凝胶色谱
前言：想要写出一篇令人眼前一亮的文章吗？我们特意为您整理了5篇凝胶色谱范文，相信会为您的写作带来帮助，发现更多的写作思路和灵感。
凝胶色谱范文第1篇
关键词 ：食品； 氯丙醇； 在线凝胶渗透色谱气相色谱串联质谱； 固相支持液液萃取净化； 非衍生化
1 引 言
氯丙醇类化合物（包括3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP和2，3DCP）早期在于酸水解植物蛋白液及以其为原料的调味品（如酱油等）中发现[1～3]，之后又陆续在面包、香肠、咖啡、谷物类等食品中检出[4～8]。
毒理学研究表明，3MCPD可以通过血睾屏障和血脑屏障，并在体液中广泛分布，具有生殖、肾脏和神经毒性[9，10]。WHO/FAO食品添加剂和污染物联合专家委员会（JECFA）确定1，3DCP具有体外遗传毒性和生殖毒性，会引起大鼠肝、肾脏、甲状腺等的癌变[11]；2，3DCP会对肝、肾脏及产生影响[11]。
目前，食品中氯丙醇的检测通常采用七氟丁酰咪唑（HFBI）、七氟丁酰酐（HFBA）[12]、三氟乙酸酐（TFAA）[13]和苯硼酸[1]等衍生试剂将氯丙醇衍生，利用气相色谱质谱（GCMS或GCMS/MS）法进行测定[14～18]。我国食品安全国家标准 GB/T 5009.1912006《食品中氯丙醇含量的测定》中氯丙醇的测定采用的是以HFBI衍生化的GCMS方法[19]。在上述方法中，衍生化步骤繁冗复杂；衍生物稳定性较差，需衍生后尽快完成测定；衍生试剂昂贵，增加样品检测成本，并且对环境湿度要求极高，否则易吸潮变质。
Online GPCGCMS是将凝胶渗透色谱和GCMS在线联用的分析检测技术，能将样品净化液中分子量较大的脂类、色素等干扰物质与目标物分离，减少基质影响，降低分析背景，提高重现性，实现连续自动的部分前处理和仪器测定的在线分析，加快分析速度和提高分析结果的准确性。与GCMS相比，GCMS/MS将离子碎片施予适当能量再次打碎，形成二级离子碎片，增强了结构解析和定性能力，更有效地排除基质干扰。本研究建立了非衍生化的Online GPCGCMS/MS法直接测定食品中氯丙醇的检测方法，同时对食品样品的前处理方法进行了优化。本方法对样品的适用性广泛，不仅适用于调味品，也适用于面包、糕点等其它食品样品。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
Online GPCGCMS/MS系统（日本Shimadzu公司），GPC系统包括SIL20ADvp自动进样器、ShodexEV200AC凝胶渗透色谱柱（150 mm × 2 mm）、CTO20ASvp柱温箱、SPD20Avp紫外检测器；GCMS/MS系统包括QP2010Plus气相色谱仪、TQ8040型质谱联用仪，并配有PTV2010大体积进样器；MilliQ超纯水器（美国Millipore公司）；G560E型涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；NEVAPTM111型吹氮浓缩仪（美国Organomation Associates公司）；G560E涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；AL204分析天平（瑞士梅特勒公司）；NDO400型电热恒温鼓风干燥箱（杭州汇尔仪器设备有限公司）；微量移液器（德国Eppendorf公司）。
3MCPD（纯度98%，德国Aldrich公司）；五氘代3氯1，2丙二醇（D53MCPD，纯度≥99%，德国DrEhrenstorfer公司）；1，3DCP、2，3DCP、五氘代1，3二氯2丙醇（D51，3DCP）和五氘代2，3二氯1丙醇（D52，3DCP）（纯度≥97%，德国Fluka公司）；2MCPD、五氘代2氯1，3丙二醇（D52MCPD）（纯度≥98%，加拿大TRC公司）；正己烷、乙酸乙酯（色谱纯，美国J.T. Baker公司）；无水Na2SO4（优级纯，天津市津科精细化工研究所，使用前经195℃烘烤8 h使用）；ExtrelutTM NT硅藻土填料（德国Merck公司）。
2.2 标准溶液的配制
分别准确称取各氯丙醇和氘代氯丙醇标准品10 mg（精确至0.01 mg），用乙酸乙酯溶解并定容至不同的10 mL棕色容量瓶中，配制成1000 mg/L标准储备液，于20℃贮存。准确吸取各氯丙醇标准储备液， 用正己烷逐级稀释，配制成10 mg/L氯丙醇混合标准使用液。准确吸取各氘代氯丙醇标准储备液，用正己烷稀释，配制成10 mg/L氘代氯丙醇混合标准使用液。分别准确吸取适量氯丙醇标准使用液和适量氘代氯丙醇标准使用液， 用正己烷稀释，配制成0.01， 0.02， 0.05， 0.1， 0.2， 0.5和1.0 mg/L的氯丙醇系列混合标准工作液，其中氘代氯丙醇的含量均为0.2 mg/L。
2.3 实验方法
2.3.1 样品提取与净化 准确称取2 g试样于10 mL离心管中（若为固体或半固体试样，则加入2 mL水，溶解后混匀），加入10 mg/L氘代氯丙醇混合标准使用液20 μL，涡旋30 s，加入到填充了2 g ExtrelutTM NT硅藻土填料的塑料层析柱（180 mm × 150 mm）中，静置10 min，用3 mL正己烷淋洗，弃去流出液，以10 mL乙酸乙酯进行固相支持液液萃取，收集流出液至装有3 g无水Na2SO4的离心管中，充分吸收水分，转移上清液并于30℃以氮气吹至近干，用正己烷定容至1 mL，涡旋混匀，无水Na2SO4除水，待测。
2.3.2 Online GPCGCMS/MS条件 Online GPC条件：泵流速0.1 mL/min；柱温40℃；载气吹扫0.1 min； 流动相为丙酮环己烷（3∶7， V/V）。
气相色谱质谱条件： 气相色谱柱系统包括空柱（惰性石英管，5 m × 0.53 mm）、预柱（DB5MS石英毛细管柱，5 m × 0.25 mm × 0.25 μm）和分析柱（DB5MS石英毛细管柱，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）。进样体积：10 μL，不分流进样。进样口程序升温：120℃保持5 min，以100℃/min升至280℃，并恒温15.9 min。进样时间：7 min；柱温箱程序升温：82℃保持5 min，以8℃/min升至150℃，继续以25℃/min升至250℃，并保持5 min。载气：高纯氦气（纯度99.999%），流速为1.75 mL/min。离子源：电子轰击源，温度为200℃。溶剂延迟时间为10 min。采用多反应监测模式（MRM）扫描，主要质谱参数见表1。
3 结果与讨论
3.1 Online GPC收集时间考察
Online GPCGCMS/MS的原理是样品经Online GPC柱分离，废液通过六通阀排出，含有目标物的馏分先被储存在定量补集环路（200 μL）中，再全部注入GC，通过溶剂蒸汽出口排出溶剂，同时目标分析物保存在预柱中。待溶剂排出口关闭后柱，柱温箱开始升温，目标物进入分析柱分离，因此收集时间的选择显得尤为重要。配制0.5 mg/L氯丙醇混合标准溶液，重复进样5次，获得目标物在GPC上保留时间为3.99～ 4.05 min，考虑到灵敏度和基质去除效果，确定收集时间为3.80～4.25 min。氯丙醇及其内标混合标准溶液（0.2 mg/L）的MRM质谱图见图1， 各氯丙醇的色谱图见图2和图3。
3.2 样品净化方法的优化
文献 [20，21]利用ExtrelutTM NT硅藻土进行固相支持液液萃取净化，测定食用植物油中的氯丙醇，使提取液先吸附于硅藻土表面，经正己烷淋洗去除脂肪和色素后，以乙酸乙酯与吸附于硅藻土表面的氯丙醇进行液液萃取。本实验对乙酸乙酯溶剂（纯度≥99%）的用量（2， 4， 6， 8， 10和12 mL）进行了优化，结果见图4，当乙酸乙酯用量为10 mL时，各氯丙醇的峰面积响应值最高。因此，乙酸乙酯用量选择10 mL。
