高效液相色谱仪
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高效液相色谱仪范文第1篇
中图分类号：O657.7+2 文献标识码：A
高效液相色谱仪（HPLC），它具有高分辨率、高灵敏度、速度高效、色谱柱可以多次反复利用、流出组很容易收集等优良性能，是我国实验室中使用频率很高的分析型仪器。现今已经被大量使用到生物医药研究、大气环境分析、农业食品检测、无机分析等诸多领域。
安捷伦1260大大提高了HPLC 的压力上限。等度泵、四元泵和二元泵系统压力上限可以高达600bar，其最高流速可以达到每分钟5mL。而等度泵和四元泵系统达压力上限200 bar时，流速可以实现10mL/min，另外再加之80 Hz的检测速率和提高了10倍左右的高灵敏度，使安捷伦1260通用性达到了新的很高的水平，安捷伦1260并可实现更高的分离度和更快的分离速度。安捷伦1260是一种高精密的仪器，其对日常维护有很高的要求：
1 安捷伦1260高效液相色谱仪的运行环境
为了仪器的正常合理运转及其保养，应该将仪器放置在平稳固定的台面上，要求台面无振动，周围无辐射和磁场。“要保持干净无灰尘，仪器工作的温度大致范围要求是在15～30℃，周边空气的相对湿度在30%～80%之间”[1]。另外，因为流动相大多数是有机溶剂，我们还要保持室内有一些排风扇等通风换气的设施设备。
2 安捷伦1260高效液相色谱仪的开机维护
首先检查检测使用的流动相以及色谱柱是否准确无误，然后再打开仪器的稳压电源，而后再开输液泵、柱箱。设置好色谱柱的最大保护柱压，进行排气工作，并要确保流路时不会有气泡。这是因为气泡会扩大基线的噪声率，造成安捷伦1260高效液相色谱仪灵敏度不断下降，如果有气泡，气泡里的氧气还会氧化仪器组件，影响机器的性能指标。而关于流速切不可操之过急，我们应该从小到大一点点地加速，这样是为了更好地保护色谱柱。与此同时，还要注意仔细观察，观察柱压与流速能否保持相对应的平稳和合理增加，待到流速已经达到所需要的流速并最终让柱压稳定之后，然后再让检测器工作，这样有利于延长检测器的使用寿命。
3 安捷伦1260高效液相色谱仪柱前维护
由于临床上的样本多为较为复杂的混合物，而这些填料都是很细小的，并且色谱柱的内腔容积非常小，这就会导致堵塞现象。同样，溶液里的细小微粒也会加大进样阀、泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的堵塞和磨损概率。安捷伦1260高效液相色谱仪用缓冲盐的时候，缓冲盐溶液会产生高压析盐情况，会产生一些小的盐粒，这些盐粒会附着在活塞杆上，并会随着活塞杆运动，这就很容易使仪器产生划痕现象，磨损仪器中的密封垫，从而产生漏液等问题。
在使用中应当注意，过滤是非常重要的环节，有效过滤才能够有效保护色谱柱、仪器。为了避免这种情况，不能使用已经存放日期过长的蒸馏水及磷酸盐溶液，如果条件许可的话，可以采用“在溶液中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠”[2]的方法来处理解决。也可以在溶剂瓶内溶剂的上方不断地吹入比较稳定的氩气从而实现隔绝空气的目的。还要注意不要把溶剂瓶放在光线强烈的地方，这样会导致溶液失效，为了缓解阳光的失效作用，尽量使用琥珀色的溶剂瓶放置。还可以在色谱柱前加上保护柱，从而避免色谱柱的污染，进而延长柱子的使用寿命。同时要定期用水冲洗所有的通道，从而有效除去阀口上可能出现的盐沉淀。
使用梯度比例阀时，当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能够实现与有机溶液有效重新融合并不会出现沉淀现象。假如在比例阀的混合点上，由于重力的因素使盐颗粒慢慢沉淀下来，通常阀A接水相盐溶液，D接有机溶剂，此连接法可有效使盐回落到盐溶液中并被溶解。但是，假若把这个连接法颠倒过来，这些盐可能落在有机溶剂之中，从而容易出现问题。因此，当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时，建议要将缓冲盐的通道接在A通道上，而将有机溶液的通道直接接在D通道上。
4 安捷伦1260高效液相色谱仪关机维护
实验完成后，要把色谱柱冲洗干净。首先要去完成的就是关掉检测器，之所以要这样做是为了节约光源，保证仪器灯的有效使用年限。另外，还要切断色谱柱与检测器的连接程序，之所以这样是为了防止污染检测池。用流动相冲洗流路30多min，然后再用15%的甲醇水洗10min左右，最后再用纯甲醇冲30min左右，并用一些纯化水同时冲外流路等地方。输液泵的流速应慢速减小到0时，才可关闭泵和稳压器。“反相系统用90%～95%有机相+10%～5%水相封存反相色谱柱”[3]，两端封死。如长时间存放可将柱子完全浸泡在有机相内，以防用纯有机相封存反相色谱柱，如果长期保存有机相会挥发。
参考文献
[1] 黄大炜.高效液相色谱仪在使用中的几个问题[J].中国药事，2010（3）：26.
