基因重组

前言：想要写出一篇令人眼前一亮的文章吗？我们特意为您整理了5篇基因重组范文，相信会为您的写作带来帮助，发现更多的写作思路和灵感。

基因重组范文第1篇

关键词：基因突变；基因重组

中图分类号：G632 文献标识码：B 文章编号：1002-7661（2013）33-151-01

一、教材内容

本章内容既是对前四章内容合乎逻辑的延续，又是学习第六章《从杂交育种到基因工程》和第七章《现代生物进化理论》的重要基础。学好这节课有助于学生更好地理解“诱变育种”和 “基因突变是新基因产生的途径，是生物变异的根本来源，是生物进化的原始材料” 。所以在知识上它起到了承上启下的作用，这决定了本节内容的重要性。

二、三维目标

知识目标：掌握基因重组的本质和特点，会辨别不同情况下的基因重组。

能力目标：借助类比活动揭示基因结构改变的类型、原因，提高学生判断、推理等能力。

情感目标：通过生物变异的事例，增强学生对生物世界的好奇心。引领学生自主合作探究.

三、重点难点

（1）重点：基因突变的类型、原因、概念、特点。（2）难点：基因突变的意义。

四、教学方法

（1）针对基因重组，选择的教学模式为：借助孟德尔的实验Ⅱ设置问题情境，引导学生对提出的问题进行探究―观察现象―分析探索―得出结论。实现由旧知到新知的跃迁。

（2）针对基因突变，选择的教学模式为：借助类比活动：全班同学抄写黑板上5位司机的身份证号统计抄错的原因？增添、缺失、替换，结果？

五、课前准备

教师准备：一个碱基序列为ATGGCATGT产生了大量的基因，其中绝大多数基因的碱基序列是正常，但偶尔也产生了如下4种新基因.如果这四种新基因也能正常表达，试写出它们转录和翻译的产物。

学生准备：1、做好相应的知识准备（减数分裂、DNA结构和复制、中心法则、孟德尔遗传规律的相关内容） 2、提前完成课前热身题小组长准备：（要求组长提前完成统计工作，上课要做为材料要进行类比活动）

六、课时安排：1课时

七、教学过程 （打开多媒体展示素材）

情景一：

（1）姐妹皮肤的白与黑，油菜籽粒饱满的种子与普通种子相比，太空椒与普通青椒相比，性状有明显的差异，原因何在？

（2）把子粒大而饱满的种子种下去长不出同样好的种子，而是普通种子；把肥大的太空青椒籽种下去可以结出肥大的青椒。这些现象说明什么问题？

（3）从上述可以看出生物的变异有几种类型？思维训练：“由环境引起的变异都是不可遗传的变异”，对吗？

【小结】可遗传的变异是生物变异的主要类型。它的来源主要由三个方面：基因突变、基因重组和染色体变异。？

情景二：孟德尔的两对相对性状的杂交实验的现象：

小组讨论：1、F1自交得到的F2代出现了几种性状表现？比例分别是多少？ 2、F2代中与亲代有什么不同的表现型？3、从性状来看，变异的概率是多少？4、这种变异产生的原因是什么？

情景三：请分析：1.同源染色体上的非等位基因在什么时期重新组合？有哪些组合情况？ 2.非同源染色体上的非等位基因在什么时期重新组合？有哪些组合情况？ 3.基因重组的结果是什么？它能产生新基因吗？ 4. 人的体细胞中有23对染色体，请你根据自由组合定律计算，一位父亲可能产生多少种染色体组成不同的，一位母亲可能产生多少子种染色体组成不同的卵细胞？如何理解人群中个体性状是多种多样的？

师生总结：“基因重组”的概念、时间、结果、意义。 “基因重组是可遗传变异来源之一”

情景四：基因突变实例-镰刀型细胞贫血症病因的图解。

学生尝试：结合镰刀型细胞贫血症的实例，尝试总结基因突变的概念，进一步理解 “基因突变产生新基因，基因突变也是产生可遗传变异的来源之一”。教师总结：基因突变如果发生在配子中，将会遗传给后代，发生在体细胞中的基因突变，一般是不能够遗传的。发生在植物体细胞中的基因突变，如何能够遗传？指导学生阅读：教材中有关基因突变原因的内容。