考虑到Online GPC的在线净化能力以及简化实验操作，比较了不经填料吸附直接进行液液萃取净化的传统方法与以ExtrelutTM NT硅藻土进行的固相支持液液萃取净化方法的效果，以空白酱油样品添加回收实验的方式（0.2 mg/L）测得4种氯丙醇的回收率分别为53.2%～81.2%和83.3%～110.1%。结果表明，以ExtrelutTM NT硅藻土进行的固相支持液液萃取净化的效果更好、准确度更高。
3.3 方法学验证
3.3.1 线性范围、检出限和定量限 以氯丙醇混合标准使用液及氯丙醇内标标准使用液配制浓度分别为0.005， 0.01， 0.02， 0.05， 0.1， 0.2， 0.5和1.0 mg/L（内标浓度均为0.2 mg/L）的氯丙醇系列标准工作液，经Online GPCGCMS/MS测定。以氯丙醇的色谱峰峰面积与其对应的内标的色谱峰峰面积之比（y）为纵坐标，氯丙醇与其对应内标的浓度之比（x）为横坐标，绘制标准工作曲线，结果见表2。4种氯丙醇在0.005～1.0 mg/L范围内呈现良好的线性关系，相关系数（R）均大于0.999。
在空白酱油样品中添加0.001， 0.002， 0.005和0.010 mg/L 4个水平的3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP和2，3DCP标准样品。以3倍信噪比（S/N=3）所对应的含量作为方法的检出限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）所对应的含量作为方法的定量限（LOQ），得到氯丙醇类化合物的检出限在0.002～0.005 mg/kg之间， 定量限在0.005～0.01 mg/kg之间，结果见表2。与文献[19]报道的衍生化方法相比，本方法的检出限更低（表3）。
3.3.2准确度与精密度 以空白酱油加标回收率表示方法的准确度，以回收率的相对标准偏差（RSD）表示方法的精密度。在空白酱油样品中添加0.02， 0.1和0.5 mg/L的3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP， 2，3DCP标准样品，每个加标水平平行测定6份，结果见表4。4种氯丙醇的3个水平加标回收率和相对标准偏差（RSD）分别为94.8%～106.3%（2.2%～10.3%）， 91.8%～108.8%（2.1%～10.6%）和83.1%～109.4%（1.3%～9.4%）。结果表明，方法的精密度和准确度良好。
3.4 实际样品分析
利用本方法对于北京地区超市、农贸市场及相关食品企业采集的78份食品样品（其中包括酱油20份、料酒16份、面包糕点21份、鸡精15份、水解植物蛋白液3份、水解植物蛋白粉3份）进行了检测，结果见表5。在检测的78份样品中，3MCPD的检出率最高，为100%（78/78），2MCPD的检出率为67.9%（53/78），1，3DCP和2，3DCP的检出率相对较低。依据食品安全国家标准GB27622012《食品中污染物限量》[22]对液态调味品和固态调味品中3MCPD的限量标准（0.4和1.0 mg/kg），酱油、水解植物蛋白液、水解植物蛋白粉、料酒、鸡精样品超标率依次为4/20， 2/3， 1/3， 2/16， 0/15。由样品检测结果可见，某些食品中氯丙醇污染水平仍然较高，因此有必要对食品中氯丙醇污染进行监测，并采取相应的监督管理措施。
4 结 论
结合固相支持液液萃取净化样品前处理技术，建立了无需衍生化反应的Online GPCGCMS/MS同时测定食品中氯丙醇的方法。通过线性实验、空白加标回收实验等方法学实验验证了方法的准确性。与传统的GCMS衍生化方法相比，本方法简便、快速、经济，适于食品中氯丙醇的检测。实际样品检测结果表明，不同食品中仍存在氯丙醇污染超过我国相关限量标准的现象，因此有必要加强监测及相应的监督管理措施。
References
1 Baer I， Calle B I， Taylor P. Anal. Bioanal Chem.， 2010， 396： 443-456
2 Velíek J， Davidek J， Hajlová J， Kubelka V， Janíek G， Mánková B. Zeitschrift Fur LebensmittelUntersuchung UndForschung， 1978， 167（4）： 241-244
3 Collier P D，Cromie D D O， Davies A P. J. Am. Oil Chem. Soc.， 1991， 68： 785-790
4 Anna R S， Ewa C. J. Verbr. Lebensm.， 2015， 10： 117-122
5 Belitz H D， Grosch W， Schieberle P. Food Chemistry. Berlin Heidelberg： Springer， 2009： 938-970
6 Dolezal M， Chaloupska M， Divinova V， Svejkovska B， Velisek J. Eur. Food Res. Technol， 2005， 221： 221-225
7 Svejkovska B， Novotny O， Divinova V， Reblova Z， Dolezal M， Velisek J. Czech J. Food Sci.， 2004， 22（5）： 190-196
8 Chung H Y， Chung S W C， Chan B T P， Ho YY， Xiao Y. Food Addit. Contam. A， 2013， 30（9）： 1508-1512
9 Jones A R， Chantrill L A. Reprod. Fert. Develop.， 1989， 1： 357-367
10 Hamlet C G， Sadd P A， Gray D A. J. Agric. Food Chem.， 2004， 52（7）： 2067-2072
11 JECFA. JECFA Monograph on the Safety Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants.， 2001
12 LI YongJun， HUANG ZhiQiang， DAI Hua. Chin. J. Anal. Lab.， 2003， 22（4）： 47-49
李拥军， 黄志强， 戴 华. 分析试验室， 2003， 22（4）： 47-49
13 LUO RenCai， JIN QingZhong， ZHANG Zheng， ZHOU Shan， LI Jie. Food Sci.， 2000， 21（7）： 36-37
罗仁才， 金庆中， 张 正， 周 珊， 李 洁. 食品科学， 2000， 21（7）： 36-37
14 FU WuSheng， WU YongNing， ZHAO YunFeng， MA JinBo， ZHANG Qi. Chin. J. Food Hyg.， 2004， （4）： 289-294
傅武胜， 吴永宁， 赵云峰， 马金波， 张 琦. 中国食品卫生杂志， 2004， （4）： 289-294
15 GAO Jie. Chin.Brew.， 2013， 32（9）： 145-147
高 洁. 中国酿造， 2013， 32（9）： 145-147
16 HUANG Qi， JI XiaoJuan， WANG DanDan. J. Zhejiang. Univer. Sci. Techn.， 2013， 25（1）： 33-37
黄 琦， 季晓娟， 丹. 浙江科技学院学报， 2013， 25（1）： 33-37
17 XU XiaoMin， SHEN XiangHong， SONG GuoLiang. REN YiPing. Chin. J. Heal. Lab. Techn.， 2006， （6）： 661-662
徐小民， 沈向红， 宋国良， 任一平. 中国卫生检验杂志， 2006， （6）： 661-662.
