流式细胞仪
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流式细胞仪范文第1篇
【关键词】 缺铁性贫血；淋巴细胞免疫表型； 流式细胞仪；骨髓细胞学检查
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.14.009
Investigation of flow cytometry in examination of lymphocyte immunophenotyping in iron-deficiency anemia patients YANG Hong， MENG Yan， WANG Chao. Department of Inspection， Beijing Fengtai Hospital， Beijing 100070， China
【Abstract】 Objective To research the changes of lymphocyte immunophenotyping in iron-deficiency anemia （IDA） patients. Methods There were 30 iron-deficiency anemia patients （IDA group） and 30 healthy people （normal control group）， and they all received flow cytometry three-color direct immunofluorescent method for detection of lymphocyte immunophenotyping. Comparison was made on the peripheral blood lymphocyte immunophenotyping between the two groups. Results IDA group had much lower levels of CD3+、CD3+CD4+， and CD4+/CD8+ ratio in peripheral blood than the normal control group （P<0.01）， and it also had higher CD3+ CD8+ value than the normal control group （P<0.05）. Conclusion Iron-deficiency anemia may affect proliferation and differentiation of T lymphocyte， resulting in decreased immune functions and immune regulatory dysfunction.
【Key words】 Iron-deficiency anemia； Lymphocyte immunophenotyping； Flow cytometry； Marrow cytology examination
缺铁性贫血是因机体铁的需要量增加和铁吸收减少， 使体内储存铁耗尽而缺乏， 又未得到足够的补充， 导致合成血红蛋白的铁不足而引起的贫血。是人类最常见的慢性疾病之一。淋巴细胞免疫表型是了解机体免疫系统功能的状态。在正常机体内各淋巴细胞亚群的相互作用， 维护着机体正常的免疫功能， 当淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时， 都可导致机体免疫功能紊乱并发生一系列的病理变化。淋巴细胞免疫表型的分析对一些疾病的诊断、治疗、免疫功能重建、器官移植监测等有重要的临床意义。流式细胞仪检测缺铁性贫血与淋巴细胞免疫表型的关系， 国内外报道较少。现将本院2012年1月～2014年12月收治的30例IDA患者进行了外周血淋巴细胞免疫表型（CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD4+/CD8+）的检测， 并与正常人对照。现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 30例IDA患者作为IDA组， 男5例， 女25例， 年龄23～81岁， 中位年龄46.5岁。血红蛋白48～92 g/L， 红细胞（3.24～4.76）×1012/L， 网织红细胞0.1%～1.0%， 外周血红细胞呈小细胞低色素性改变。骨髓细胞学检查示：骨髓增生明显活跃-活跃， 粒/红比值1.91～4.37， 红系增生活跃， 以中晚幼红细胞为主， 晚幼红细胞核固缩明显。成熟红细胞大小不等， 以小者居多， 中心淡染区明显扩大。骨髓细胞铁染色：外铁（-）， 细胞内铁为0～13%， 骨髓报告：符合缺铁性贫血骨髓象。血清铁2.51～11.5 mol/L， 血清铁蛋白3.15～12.4 ng/L。全部病例服用铁剂治疗有效。另选健康体检者30例作为正常对照组， 其中男10例， 女20例， 为血常规、血清铁、铁蛋白各项指标均在正常范围内， 且无其他器质性病变。两组一般资料比较， 差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。
1. 2 仪器与试剂 采用美国BD FACSCalibur流式细胞仪， 三色标记McAb：CD3FITC/CD4PE/CD45PerCP、CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP、红细胞裂解液、荧光校准微球 calibrate 3 Beads均购自美国BD公司。
1. 3 方法
1. 3. 1 样品的制备 各管分别加入CD3FITC/CD4PE/CD45 PerCP、CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP荧光抗体20 μl， 再分别加入新鲜EDTA-K3抗凝外周血100 μl， 混匀， 室温避光孵育 20 min， 加入 1∶9 配制的溶血素 2 ml， 避光 10 min。2000 r/min 离心5 min， 倒掉上清液， 加入 PBS 缓冲液 2 ml， 2000 r/min 离心5 min。去上清， 加入500 μl PBS混匀待测。
1. 3. 2 流式细胞仪测定 以荧光微球calibrite 3-colour校准仪器补偿、使仪器分辨率CV<2%达到最佳工作状态， 采用MultiSET 软件获取数据。建立SSC/CD45Percp、CD4PE/CD3 FITC、SSC/CD3FITC荧光点图， 用CD45-PerCP/SSC-Gating和Back-Gating 细胞群双圈门以排除碎片的干扰， 调节 FSC、SSC、Detectors/Amps、Copensation， FL1-FL 2% 、FL2-FL 1% 荧光补偿， 每管获取1.5万个细胞， 建立CD4+/CD3+、CD8+/CD3+散点图， Th（CD4+）和Ts（CD8+）的表达情况， 同时计算出 Th/Ts 比值。
1. 4 统计学方法 应用SPSS11.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
IDA组外周血中CD3+、CD3+CD4+及CD4+/CD8+比值显著低于正常对照组（P<0.01）， CD3+CD8+值高于正常对照组（P<0.05）。见表1。
3 讨论
3. 1 缺铁性贫血是一种全球性疾病， 虽然随着现代物质生活条件的改善， 各种营养缺乏性疾病已大为减少， 但缺铁性贫血仍然是人们所面临的威胁健康的一大难题。为了了解缺血性贫血对机体免疫系统功能的影响， 本试验通过流式细胞仪三色免疫标记法观察30例成人缺铁性贫血外周血淋巴细胞免疫表型的变化， 总结出缺铁性贫血主要影响机体的细胞免疫功能， 可引起细胞免疫功能障碍和免疫调节紊乱。
3. 2 淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分， 在人体细胞免疫中发挥核心作用。T 细胞免疫主要通过T 细胞的增殖分化来实现， 这是一个消耗能量 、依赖核酸及蛋白质合成的复杂过程。CD3+ CD4+ T 细胞是辅/诱导性T淋巴细胞（Th细胞）， 也是迟发性超敏反应的启动者、促使B细胞产生抗体的辅助细胞、抑制性T淋巴细胞的诱导细胞；CD3+CD8+ T 细胞是抑制性/细胞毒性T细胞（Ts细胞）， 是细胞毒性T 细胞介导反应的效应细胞， 也是抑制B细胞产生抗体的抑制性细胞； 当CD4+/CD8+比值发生变化时， 可引起机体免疫功能降低。从而影响淋巴细胞的增殖和分化， 使T淋巴细胞功能受损， 导致免疫功能低下和免疫调节紊乱。
3. 3 缺铁性贫血可对多系统造成危害， 但对免疫功能的具体影响具有争议。Salaman 等认为， IDA 可影响人体整个免疫系统， 使特异性和非特异性免疫功能均下降； 本研究从机体免疫功能角度出发， 分析IDA 对人体免疫功能的影响， 结果发现IDA 患者CD3+、CD3+CD4+T细胞比例减少、CD3+CD8+ T 细胞比例升高， 提示IDA影响T细胞的增殖分化， 导致细胞免疫功能障碍和免疫调节机制紊乱。
参考文献
张之南， 沈悌. 血液病诊断及疗效标准. 北京： 科学出版社， 2007：6-9.
