t淋巴细胞

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t淋巴细胞范文第1篇

【关键词】AIDS;相关性;总淋巴细胞;分析

【中图分类号】R46.62 【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)08-0011-03

AIDS是由HIV引起的一组综合征，HIV主要侵犯人CD4+ T淋巴细胞，导致其数量上的减少和功能缺陷，使机体免疫平衡被打破造成免疫功能低下，最终导致各种机会感染和肿瘤。因而，对HIV感染者和AIDS病人定期进行CD4+、CD8+T淋巴细胞 检测具有十分重要的意义。外周血CD4+T淋巴细胞数是监测HIV+／AIDS患者病情进展、确定抗病毒治疗时机和疗效评价的重要指标。流式细胞术是检测CD4+T细胞数的标准方法，该方法所需仪器设备和试剂价格昂贵，对操作人员要求也较高，在医疗资源匮乏的地区和单位难以推广应用。因此，寻找一种可靠、经济、简便的常规检测指标来替代CD4+T细胞计数，对于HIV+／AIDS的防控有着重大实用价值。

1 材料与方法

1.1 材料来源:保山市疾病预防控制中心艾滋病、性病防治科病治疗数据库基本信息。

1.2 方法:

从上述资料作统计描述、相关性、试验的评价、ROC曲线等方面作统计分析研究。

1.3 统计学处理:

统计学处理采用SPSS17.0分析软件。

2 结果

2.1 对895例A1DS CD4+T淋巴细胞和总淋巴细胞的统计描述，CD4+T淋巴细胞均值134.18±102.48个/ul，直方图见图1，总淋巴细胞均值1818.96±3237.57个/ul，直方图见图2。

2.2 相关性分析

总样本数（895）CD4+T淋巴细胞数与TLC的相关系数（r=0.487，P＜0.01）（Spearman相关）；TLC数值在区间（0，1200］时，相关系数为（r=0.421,P＜0.01）；TLC数值在区间（1200，1500］时，不存在相性（P＞0.05）；TLC数值在区间（1500，1800］时，不存在相性（P＞0.05）；TLC数值在区间（1800，7300］时，存在正相关，相关系数为（r=0.092,P＜0.05）。

2.3 筛检试验的评价

2.3.1 用TLC数值小于等于1200个/ul预测CD4+T淋巴细胞小于等于100个/ul，灵敏度为62.72%，特异度为82.53%，约登指数（正确指数）为0.45，符合率为73.74%，阳性预测值为74.11%，阴性预测值为73.52%。阳性可能性比值为3.59，阴性可能性比值为2.21。详见表1。

2.3.2 用TLC数值小于等于1500个/ul预测CD4+T淋巴细胞小于等于200个/ul，灵敏度为64.15%，特异度为67.77%，约登指数为0.32，符合率为65.25%，阳性预测值为81.93%，阴性预测值为45.34%。阳性可能性比值为2.0，阴性可能性比值为1.9。详见表2。

2.3.3 用TLC数值小于等于1800个/ul预测CD4+T淋巴细胞小于等于300个/ul，灵敏度为69.39%，特异度为51.02%，约登指数为0.21，符合率为68.38%，阳性预测值为96.07%，阴性预测值为8.80%。阳性可能性比值为1.42，阴性可能性比值为1.67。详见表3。

2.4 ROC曲线:

TCL数值在区间（0，1200］，状态变量值为15时，ROC曲线下面积最大，面积为0.671，95%置信区间为（0.476，0.865］；ROC曲线见图3。TCL数值在区间（1200，1500］，状态变量值为70时，ROC曲线下面积最大，面积为0.720，95%置信区间为（0.411，0.998］；ROC曲线见图4。TCL数值在区间（1500，1800］，状态变量值为100时，ROC曲线下面积最大，面积为0.874，95%置信区间为（0，1.0］。ROC曲线见图5。

3 讨论

T淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一群细胞。在正常机体内各淋巴细胞亚群相互作用，维持着机体正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，可导致机体免疫功能紊乱并发生一系列病理变化。因此，T淋巴细胞亚群的免疫分型能够提供有关患者免疫状态的重要信息。通过对895例原始数据采用Spearman等级相关分析，得出总淋巴细胞与CD4之间在数值上呈正相关性（r=0.487，P＜0.01）。与有关文献报道相一致，张福杰等的研究也证实HIV+/AIDS患者的CD4+ T细胞计数与总淋巴细胞计数之间存在相关性(r=0．528，P