[2] 丰昌云.高效液相色谱仪的故障对策[J].精细化工中间体，2011（7）：54-55.
高效液相色谱仪范文第2篇
【关键词】高效液相色谱；孔雀石绿；隐形孔雀石绿；水产品
0.前言
孔雀石绿（MG）为三苯甲烷类工业染料, 在水产养殖上可以有效的预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小虫病，并能保持水产品的新鲜度。一些水产品贩运商和酒店为保持水产品新鲜度普遍使用MG，使用MG后的鱼即使死亡后颜色也较为鲜亮，消费者很难从外表进行辨认。MG 在水生生物体中的主要代谢产物为隐色孔雀石绿（LMG），MG 具有毒性强、高残留和致畸、致癌、致突变等副作用。LMG 由于不溶于水，其残留毒性比MG 更强，保留时间更长。所以，目前世界上诸如美国、日本、加拿大和欧盟等许多国家已将MG 列为水产养殖禁用药物，我国也于2002年将其列入食品动物禁用的兽药及其化合物清单。2008年我国公布的食品中可能违法添加的非食用物质名单中就有孔雀石绿。虽然MG 已被列为水产养殖禁用药物，但因其价格低廉和保鲜，仍有一些水产养殖户和酒店在普遍使用。
目前孔雀石绿的检测方法主要有高效液相色谱-荧光检测法[1][2]、高效液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联质谱法[3][4][5]。本文在国标方法的基础上进行优化，前处理方法与国标法相同（此文略），就流动相的选择、流动相溶剂比例和用氨基柱代替C18柱方面进行实验。计算出线性范围、最低检测浓度和精密度。
1.实验部分
1.1仪器及试剂
1.1.1仪器
（1）高效液相色谱仪。
（2）分析天平 感量0.1mg。
1.1.2试剂
（1）乙睛：色谱纯。
（2）乙酸铵：色谱纯。
（3）孔雀石绿（MG）纯度98%。
（4）隐色孔雀石绿（LMG）纯度98%。
（5）0.125mol/L乙酸铵溶液：称取乙酸铵9.64g，用纯水溶解并定容至1000mL，用 0.45μm滤膜过滤。
（6）MG标准储备液：准确称取孔雀石绿0.1000g，用乙睛溶解并定容至100mL。该标准溶液浓度为1mg/mL。避光、冰箱冷冻保存。
（7）MG标准应用液：吸取 1mg/mL MG标准储备液用乙睛稀释至1.0μg/mL。
（8）LMG标准储备液（1mg/mL）：准确称取LMG 0.1000g，用乙睛溶解并定容至100mL 。
（9）LMG标准应用液：吸取1mg/mL LMG标准储备液用乙睛稀释至1.0μg/mL。
（10）MG和LMG标准混合溶液分别吸取MG和LMG标准储备液，用乙睛稀释成不同浓度的标准混合溶液。
1.2仪器条件
检测器：紫外-可见光检测器，波长 618nm。
色谱柱：氰基柱，4.6mm×250mm，5μm。
流动相：乙睛-0.125mol/L 乙酸铵（pH4.5）=（47+53）。
柱 温：35℃。
流 速：1mL/min。
进样量：20μL。
1.3 测定
吸取20μL MG和LMG标准混合溶液（5.0μg/mL）分别注入色谱仪，在上述色谱条件下，绘制色谱图。见下图。
5.0μg/mL 孔雀石绿和无色孔雀石绿标准混合溶液色谱图
2.结果与讨论
2.1流动相的选择
MG和LMG的HPLC法分离，无论是C18柱还是氰基柱，多采用乙睛和乙酸铵作流动相的反相体系。其中乙酸铵浓度对MG和LMG的分离有很大影响。对于梯度洗脱方式多采用 50mmol/L乙酸铵溶液，而等梯度洗脱方式乙酸铵溶液浓度较大,为0.125mol/L。
2.2 流动相溶剂比例的影响
在上述色谱条件下，用1.0μg/mL MG和LMG标准混合溶液在不同比例（V/V）的乙睛—0.125mol/L 乙酸铵溶液中观察分离效果，结果表明，在乙睛—乙酸铵溶液（pH4.5）=47+53 时分离效果好，灵敏度最高，所以选择该溶剂比为流动相比例。见表 1。
