床疗效，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 合并糖尿病早期肾病的2型糖尿病105例患者，均为我院住院或门诊长期随访的2型DM患者，其中男53例，女52例，年龄41-66，均龄48岁，病程4-17年。患者均符合WHO制定的2型DM诊断标准。依据该标准，早期尿白蛋白排泄率（UAER）为30-200ug/min；近期血糖控制为空腹血糖

1.2 方法 各组均采用原有的糖尿病治疗方案不变，注射胰岛素、口服降糖药使空腹血糖维持在3.8-7.1mmol/L。随机分为3组各35人，分别为依那普利组、替米沙坦组及联合治疗组（依那普利联合替米沙坦）。依那普利组给予依那普利10mg/d治疗；替米沙坦组给予替米沙坦80mg/d治疗；联合治疗组给予依那普利10mg/d和替米沙坦80mg/d治疗，用药时间都在早餐前30min用药。治疗时间为14周。

1.3 观察指标 治疗前后3组MAP、FBG、UAER、BUN、SCR水平。各组间患者性别、年龄、病程、综合治疗方法差异均无显著性（P>0.05）。

1.4 统计学处理 数据采用SPSS10.0统计软件做统计学处理，计量指标用（χ±s）表示，各组治疗前后及组间对照用t检验，P

2 结 果

依那普利组和替米沙坦组MAP、UAER比治疗前降低（P

3 讨 论

DN是糖尿病微血管病变导致的肾小球硬化，是引起ESRD并导致患者死亡的主要原因。其发病机制复杂，因高血糖环境下微血管病变所致，RAAS的异常激活在糖尿病肾病的发病机制中起着重要作用，特别是血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）。RAAS可引起血压升高，肾小球内压力增高，以致于蛋白尿及肾脏硬化、纤维化、且促使炎症介质和纤维化介质的释放，加速肾脏病变速度[2]。研究表明AngⅡ对肾小球细胞转型、小管细胞增生、尿蛋白的排出方面的作用，可能通过AT2R而发挥功效，因此AT1RA也不能完全阻止AngⅡ的作用，故此类药物联合应用具有很好的效应。本研究表明在依那普利、替米沙坦和联合治疗组3组间治疗前后FBG、BUN、SCR均无显著性差异，而3组MAP治疗后较治疗前均显著下降，联合治疗组与依那普利、替米沙坦组间比较有显著性差异。3组UAER治疗后均较治疗前有显著下降，且联合治疗组UAER下降幅度明显大于依那普利和替米沙坦组，这说明联合治疗具有降低血压和减少UAER的作用。这一结果说明依那普利联合替米沙坦治疗2型糖尿病早期肾病比单一用药更能有效减少UAER，延缓2型糖尿病早期肾病的发展，起到对肾功能的保护作用。

参考文献