总淋巴细胞与CD4+T淋巴细胞之间有直线相关,在条件艰苦，医疗资源匮乏的艾滋病高流行区,可以用TLC预测CD+T淋巴细胞水平, 从评价结果看， TLC≤1200个／μl预测CD4≤100个／μl、TLC≤1500个／μl预测CD4≤200个／μl、TLC≤1800个／μl预测CD4≤300个／μl均有较高的灵敏度和特异度。

参考文献

［1］ 张福杰, 郜桂菊, 赵红心.HIV／AIDS患者中CD4细胞计数与总淋巴细胞计数间相关性研究［J］中国艾滋病性病, 2004,10(4):241-243.

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［3］ 朱荣华，李凤德.2004-2007年HIV/AIDS病例分析［J］皮肤病与性病，2008.（2）：49

t淋巴细胞范文第2篇

【关键词】重症肌无力;Fas抗原;T淋巴细胞亚群;胸腺切除

The influences of thymectomy on the fas expression and T Cell subsets in peripheral blood lymphocyte from patients with myasthenia gravis

MAI Wei-hua,KOU Li,ZHOU Wen-ying,et al. Department of Neurology,Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,ZhuHai 519000,China

【Abstract】 Objective To investigate the influences of thymectomy on the Fas expression and T cell subsets in peripheral blood lymphocyte(PBL) from patients with myasthenia gravis(MG),so as to make sure whether Fas-mediated apoptosis is involved in the mechanism of thymectomy in MG therapy.Methods We analyzed CD4、CD8 and Fas expressions in PBL from 17 patients with MG and 13 healthy controls using flow cytometric analysis.Results The percentage of CD4-CD8+cells in PBL of MG patients without thymectomy was significant higher,while the percentage of CD4-CD8-cells was significant lower,compared with controls(P

【Key words】Myasthenia gravis;Fas antigen;T cell subsets;Thymectomy

DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.06.16

作者单位:519000中山大学附属第五医院神经内科

重症肌无力(myasthenia gravis.MG)是一种神经-肌肉接头传递功能障碍的获得性自身免疫性疾病,主要累及突触后膜上的乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AchR),由抗乙酰胆碱受体抗体(AchRAb)介导。然而,MG确切的发病机制迄今尚未清楚。胸腺与MG的发病密切相关。10%~15%的MG患者伴有胸腺瘤,50%~60%伴有胸腺增生[1]。胸腺切除术治疗MG可获得良好疗效[2]。Fas/CD95是一细胞表面分子,属于肿瘤坏死因子家族成员。Fas通过与其配体FasL结合诱导细胞凋亡。Fas/FasL对于调节自身抗原反应性T淋巴细胞的克隆清除,维持机体内免疫功能状态的稳定,防止自身免疫性疾病的发生具有重要意义。关于Fas/FasL与MG的关系目前国内外报道尚少。本实验通过流式细胞技术检测MG患者外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)表面CD4、CD8及Fas的表达,研究胸腺切除术对MG患者PBL中Fas表达及T淋巴细胞亚群的影响,探讨胸腺切除术治疗MG与Fas/FasL介导的细胞凋亡的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 MG患者组17例,为2007年10月至2009年12月我院神经内科住院及门诊患者,根据典型临床表现、新斯的明试验及部分患者神经重复电刺激检查确诊。其中男6例,女11 例,年龄22~76岁,平均(46.47±14.35)岁,病程8个月~20年,平均(6.43±5.15)年。Osserman分型:I型4例(23.5%),IIA型4例(23.5%),IIB型6例(35.3%),IV型3例(17.6%)。其中11例患者行胸腺切除术治疗,术后病理:胸腺增生7例(63.6%),胸腺瘤2例(18.2%),胸腺脂肪瘤1例(9.1%),胸腺多房囊肿1例(9.1%)。所有患者均不伴有感染性疾病及其他免疫性疾病,采血前3个月内未接受过免疫抑制剂治疗。正常对照组13例,为健康自愿献血者,男4例,女9例,平均年龄(40.23±11.05)岁。本研究得到中山大学附属第五医院伦理委员会批准,取得了受试对象的知情同意。