情景五：癌细胞是体细胞发生基因突变的结果，在生活中有什么因素容易引发癌症，从而发生基因突变呢？即癌基因突变的具体原因（外因？内因？）

情景六： 资料①正常人红绿色盲病②？人的正常人细胞癌细胞③普通羊短腿羊 ④果蝇的红眼白眼⑤果蝇长翅残翅⑥小麦的有芒无芒⑦低产青霉高产青霉 。

小组活动：结合投影资料1、2能分析出基因突变有什么特点？

教师小结：即基因突变是新基因产生的途径，是生物变异的根本来源

学生填表：比较基因突变和基因重组

八、教学反思

适当改变了课本内容的呈现顺序：先讲基因重组发生的时期、特点，再讲基因突变的类型、原因、概念、特点和意义，在知识上实现了由旧知到新知的跃迁，有利于学生对知识的理解和掌握。在共同探究概念、动手体验、合作交流部分注意时间的分配，一定要给学生留够观察、阅读、思考、分析、合作的时间。教师不要独霸课堂，真正落实学生为主体，教师为主导的理念。

基因重组范文第2篇

关键词：重组腺病毒；山羊SKIP基因；基因过表达；感染细胞

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）21-5258-04

Construction of A Recombinant Adenovirus Vector pAd-SKIP

XIONG Qi，ZHANG Nian，SUO Xiao-jun，LI Xiao-feng，LIU Yang，CHEN Ming-xin

（Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding / Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China）

Abstract： In this study， the Gateway technology was used to construct a recombinant adenovirus vector pAd-SKIP. The SKIP gene was amplified first by PCR and inserted into pcDNA3.1（+） vector， then cloned into adenovirus adshuttle vector pYr-adshuttle-2 to obtain recombinant plasmid pYradshuttle-2-SKIP. The expression cassette of SKIP-EGPF was transferred to pAd/PL-DEST with LR recombinant reaction to acquire recombinant adenovirus plasmid pAd-SKIP-EGFP. The correct clone was linearized and tranformed into 293A cells. Recombinant adenovirus pAd-SKIP was obtained and identified. The transfection efficiency was observed under the fluorescent microscope. The results confirmed that the recombinant adenovirus vector contained goat SKIP gene. This vector was found to infect C2C12 cells efficiently. It indicated that the recombinant adenovirus expressing SKIP gene and green fluorescence was successfully constructed， laying the foundation for further study.

Key words： recombinant adenovirus vector； goat SKIP gene； gene overexpression； infected cells

5′肌醇磷酸酶（SKIP）由Ijuin等[1]首先发现并分离，在动物各组织中广泛表达，尤其在心脏骨骼肌和肾脏中高表达，因此SKIP被称为骨骼肌和肾脏富含的5′肌醇磷酸酶。SKIP被鉴定为通过水解PI（3，4，5）P3为PI（3，4）P2而调控胰岛素信号的5′-脂质磷酸酶。PI（3，4，5）P3的下游PI（3，4，5）P3/Akt信号在成肌分化进程中有重要作用[2-4]。SKIP杂合突变小鼠比目鱼肌和股四头肌的质量显著提高[5]也提示SKIP具有调节骨骼肌纤维发育的功能。因此有必要进一步研究该基因在体内外参与骨骼肌生长发育的调控机制。本试验采用基因工程技术，成功构建了SKIP基因重组腺病毒，为下一步在体内外研究SKIP对成肌分化的作用机制以及SKIP基因的功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

真核表达载体pcDNA3.1（+）和腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-2购自长沙赢润生物技术有限公司；腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST、LR重组酶、DMEM培养液及新生牛血清购自Invitrogen公司。限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；CloneEZ试剂盒购自Genescript公司；质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、dNTPs、Taq酶及DNA Maker购自天根生化科技（北京）有限公司；酵母粉和胰蛋白胨购自Oxide公司；腺病毒包装细胞HEK293购自美国ATCC；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的设计、合成及PCR扩增 应用Primer5.0软件设计引物，在上、下游引物5′端分别引入用于定向克隆的限制性酶切位点KpnⅠ、XhoⅠ，同时在上游引物中添加kozak序列GCCACC，用以增强基因表达。提取山羊体细胞RNA反转录成cDNA为模板扩增目的基因，引物序列如下：SKIP-F：5'GGTACCGCCACCATGGAGGCCATGAG3′；SKIP