18 YANG XueQin， LU LiXia， XIONG XiaoHui. Food Res. Develop.， 2008， 29（7）： 162-164
杨雪芹， 陆利霞， 熊晓辉. 食品研究与开发， 2008， 29（7）： 162-164
19 GB/T 5009.1912006， Ministry of Health of the People′s Republic of China. Determination of Chloropropanols in Foods， 2006
GB/T 5009.1912006， 中华人民共和国卫生部. 食品中氯丙醇含量的测定， 2006
20 LI Shan， MIAO Hong， CUI Xia， ZHAO YunFeng， WU YongNing. Chin. J. Prev. Med.， 2015， 49（6）： 102-107
李 珊， 苗 虹， 崔 霞， 赵云峰， 吴永宁. 中华预防医学， 2015， 49（6）： 102-107
21 CUI Xia， DING Hao， ZOU JianHong， LI Shan， MIAO Hong， FU WuSheng， ZHAO YunFeng， WU YongNing. Food Sci.， 2014， 35（12）： 98-102
崔 霞， 丁 灏， 邹建宏， 李 珊， 苗 虹， 傅武胜， 赵云峰， 吴永宁. 食品科学， 2014， 35（12）： 98-102
22 GB/T 2762-2012， Ministry of Health of the People′s Republic of China. The Limit of Contaminants in Foods， 2012
GB/T 2762-2012， 中华人民共和国卫生部. 食品中污染物限量， 2012
凝胶色谱范文第2篇
【关键词】 高效凝胶色谱法； 多花黄精多糖； 分子量及其分布
多花黄精多糖是从传统中药百合科植物多花黄精中发现并分离出一种低分子量活性多糖，为新药(中药)原二类,全国第一个治疗病毒性角膜炎的中药。多花黄精多糖抗单纯疱疹病毒i型的体外细胞培养试验结果结果表明,多花黄精多糖有明显的抗单纯疱疹病毒i型的作用。多糖为单糖的天然聚合物，多糖的性质和药理作用与其分子量大小，分子量分布及其结构密切相关。多糖的分子量不是均一的，具多分散性，需要用统计方法表征其平均分子量及其分子量分布。高效凝胶色谱法测定多糖的分子量及其分布，具有快速，重现性好等优点，在国内外得到了广泛的应用[1]。多花黄精多糖为水溶性多糖，针对其单糖组成和空间结构与葡聚糖相似，在色谱柱的选择上倾向于更适合于水溶性多糖分离测定用的shodex ohpak sb803hq系列（对葡聚糖的排阻极限为1×105）。有关多花黄精多糖的平均分子量及其分子量分布尚未见相关报道，本文应用凝胶渗透色谱（gpc）法测定多花黄精多糖的平均分子量及其分子量分布[2]，为考察生产工艺的稳定一致性及控制产品质量提供了科学依据，为多花黄精多糖分子大小和药理作用的相关性研究打下了一定基础。
1实验部分
1.1仪器与试药
agilent 1100型高效液相色谱仪（自动进样器），示差折光检测器。shodex ohpak sb803hq凝胶色谱柱。北京龙智达公司提供gpc专用软件。
供分子量测定用右旋糖酐分子量标准对照品（中国药品生物制品检定所提供，d0、d1、d2、d3、d5、d6、d8、d2000分子量依次为180、2500、4600、7100、21400、41100、133800、2000000）；其余试剂均为分析纯；高纯水用milliporeq超纯水系统制得。
试验用样品多花黄精多糖由四川泰华堂制药有限公司提供。
1.2方法与结果
1.2.1色谱条件色谱柱为shodex ohpak sb803hq，流动相为0.71%硫酸钠溶液（内含0.02%叠氮钠），柱温：35 ℃，示差折光检测器（检测器温度35 ℃），流速0.5 ml·min－1，取供试品溶液及对照品溶液各20μl注入液相色谱仪。
1.2.2溶液的制备取多花黄精多糖适量，加流动相制成每1 ml中约含10 mg的溶液，振摇，室温放置过夜，作为供试品溶液。另取d0，d2000及4～6个已知分子量的葡聚糖对照品，同法制成每1ml中各含10 mg的溶液作为对照品溶液。
1.2.2.5系统适应性试验取葡萄糖对照品溶液（d0），按1.2.1的色谱条件进样，纪录色谱图，按葡萄糖峰计算理论塔板数n=5.54×trw1/2=16083；另取d2000对照品溶液，1.2.1的色谱条件进样，纪录色谱图，计算分配系数，kd=trt0ttt0=0.52，kd在0～1之间，符合中国药典2005年版的要求。式中tr为供试品峰保留时间，t0为蓝色葡聚糖（d2000）峰保留时间，tt为葡萄糖（d0）峰保留时间。
1.2.3标准曲线的制备及样品测定
取上述右旋糖酐系列对照品溶液分别进样，记录洗脱峰的保留时间，由gpc专用软件绘制标准曲线，以标准分子量的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性回归，得回归方程。该方法的标准校正曲线线性良好，相关系数达0.9997。根据gpc专用软件绘制的标准曲线及供试品的保留时间采用gpc专用软件计算样品各组分的重均分子量及其分子量分布。 表1 右旋糖酐分子量标准对照品保留时间及其相应的对数值
1.2.4 精密度试验取供试品溶液20 μl，按“1.2.1”项下色谱条件，连续测定5次，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5018，5009，5009，5028，5017，rsd为0.16%，表明该系统测定样品分子量的精密度良好。
1.2.5重复性试验取批号为060701的样品，按“1.2.2”项下方法分别制备供试品溶液5份，按“1.2.1”项下色谱条件测定分子量及其分子量分布，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5020，5028，5044，5054，5053，rsd为0.30%。表明该分析方法测定样品分子量精密度良好。