1.2 主要试剂 藻红蛋白标记小鼠抗人Fas/CD95单克隆抗体(Fas/CD95-PE)、多甲藻黄素叶绿素蛋白标记小鼠抗人CD4单克隆抗体(CD4-PerCP)、异硫氰酸荧光素标记小鼠抗人CD8单克隆抗体(CD8-FITC)、同种型荧光染色免疫球蛋白(小鼠抗人IgG1-PE、IgG1-PerCP、IgG1-FITC),均为美国Becton Dickinson公司产品,购自广州流式生物科技有限公司。

1.3 流式细胞术(Flow cytometry analysis) 取MG患者及对照组新鲜肝素钠抗凝血100 ul,加入3种小鼠抗人荧光素标记的单克隆抗体Fas/CD95-PE、CD4-PerCP、CD8-FITC各20 ul,混匀后室温避光孵育15~20 min。加入100 ul溶血素(BD Bioscience,USA)混匀,室温避光静置10 min,离心10 min(1000 r//min)后去上清。PBS洗涤2次后,加入1%多聚甲醛适量固定细胞,避光放置10 min,以同种型荧光染色免疫球蛋白(小鼠抗人IgG1-PE,IgG1-PerCP,IgG1-FITC)作为阴性对照,用FACScan型流式细胞仪(Becton Dickinson,USA)进行检测,使用Cell Quest软件分析PBL表面CD4、CD8及Fas抗原的表达。

1.4 统计学方法 使用SPSS 16.0软件。正态性检验采用one sample Kolmogorov-Smirnov test,正态分布计量资料用均数±标准差(x±s)描述,组间差异比较采用one-way ANOVA方差分析,多组均数比较采用SNK及LSD法,双侧检验水准α=0.05。P

2 结果

2.1 MG患者与对照组PBL表面CD4、CD8分子的表达 与对照组相比,无行胸腺切除术组MG患者PBL中CD4-CD8+细胞比例升高,CD4-CD8-细胞比例下降,差异有统计学意义(P=0.028及0.047);行胸腺切除术组CD4-CD8+细胞比例较无行胸腺切除术组下降,差异有统计学意义(P=0.019)。结果见表1。

表1

MG患者与对照组外周血淋巴细胞表面CD4、CD8分子的表达(x±s,%)

组别例数CD4+CD8-CD4-CD8+CD4+CD8+CD4-CD8-CD4+/CD8+

无行胸腺切除术MG患者630.372±6.49036.733±11.5840.392±0.19232.422±12.0930.928±0.421

行胸腺切除术MG患者1136.070±7.85325.248±7.6200.576±0.51238.108±7.1061.651±0.962

对照组1330.285±6.63526.311±8.9990.448±0.33342.957±11.5451.292±0.510

三组比较P值0.1200.044*0.5990.1250.137

F值2.3003.5090.5232.2462.143

两两比较P值 P10.1250.019*0.3630.2840.052

P20.9800.028*0.7740.047*0.302

P30.0560.7770.4330.2580.222

注:P1为无行胸腺切除术MG组与行胸腺切除术MG组比较P值;P2为无行胸腺切除术MG组与对照组比较P值;P3为行胸腺切除术MG组与对照组比较P值。*P

2.2 MG患者与对照组PBL表面Fas抗原的表达 无行胸腺切除术组MG患者PBL中Fas+、CD8+Fas+细胞比例以及行胸腺切除术组Fas+细胞比例均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结果见表2。

表2

MG患者与对照组外周血淋巴细胞表面Fas抗原的表达(x±s,%)

组别例数Fas+CD4+Fas+CD8+Fas+

无行胸腺切除术MG患者644.792±6.14566.163±12.45861.140±11.818

行胸腺切除术MG患者1139.962±8.12263.424±9.98751.776±9.840

对照组1331.219±12.99955.179±10.84945.590±11.497

三组比较P值0.026*0.0800.026*

F值4.1992.7724.167

两两比较P值 P10.3650.6230.104

P20.013*0.0500.008*

P30.048*0.0750.180

注:P1为无行胸腺切除术MG组与行胸腺切除术MG组比较P值;P2为无行胸腺切除术MG组与对照组比较P值;P3为行胸腺切除术MG组与对照组比较P值。*P

3 讨论

Fas/FasL是介导细胞凋亡的主要途径之一。许多自身免疫性疾病存在自身反应性淋巴细胞清除障碍,尤其是外周,与Fas介导的细胞凋亡缺陷有关[3]。MG属于器官特异性自身免疫性疾病,胸腺与MG的发病密切相关。胸腺可能是MG患者自身免疫反应的始动及维持部位。胸腺切除术后,MG患者体内抗AchR抗体滴度下降[4]。然而,胸腺切除术治疗MG与Fas/FasL介导的细胞凋亡的关系迄今尚未明确。