-R：5'CTCGAGTCAGATCTGTGGCTGGGCTTCAT3′。反应条件为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s， 75 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。然后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测是否出现预期中的SKIP基因带。

1.2.2 pcDNA3.1（+）-SKIP质粒的构建 将pcDNA3.1（+）和两端带酶切位点的SKIP基因分别以KpnⅠ和XhoⅠ双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，分别回收的线性化pcDNA3.1（+）质粒和SKIP cDN段以定向克隆的方式用T4 DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，挑选菌落扩增，小量提取质粒后以KpnⅠ和XhoⅠ双酶切，若电泳后得到1.3 kb和5.4 kb两个片段，则证明SKIP cDNA已插入到真核表达载体pcDNA3.1（+）上。

1.2.3 SKIP基因克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-2 用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切穿梭载体pYr-adshuttle-2和重组表达载体pcDNA3.1（+）-SKIP，凝胶电泳回收线性化的pYr-adshuttle-2和SKIP基因，用T4 DNA连接酶连接过夜，反应产物转化大肠杆菌DH5α。次日挑取卡那霉素选择性培养基筛选的阳性克隆子进行菌落PCR鉴定；提取质粒进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定；同时送阳性菌落到北京奥科生物公司测序。

1.2.4 采用LR体外同源重组将SKIP表达框克隆至腺病毒表达载体pAd/PL-DEST 在10 μL LR体外同源重组反应体系（含pYr-adshuttle-2-SKIP、pAd/PL-DEST和LR Clonase Ⅱ）中，加入蛋白酶K消化LR Clonase Ⅱ。将充分反应后得到的反应产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含AmpR抗性（终浓度为100 μg/mL）的LB平板上，37 ℃恒温箱培养过夜。接着再次从每个培养皿上随机挑取若干个单克隆菌落接种于50 mL含AmpR抗性（终浓度为100 μg/mL）的LB培养液中，37 ℃恒温摇床（250 r/min）培养过夜。用中量提取试剂盒提取质粒，对提取的质粒进行PCR验证XbaⅠ酶切鉴定。

1.2.5 重组腺病毒pAd-SKIP的包装 HEK293A细胞的准备：提前12～24 h将1 mL HEK293A细胞悬液（1.5×106 个细胞/mL）接种在培养皿中，转染前1 h换成无血清的DMEM培养基250 μL。

转染HEK293 A细胞包装病毒：用脂质体2000介导，由PacⅠ线性化的腺病毒DNA转染HEK293 A细胞。当有明显的细胞病态反应（CPE）现象，且有>50%脱壁时即收细胞，加入500 μL无菌PBS缓冲液重悬，干冰浴和37 ℃间快速反复冻融3次裂解细胞，室温下1 000 r/min离心15 min，沉淀细胞碎屑。将上清液再次感染HEK 293 A细胞扩增病毒，直至细胞在1周内有明显的CPE现象，且有>50%脱壁时即收细胞。同样用无菌PBS缓冲液重悬，干冰浴和37℃间快速反复冻融3次裂解细胞，室温下1 000 r/min 离心15 min，收集上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-80 ℃保存。并进行PCR鉴定。

1.2.6 测定重组腺病毒滴度 取纯化后的病毒液100 μL，10%SDS 20 μL、PBS 880 μL，65 ℃热浴30 min后，涡旋3次，离心后测定病毒基因组DNA的OD260 nm和OD280 nm，据此计算病毒的颗粒数和纯度，1 OD260 nm =1012 PFU/mL，若OD260 nm /OD280nm >1.3，表明纯度较高。病毒滴度（PFU/mL）=OD260 nm×稀释度×1012。

1.2.7 病毒感染C2C12细胞 将C2C12细胞（1×106个细胞/mL）接种于12孔板，每孔1 mL，12 h后将培养液吸出，各孔分别加入MOI 50～150的Ad-SKIP，常规培养48 h后，在倒置荧光显微镜下分别用可见光和荧光观察、成像。

2 结果与分析

2.1 pcDNA3.1（+）-SKIP的酶切鉴定结果

用KpnⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，PCR扩增SKIP基因的正反向引物分别带有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点。将含有插入方向正确的SKIP cDNA的重组pcDNA3.1（+）-SKIP经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切产生大小分别为1.3 kb和5.4 kb的片段（图1）。