王建中. 流式细胞术分析血液淋巴细胞免疫表型方法学研究. 中华检验医学杂志， 2000， 23（4）：203-206.
王腊梅， 周红彬. 3～6岁缺铁性贫血患儿免疫功能变化研究 . 西南军医， 2004， 6（4）：9-10.
礼征南， 王亚男， 董敏， 等. T-淋巴细胞亚群在血液病中的诊断应用. 中国医药前沿， 2010， 5（4）：63-64.
流式细胞仪范文第2篇
[关键词]秋海棠；愈伤组织；变异；DNA含量
离体保存是种质资源保存的一条重要途径，具有节省人力、物力、财力以及避免自然灾害和病虫害等优点。但是在离体保存过程中常有遗传变异的发生，因此需要对离体保存材料进行鉴定。目前的鉴定方法包括形态学标记、细胞学标记、分子标记等。
秋海棠属植物的染色体很小，计数十分困难。而且某些种类的细胞质中含有许多小颗粒，与因缢缩而变得极小的染色体难以区分，观察难度较大。本研究用流式细胞仪对3种培养多年的秋海棠进行了DNA含量分析，以期为进一步研究该属植物离体培养的遗传变异规律提供基础。
1.材料与方法
1.1植物材料
供试材料为温室中保存和以愈伤组织形式保存10年的的花叶秋海棠（β.cathayana）、掌叶秋海棠（β.hemsleyana）和假厚叶秋海棠（β.pseudodryadis）。培养基为1／2MS培养基，不加激素，每2个月继代一次。实验前随机选取3种秋海棠属植物的愈伤组织进行培养，直至幼嫩叶片长出。
1.2方法
选取叶片约1cm2，加入0.5ml的Otto I buffer和2μl／ml的β巯基乙醇，用手术刀将其切碎，室温孵育30min后用200目尼龙网过滤得到悬浮液。采用同样的方法获得水稻悬浮液。往悬浮液中加入1ml的Otto IIbuffer（50μg·L-1的碘化丙啶和50μg·L-1的RNase），200目尼龙网过滤后置于常温黑暗条件下染色1h。
1.3分析方法
流式细胞仪系统为FACSAria（美国BD公司）。以水稻为内标，每个种测定5个样品，每个样品至少收集20，000个细胞，变异系数控制在8％以内。使用BDFACSDiva软件分析数据。DNA含量差异显著性分析采用SPSS13.0分析软件。
2.结果与分析
结果表明，离体保存的三种秋海棠植物中，掌叶秋海棠的DNA含量发生了非整倍性变化，离体培养材料的DNA含量是保存在温室中材料的1.5倍，其它两种秋海棠无明显变化（表1）。
3.讨论
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是目前染色体倍性鉴别中一种快速、有效地方法，它可以直接或间接测定细胞的DNA含量。20世纪90年代国内开始就有学者将FCM运用到植物倍性分析中。
通过对3种秋海棠DNA含量的测定，我们发现，掌叶秋海棠的DNA含量发生了非整倍性变化，而其它两种秋海棠属植物的DNA含量没有发生变化。这3种秋海棠植物于同时进行离体保存，保存的时间和条件均相同，但它们的DNA含量变化的情况并不相同，说明植物体本身是影响变异的重要因素。另外，掌叶秋海棠的DNA含量为非整倍性变化，其原因可能是愈伤组织在培养的过程中由于单个染色体的丢失或获得、不分离和染色体滞后所致。张俊娥等认为，在愈伤组织中有DNA含量加倍的现象是否就一定是染色体数目发生变化，不能仅仅通过DNA含量分布曲线来下结论，还需对其进性细胞周期分析。因为细胞处在分裂间期的s期时DNA进行复制，DNA含量也要加倍。所以，对于掌叶秋海棠DNA含量发生非整倍性变化的原因还有待于进一步研究。
流式细胞仪范文第3篇
关键词：自噬；凋亡；3-甲基腺嘌呤（3-MA）；顺铂（DDP）；骨肉瘤细胞
1实验材料
1.1细胞来源 骨肉瘤MG63细胞购于中科院上海细胞库。
1.2主要试剂 3-甲基腺嘌呤（3-MA）、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）、单丹黄酰尸胺（MDC）购于美国Sigma公司。Annexin-FITC/PI凋亡试剂盒购于上海碧云天公司。
1.3实验仪器 流式细胞仪（美国BD公司）、酶标仪（美国Thermo公司）、倒置荧光显微镜（德国LEICA公司）、低温高速旋转离心机（美国Beckman公司）、细胞培养孔板（美国NEST公司）。
1.4试剂配制
1.4.1 MDC溶液 将1 mg MDC粉末溶于1 mL无菌水中，可获得3 mmol/L的MDC溶液，取上述溶液100 μL加到6 mL无菌水中，获得实验用50 μmol/L的最终溶液，置于4℃冰箱避光保存备用。
1.4.2 DDP溶液 取1 mL浓度为5 mg/mL的DDP，用无菌水稀释到250 mL，即获得20 μg/mL的DDP用于实验，4℃冰箱保存。
2实验分组
该实验分为4组：空白对照组（加入等量的培养液做对照）、3-MA组（仅添加浓度为12.5 μg/mL的3-MA）、DDP组（仅添加浓度为20 μg/mL的DDP）、3-MA+DDP组（12.5 μg/mL的3-MA和20 μg/mL DDP同时添加）。
3实验方法
3.1细胞培养 骨肉瘤MG63细胞培养于提前配置好的含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，其中含有100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素。在湿度饱和的情况下，培养于5%CO2、37°的培养箱中，隔天换一次培养液，3 d传代1次，取适量对数生长期的细胞进行下一步实验研究。
3.2 MTT比色法 外源性MTT在活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶作用下能够还原成蓝紫色结晶甲，且该结晶物质不溶于水，DMSO可使不溶于水的甲溶解，在490 nm波长处可以用酶标仪检测光吸收值，在死亡细胞中不存在上述反应过程，检测不到吸光度值，从而可以用来比较不同组之间细胞增殖率。取细胞数为1×108个/L，种植于96孔板中，分别在每孔添加等量的细胞悬液，细胞培养液培养10 h后根据实验分组在3个组中加入相应的药物，在恒温（37℃）5%CO2的环境下培养24 h后，将每孔加入等量的MTT溶液作用4 h，然后PBS溶液洗1遍，再加入等量的DMSO溶液，摇摆15 min，然后在酶标仪上检测不同组的吸光度值（A）。结合以下公式计算细胞增殖率：细胞增殖率（%）=（实验组A/对照组A）×100%。
3.3 MDC染色法 单丹黄酰尸胺（MDC）被细胞吸收后蓄积于嗜酸性的细胞囊泡中，在荧光显微镜下可以看到蓝绿色或黄绿色点状结构出现在细胞核周围，经常被用来检测细胞自噬囊泡的存在。取处于对数生长期的骨肉瘤MG63细胞（细胞数为1×105个/mL）加入24孔细胞培养板中培养12 h待细胞贴壁后根据实验分组加入相应浓度的药物继续培养24 h，24 h后加入MDC溶液（浓度为50 μmol/L）避光环境中培养1 h，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定，用PBS洗涤，然后用倒置荧光显微镜观察自噬空泡差异；同样方法，经相应药物处理24 h后，MDC染色、4%多聚甲醛固定，PBS洗涤，然后分别收集各组细胞（不能收集倒置荧光显微镜观察过的细胞，以免影响细胞荧光强度），用流式细胞仪检测不同组细胞荧光强度。