Masunaga等[5]报道Fas抗原及Fas mRNA在MG患者胸腺细胞中表达均下降。Utsugisawa等[6]则发现Fas mRNA在MG患者胸腺细胞中的表达不下降,反而升高。Moulian等[7]报道抗AChR抗体阳性的MG患者Fas高表达的胸腺细胞比例升高。MG患者胸腺瘤中Fas的表达显著高于正常胸腺组织[8]。另有报道MG患者CD4+CD8+胸腺细胞Fas表达降低,CD4-CD8+胸腺细胞Fas表达升高[9]。上述研究提示MG患者胸腺细胞存在Fas表达异常。本实验通过研究胸腺切除术对MG患者PBL中Fas表达及T淋巴细胞亚群的影响,探讨胸腺切除术治疗MG与Fas/FasL介导的细胞凋亡的关系。

关于MG患者外周血T淋巴细胞亚群的研究目前结果不一,有报道MG患者外周血单个核细胞CD4+CD8-细胞比例下降[10];另有报道外周血CD8+T淋巴细胞百分率下降,CD4+/CD8+比值升高[11]。本实验结果示,无行胸腺切除术组MG患者PBL中CD4-CD8+细胞比例升高,CD4-CD8-细胞比例下降。与无行胸腺切除术组对比,行胸腺切除术组CD4-CD8+细胞比例下降,差异有统计学意义;CD4+CD8+细胞比例及CD4+/CD8+比值升高,但差异无统计学意义。本实验结果表明MG患者存在外周血T淋巴细胞亚群分布异常,胸腺切除术对外周血T淋巴细胞亚群分布具有影响。

国内有学者发现MG患者外周血单个核细胞中Fas+、CD4+Fas+细胞比例低于对照组,提示MG患者外周血淋巴细胞可能存在活化诱导的细胞凋亡障碍,活化的淋巴细胞不能通过Fas途径凋亡,从而引起过强的免疫应答,导致自身免疫性疾病的发生[10]。Moulian等[7]报道MG患者胸腺细胞Fas的高表达在外周未被中和,外周血淋巴细胞Fas的表达仍升高。本实验结果示,无行胸腺切除术组MG患者PBL中Fas+及CD8+Fas+细胞比例高于对照组,行胸腺切除术组MG患者PBL中Fas+细胞比例高于对照组,与Moulian的报道一致。已有研究表明系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血淋巴细胞Fas的表达升高,并认为其反映了体内T淋巴细胞的活化[12,13],因为SLE患者外周血T淋巴细胞活化标记物CD25[14]、MHC-II分子[15]的表达增加,且幼稚T淋巴细胞在体外经促有丝分裂刺激后可诱导Fas产生[15]。此外,有报道FasL参与不依赖Ca2+的T细胞介导的细胞毒性作用[17],SLE患者CD8+T淋巴细胞Fas表达的增高还可能与FasL的表达相关,从而促进Fas+CD8+T淋巴细胞介导的组织损伤[12]。本实验结果示MG患者PBL中Fas+及CD8+Fas+细胞比例高于对照组,推测可能反映了MG患者体内T淋巴细胞的活化及Fas+CD8+T淋巴细胞介导的细胞毒性作用增强,与MG的发病机制有关。本实验结果还显示,行胸腺切除术组MG患者外周血Fas+、CD4+Fas+及CD8+Fas+细胞比例均低于无行胸腺切除术组,虽然差异无统计学意义,仍提示胸腺切除可能通过降低PBL中Fas的表达,减少体内T淋巴细胞的活化及Fas+CD8+T淋巴细胞介导的细胞毒性作用,达到治疗MG的目的。加大样本量深入研究有助于进一步明确胸腺切除术治疗MG与Fas/FasL介导的细胞凋亡的关系。

参考文献

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[5] Masunaga A,Arai T,Yoshitake T,et al.Reduced expression of apoptosis-related antigens in thymuses from patients with myasthenia gravis.Immunol Lett,1994,39(2):169-172.