表1 流动相溶剂比例对 LMG/MG 分离的影响
2.3 最低检测浓度
在上述色谱条件下，以3S/N的响应信号为最低检测浓度，LMG的最低检测浓度为0.02μg/mL，MG的最低检测浓度为0.05μg/mL，均能满足试验要求。以取样量10.0g 计，最低检测浓度 LMG为2μg/kg，MG为5μg/kg。
2.4 线性范围试验
上述色谱条件下，LMG和MG线性关系均良好。LMG和MG线性范围为2μg/mL～160.0μg/mL，相关系数r>0.999。
2.5 精密度试验
在上述色谱条件下，分别用1.0μg/mL、5.0μg/mL和10.0μg/mL LMG/MG混合标准溶液进行平行性测定。保留时间相对标准偏差（RSD）一般小于0.4%，峰面积相对标准偏差小于5%。见表2。
表2 不同浓度 LMG/MG 混合标准溶液测定精密度试验
3.结论
高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿的方法中，SC/T3021-2004 采用C18柱，等梯度洗脱方式，但需要较大流速（2ml/min）；而GB/T19857-2005法采用C18柱，梯度洗脱方式并需柱后衍生，比较繁琐；GB/T20361-2006法中需要荧光检测器，对只有紫外检测器的用户还需再购置；文献有采用氰基柱分离的梯度洗脱方式。我们在研究这些方法的基础上，采用氰基柱分离、改变流动相比例、减少流速（1.0mL/min）和等梯度洗脱方式，测出最低检测浓度MG为0.05μg/mL，LMG为0.02μg/mL。线性范围0.1μg/mL～160.0μg/mL。该方法具有保留时间短、分离效果好、线性范围宽，节省试剂，减少成本等优点，适用于水产品中MG和LMG含量检测。
【参考文献】
［1］GB/T20361-2006.水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定，高效液相色谱荧光检测法[S].
［2］杨贤庆，孙满义，李来好等.水产品中孔雀石绿高效液相荧光检测法的改良研究[J].食品科学，2008，29（8）：26-29.
［3］GB/T 19857-2005.水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定[S].
高效液相色谱仪范文第3篇
【关键词】 仔花感冒胶囊；对乙酰氨基酚；高效液相色谱法
Abstract：Objective To establish a method for the determination of Paracetamol in Zihua Ganmao Capsule. Method Samples were separated on a Kromasil-C18 column with the mobile phase of methanol- water (35∶65)， and the detection wavelength was set at 249 nm. Result The calibration curves were linear in the range of 0.165～0.99 μg (r＝0.999 9) for Paracetamol. The average recovery was 98.41% and RSD＝ 0.64% (n＝6). Conclusion The method is accurate and repeatable， and can be used for the quality control of Zihua Ganmao Capsule.