1.2.6稳定性试验取同一供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件，在0h、2h、4h、8h、12h和24h分别进样，测定分子量及分子量分布，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5055，5090，5100，5126，5160、5046，rsd为0.84%。表明供试品溶液在24小时内稳定。
1.2.7样品的测定取不同批号的多花黄精多糖样品，按“1.2.2”项下的方法制备供试品溶液，然后按“1.2.1”项下的色谱条件测定分子量及分子量分布，结果见表2。表2 3 批样品重均分子量及其分布情况表
2讨论
根据以上测定结果可见，测定的三批多花黄精多糖的重均分子量分布在2500～7500之间，分布宽度小于2.0。用本方法测定多花黄精多糖的分子量与分子量分布，准确可行，简便快捷，精密度好。
分布宽度的引入，使多花黄精多糖的分子量分布更具可控性，能够通过检测该指标反映生产该样品的工艺的变化以及样品质量的变化，使得样品的质量更具有可控性。
凝胶色谱范文第3篇
【关键词】 宁心胶囊;薄层色谱法;丹参酮ⅡA;黄芪甲苷;苦参碱
Abstract：Objective To establish the qualitative identification methods of Ninxin Capsules. Methods TLC method was used to identify salvia miltiorrhiza， membranous milk vetch root， radix sophorae flavescentis， with chemical substance and medicinal materials as reference. Results The spots for TLC identification of sample， preparation of chemical reference (Tanshinone IIA， astragaloside， matrine) and medicinal materials (salvia miltiorrhiza， membranous milk vetch root， radix sophorae flavescentis) were in the same position with the same color. Conclusion The method is reproducible and feasible， and provides basis for the qualitative quality standard of Ninxin Capsules.
Key words：Ninxin Capsules;TLC;Tanshinone IIA;astragaloside;matrine
宁心胶囊为本院制剂，由丹参、黄芪、苦参等药物组成，具有宁心安神、益气养心、活血通脉功效和抗心律失常作用，对胸痛、心悸也有良好的治疗效果。本试验采用薄层色谱法，对宁心胶囊样品中的主要组成药物丹参、黄芪、苦参等进行定性鉴别，为本品的质量控制提供依据。现将试验结果报道如下。
1 仪器与试药
PBQ-1型自动铺板器(重庆南岸动力仪器厂)，恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)，紫外透射反射仪(北京六一仪器厂)，KQ-500超声波清洗器(上海超声波仪器厂)等。
宁心胶囊(本院制剂室自制，批号080613、081025、090301);对照药材丹参、黄芪、苦参(购自江苏南通鑫鑫医药药材有限公司，经本院陈峰生主任中药师鉴定);对照品丹参酮ⅡA(批号110766-200416)、黄芪甲苷(批号781-9002)、苦参碱(批号100078-200414)，供含量测定用，购自中国药品生物制品检定所。硅胶G(青岛海洋化工有限公司产品)。所用化学试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 丹参的鉴别
取丹参酮ⅡA对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。取本品内容物粉末2 g，加乙醚10 mL，置具塞试管中，超声提取30 min，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。取丹参药材1 g，按上述供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液。按处方量，取除丹参外的其余药味按工艺要求制成缺丹参的样品，按供试品溶液制备方法制备阴性供试品溶液。吸取上述溶液各5 ?L，分别点于以同一羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验[1]，以苯-乙酸乙酯(19∶1)为展开剂，展开，取出，晾干， 10%硫酸乙醇液喷雾显色，热风吹干(80 ℃)，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应位置上显相同的暗红色斑点，见图1。
2.2 黄芪的鉴别
取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取本品内容物粉末2 g，置索氏提取器中，加甲醇50 mL冷浸1 h，水浴回流2 h;提取液回收甲醇并浓缩至干，残楂加水10 mL微热使溶解;用水饱和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，用氨试液处理2次，弃除氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水3～5 mL使溶解，放冷;通过D101型大孔吸附树脂柱，先以水50 mL洗脱，弃除水液，再用40%乙醇30 mL洗脱，弃除40%乙醇液，继用70%乙醇50 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2 mL量瓶内，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取黄芪药材粉末1.5 g，依上述供试品溶液的制备方法制备对照药材溶液。按处方量，取除黄芪外的其余药味，按工艺要求制成缺黄芪的样品，按供试品溶液的制备方法，制备阴性供试品溶液。吸取上述溶液各5 ?L，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验[1]，以氯仿-甲醇-水(13∶6∶2)(10 ℃以下放置过夜)为展开剂，展开，取出，晾开。喷雾10%硫酸乙醇液显色，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应位置上显相同的暗蓝色斑点，见图2。