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[7] Moulian N,Bidault J,Truffault F,et al.Thymocyte Fas expression is dysregulated in myasthenia gravis patients with anti-acetylcholine receptor antibody.Blood,1997,89(9):3287-3295.

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t淋巴细胞范文第3篇

关键词：间充质干细胞；T淋巴细胞；免疫调节

Immune Regulation of Mesenchymal Stem Cells on T Lymphocytes

WANG Hui-ge，GAO Jian-peng

（Department of Gastroenterology，The Affiliated Yanan Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650015，Yunnan，China）

Abstract：Mesenchymal stem cells have the biological characteristics involving strong proliferation capability，widely distribution and low immunogenicity，which are used in the treatment of the immune diseases.A growing number of studies have found that T lymphocytes play a significant role in the development and progression of autoimmune disease.And MSCs can influence the activation，proliferation and the proportion of subsets of T lymphocytes through the cell-cell contact，cytokine，then achieve the goal of immune regulation，relieve illness.The review summarizes that the immune effect of MSCs on T lymphocytes.

Key words：Mesenchymal stem cells；T lymphocytes；Immune regulation

相关研究证明，T淋巴细胞的异常表达和缺失可导致自身免疫性疾病的发生，而间充质干细胞具有多项分化潜能及免疫调节功能，可通过细胞间的直接接触或（和）通过产生可溶性因子对调节性T细胞进行调控，从而控制自身免疫性疾病的发生和发展。

1 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）

间充质干细胞仅表达中等量水平MHC-I类分子，不表达MHC-II分子和Fasl配体和B7-1、B7-2、CD40、CD40L等共刺激分子。而T淋巴细胞的激活所需的共刺激分子缺如，使T细胞活化的第二信号丧失，导致Th细胞的无反应性而促成免疫耐受，因此MSCs表现出耐受原性和低免疫原性。

2 T淋巴细胞

T细胞具有高度的异质性，根据其表面标志和功能特征，T细胞可分为不同的亚型，各亚群之间相互调节，共同发挥免疫学功能。

2.1 CD4+T细胞和CD8+T细胞的亚群、分化及功能

2.1.1 CD4+T细胞的亚群、分化及功能 Th1细胞分泌IFN-γ、TNF、IL-2、IL-3等；Th2细胞分泌IL-3、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等；Th3细胞分泌大量TGF-β。这些细胞因子不仅每个亚群的免疫效应功能，还调控各亚群的形成和扩增。

2.1.2 CD8+T细胞的功能 CD8+T细胞受自身MHC-I类分子的限制，活化后分化为细胞毒性T细胞（CTL），其可通过分泌穿孔素、颗粒酶、淋巴毒素及表达FasL引起靶细胞裂解和凋亡。

2.2 T细胞的活化 T细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。T细胞活化的双信号：第一信号即抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC）将pMHC提成给T细胞，T细胞受体（T cell receptor，TCR）特异性识别结合在MHC分子槽中的抗原肽，启动抗原识别信号（即T细胞对抗原的识别）；第二信号即T细胞与APC细胞表面多对协同刺激分子相互作用产生T细胞活化。活化的APC和T细胞可分泌IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ等多种细胞因子，他们在T细胞激活中发挥重要作用。

3 MSCs对T细胞的作用

3.1不同来源的MSCs对T细胞的作用具有相似性。有学者研究进行研究，发现骨髓来源和脂肪来源的MSCs同样具有抑制T细胞增殖的能力；同时研究者对来源于脐带血和骨髓的MSCs进行分析，发现两种来源的MSCs均具有抑制植物血凝素诱导淋巴细胞增殖的作用。故而可认为不同来源的MSCs对T淋巴细胞的作用具有相似性。

3.2 MSCs可以抑制T淋巴细胞增殖，并改变其亚群比例。MSCs可以通过分泌细胞因子和影响树突细胞（DC）的作用抑制T淋巴细胞的增殖，并改变其亚群比例。张伟等研究发现MSCs能分泌高水平的TGF-β1，且MSCs的上清抑制PHA刺激的T淋巴细胞的增殖，抑制PHA活化的T淋巴细胞IFN-γ的分泌。陈健琳研究小组也发现MSCs高表达TGF-β1基因，但不表达IL-4和IFN-γ基因，ELISA证实MSC培养上清存在TGF-β1蛋白。