Key words：Zihua Ganmao Capsule；Paracetamol；HPLC
仔花感冒胶囊由狗仔花、柴胡、藁本、防风、黄芩以及马来酸氯苯那敏、对乙酰氨基酚等制成，具有清热解毒、祛风止痛的功效，用于风热感冒所见发烧头痛、肢体不适。对乙酰氨基酚为其中的主要西药成分之一，原质量标准中用紫外分光光度法[1]测定对乙酰氨基酚的含量，重现性差、阴性干扰严重、误差较大。为了更好地控制该药的质量，笔者采用高效液相色谱法测定对乙酰氨基酚的含量，方法简便、结果准确、重复性好，可以较好地控制该产品的质量。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：日本岛津LC-10AD泵，SPD-10AV紫外检测器，C-R7Ae数据处理机；超声波清洗器[必能信超声(上海)有限公司]。对乙酰氨基酚(中国药品生物制品检定所提供，批号10018-200408，供含量测定用)；仔花感冒胶囊(广西玉林制药有限责任公司提供，批号635002、635003、635004、735001、735002)。甲醇为色谱纯，其他为分析纯、水为去离子水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Kromasil-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(35∶65)，流速：0.5 mL/min，柱温：30 ℃，检测波长：249 nm，进样量10 μL。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取在105 ℃干燥至恒重的对乙酰氨基酚适量，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备
取本品20粒的内容物，精密称定，研细，混匀，取约0.3 g，精密称定。加甲醇35 mL，超声处理(功率500 w，频率50 kHz) 20 min，放冷，滤过，滤液置50 mL量瓶中，用少量甲醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取1 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
2.4 线性关系考察
精密称取在105 ℃干燥至恒重的对乙酰氨基酚适量，加甲醇制成每1 mL含0.165 mg的溶液作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，各精密吸取10 μL，分别注入液相色谱仪，依本法测定。以测得峰面积为纵坐标，对照品进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程：Y＝3 450 864X－9 698，r＝0.999 9(n＝6)，表明对乙酰氨基酚进样量在0.165～0.99 μg范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
取同一份供试品溶液，依本法，按上述色谱条件测定，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，重复进样6次，对乙酰氨基酚峰面积的RSD＝0.55%，结果表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
吸取供试品溶液10 μL，于0、1、4、8、12、24 h，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，结果对乙酰氨基酚峰面积RSD＝1.6%，说明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验
取同一批号(批号635003)的仔花感冒胶囊样品5份，按供试品溶液制备项下操作，制备5份供试品溶液，按上述色谱条件测定，分别吸取10 μL注入液相色谱仪，测得对乙酰氨基酚的平均含量为0.306 8 g/g(n＝5，RSD＝1.50%)。
2.8 加样回收率试验
精密称取已知含量的仔花感冒胶囊(对乙酰氨基酚含量为0.321 5 g/g)6份，分别准确加入对乙酰氨基酚对照品溶液(98.5 mg/mL)各1 mL，按供试品溶液制备项下操作，制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定，分别吸取10 μL注入液相色谱仪。结果见表1。表1 加样回收率试验结果（略）
2.9 样品测定
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，根据对照品峰面积，计算出样品溶液中对乙酰氨基酚的含量(见表2)。表2 样品测定结果(略)
2.10 专属性考察
对乙酰氨基酚对照品和仔花感冒胶囊在相同保留时间处有吸收峰，而阴性样品在此处无吸收峰。色谱图见图1。
3 讨论
由于仔花感冒胶囊样品中对乙酰氨基酚含量较大，为了尽量减少误差，提高方法的准确性，通过紫外扫描，对乙酰氨基酚在249 nm有处最大吸收，故选择249 nm为检测波长。
根据文献报道，曾用过流动相、检测波长：①甲醇-水(15∶85)，冰醋酸调pH至4.5，波长243 nm[2]；②以甲醇-0.025 mol KH2PO4(15∶85)用磷酸调节至pH 3.0，检测波长为295 nm[3]，结果以本试验所用的流动相较佳，对乙酰氨基酚保留时间约为7.6 min，整个分析时间10 min。
在提取条件的选定过程中，我们曾采用过索氏提取法、热回流法、超声提取法，结果三者之间提取出的对乙酰氨基酚含量没有显著差异，但由于索氏提取法和热回流法费时间较长，不利于生产过程的控制，超声20 min提取所测定的对乙酰氨基酚含量最高。因此，选择了比较简便、且效率较高的超声提取法。
参考文献
[1] 广西壮族自治区卫生厅.广西药品标准[S].1988.217.