2.2 pYr-adshuttle-2-SKIP的重组鉴定结果

将SKIP基因连接入pYr-adshuttle-2载体，阳性克隆经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，pYr-adshuttle-2载体大小为4 470 bp，SKIP基因大小约为1 350 bp，由酶切结果（图2）可知，该克隆为正确克隆。将酶切鉴定正确的pYr-adshuttle-2-SKIP送去测序。并将测序结果与欲得到的目的序列相比对，显示获得的SKIP基因片段序列完全正确，证实pYr-adshuttle-2-SKIP构建成功。

2.3 重组腺病毒载体pAd-SKIP的鉴定

将SKIP基因表达框采用LR体外重组技术克隆至表达载体pAd/PL-DEST，阳性克隆经XbaⅠ单酶切鉴定，可切出一条约550 bp和一条约2.3 kb的条带，且大带大于8 kb（实际有3条大带，即18 kb、8 kb、8 kb，但是一般很难分开，所以看上去就是一条粗带）。由图3结果可以初步判断pAd-SKIP构建成功。接着以质粒pAd-SKIP为模板，设计引物扩增SKIP片段，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图4。由图4可见，PCR扩增出的片段大小与SKIP基因片段大小一致，证实pAd-SKIP载体构建成功。

2.4 重组腺病毒rAd-SKIP的产生和PCR鉴定

将PacⅠ线性化的腺病毒DNA转染HEK293A，当细胞有明显的CPE现象，且有>50%脱壁时即收细胞进行裂解收病毒。提取腺病毒基因组DNA，以之为模板进行PCR反应。引物用载体上自带的CMV和BGH引物验证。由PCR鉴定结果（图4）可知，用载体上自带的引物扩增出与SKIP基因长度同样大小的片段，表明此腺病毒中有SKIP基因，而且相关表达框都在。证实rAd-SKIP包装成功。

2.5 重组腺病毒对成肌细胞C2C12的感染

用不同MOI的重组腺病毒感染C2C12细胞，当MOI为150时，超过80%的细胞出现荧光（图5），表明所构建的重组腺病毒生物活性高，可以有效地转导目的基因表达。

3 小结与讨论

SKIP是调节PI3K-Akt信号通路的关键5′肌醇磷酸酶。在肌源细胞中，血清饥饿可诱导IGF2自分泌。IGF2与IGF1受体互作，激活PI3K，产生PI-3，4，5-P3，PI-3，4，5-P3募集到细胞膜上激活Akt（蛋白激酶B），接着激活成肌基因的转录[5]。因此PI3K-Akt信号与成肌分化紧密相关。近年来，一些新的信号通路、分泌因子和信号分子不断被发现能调控PI3K-Akt信号。如肌醇磷酸酶SKIP，它通过水解PI3K合成的脂质第二信使PI-3，4，5-P3，参与Akt（蛋白激酶B）的激活[6-8]。但SKIP是否调控PI3K-Akt信号介导的成肌分化仍有待研究。

基因的过表达是研究基因功能的重要手段之一，将外源基因有效地导入靶细胞表达是后续研究的先决条件。腺病毒（Adenovirus）是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一，可用于在哺乳动物细胞中瞬时及高水平地表达目的蛋白。具备宿主范围广，不依赖细胞周期，病毒滴度高，有较好的生物安全性等优点[9]。腺病毒表达系统中的难点主要在于如何将外源基因表达框或者外源的shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上。由于腺病毒骨架载体比较大（～30 kb），而且载体中的一些常用酶切位点几乎都有多个，如果用常规的酶切-连接的方式将外源基因或者shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上，则成功率很低，因此，目前的腺病毒表达系统基本上都是用同源重组的方法将外源基因构建至腺病毒骨架载体上。

本试验采用了Invitrogen公司的BLOCK-iT腺病毒表达系统和Gateway 技术，与市面上其他腺病毒表达系统往往利用大肠杆菌或者293细胞自身的同源重组系统不同，即利用LR 重组酶进行体外重组。与当前其他腺病毒表达系统相比，这种体外重组更加方便、快速，重组效率更高。在本研究中，构建了含山羊SKIP基因的腺病毒载体，并且经酶切鉴定分析和PCR结果证实SKIP重组病毒构建成功。病毒滴度高，并且可以高效感染C2C12细胞，表达能有效介导基因转染，为下一步证实SKIP对骨骼肌细胞成肌分化的调控等研究奠定了基础。

参考文献：

[1] IJUIN T， MOCHIZUKI Y， FUKAMI K， et al. Identification and characterization of a novel inositol polyphosphate 5-phosphatase[J]. Journal of Biological Chemistry，2000，275（15）：10870-10875.