4 小结和展望

MSCs可对T淋巴细胞的增殖、活化、亚群比例进行调节，但不同组织来源的MSCs对T淋巴细胞的抑制效果不同的，且MSCs对T淋巴细胞的调节具有浓度依赖性，故而还需大量的实验证据对MSCs作用T淋巴细胞的浓度提供依据，并完善MSCs对T细胞的作用途径的描述。

参考文献：

[1]陈莉娜，王颖，张艳艳，等.间充质干细胞的免疫调控作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，2（28）：5626-5629.

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[4]金伯泉.医学免疫学[M].第5版.北京：人民卫生出版社，2008：6.

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t淋巴细胞范文第4篇

[关键词]脂多糖；哮喘小鼠；T细胞；白介素-17

[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）01（c）-0120-03

[Abstract]Objective To explore the influence of LPS with low dosage on the secretion of IL-17 and the potential mechanism.Methods The asthma mouse model was copied successfully and the T cells from spleen were isolated and cultured in vitro，and the mice were divided into the control group and the LPS group.The mice in LPS group were divided into the LPS group 1 and the LPS group 2，and were stimulated with 1，2 ng/ml LPS respectively for 72 hours.The control group was stimulated with the same volume of saline.The concentrations of IL-17 in the supernatant were detected with ELISA，the change of concentration of IL-17 was observed.Results After stimulation with lower dosages of LPS，the secretion of IL-17 in the supernatant decreased significantly in the LPS groups than that in the control group，with significant difference （P

[Key words]Lipopolysaccharide；Asthma mice；T cell；Interleukin-17

支夤芟喘是全球常见的慢性疾病之一，是由T细胞、B细胞、嗜酸粒细胞、肥大细胞等多种炎症细胞和细胞因子参与的慢性气道炎症性疾病[1-2]。T细胞及其亚群如Th2细胞分泌的细胞因子如白介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-5、IL-13、IL-17等直接参与了哮喘的炎症过程，进而诱发哮喘的一系列症状[3]。IL-17是一种主要由CD4+T淋巴细胞、嗜酸粒细胞等分泌的前炎性细胞因子，具有强大的募集中性粒细胞及促进多种炎性因子释放的作用，参与了机体多种炎症性疾病的发生、发展[4-5]，在哮喘的慢性气道炎症过程中，也发挥着重要的作用[6]。本实验利用低剂量脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）在体外刺激哮喘小鼠T细胞，检测其IL-17的产生情况，探讨低剂量LPS诱导IL-17的产生及哮喘T淋巴细胞免疫耐受的可能机制。

1材料与方法

1.1主要试剂及仪器

RPMI 1640培养基、胎牛血清（Hyclone公司），Al（OH）3（A8222，Sigma公司），鸡卵清蛋白（A5503，Sigma公司），尼龙毛柱（Cat.146-04231，日本Wako公司），小鼠红细胞裂解液（碧云天公司），小鼠IL-17 ELISA试剂盒（Diaclone公司），倒置显微镜（日本Nikon），Eppendorf离心机，流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），雾化器（boyo37G6000型，德国百瑞公司），空气压缩泵（德国百瑞公司）。

1.2实验动物与分组

BALB/c小鼠15只，清洁级，4～6周龄，体重20～30 g，雌雄不限，随机分为两组，对照组5只，LPS组10只，其中LPS组又分为LPS1组和LPS2组，各5只。小鼠购自温州医学院实验动物中心，在普通清洁条件下饲养，自由取水、摄食。

1.3哮喘小鼠模型的制作

10只LPS组小鼠分别于第1、14天致敏，即经小鼠腹腔注射OVA 10 μg与Al（OH）3凝胶20 mg的混合液，总体积200 μl；第25天开始，将小鼠放置于容积为5 L的密闭容器中，通过连接雾化吸入器的空气压缩泵，以3%的OVA气溶胶激发小鼠，30 min/次，1次/d，总共3次。5只正常对照组小鼠以等量的生理盐水代替OVA致敏及激发。最后1次激发后48 h处死小鼠，收集标本。