高效液相色谱仪范文第4篇
【摘要】 目的建立益气养阴降糖丸中葛根素的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法（HPLC）法，检测波长：250 nm， 流动相：甲醇0.1%枸橼酸溶液(25∶75)， 流速：1.0 ml/min 。结果葛根素浓度在10.0～90.0 μg/ml范围内线性关系良好（r=0.999 6），加样回收率为99.5%（n=3），RSD为1.2%。结论 此方法操作简便，结果准确，可用于益气养阴降糖丸中葛根素的含量测定。
【关键词】 高效液相色谱法； 葛根素； 益气养阴降糖丸
Determination of Puerarin Content in Jiangtang Pill for Invigorating Qi Nourishing Yin by HPLC Method
Abstract：ObjectiveTo develop a method to determine the content of puerarin in Jiangtang pill for invigorating Qi， nourishing Yin.MethodsHigh Performance Liquid Chromatography (HPLC)， with detection wavelength of 250 nm， the mobile phase consists of methanol and 0.1% citric acid (25∶75)， at flow rate∶1.0 ml/min.ResultsThe linear range of puerarin was 10.0～90.0 μg/ml(r=0.999 6). The recovery of sample was 99.5%(n=3) with RSD of 1.2%.ConclusionThis method is simple accurate， and can be used for the determination of puerarin content in Jiangtang pill for invigorating Qi， nourishing Yin.
Key words：HPLC method; Puerarin; Jiangtang pill for invigorating Qi
益气养阴降糖丸是我院研制的治疗糖尿病的中成药，由黄芪、葛根、桑寄生、生地、生水蛭等十多味中药组成，具有益气养阴、健脾运津、除烦止渴、补益肝肾的作用，临床疗效良好。为了更有效地控制制剂的质量，我们对其主要成分葛根素进行了含量测定，以期为该制剂的质量控制提供检测方法。
1 仪器与试药
日本岛津LC10ATVP高效液相色谱仪，SPD10AVP紫外检测器，赛多利斯BP211D电子天平，葛根素对照品（中国药品生物制品检定所01250107），甲醇为色谱纯，益气养阴降糖丸（自制）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为日本岛津Shimpeck VPODS 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇0.1%枸橼酸溶液(25∶75)， 流速1.0 ml/min，检测波长为250 nm，柱温为室温。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取葛根素对照品25 mg（60℃五氧化二磷减压干燥4 h）置50 ml量瓶中，加流动相溶解，并稀释至刻度，摇匀即得。
2.2.2 供试品溶液的制备
精密称取供试品4.0 g，研细，置50 ml量瓶中，用甲醇溶解，超声处理30 min，并稀释至刻度，离心，取上清液，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，精密量取续滤液5 ml，置25 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀即得。
2.3 标准曲线的制备精密量取对照品溶液1.00，3.00，5.00，7.00，9.00 ml分别置于50 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，制得标准溶液系列，取10 μl注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品溶液浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归分析，回归方程为：A=50 939 138C-10 496，r=0.999 6，线性范围10.0～90.0 μg/ml，最低检测限为100 μg/ml（S/N≥3）。
2.4 精密度实验
在上述色谱条件下，取50μg/ml的对照品溶液，重复进样6次，峰面积的RSD值为0.62%。结果表明仪器的精密度较好。
2.5 重复性实验
精密称取同一批号的样品5份，按照样品测定方法操作，测定含量，计算RSD为1.6%。
2.6 回收率实验
精密称取已知葛根素含量的样品3份，每份中分别加入精密称定的葛根素对照品，混匀，照供试品的测定方法，计算平均回收率为99.5%（n=3），RSD为1.2%。