3.4流式细胞术检测细胞凋亡率 磷脂酰丝氨酸位于正常细胞膜的内侧，但是在细胞凋亡的初期，磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，出现在细胞外环境中，也就是所谓的磷脂酰丝氨酸外翻。Annexin-V是一种分子量为35~36 KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。 Annexin-FITC/PI凋亡试剂盒是用带绿色荧光灯荧光探针FITC标记的Annexin，直接用流式细胞仪检测磷脂酰丝氨酸外翻这一细胞凋亡的重要特征，可以使坏死细胞呈绿色荧光。而碘化丙啶（PI）可以将坏死细胞和凋亡晚期失去细胞膜完整性的细胞染成红色。因正常细胞不被FITC和PI染色，所以二者结合可以较准确检测细胞凋亡情况。将细胞数为1×105个/mL的骨肉瘤MG63细胞种植于6孔板中培养，待细胞贴壁后，结合试验分组加入相应药物干预24 h，然后分组收集、离心细胞，PBS洗涤，按照Annexin-FITC/PI凋亡试剂盒说明进行操作，经流式细胞仪检测细胞凋亡率，比较各组间差异。实验重复3次。
3.5统计学分析 用均数±标准差（x±s）表示实验结果，在SPSS 17.0统计软件帮助下进行统计学分析，多组间差异用单因素方差分析进行比较，取P
4结果
4.1 MTT法检测各组细胞增殖抑制率 MTT法检测结果显示：与对照组相比，单独添加3-MA对细胞增殖没有明显影响；单独添加DDP细胞增殖率为（47.6±3.1）%；与单独添加DDP相比，同时添加3-MA和DDP组细胞增殖率为（27.1±2.8）%，增殖率下降，P
4.2 MDC染色检测细胞自噬 MDC染色后在细胞核周围出现黄绿色的自噬空泡，与单独添加DDP组相比，3-MA和DDP同时添加组细胞自噬空泡较少。经倒置荧光显微镜拍片后显示，见图1。通过流式细胞仪检测各组荧光强度差异，结果提示：对照组为（83.1±8.2）%，单独添加3-MA组为（89.8±9.5）%，单独添加DDP组为（183.1±14.8）%，3-MA和DDP同时添加组为（121.5±10.4）%。3-MA和DDP同时添加组与单独添加DDP组相比，P
图1 不同组MDC染色后自噬空泡的变化
4.3流式细胞术检测细胞凋亡 经流式细胞仪检测我们发现，单独添加3-MA组细胞凋亡率为（2.5±0.4）%；单独添加DDP组为（12.5±1.1）%，与对照组相比，P
图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡率
5讨论
骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性是决定治疗效果的关键因素，据统计仍有10%~25%患者对化疗反应较差，根本原因在于对化疗药物产生耐药性[1-2]。另外，临床上不合理、不规范的使用化疗药物也可引起肿瘤细胞对药物产生耐药性，将严重影响治疗效果。近些年多数研究[3-4]认为骨肉瘤的耐药性与多种肿瘤基因位点或传导通路有关，如骨肉瘤的生长、发展或耐药性与信号传导子STAT3通路的激活存在一定的相关性；肿瘤细胞对甲氨蝶呤耐药与异位转染miR-140存在联系等。由于新的化疗方案的实施，外加新的化疗辅助药物的应用，能很大程度上控制骨肉瘤的发展，产生良好治疗效果[5-6]。为了寻找更有效、更广泛的肿瘤化疗辅助药物，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对肿瘤耐药性的影响日益引起大家的关注[7-8]。
顺铂属于细胞周期非特异性药物，结构类似于双功能烷化剂，在DNA复制过程中发挥抑制作用。在骨肉瘤、肺癌、食管癌、卵巢癌等实体恶性肿瘤中应用较广泛。自噬是细胞通过自身来消除细胞内部衰老或死亡细胞来维持内环境稳定的过程。3-甲基腺嘌呤可以通过抑制磷脂酰肌醇-3激酶（ClassⅢPI3K），阻止自噬体与溶酶体形成自噬溶酶体，进而发挥抑制作用，是一种常见的自噬抑制剂，广泛应用于自噬相关基础研究[9]。MDC是特异性自噬体标记物，被MDC染色的细胞核周围可见蓝绿色或黄绿色点状结构，常用来检测细胞自噬囊泡[10]。
本研究结合临床中顺铂在骨肉瘤化疗中的应用，借助自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤来说明自噬在骨肉瘤化疗过程中的作用。经MTT比色法检测，我们发现3-MA+DDP组细胞增殖率明显低于单独添加DDP组，P
随着人们对自噬与肿瘤发生、发展机制研究的深入，我们不难发现通过调控自噬可以克服肿瘤耐药性，促进细胞凋亡，为临床获得良好的治疗效果提供实验依据，该研究也证实调控自噬在改进肿瘤治疗方案中有更宽阔的研究前景。但是如今，自噬抑制剂不能在临床上应用的主要原因主要有：①自噬在临床上还没有特异性的抑制剂，实验中应用的药物还不能直接应用于临床。②在临床上对自噬水平的检测到目前为止还没有一个客观定量的方法，比如根据一个血液标本或者肿瘤组织就可以检测到自噬水平。这两点也正是我们下一步继续努力研究的方向。
参考文献：
[1]Longhi A,Errani C,Depaolis M,et al.Primary bone osteosarcoma in the pediatric age:state of the art[J].Cancer Treat Rev,2006,32:423-436.
[2]Mehta RG,Murillo G,Naithani R,et al.Cancer chemoprevention by natural products:how far have we come[J].Pharm Res,2010,27:950-961.
[3]Lee JW,Kim KS,An HK,et al.Dendropanoxide induces autophagy through ERK1/2 activation in MG-63 human osteosarcoma cells and autophagy inhibition enhance dendropanoxide-induced apoptosis[J].PLoS One,2013,8:e83611.
[4]Funderburk SF,Wang QJ,Yue Z.The Beclin 1-VPS34 complex-at the crossroads of autophagy and beyond[J].Trends Cell Biol,2010,20:355-362.