2.3 苦参的鉴别
取苦参碱对照品适量，加氯仿制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取本品内容物粉末1 g，置具塞锥形瓶中，加氯仿-氨水(25∶0.3)20 mL，超声提取20 min，滤过，水浴蒸干，加氯仿适量溶解，滤过，定容至10 mL，作为供试品溶液。取苦参药材粉末0.5 g，加氯仿25 mL，浓氨试液0.3 mL，放置过夜，滤过，滤夜蒸干，残渣加氯仿0.5 mL使溶解，作为对照药材溶液。按处方量，取除苦参外的其余药味，按工艺要求制成缺苦参的样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性供试品溶液。取上述4种溶液各5 ?L，分别点于同一以2%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验[1]，以苯-丙酮-甲醇(8∶3∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾开，喷以碘化铋钾试液，热风吹干。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应位置上显相同的鲜红色斑点，而阴性供试品色谱在此位置上无斑点，见图3。
注：1，2.对照品;3，4.对照药材;5，6.供试品;7，8.阴性供试品
图3 苦参薄层鉴别图谱
3 讨论
苦参是本制剂的主要成分之一，笔者参考文献[2]对苦参进行定性鉴别，同时对方中丹参、黄芪进行了定性鉴别。试验结果显示，制剂中丹参、黄芪、苦参药材的薄层定性鉴别斑点清晰明显，结果重复性好，可作为宁心胶囊制订定性质量标准依据。本品君、臣药指标性成分的含量测定方法与标准有待进一步研究制定。
参考文献
凝胶色谱范文第4篇
【关键词】节能环保；绿色混凝土；搅拌站
一、前言
预拌混凝土企业起源于对散装水泥的运用，本身是一种节能减排的措施，但随着人们对环境重视程度的不断提高，“绿色生产”、“可持续发展”、“低碳”和“节能减排”等与环境协调发展等相关理念不断在混凝土行业中出现，预拌混凝土生产过程中的环境污染问题越来越受到重视，从目前行业发展水平来看，存在的突出问题在于：
（1）预拌混凝土企业环保不达标，生产过程中的噪音、粉尘和废水超标，对周边环境和居民正常生活造成影响。（2）预拌混凝土企业绿化面积不达标，厂区污水横流、粉尘飞扬，生产和运输设备脏、乱、差，与周边环境形成反差，破坏了城市整体形象。（3）许多企业在生产过程中过度消耗不可再生资源，不能对工业废渣、再生骨料、尾矿等废弃资源进行综合利用。（4）预拌混凝土企业生产销售过程中出现的废弃混凝土未能得到及时有效利用，成为新的建筑垃圾，在增加资源消耗的同时加大了环境负担。在这种发展现状下，建设现代化绿色环保搅拌站已经成为加快建设资源节约型、环境友好型社会的必然要求。
南京普迪混凝土有限公司是1996年成立的南京市混凝土行业龙头企业，目前有4个搅拌站，由于地处市区，均面临着市政规划的拆迁。作为南京市混凝土协会的会长级单位，公司在拆迁建站方面积极配合地方政府，并响应国家和社会的绿色环保要求，严格按照最新绿色混凝土生产企业规范，去年在南京江北永宁成功新建了一座绿色环保、全封闭的花园式工厂，完全解决了上述行业内普遍存在的问题。
本文以南京普迪混凝土有限公司永宁站建设实例，从建站背景和总体思路、选址和市场及投资分析、平面规划和功能区分布、设备选型和三废处理、管理创新和经营效果分析等方面成功经验分析，以期为我国绿色混凝土搅拌站的建设和管理提高借鉴。
二、建站背景和总体思路
南京普迪混凝土有限公司自成立至今，已经成功运营了17年，曾经成功地抓住了南京市河西地区大开发的机遇，从当初的一个搅拌站，发展成为在南京江南、江北拥有4个搅拌站，6条生产线的大型混凝土企业，年生产销售量一直处于南京市前三甲。随着南京城市中心区的扩大和市政大型建设的要求，原处城市中心区的几个搅拌站都面临拆迁，同时，现代绿色搅拌站规范的出台，对早期搅拌站节能环保的要求和压力越来越大。公司在面临外部拆迁压力的同时，更考虑到企业的长远发展必然要符合国家节能环保的绿色要求，决定从战略的高度首先考虑在江北筹建高标准的绿色混凝土搅拌站。
通过市场和行业的充分调研，以及对国家相关政策的理解和把握，公司认为建设绿色节能环保站，既符合了国家对绿色建筑材料的要求，也能够从企业内部管理运营上实现经济效益。因此，公司的总体思路是：建设节能环保的绿色花园式工厂，以资源利用最大化、环境污染最小化、厂区建设最优化为基本目标，采用节能设备、先进技术与管理措施，将绿色理念贯穿搅拌站建设、运营的各个环节，实现混凝土生产全过程的绿色生产。
三、选址和市场及投资分析
（一）选址
根据公司建站的总体思路，公司成立新站筹备组，全权负责新站的筹备建设工作，首先，在江北选址。根据搅拌站拌和设备的自身特点，对场地的要求应从经济、便利、安全和环保等方面综合统筹考虑。
（1）场地应选择交通便捷，原材料供应经济方便。（2）场地选择应考虑混凝土的运输半径辐射范围和市场。（3）环保因素，场地应远离住宅和人口稠密区。（4）场地的土地符合国家建设要求，并能实现长远经营的需要。
基于以上四点，筹备组与江北永宁镇达成一致，先期租用永宁57亩地，一年后拿到土地指标，土地转让给普迪公司，实现长久经营。从土地的位置、面积和道路状况，非常适合做搅拌站。事实上，在选址过程中，公司已经贯彻了节能环保理念，我们曾经考察过的两块地就是因为位置和环境问题不符合节能环保理念而放弃。
（二）市场和投资分析