2.7 样品的含量测定
取3个批号的样品，制成供试品溶液，分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各10 μl注入液相色谱仪，依法测定，以外标法计算含量。结果见表1。表1 益气养阴降糖丸中葛根素的含量（略）
3 讨论
3.1 流动相的选择
本实验比较了甲醇-水，乙醇-水，甲醇-酸液系统对样品中葛根素保留时间、分离度的影响，结果发现采用甲醇-0.1%枸椽酸溶液（25∶75）的流动相色谱效果良好。
3.2 提取方法的比较
对于葛根素的提取，以往的文献有采用索氏提取器提取的［1］，有采用水浴加热回流提取的［2］，本实验采用甲醇为溶媒，采取超声振摇提取法提取，效果良好，方便快捷。
方法学验证显示，本实验所建立的方法简便、可靠，可作为该制剂质量控制的方法。
【参考文献】
高效液相色谱仪范文第5篇
目的建立了参杞益脑胶囊中β-细辛醚的高效液相色谱含量测定方法。方法色谱柱为Thermo BDS Hypersil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.1％冰醋酸溶液（60∶40）；柱温35 ℃；流速1.0 ml·min-1；检测波长为257 nm。结果β-细辛醚浓度在4.885 ～ 146.55 μg/ml之间峰面积与浓度具有良好的线性关系。其高、中、低3种浓度的平均回收率分别为103.2％，102.1％和100.2％；RSD分别为0.4％，0.3％和0.7％。结论方法简便灵敏，结果准确可靠，专属性强，可用于参杞益脑胶囊中石菖蒲的质量控制。
【关键词】 参杞益脑胶囊 β-细辛醚 石菖蒲 高效液相色谱法
Abstract：ObjectiveTo establish a high performance liquid chromatographic method for the determination of β-asarone in Shenqiyinao Capsules. MethodsThe column was Thermo BDS Hypersil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm). The mobile phase was methanol - 0.1% glacial acetic acid solution (60∶40) and the temperature of column was 35 ℃. The flow rate was 1.0 ml·min-1 and the detection wavelength was 257 nm with external method. ResultsThe linear range of β-asarone was 4.885 ～ 146.55 μg·ml-1. The average recoveries of β-asarone were 103.2%， 102.1% and 100.2% with corresponding RSD of 0.4%， 0.3% and 0.7%，respectivery. ConclusionThe method is simple， sensitive， accurate and can be used for the determination of Rhizoma Acori Tatarinowii (RAT) in Shenqiyinao Capsules.
Key words：Shenqiyinao Capsules； β-asarone； Rhizoma Acori Tatarinowii (RAT)； HPLC
参杞益脑胶囊具有补益肝肾，益气养血，健脑益智等功能，适用于肝肾不足，脑神失养所致的健忘，失眠，多梦，记忆力减退等症。其处方来源于国家药品监督管理局标准，由枸杞子、黄精、白首乌、石菖蒲、猪脑粉、荷梗、肉苁蓉、郁金、远志(蜜)、骨碎补、紫苏子(炒)、人参、鹿茸等13味中药组成。现行质量标准中未收载含量测定项目，目前仅有报道测定参杞益脑胶囊中毛蕊花糖苷的含量作为肉苁蓉的质量控制［1］。石菖蒲具有化湿开胃，开窍豁痰，醒神益脑的功能［2］，为其主药之一。而β-细辛醚为石菖蒲的主要活性成分之一［3］，其在市售的石菖蒲挥发油中的含量占83.75％［4］。本实验采用高效液相色谱法测定参杞益脑胶囊中β细辛醚的含量，为参杞益脑胶囊中石菖蒲的含量提供了质量控制方法。
1 仪器与试药
Agilent 1100 高效液相色谱仪，配置G1311A 四元泵；G1313A 自动进样器；G1316A 柱温箱；G1315B 二极管阵列(DAD)检测器；Agilent 化学工作站；Elmasonic S 300H 型超声波清洗器（功率1 500 W）。