1.4 T细胞的体外分离培养

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t淋巴细胞范文第5篇

作者：彭磊　王臻　王庆良　王鹏飞　胡蕴玉　吴银松

【关键词】 骨肉瘤

关键词: 骨肉瘤;T淋巴细胞，细胞毒性;体外扩增

摘 要:目的 研究骨肉瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）体外扩增培养的方法，并进行细胞毒检测. 方法 抽取骨肉瘤患者自身的外周血，分离淋巴细胞，用IL-2体外短期刺激方法提高对骨肉瘤细胞的免疫性，再按一定比例体外与多西紫杉醇处理的骨肉瘤细胞及巨噬细胞混合培养（MTLC）可获得骨肉瘤的特异性CTL细胞，进行鉴定并观察其杀伤特性. 结果 混合培养4d后，即可扩增出大量淋巴细胞，流式细胞仪证实主要是CD8+ 细胞，这些具有杀伤活性的CTL细胞体外对自身肿瘤细胞有很强的细胞毒作用. 结论 在IL-2作用下，应用巨噬细胞、自体肿瘤细胞及淋巴细胞体外混合培养，是体外扩增特异性细胞毒性T淋巴细胞的较好方法，CTL作为新的特异性免疫治疗方法有望提高骨肉瘤的免疫治疗效果.

Keywords:osteosarcoma;CTL;proliferation in vitro

Abstract:AIM To induce the osteosarcoma specific CTL proliferation in vitro.METHODS We isolated T lympho-cytes from peripheral blood of osteosarcoma cases，which were previously dealt with docitaxol，and activated with com-bination of macrophages and interleukin-2（IL-2），then their tumor-killing ability was measured.RESULTS A large number of lymphocytes that proliferated after3d mixed cul-com ture were proved mainly to be CD8+ T cell by FCM，and their tumor-killing ability was great in vitro.CONCLUSION The specific CTL proliferation in vitro by mixed culture of macrophages，host tumor cells and lymphocytes under the presence of IL-2is a prospective way in the immunological therapy of tumor.It may improve the therapeutic effect of osteosarcoma.

0 引言

免疫治疗是恶性肿瘤治疗的重要辅助方法，已确认机体免疫监视功能中起重要作用的是细胞免疫，其中起特异性杀伤作用的是细胞毒T淋巴细胞（CTL），CTL具有特异性高、杀伤性强等特点，故有重要的临床应用前景，成为新的研究热点，但此研究在骨恶性肿瘤尚属起步阶段.我们应用自建系的骨肉瘤细胞系PL-992与患者自身淋巴细胞及巨噬细胞体外混合培养（MTLC），扩增出大量淋巴细胞，并对这些淋巴细胞进行生物学特性测定.

1 材料和方法

1.1 骨肉瘤细胞系PL991来源及预处理 手术无菌切除新鲜活力好的骨肉瘤组织，病理诊断为骨肉瘤骨母细胞型，接种裸鼠皮下，待肿瘤长出后，组织块培养法，体外传代建系并进行生物学特性测定.用6mg L-1 多西紫杉醇处理48h后与淋巴细胞体外混合培养.

1.2 自体淋巴细胞的分离 抽取骨肉瘤患者外周血4mL，淋巴细胞分离液（购于Sigma公司）1500g离心15min，分离淋巴细胞（1×106 ），培养于200mL L-1 小牛血清RPMI1640的完全培养液中.

1.3 特异性杀伤性T淋巴细胞的体外刺激诱导 用班蟊液获得患者自体的巨噬细胞加入用IL-2（上海华新生物高技术公司）150U mL-1 ，植物血凝素预刺激36h的淋巴细胞，同时加入1/8的多西紫杉醇处理的骨肉瘤细胞PL-991，37℃50mL L-1 CO2 条件下培养，细胞计数，并在倒置显微镜下观察.

1.4 流式细胞仪增殖T淋巴细胞检测 取2×106 mL-1 待测细胞加入U型孔内，再加入CD3+ CD4+ CD8+ 单抗，每孔各20μg，4℃孵育30min，应用免疫荧光和流式细胞仪测定淋巴细胞CD3+ +CD4+ +CD8+ 表型.