江北浦口是南京的新市区，与南京主城隔江相望，面积914平方公里，是长江进入江苏段的第一门户，也是南京“以江为轴，跨江发展”的中心区域。随着省市政府沿江大开发和“跨江发展”战略的实施，高速铁路、城市轻轨、过江隧道等交通设施的贯通，整个浦口的建设和发展将迎来新契机。未来8～10年，浦口区将投入700亿元用于江北新城的基础设施建设，规划建设面积约70平方公里，全面提升城市品质、完善城市功能。根据发展规划，江北新城将着力培育“五大产业”、打造“十大功能区”，逐步拉开城市框架和产业载体框架。至2017年，现代化江北新城将基本建成，成为呼应江南主城，辐射苏北皖豫的新城区。江北新城区的基础建设，商业地产、房地产的开发，产业园区、沿江码头的兴建，将为江北混凝土企业未来带来较多的发展机会。目前，江北地区每年混凝土需求量稳定在600万立方以上。随着江北开发步伐的加快，预测未来江北地区商品混凝土的需求量呈稳步上升趋势。
我们的选址永宁镇完全辐射上述市场，通过对市场、行业产能和投资经济效益的分析，公司决定在永宁兴建年产80万方（两个3方机、一个2方机）的大型绿色混凝土搅拌站。
四、平面规划和功能区分布（环保概念和理念）
（一）搅拌站的功能区描述
搅拌站主要分为：原材料进场、过磅、原材料取样与检测、试验配比、卸料与堆料、上料、皮带运输、拌料、装罐车、取任务单、过磅、出厂等环节，同时还要考虑罐车清洗、维修、停车、待料、办公、员工休息等。因此，各功能区要综合考虑，在平面规划设计上要科学规划，是各自有相对独立性，有相互关联，既保证生产有序，同时考虑能耗、噪音等环保因素。
（二）各功能区划分与布置
使各功能区布置紧凑，又不相互影响，同时在考虑各自功能的时有意识贯彻节能环保的设计原则。
（1）进厂道路和地磅区：原材料的进出和部分罐车进出厂都应过磅，则地磅应设置在厂区主出入口。（2）搅拌生产区、砂石材料库存区：采用封闭砂石料仓和料仓内喷淋，确保粉尘最小化；采用地仓式骨料上料，减少装载机上料能耗；车辆实现厂内内循环，减少粉尘和能耗；采用电子大屏和刷卡等待系统，减少待料车辆能耗损失等等。（3）办公和员工休息区：加大该区域绿化，通过绿化隔离带与厂区相对隔离，优化办公和休息环境。（4）污水砂石分离处理区：全厂设计回路水沟，实现污水循环使用；设计污水和砂石分离设备，实现污水和砂石的二次利用，实现全厂污水零排放。（5）车辆维修区：设计安排在全封闭料仓背面，减少噪音污染，提高场地利用空间。
五、设备选型和三废处理
国内生产围绕混凝土生产相关设备的厂家举不胜举，在大力推行环保型搅拌站建设的今天，各类设备生产厂家无一不称之为符合环保型搅拌站对设备的要求，事实不尽如此。环保型搅拌站的主要特征是：从外观上看，搅拌站的料场，斜皮带，主楼及筒仓全封装，内部结构则加强除尘，防震，减噪效果，配备砂石分离机与浆水回收系统，搅拌站生产物料“零排放”，从而实现混凝土的高效，环保生产。这就要求我们在设备造型上要高度重视对设备的整体要求和细节考虑。但需要提出的是，并不是全封装的搅拌站就是环保型搅拌站，也不是设备具备环保功能就是环保站。真正的环保站必须是全封装和设备本身优良的环保性能的结合体，同时还要做到造型美观。基于这样的理念和对设备的要求，我们在设备招投标时，都一一做了具体的要求。例如：设备低碳节能，生产效率高；废水废渣循环利用；易损件使用寿命长；设备无跑冒，滴漏等现象；搅拌主机安装支座上配备防震垫，减少主楼的震动；混凝土质量稳定，合格率高，整体全封闭外观与内部环保性能内外兼修。在一些主要的细节上，我们考虑到设备上能满足做到的重要的环保要求。
1.顺应节能减排的要求，对各部分大功率电机采用变频调速控制，主要是大规格螺旋输送机，电机和斜皮带机电机，既可提高计量精度，又做到了节能降耗。
2.主楼，筒仓，斜皮带及砂石料场全方位完整封闭，实现粉尘，噪音的完全隔离。砂石料场添加喷淋装置再减粉尘。
3.粉仓采用组合式高效防尘方式，脉冲强制式反吹收尘，并实现二次收尘。装有可测试料位计，杜绝暴仓，杜绝扬尘。
4.主楼部分的除尘，由被动除尘转向主动除尘，由单一除尘转向综合除尘。从根本上消除主楼处扬尘。
5.采用地仓式配料机。称量斗位于地面以下，有效地隔阻了砂石下落时的噪声，配料机及砂石堆场位于封闭大棚内，大大降低了装载机作业时噪声对外界的影响。
6.雨水排放与浆水处理完全独立。雨水自然排放。砂石分离后归仓再用。浆水入八角池搅拌后重新输入搅拌机台用于低标号混凝土。废水过滤压缩成块再利用，多种办法解决废水利用问题，既可防止外加剂泄露造成的污染，又能保证混凝土的质量。
7.外加剂称设防漏装置，既可防止外加剂泄露造成的污染，又能保证混凝土的质量。
8.办公区统一进行景观设计，种植枝叶繁茂的树木，以达到吸声隔音的效果。
9.建筑材料尽可能使用绿色建材，使用天然资源的能源，无毒，无污染，无放射性材料。
10.利用厂房大面积屋顶的优势，做中水循环利用，对雨水收集后做日常洗车，节约水资源。
11.辅助用房的宿舍部分和职工食堂淋浴用热水采用太
阳能加热辅助以电加热的模式，节约能源。
六、管理创新和经营效果分析
环保型搅拌站与老搅拌站已经发生了翻天覆地的根本性的变化。但使用搅拌站的人还是那拨人，众多职工的理念有没有更新，尤其是国有企业的职工，惰性严重，接受新事物的欲望较弱。这一现实的难题摆在公司的面前。如何在广大的职工队伍中全面推行环保的意识和理念，这是在使用环保型搅拌站之前所必须解决的问题。
1.培训：什么是环保型搅拌站？为什么要建环保型搅拌站？环保型搅拌站会给我们带来什么益处？仁者见仁，智者见智。请专家授课，每一位职工必须全部完成专家的授课时间，并进行理论考试。
2.观摩：组织全体员工对公司新建的环保型搅拌站进行现场观摩。主要解决的问题是让员工队伍了解新老搅拌站的客观上的区别，和我们在实际操作过程中应该知道的注意事项。并组织员工对环保型搅拌站进行整体的操作演练，在演练过程中发现问题纠正错误。良好的习惯必须从头抓起。
3.制度：把老搅拌站运作过程中的各项管理制度拿出来重新梳理，有悖于环保型搅拌站运行的规章制度加以改变。使之成为符合环保型搅拌运作的规章制度应运而生。中国有句老话，没有规矩不成方圆。靠制度约束人的行为必将行之久矣。
南京普迪混凝土有限公司，在理念更新，与时俱进的宗旨下，成功的给永宁环保站进行了具有时代气息的定位。在设备选型的硬件配套商，完美地与环保型搅拌站进行了一次姻缘组合。在管理创新上，破除桎梏，把人的因素放在首位，较好地实现了企业效益，社会效益，环境和谐的共赢局面。进一步提升了普迪品牌的社会声誉。环保型搅拌站的成功运作，必将给普迪公司带来长远的，可持续性的发展。
七、结论
从目前使用状况来看， 南京普迪混凝土有限公司永宁站已经充分体现了节能效果，实现了混凝土生产无废料、无噪音、无废水，零排放，在管理上运用GPS和局域网的等企业管理手段，大大地提高了运营效率，既实现了企业效益的大提升，更为加快建设资源节约型、环境友好型社会作出了贡献。