[5]Bacci G,Longhi A,Fagioli F,et al.Adjuvant and neoadjuvant chemotherapy for osteosarcoma of the extremities:27 year experience at Rizzoli Institute,Italy[J].Eur J Cancer,2005,41:2836-2845.
[6］Tanida I,Ueno T,Kominami E.Human light chain 3-MAPI-LC3-B is cleaved at its carboxyl-teminal met121 to exposegiy 120 for lipidation and targeting to autophagosomal membranes[J].Biol Chem,2007,279:47004-47710.
[9]Kim HJ,Lee SG,Kim YJ,et al.Cytoprotective role of autophagy during paclitaxel-induced apoptosis in Saos-2 osteosarcoma cells[J].Int J Oncol,2013,42:1985-1992.
[7]Chiu HW,Lin W,Ho SY,et al.Synergistic effects of arsenic trioxide and radiation in osteosarcoma cells through the induction of both autophagy and apoptosis[J].Radiat Res,2011,175:547-560.
[8]Zhang Z,Shao Z,Xiong L,et al.Expression of Beclin1 in osteosarcoma and the effects of down-regulation of autophagy on the chemotherapeutic sensitivity[J].J Huazhang Univ Sci Technology Med Sci,2009,29:737-740.
流式细胞仪范文第4篇
【关键词】 cd36 免疫表型 多参数流式细胞术
cd36 expression in leukemia cells checked with multiparameter flow cytometry and its significance
tang huarong, wang fachun, jiang yunwei, fei xia, jiang qian1, xu wenlin,
lin jiang
central laboratory, people hospital, jiangsu university, zhenjiang 212002, china; 1department of medical laboratory examination, jiangbing hospital, jiangsu university, zhenjiang 212002, china
abstract the aim of study was to investigate the expression of cd36 in leukemia cells and to explore its significance in diagnosis and differntial diagnosis for leukemia in patients. blood samples from 133 cases of leukemias were analyzed by cd45/ssc double parameters and multicolor flow cytometry in order to determine the cd36 and other leukocyte differentiation antigens. the results show that the cd36 positive rate was 21.8% (29/133) in 133 cases of leukemia, 41.9% (26/62) in 62 cases of aml(acute myeloid leukemia), and none of the 54 cases of lymphocytic leukemia was positive for this antigen. the positive rate of cd36 in m4(8/10), m5(12/12) and m6(3/3) was significantly higher than that in m1(0/9), m2(3/12), m3(0/16) (all p<0.001). the percent of positive cells of cd36 in m5a was significantly higher than in m5b(p=0.001). a significantly negative regression was found between cd36 and cd117 in aml(r=-0.751, p=0.005). and a significantly positive regression was found between cd36 and cd14 in m4 and m5b (r=0.870, p= 0.011). in monocyte lineage involved leukemia (mlil), the positive rate of cd36( 92.6%, 25/27 ) was significantly higher than that of cd14 ( 48.1%, 13/27)（p=0.001）. none of the 7 cases with m5a was positive for cd14, but 4 of 5 cases of m5b were positive. the positive rate of cd117 in m5a was significantly higher than that of in m5b（p=0.01）. the positive rate of cd34 in m5 was low (33.3%,4/12). it is concluded that the combination of cd36 with lymphoid and myeloid antigens is helpful to the diagnosis and differential diagnosis of lymphoid, myeloid and mlil. the positive rate of cd36 is higher than that of cd14 in mlil.