甲醇为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。β-细辛醚对照品（广州中医药大学第一附属医院实验中心，按面积归一化法测定，含量为98.94％）。参杞益脑胶囊（批号：20060701，20060702，20060703，20060704，20060705，20060801，20060802，20060803，20060804，20060805 深圳万基药业有限公司生产并提供）；不含石菖蒲的阴性样品（深圳万基药业有限公司生产并提供）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱： Thermo BDS Hypersil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.1％冰醋酸溶液（60∶40）；柱温：35 ℃；流速1.0 ml·min-1；检测波长为257 nm，进样体积20 μl。在上述色谱条件下β-细辛醚与其它组分能达到基线分离，色谱峰的理论板数为3139，并且石菖蒲阴性样品无干扰，色谱图见图1～3。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取β-细辛醚对照品适量，加甲醇制成每毫升含 β-细辛醚35μg的溶液，摇匀，即得。
2.3 供试品溶液的制备 取本品20粒，求得平均装量，将内容物混合均匀，取本品内容物约0.5 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加甲醇约30 ml，超声处理30 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
图1 供试品溶液色谱图（N=3 139，R＝2.42）（略）
图2 β-细辛醚对照品溶液色谱图（略）
图3 石菖蒲阴性样品溶液色谱图（略）
2.4 线性关系考察 精密称取β-细辛醚对照品19.54 mg，置20 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取3，3，2，2，2，1 ml分别置20，25，20，50，100，200 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别取20 μl按“2.1”项下色谱条件注入液相色谱仪，以峰面积Y为纵坐标，对照品浓度X (μg/ml)为横坐标，进行线性回归。回归方程为：
Y=46.242 4X-42.458 8，r＝0.999 9
表明β-细辛醚在4.885～146.55 μg·ml-1浓度范围内具有良好的线性关系。
2.5 重复性实验 取同一批参杞益脑胶囊样品，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定，结果RSD为2.2％，结果表明本法重复性良好。
2.6 精密度实验 精密吸取上述供试品溶液20 μl，连续进样6次，按上述色谱条件测定β-细辛醚峰面积，RSD为0.5％。
2.7 稳定性实验 取1份供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10 h进样20 μl，按上述色谱条件测定β-细辛醚的含量，RSD为0.6%，结果表明供试品溶液在10 h内稳定。
2.8 回收率实验 精密称取已测定含量的样品(批号20060805；含β-细辛醚1.57 mg/粒) 9份 (每种浓度3份，低浓度约0.15 g，中浓度约0.25 g，高浓度约0.70 g)，置50 ml量瓶中，分别精密加入β-细辛醚对照品溶液（0.249 6 mg·ml-1）3，5，15 ml，每种加入量平行操作3份，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法，自“加甲醇约30 ml……”操作，各进样20 μl，记录色谱图，计算回收率。其高、中、低3种浓度的平均回收率分别为103.2％，102.1％和100.2％；RSD分别为0.4％，0.3％和0.7％。结果见表1。
2.9 样品含量测定 取不同批号的样品，分别按“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备，测定含量。结果见表2。
表1 回收率实验结果（略）
表2 样品中β-细辛醚的含量测定（略）
*为每粒中含量
3 讨论
3.1 检测波长的选择 采用二极管阵列检测器，在200～400 nm波长范围内检测 β-细辛醚在流动相中的紫外吸收图谱及参考相关文献［5］，选择257 nm为检测波长。
3.2 流动相的选择 考察了不同比例的甲醇-水、乙腈-水及甲醇-0.1％冰醋酸溶液等作为流动相体系，以甲醇-0.1％冰醋酸溶液(60∶40)为流动相时效果最好，供试品溶液中β-细辛醚能与其它组分获得基线分离，且主峰符合要求。
3.3 耐用性实验 考察不同厂牌的HPLC仪：Agilent 1100 高效液相色谱仪、岛津LC-2010A高效液相色谱仪；不同厂牌的色谱柱：Thermo BDS Hypersil C18柱，Luna C18柱和LiChrospherR100 RP-18e C18柱，由不同的实验者进行实验，也可得到满意的色谱图，表明本法的耐用性好。
致谢：广州中医药大学第一附属医院实验中心的柯雪红老师为本实验研究提供了β-细辛醚对照品，在此表示感谢！
【参考文献】
［1］ 邬晓鸥， 熊 英， 肖丽和. 参杞益脑胶囊中毛蕊花糖苷的HPLC分析［J］.中成药， 2004， 26 (6): 458.
［2］ 国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社， 2005：62.
［3］ 胡锦官， 顾 健， 王志旺. 石菖蒲及其有效成分对学习记忆的实验研究［J］.中药材， 1999， 22 (11): 584.