参 考 文 献
[1]陈向锋.混凝土搅拌站管理实用手册.北京中国建材工业出版社，2011
凝胶色谱范文第5篇
【摘要】 目的从舟山眼镜蛇蛇毒中分离L氨基酸氧化酶(LAO)，测定其理化和酶学性质。方法应用Sephadex G100凝胶色谱和POROS CM20离子交换色谱分离纯化LAO;Wellner和Lichtenberg法测定LAO活力;SDSPAGE法测定相对分子质量。结果舟山眼镜蛇蛇毒经Sephadex G100凝胶色谱和两次POROS 20 离子交换色谱后，获得LAO纯品(暂定名NALAO)。NALAO在非还原和还原条件下相对分子质量均为58 kD左右;其反应最适pH为8.0，最适温度为60 ℃，对L苯丙氨酸的米氏常数(Km)为3.08 mmoL/L。结论应用凝胶过滤色谱和离子交换色谱可从舟山眼镜蛇毒中分离纯化LAO。
【关键词】 眼镜蛇毒液类; 氨基酸氧化还原酶
蛇毒成分复杂，主要为酶和毒素，L氨基酸氧化酶(EC.1.4.3.2)在蛇毒中分布非常广泛，在蝰科、响尾蛇科、眼镜蛇科以及蝮蛇科中都有分布[14]。L氨基酸氧化酶(Lamino acid oxidase，LAO)是蛇毒中一种重要的活性组分，能够催化L氨基酸的氧化脱氨反应，生成相应的α酮酸、氨以及过氧化氢[5]，具有多种生物活性，如诱导血管内皮细胞凋亡、抑制或诱导血小板聚集、细胞毒性和抗菌活性等[610]。已从几种蛇毒中分离得到LAO，笔者应用凝胶色谱和离子交换色谱从舟山眼镜蛇蛇毒分离LAO，并对其部分理化和酶学性质进行初步研究。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1蛇毒舟山眼镜蛇(Naja atra)蛇毒冻干粉，福建医科大学蛇毒研究所提供。
1.1.2试剂与仪器L苯丙氨酸(批号040924，上海翔军生物科技有限公司);砷酸钠（Lot#:0892B82，美国Amresco公司）;过氧化氢酶（AA1041，美国Sigma公司）。SephadexG100凝胶柱(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司);CM20阳离子交换填料预装柱(POROS 20，美国Applied Biosystems公司);BioCAD纯化工作站(美国Applied Biosystems公司);自动部分收集器(BSZ100)和恒流泵(HL1，上海沪西分析仪器厂);恒温摇床(美国Forma公司);紫外分光光度计(美国Biorad公司);试剂均为进口或国产分析纯。
1.2方法
1.2.1眼镜蛇蛇毒的凝胶色谱Sephadex G100凝胶柱(2.6 cm×100 cm)用HAcNaAc缓冲液(pH 5.8，0.05 mol/L+NaCl 0.05 mol/L)预先平衡过夜。称取眼镜蛇粗毒0.5 g溶于10 mL双蒸水，4 ℃静置过夜，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min。取上清液凝胶柱，用HAcNaAc缓冲液洗脱，流速16 mL/h。收集洗脱液，4 mL/管，根据D(280 nm)值绘出洗脱曲线。
1.2.2凝胶色谱组分LAO活力按文献[5]介绍的流程和反应体系进行分离组分酶活力测定。凝胶色谱洗脱组分0.1 mL与L苯丙氨酸反应，以终产物的光密度值[D(300 nm)]为指标，以反应体系中加HAcNaAc缓冲液0.1 mL取代蛇毒组分为未加酶对照。一个活力单位定义为在上述条件下得到0.03D300 nm所需的酶量。
1.2.3LAO纯化合并经凝胶色谱收集的具有LAO活性的组分。以POROS 20进行纯化。线性梯度洗脱(A液:0.05 mol/L，pH 5.8的HAcNaAc缓冲液;B液:含有0.5 mol/L NaCl的平衡液)，收集洗脱蛋白峰，浓缩和脱盐。测定POROS 20离子交换层析各组分的LAO活性，收集具有活性的组分，用POROS 20离子交换层析，以0.02 mol/L，pH 6.2的HAcNaAc缓冲液平衡，线性梯度洗脱(A液:0.02 mol/L，pH 6.2的HAcNaAc缓冲液;B液:含有0.5 mol/L NaCl的平衡液)，进一步纯化，收集活力峰，浓缩、透析脱盐。
1.2.4LAO纯度鉴定及相对分子质量按碱性不连续系统进行。样品按是否含有2%β巯基乙醇分为还原性和非还原性两种。在Hoefer电泳仪上电泳2 h，稳流12 mA/10 cm×10 cm。常规染色脱色。在Image Master VDS凝胶成像系统上依据标准蛋白绘制标定曲线，计算相对分子质量。
1.2.5蛋白质浓度采用文献[11]方法，将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260 nm和280 nm处分别测出D值，然后利用280 nm和260 nm波长下的吸收差求出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度(mg/mL)=1.45D(280 nm)-0.74D(260 nm)
1.2.6LAO对温度和pH适应性最适pH测定:在pH 6.0~10.0缓冲液中，其他条件不变，测定酶活力。最适温度测定:酶液在0.4 moL/L，pH 7.8的TrisHCl缓冲液中，测定20，30，40，50，60和70 ℃下的酶活力。以酶活力最高者为100%，其余折算为最高活力的百分数，并以pH或温度为横坐标，最高活力百分数为纵坐标，绘制酶活力适应曲线。
1.2.7LAO米氏常数(Km)酶液与不同浓度L苯丙氨酸反应，利用反应终止法测定酶反应初速度(V)，根据LineweaverBurk作图法求出该酶对L苯丙氨酸的Km值[12]。
2结果
2.1眼镜蛇蛇毒凝胶色谱眼镜蛇毒粗毒经Sephadex G100凝胶层析后获得5个蛋白峰，分别标记为Ⅰ~Ⅴ。其中第Ⅱ峰具有LAO活力。从粗毒500 mg中可获得Ⅱ组分38.6 mg，蛋白回收率约7.8%(图1，表1)。
样品:眼镜蛇蛇毒(500 mg);凝胶柱:Sephadex G100 2.6 cm×100 cm;洗脱液:HAcNaAc缓冲液(0.05 mol/L，pH 5.8，含0.05 mol/L NaCl);流速:16 mL/h，4管/h;阴影部分为L氨基酸氧化酶活性组分.