1.5 细胞毒活性检测 采用51 Cr释放法，取对数生长期的PL-992骨肉瘤细胞为靶细胞，密度为107 mL-1 ，加入（51 Cr）Na2 CrO3 70kBq mL-1 ，37℃孵育1h，PBS洗涤2遍后，按104 /孔加入96孔板，按不同的效靶比加入T细胞，培育4h后收集上清液作γ计数，自然释放孔为仅加入靶细胞，最大释放孔为靶细胞加入100μL NP40.

细胞毒计算公式为:细胞毒活性=（实验孔CMP-自然孔CMP）/（最大释放孔CMP-自然孔CMP）×100%.实验孔均设三复孔.

2 结果

2.1 形态学观察 应用倒置显微镜观察，细胞体积明显变大，共孵后体积增大2～3倍，呈圆形、多边形、新月形、三角形等多种不规则形态，以肿瘤细胞为中心，形成特异性淋巴细胞增值克隆，在倒置显微镜下呈葡萄状排列，并且细胞数量逐渐增多，4d后细胞串开始脱落，肿瘤细胞已经发生凋亡（Fig1）.

图1 诱导前后CTL细胞形态，诱导后细胞多样并可见肿瘤细胞的凋亡　略

2.2 细胞生长曲线 淋巴细胞加入肿瘤细胞后生长迅速，继而细胞数量迅速增加由1.6×106 增至第5日1.5×107 （Fig2）.

图2 CTL细胞增殖迅速　略

2.3 流式细胞仪测定 淋巴细胞CD4+ （17.0±1.1）%，CD8+ 占（76.0±5.3）%，CD3+ 占（84.0±2.4）%，CD8+ CD3+ 占（67.0±2.1）%证实为特异性淋巴细胞为主.

2.4 特异性杀伤性T淋巴细胞细胞毒活性 诱导出的CTL对自体骨肉瘤细胞的细胞毒活性，培养诱导的细胞毒性T淋巴细胞对自体骨肉瘤细胞的杀伤活性为84.3%与未诱导的T淋巴细胞有显著性差异（P

3 讨论

体外诱导肿瘤特异性CTL并作为新的过继性免疫治疗的活性细胞已成为近年来肿瘤治疗研究中的一个新的热点，特别是由CTL筛选肿瘤的特异性抗原作为肿瘤疫苗有广阔的应用前景，与黑色素瘤等免疫原性肿瘤不同，骨肉瘤的特异性抗原至今仍难定义［1］ ，因此设想直接用处理的肿瘤细胞刺激诱导CTL较为困难，但是国外有应用树突状细胞刺激诱导出肿瘤特异性CTL细胞的研究基础，巨噬细胞也同属于肿瘤抗原提呈细胞，对肿瘤抗原有一定的提呈功能.另外，活化巨噬细胞分泌多种因子，有利于淋巴细胞识别肿瘤抗原，MHC I，II抗原表达增强，膜表面TNF IL-1，IL-7表达增强［2，3］ .体内实验也证明，杀伤肿瘤细胞时巨噬细胞的浸润要早于T淋巴细胞，在肿瘤原位也找不到活化迹象，在引流淋巴结处T细胞有明显的活化，增殖巨噬细胞处理抗原，提呈抗原，导致肿瘤特异性T细胞活化［4-6］ .因此，我们采用巨噬细胞，处理的肿瘤细胞以及淋巴细胞体外混合培养，借助这两方面的理论基础，设想在体外模拟T细胞特异性激活的过程，诱导特异性的CTL.我们发现，应用巨噬细胞体外刺激淋巴细胞，T淋巴细胞体外扩增的速度明显快于既往作者的扩增速度，巨噬细胞提取方法简便宜行，使用价值较大［7-9］ .另外，我们还发现共孵后巨噬细胞的吞噬功能明显增强（另文报道），说明体内巨噬细胞与淋巴细胞有协同作用.

图3 略

总之，巨噬细胞与淋巴细胞共培养是一种较好的体外扩增特异性T淋巴细胞的方法，对于研究体内特异性淋巴细胞的转归及机制有重要价值，同时也说明了骨肉瘤的抗原性较强，肿瘤特异性淋巴细胞体外 回输的方法具有杀伤性强，特异性高等特点，有望提高骨肉瘤免疫治疗的结果，故有着重要的临床应用前景，值得深入研究.

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