key words leukemia; cd36 antigen; immunophenotyping; multiparameter flow cytometry
j exp hematol 2007; 15(1):29-34
近年来的研究表明,流式细胞术( fcm) 检测结果对于确定白血病的诊断与分型至关重要。以往采用横向分析的方法对白血病进行免疫分型的报道较多,而对于某一个特定标志在白血病免疫学诊断中的作用报道较少。
单核细胞相关性白血病(monocyte lineage involved leukemia, mlil)包括急性粒细胞单核细胞白血病(amlm4a、m4b、m4c、m4eo)、急性单核细胞白血病未分化型（amlm5a）、急性单核细胞白血病部分分化型（amlm5b）、以幼稚单核细胞增生作为白细胞成分的急性红白血病（amlm6）、慢性髓细胞白血病急性单核细胞变（cmlmobc）、慢性粒细胞单核细胞白血病（cmml）等均存在单核细胞成分。目前国际上普遍采用cd14作为单核细胞的表面标志而应用于白血病的免疫学诊断，但cd14 的阳性表达率较低，这给白血病（尤中国实验血液学杂志 j exp hematol 2007; 15(1)多参数流式细胞术观察cd36在白血病细胞上的表达及其意义其是单核细胞相关性白血病）的免疫学诊断与鉴别带来了一定的困难［1］。
cd36为一种膜糖蛋白，在造血细胞上主要表达于单核细胞、巨核细胞、红系前体细胞［2］。我们采用多种高质量标准单克隆抗体和cd45/ssc设门多参数fcm对133例各类白血病患者白血病细胞中cd36的表达情况作了深入的分析,重点分析其在单核细胞相关性白血病上的表达情况，并分析了它与其它白血病细胞相关抗原如cd117、hladr、cd34等的相互关系, 结果报道如下。
材料和方法
对象
2003 年10月-2005 年12 月来本院就诊以及外院送本院作细胞表面标记检查的白血病患者共133例,其中男性71例,女性62例,均为初诊病例。患者年龄1.5岁-86岁,中位年龄44岁。急性白血病95例, 按fab 标准［3］诊断为急性淋巴细胞白血病(all)32例;急性髓细胞白血病(aml )62例,其中m1 9例,m2 12例,m3 16 例,m4 10例,m5a 7例, m5b 5例,m6 3例；参照1994 年欧洲白血病免疫分型研究组( egil)关于急性混合细胞白血病(acute mixed lineage leukemia, amll) 诊断积分标准［4］, 诊断为amll 1例。慢性白血病38例, 其中慢性淋巴细胞白血病(cll) 22例,慢性髓细胞白血病(cml) 15例,慢性期13例及单核细胞白血病急性变2例，慢性粒细胞单核细胞白血病（cmml）1例。
样本制备
每管加入肝素抗凝的骨髓100 μl（细胞数1×105-1×106）及3种直接标记的荧光抗体各5-10 μl, 20℃反应20分钟,再加入2 ml细胞溶解液(becton dickinson产品) ,振荡后于室温下置10 分钟,用pbsbsa 洗涤细胞1 次,加入0.5 ml pbs，待测 。
试剂
所用标准单克隆抗体包括fitc、pe、percp 标记的cd10、cd19、cd20、cd22、cd2、cd3、cd5、cd7、cd56、cd11b、cd41a 、cd61、cd117、cd38、cd45、hla dr、mpo（髓过氧化物酶） 单克隆抗体均购自美国becton dickinson 公司，cd13、cd14、cd33、cd34、cd36单克隆抗体购自美国coulter公司。
流式细胞术分析
fcm 检测用facscaliburtm流式细胞仪(becton dickinson产品) 和cell quest 软件获取并分析10 000个细胞。通过cd45/ssc 设门识别幼稚细胞群, 再分析计算该幼稚细胞群各白血病相关抗原的阳性百分数。以白血病细胞表面抗原阳性百分数≥20%为抗原阳性病例。
统计学处理
用spss 10.0软件包进行统计学处理,作相关分析、χ2 检验或fisher确切概率法，以p<0.05表示有显著差异。
结 果
cd36在白血病细胞中的表达
图1为一正常骨髓cd45/ ssc散点图。根据各群细胞cd45荧光强度与侧向角反射（ssc）的差异可将骨髓细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、
figure 1. dot plot of cd45-side scatter (ssc) of normal bm cells. r1 is blast cells ; r2 is nucleated erythrocytes; r3 is granulocytes; r4 is monocytes; r5 was lymphocytes.
有核红细胞和原始细胞群，对不同的细胞群体框定（即射门）后，即可知各群细胞所占的比例，并可明确显示幼稚细胞群体的免疫表型（图2）。
figure 2. dot plot of cd45-side scatter (ssc) of leukemia bm cells. r1 is blast cells ; r2 is nucleated erythrocytes; r3 is granulocytes; r4 is lymphocytes.