图1眼镜蛇蛇毒的Sephadex G100凝胶色谱
Fig 1Gel filtration of Naja atra venom on Sephadex G100
2.2LAO纯化凝胶色谱第Ⅱ峰经CM20预装柱POROS 20 进行分离，分离后可得到7个洗脱峰，其中第4峰具有LAO活力(图2)。合并收集该组分，再次用POROS 20 纯化，得到A、B两个蛋白峰，经活性测定，其中第B峰具有LAO活性。该组分经SDSPAGE鉴定为电泳纯暂定名为NALAO。从粗毒到获得NALAO各层析步骤的目的组分得率及酶活性变化(表1)，NALAO在眼镜蛇毒粗毒中的含量约为0.3％。 表1L氨基酸氧化酶的酶活力变化及得率样品:第Ⅱ组分;上样体积:5 mL;色谱柱:CM20 (POROS 201.6 mm×100 mm);缓冲液体系:A液:HAcNaAc(pH 5.6，0.05 mol/L);B液:A液+0.5 moL/L NaCl;梯度:30%~100%，25CV;流速1 mL/min;出现“—”组分具有L氨基酸氧化酶活性.
转贴于
图2POROS 20 离子交换色谱图
Fig 2Ionexchange chromatography of LAO on CM20 (POROS 20)
2.3NALAO纯度鉴定及相对分子质量NALAO经12.5%SDSPAGE电泳为一条清晰的蛋白带(图3)，NALAO不论是还原还是非还原SDSPAGE电泳均为一条带，说明NALAO为单链蛋白，相对分子质量约58 kD。
2.4NALAO对温度和pH的适应性在LAO酶活力测定的体系中，改变反应温度，其余条件不变，NALAO在20~70 ℃区间，60 ℃时活力最高。以60 ℃时LAO活力为100%，绘制NALAO在不同温度下的酶活力(图4)。
在pH 6.0~10.0的缓冲体系，NALAO活性在pH 8.0时为最高，在pH 9.0~10活性较pH 8.0为低，但仍保持较高活性。以pH 8.0时酶活力为100%，绘制NALAO在不同pH下的酶活力(图5)。
2.5LAO米氏常数(Km)以苯丙氨酸为底物，在pH 7.8，37 ℃下，根据LineweaverBurk双倒数作图法作图，得出的方程为:[1/V]=0.0276+0.0851*[1/S]，计算眼镜蛇LAO对L苯丙氨酸的Km值为3.08 mmoL/L(图6)。
3讨论
3.1眼镜蛇毒LAO的分离纯化蛇毒是多种酶或非酶蛋白质或多肽的混合物，含有多种相对分子质量大小不等、等电点各异的蛋白质或多肽分子。分离蛇毒中活性成分有凝胶过滤层析法、离子交换层析法、疏水层析法和反相层析法等。笔者根据眼镜蛇毒中各种组分相对分子质量的差异应用Sephadex G100凝胶过滤法进行分离，具有LAO活性的组分为相对分子质量相对较大的成分，约占粗毒7.8％，这一过程去除了大量相对分子质量低的组分(约90%)，为进一步用离子交换层析降低了层析柱负荷。由于凝胶色谱分级所得到的活性组分间还含有不少其他非LAO的蛋白质，因此，根据蛋白质的荷电性质差异，应用ROROS 20弱阳离子交换色谱进一步分离，发现70％为非LAO蛋白质。根据相关文献和前期预实验的结果，笔者采用在不同pH条件下的ROROS 弱阳离子交换色谱，将相对分子质量和等电点接近的蛋白质进一步分离，结果发现经第一次ROROS 色谱所得具有LAO活性的蛋白峰再次经ROROS 色谱柱(洗脱液pH由5.6改为6.2，洗脱梯度由30%~100％改为0~50％)获得两个色谱峰，含有LAO的为第B峰。
3.2蛇毒LAO的理化性质及活性根据以往的研究报道，从不同蛇毒中分离纯化出来的LAO有不同的结构，以同二聚体或异二聚体形式存在的相对分子质量分布在100~142 kD，以单体蛋白质形式存在的相对分子质量55~60 kD[3]。本文分离得到的眼镜蛇毒LAO即NALAO在还原与非还原条件下，SDSPAGE电泳均显示一条带，说明它为单链蛋白质，相对分子质量为58 kD，与文献报道的江浙蝮蛇毒LAO相似。Tan等报道的同属眼镜蛇科的孟加拉眼镜蛇(Naja kaouthia)毒LAO及Ahn等报道的眼镜王蛇毒LAO均为同二聚体蛋白，相对分子质量分别为112和135 kD[1，4]，说明不同蛇毒的LAO的理化性质差异很大，但是LAO单体或二聚体存在与蛇种关系不大。
【参考文献】
[1]Ahn M Y，Lee B M，Kim Y S. Characterization and cytotoxicity of Lamino acid oxidase from the venom of king cobra(Ophiophagus hannah)[J]. Int J Biochem Cell Biol， 1997，29(6):911919.
[2]Ali S A，Stoeva S，Abbasi A，et al. Isolation，structural，and functional characterization of an apoptosisinducing Lamino acid oxidase from leafnosed viper(Eristocophis macmahoni ) snake venom[J]. Arch Biochem Biophys， 2000，384(3):476478.
[3]刘杰武，柴敏强，杜晓燕，等. 江浙蝮蛇毒L氨基酸氧化酶的分离纯化及性质鉴定[J]. 生物化学与生物物理学报， 2002，34(3):305310.
[4]Tan N H，Swaminathan S. Purification and properties of the Lamino acid oxidase from monocellate cobra (Naja naja kaouthia) venom[J]. Int J Biochem， 1992，24(6):967973.
[5]Wellner D，Lichtenberg L A. Assay of amino acid oxidase. Methods in enzymology[M]. New York:Academic Press， 1971:17，593596.
[6]赵启韬，解琨，张捷，等. 出血性蛇毒诱导血管内皮细胞凋亡的成分及作用机制研究进展[J]. 中国实验血液学杂志， 2004，12(5):708712.
[7]Zhang Y J，Wang J H，Lee W H，et al. Molecular characterization of trimeresurus stejnegeri venom Lamino acid oxidase with potential antiHIV activity[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2003，309(3):598604.
[8]魏继福，魏勤，吕秋敏，等. 烙铁头蛇毒L氨基酸氧化酶的分离、纯化及其生物学活性[J]. 生物化学与生物物理学报， 2003，35(3):219224.
[9]Sakurai Y，Shima M，Matsumoto T，et al. Anticoagulant activity of MLAO，Lamino acid oxidase purified from Agkistrodon halys blomhoffⅡ，through selective inhibition of factor Ⅸ[J]. Biochim Biophys Acta， 2003，1649(1):5157.
[10]Suhr S M，Kim D S. Identification of the snake venom substance that induces apoptosis[J]. Biochem Biophys Res Commun， 1996，224(1):134139.
[11]张均田. 现代药理学实验方法[M]. 北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社， 1998:6164.