133例病人中cd36阳性29例（阳性率21.8%），62例aml患者中表达cd36者26例，阳性率为41.9%。但54例淋系白血病中（其中all 32例， cll 22例）未见cd36阳性病例。15例cml中慢性期13例未见cd36阳性表达，另外2例cml单核细胞白血病急性变的患者cd36阳性，1例患者的免疫表型为： cd34+、cd38+，cd10+，cd13+、hladr+、cd36+、cmpo+/-；另1例患者的免疫表型： cd38+，hladr+，cd14+， cd36+、cd13+，cd33+，cd11b+。1例amll患者cd36表达为阴性。1例慢性粒细胞单核细胞白血病（cmml）cd36表达阳性，该患者表型为：cd13+、cd33+、cd14+、cd10+、hladr+、cd36+、cd11b+（表1）。
在aml 各亚型中的表达
在62例aml中cd36在m1 、m2 、m3、m4、m5a 、m5b 、m6中阳性率分别为0.0% (0/ 9) 、25.0% (3/ 12) 、0.0% (0/ 16) 、80%(8/10) 、100.0 %(7/ 7) 、100.0%(5/5) 、100.0%(3/3)。可见cd36阳性表达主要见于m4、m5、m6, 其阳性率明显高于m1、m2、m3，差异具有显著性（χ2=25.593, p<0.001； χ2=17.422, p<0.001； χ2=33.529, p<0.001）。在m4中，2例m4eo的患者全部为阴性，阳性细胞百分率分别为7.1%和8.6%。余8例m4a/b/c均为阳性，阳性细胞百分率20.5%-89.2%，中位数为28.4%。9例m5患者中cd36表达均为阳性，阳性细胞百分数25.3%-95.2%，中位数为50.8%。但在m5b组的阳性细胞百分数（50.8%-95.2%，中位数为89.6%）明显高于m5a组（25.3%-36.5%，中位数为32.7%），差异具有统计学意义（f=15.273,p=0.001）。3例m6中2例为急性红白血病，1例为急性红血病。在2例急性红白血病的骨髓细胞群体中有两个异常细胞群体，一个群体为幼稚红系群体，另一个群体为幼稚粒细胞单核细胞群体。在幼稚粒单核细胞群体中2例均为cd36阳性表达，阳性细胞百分数为40.0%和73.4%。1例急性红血病的骨髓细胞中只有1个异常群体即幼稚红细胞群体。在3例患者的幼稚红细胞系群体中的cd36阳性细胞百分数33.60%-77.8%，中位数为73.2%。 这例急性红血病患者的免疫表型为：cd33+、hladr+、cd36+、cd235a+、cd117+、cd71+、cd38+。在m1、m2、m3中只有3例m2a患者cd36表达阳性，其阳性细胞数百分数分别为22.1%-27.4%，中位数为24.3%（表2）。
在aml组中，cd36表达的阳性细胞百分数与cd117表达的阳性细胞百分数呈负相关(r=-0.751, p=0.005)。在12例m2中2例为cd36+cd117+,1例cd36+cd117-， 8例cd36cd117+，1例cd36-cd117-; m4组7例cd36+cd117+，1例cd36+cd117-，2例cd36-cd117+。7例m5a全为cd36+cd117+，5例m5b中1例为cd36+cd117+，4例为cd36+cd117-。在m6 3例患者中全为cd36+cd117+（图3）。在aml组中，cd36的阳性表达与hladr的阳性表达不相关（r=0.142, p=0.677）.在12例m2中3例cd36+hladr+，4例cd36-hladr+，5例cd36-hladr-。10例m4中6例cd36+hladr+，2例cd36+hladr-，1例cd36-hladr+，1例cd36-hladr- 。在7例m5a组中4例cd36+ hladr+, 3例cd36+hladr-。在5例m5b组中4例cd36+hladr+，1例cd36+hladr-。在m6均为3例患者均为cd36+hladr+。另外，在aml组中cd36的阳性表达与cd34的阳性表达不相关（r=-0.472, p=0.076）。在12例m2中3例cd36+cd34+，0例cd36+cd34-，6例cd36-cd34+，3例cd36-cd34-。10例m4中5例cd36+cd34+，3例cd36+cd34-，1例cd36-cd34+，1例cd36-cd34- 。在7例m5a组中3例cd36+ cd34+, 4例cd36+cd34-。在5例m5b组中1例cd36+cd34+，4例cd36+cd34-。在m6中1例为cd36+cd34+，2例为cd36+cd34-。在m4与m5b组别中cd36与cd14表达的阳性细胞百分数呈正相关(r=0.870, p=0.011)。在12例m2中3例cd36+cd14-，9例cd36-cd14-；
cd36阳性白血病其它髓系主要相关抗原的表达
cd14在cmml、cmlmobc、m2、 m4、m5a、m5b、m6中阳性表达率分别为100.0%（1/1）、50.0%（1/2）、0.0%（0/12）、60.0%（6/10）、0.0%（0/7）、100.0%（5/5）、0.0%（0/3）。cd117在cmml、cmlmobc、m2、 m4、m5a、m5b、m6中阳性率分别为0.0%（0/1）、0.0%（0/2）、83.3（10/12）、90.0%(9/10)、100.0%(7/7)、20.0%(1/5)、100.0%（3/3）。cd117在m5a中阳性率明显高于m5b（χ2=8.400, p=0.010）。cd34在其分别在cmml、cmlmobc、m2、m4、m5a、m5b、m6的阳性表达率为0.0%（0/1）、50.0%（1/2）、75% (9/12)、60.0%(6/10)、42.9%(3/7)、20.0%(1/5)、33.3%（1/3）。cd34在m5的阳性率较低，为33.3%（4/12）。hladr分别在cmml、cmlmobc、m2、m4、m5a、m5b、m6的阳性表达分别为100%（1/1）、100%（2/2）、66.7% (8/12)、70.0%(7/10)、57.1%(4/7)、80.0%(4/5)、100%（3/3）。cd13分别在cmml、cmlmobc、m2、m4、m5a、m5b、m6的阳性表达率分别为100%（1/1）、100.0%（2/2）、100%(12/12)、90.0%(9/10)、85.70%(6/7)、60.0%(3/5)、66.7%（2/3）。cd33分别在cmml、cmlmobc、m2、m4、m5a、m5b、m6的阳性表达率分别为100%（1/1）、50.0%（1/2）、91.7%(11/12)、80.0%(8/10)、58.7%(6/7)、100.0%(5/5)、66.7%（2/3）（表3）。
讨 论
cd45 抗原表达于所有白细胞表面,虽然cd45 抗原存在3 个异构体,不同异构体在造血干/ 祖细胞及t 细胞表面表达不同,但本研究所用的cd45 抗体为识别3种异构体的共同抗体。cd45 在淋巴细胞、单核细胞、粒细胞及幼稚细胞的表达量不同,表现为cd45荧光强度不同。淋巴细胞最强,单核细胞次之,粒细胞比单核细胞弱,幼稚细胞比成熟细胞弱。结合细胞的ssc 值(反映细胞的颗粒性) ,可将骨髓细胞分为淋巴细胞,单核细胞,粒细胞及幼稚细胞群。cd45/ ssc 设门法的突出特点在于它可将异常的幼稚细胞与正常的成熟细胞区分开,因而能够做到特异地对幼稚细胞进行分析［5］。我们在采用cd45/ssc双参数射门的基础上应用一系列高质量标准单克隆抗体对较大样本白血病细胞cd36 的表达作了较为详细的分析。结果发现，在133例白血病患者中aml组有41.9%（26/62）的患者cd36表达阳性，在54例淋巴细胞白血病中无1例cd36阳性表达。cd36是一种细胞膜糖蛋白，在造血细胞中它主要表达于单核细胞、红细胞前体、血小板、巨核细胞上。本研究中12例伴有单核细胞分化的amlm4和amlm5亚型的病人中cd36表达全部为阳性，cml单核细胞白血病急性变2例及cmml 1例为cd36阳性，12例amlm2亚型组有3例cd36表达阳性。另外2例以单核细胞增生的amlm6 cd36表达全部阳性。作为单核细胞分化的抗原之一，其敏感性为92.6%（25/27）。虽然cd14 是单核细胞的特异性标志,但cd14 只有在成熟的单核细胞表达为阳性,幼稚单核细胞cd14表达为阴性。而多数m4/ m5 患者为幼稚单核细胞增多。因此免疫分型难以根据单项cd14 是否阳性而诊断m4/ m5。在本研究中cd14在单核细胞相关性白血病上的阳性率仅为48.1%（13/27），低于cd36的阳性率（92.6%，25/27）。cd14在m5a上阳性率为0.0%(0/7)，在m5b中阳性率为100%（5/5）。因此，在诊断单核细胞相关性白血病中结合cd36与其它单核细胞分化抗原(如cd14、cd64等)分析，有利于提高其诊断率。在amlm2组中有3例患者的cd36表达阳性，其原因可能与白血病细胞群体中混有部分单核细胞成分有关。cd36除了表达在单核细胞外，还在巨核细胞和早期红细胞上有表达。在本研究中3例m6患者，在幼稚红系群体上都有cd36的高表达，但他们同时都有glya和cd71的表达。因此同时加做cd41和（或）cd61（巨核系标志）、glya和/或cd71（红系标志）及单核系其它标志抗原，可以将巨核细胞、早期红细胞及单核细胞区分开来。这也同时说明，在白血病的诊断分型中须综合多参数信息来分析。
在单核细胞上cd36随细胞的分化成熟而表达增加。在m4与m5b组中cd36与cd14的表达呈正相关。急性单核细胞白血病m5b的白血病细胞与m5a相比，前者在分化程度上较后者要成熟些，尽管本研究结果中显示cd36在m5中都为阳性表达，但其在m5b上的表达的阳性细胞百分数明显高于m5a，因此将cd36和cd14结合分析有助于m5的诊断及分型。m4为粒细胞和单核细胞成份同时存在，m4eo除了具有前面的特征外，嗜酸性粒细胞比例增多大于5%-30%。在本研究结果中显示2例m4eo均为cd36表达阴性，他们的cd14表达也为阴性。其余的6例m4患者cd36表达均为阳性。cd36是否有助区分m4的亚型还需要更多的病例数来分析。cd14在m4患者中阳性率为60.0%（6/10），这与冯国安等［6］和宁铂涛等［7］报道的较为相似。在aml组中cd36的表达与cd117呈负相关，m5a中cd117阳性率为100%（7/7），阳性细胞百分数为28.6%-92.5%，中位数为53.9%；cd36的阳性为100%（7/7），但其阳性细胞百分数为21.3%-36.5%，中位数为32.7%；m5b中cd117阳性率为20%（1/5），阳性细胞百分数为21.0%，而cd36的阳性率为100%，阳性细胞数为50.8%-95.2%，中位数为89.6%。cascavilla等［8］检测了9例m5a患者，其白血病细胞都表达cd117，而在11例m5b中仅有1例表达该抗原。由此可见cd117主要在较幼稚的单核细胞上高表达，而cd36随着单核细胞的成熟而表达增高。因此，结合cd117的表达情况也有助于区分亚型并可了解单核细胞的分化程度。另外，在aml组中cd36与hladr、cd34的阳性表达不相关。cd34在m5患者中多数（66.7%，8/12）为阴性表达，这与weir［9］和刘艳荣等［10］报道相似。
综上所述，本组资料说明：cd36阳性者可以排除淋系白血病（amll除外）；cd36作为单核细胞系分化的指标之一，其敏感性（92.6%，25/27）高于cd14（48.1%，13/27），但cd36还表达于红系前体细胞、巨核细胞上，因此须结合cd36与其它单核细胞分化抗原分析才有助于提高单核相关性白血病的诊断率；另外cd36结合cd14和（或）cd117有助于区分m5亚型及了解单核细胞分化程度。
【参考文献】
1khalidi hs, medeiros lj, cheng kl, et al. the immunophenotype of adult acute myeloid leukemia: high frequency of lymphoid antigen expression and comparison of immunophenotype, frenchamericanbritish classification, and karyotypic abnormalities. am j clin pathol, 1998; 109 : 211-220
2傅绪杰. 细胞膜糖蛋白cd36的研究现状. 国外医学·心血管疾病分册， 1998； 25：329-331
3王凤计. 现代血液细胞诊断学. 天津：科技翻译出版公司，2004: 269-270
4张之南. 血液病. 北京：人民卫生出版社，2003: 873-873
5li w, chen z, liu z, et al. application of cd45/ssc gating multiparameter flow cytometry in the classification of acute leukemia —— an analysis of 139 cases. j tongji med univ, 2001; 21:209-211
6冯国安，郭农建，黄平等. 单核细胞相关性白血病fcm免疫表型分析. 白血病·淋巴瘤， 2005；14：148-150
7宁铂涛, 汤永民, 沈红强等. 多参数流式细胞术观察251例白血病细胞cd14表达的意义. 实用肿瘤学杂志，2003；18：101-105
8cascavilla n, musto p, d'arena g, et ai. cd117 (ckit) is a restricted antigen of acute myeloid leukemia and characterizes early differentiative levels of m5 fab subtype. haematologica, 1998, 83 : 392-397
流式细胞仪范文第5篇
【关键词】流式细胞术，血小板，特发性血小板减少性紫癜，IgG，阳性
有研究发现血小板相关抗体的检测在ITP的诊断和治疗中有重要价值，但是传统的检测方法会增加患者的不适和痛苦、不利于患者的治疗、采血量较多、家属和患者难以接受等，更重要的是传统方法是导致医疗纠纷的主要原因【1】。所以，寻找新的检测方法，提高ITP患者的血小板相关抗体检出率，对ITP患者的康复和减少医疗纠纷有重要作用。流式细胞仪对血小板相关抗体的检测具有简单、重复性高、结果准确、采血量少等优点，随着对其研究的深入，发现流式细胞仪对临床治疗ITP的疗效判定有一定的意义【2】，在临床检测当中，应用的范围越来越广。本文就流式细胞仪在检测ITP患者血小板相关抗体中的意义作进一步探讨，其探讨结果如下：
1一般资料和方法
1.1一般资料 选取在2010年5月到2013年5月，来我院接受治疗的100名特发性血小板减少性紫癜患者，随机分成两组，对照组和观察组，每组各50人。观察组患者中男28人，女22人，年龄在21到60岁之间，平均年龄为41.3岁；对照组患者中男29人，女21人，年龄在23到59岁之间，平均年龄为38.9岁。所有患者经详细询问病史、系统的体格检查和实验室检查后确诊为特发性血小板减少性紫癜。两组患者在性别、年龄、病程及病情等一般资料上的差异没有统计学意义即p>0.05。
1.2方法 首先进行采血及血浆分离，经肘静脉采血后，加入EDTA-Na?2抗凝，然后离心10min，离心速度为1000转每分钟，用TEN洗涤分离出上层血浆，再对余血离心10min，离心速度为2500转每分钟，去上清，重复操作3次，分离出血浆；然后对以上标本进行检测，对照组患者采用ELISA检测，将洗涤后血小板的浓度调整为100×109/L，加入Triton悬液，4℃下破碎离心，用人IgG包被，封闭后加入人IgG标准液或者血小板破碎液，再加入羊抗人IgG稀释液，培育后显色，测定OD490吸光度值。观察组患者采用流式细胞仪检测IgG，首先将血小板进行标记，将羊抗鼠抗体或者羊抗人抗体与血小板悬液混合，洗涤两次，孵育25分钟后，进行检测，然后进行流式分析，调整激光器的波长为488nm，调整仪器处于正常状态，采用荧光强度道数对血小板表面的IgG含量进行测定。
统计学分析，采用SPSS13.0统计学软件对检测结果进行分析，分析结果如下：
2结果
对经流式细胞仪和ELISA法检测特发性血小板减少性紫癜患者的IgG结果进行比较，其结果如下：
表1经流式细胞仪和ELISA检测两组患者的IgG结果比较
分组 人数 IgG平均含量 阳性人数 阳性率
观察组 50 191±78b 43 86%
对照组 50 28±21 36 72%
从以上结果可以看出，观察组患者的IgG阳性率明显高于对照组患者，两组患者在IgG阳性率上的差异有统计学意义即，P
对观察组患者经激素治疗后，经流式细胞仪检测其治疗前后的IgG平均荧光强度结果如下：
表2经激素治疗前后的IgG平均荧光强度比较
患者 荧光强度
治疗前 治疗后
1到10名 81.32 49.20
11到20名 121.15 51.38
21到30名 69.39 31.41
31到40名 92.13 44.30
41到50名 86.36 50.12
从以上结果可以看出，流式细胞仪检测ITP患者的IgG灵敏度较高，对患者的治疗效果有一定的评估作用。
3讨论：
诊断血小板相关疾病的关键是，检测出血小板生存时间和血小板相关抗体【3】，流式细胞仪在判定血小板功能、对出血性疾病的诊断、诊断血栓性疾病和检测血小板相关抗体等方面上有一定的优势。传统方法在检测血小板相关抗体上有采血量较多、影响患者的治疗效果、易引起患者的不适和痛苦、不能指导治疗、可引起多种医疗纠纷等缺点【4】，因此，采用流式细胞仪进行血小板相关抗体的检测方法逐渐在临床检验上发展起来。本研究通过分别采用流式细胞仪和传统方法对两组患者进行血小板相关抗体的检测，对检测出的IgG阳性率进行比较，可以看出经流式细胞仪检测的患者IgG阳性率明显高于经传统方法检测的患者IgG阳性率；对观察组患者进行激素治疗后，经流式细胞仪检测其IgG的荧光强度，灵敏度较高，可在一定程度上评估治疗效果，对临床治疗血小板相关疾病有重要价值。
参考文献：
[1] 余晖，高晓阳. 全血法流式细胞术检测血小板相关抗体[J].细胞与分子免疫学杂志，2010，（12）：1296-1297.
[2] 聂咏梅. 流式细胞术检测小鼠全血中人血小板方法的建立[J].广东医学，2010，31（16）：2049-2052.