[2] TURECKOVA J， WILSON E， CAPPALONGA J， et al. Insulin-like growth factor-mediated muscle differentiation collaboration between phosphatidylinositol 3-kinase-Akt-signaling pathways and myogenin[J]. Journal of Biological Chemistry，2001，276（42）：39264-39270.

[3] GONZALEZ I， TRIPATHI G，CARTER E， et al. Akt2， a novel functional link between p38 mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase pathways in myogenesis[J]. Molecular and Cellular Biology，2004，24（9）： 3607-3622.

[4] CENNI V， SIRRI A， RICCIO M， et al. Targeting of the Akt/PKB kinase to the actin skeleton[J]. Cell Mol Life Sci，2003， 60（12）： 2710-2720.

[5] ERBAY E， PARK I-H， NUZZI P D， et al. IGF-II transcription in skeletal myogenesis is controlled by mTOR and nutrients[J]. The Journal of Cell Biology，2003，163（5）：931-936.

[6] IJUIN T， TAKENAWA T. Regulation of insulin signalling and glucose transporter 4（GLUT4） exocytosis by the phosphatidylinositol 3，4，5-trisphosphate （PIP3） phosphatase， SKIP[J]. J Biol Chem，2012，287（10）：6991-6999.

[7] MANNING B D， CANTLEY L C. AKT/PKB signaling： navigating downstream[J]. Cell， 2007，129（7）：1261-1274.

基因重组范文第3篇

【摘要】 目的 构建鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染性克隆，通过体外细胞转染获得单一来源、基因序列清楚的体内实验的感染毒种。方法 以湖北麻鸭DHBV分离株（DQ276978）为模板，用PCR法从该DHBV全基因组克隆质粒（pMD-DHBV）和DHBV阳性血清中获取3部分基因片段，总长44kb，克隆至载体PCR21的SacI和NotI酶切位点，构建含15倍鸭乙型肝炎病毒全基因的重组质粒，并酶切鉴定其插入方向。将构建的重组质粒经脂质体LipofectineTM 2000导入鸡肝癌细胞系(LMH)细胞中转染表达，收集纯化后的转染细胞培养上清液作为体内实验感染的标准毒种。结果 PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定，证实成功获得正向插入的1.5倍鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒PCR2.1-DHBV1.5。Southernblot检测表明，该重组质粒在LMH细胞内存在各种病毒复制中间体；通过电镜观察，转染细胞上清液中存在DHBV完整病毒颗粒。结论 经体外重组，构建出携带1.5倍加长DHBV基因组片段的重组质粒PCR21-DHBV15，并可在鸡肝癌细胞LMH中介导高水平病毒复制，从而获得含可自我复制病毒颗粒的转染细胞上清液作为动物体内感染接种物。

【关键词】 鸭乙型肝炎病毒

鸭乙型肝炎病毒（DHBV）与人类乙型肝炎病毒（HBV）同属嗜肝DNA病毒科，它们在形态结构、基因序列、病毒复制、致病机制及感染宿主规律等方面均较为相似，DHBV感染鸭模型使人们认识了嗜肝病毒的复制周期以及病毒持续存在和病毒彻底清除的机制。我们在对湖北麻鸭DHBV自然感染率调查的基础上，选择对DHBV易感且取材方便的湖北麻鸭作为实验鸭种，并分离出1株DHBV新毒株（DQ276978）〔1〕。进而以该毒株为模板，构建了15倍DHBV全基因重组质粒，通过该质粒在鸡肝癌细胞系(LMH)中稳定转染表达出含有可自我复制的病毒颗粒的细胞培养上清液作为单一来源、基因序列清楚的实验毒种，以期建立标准化的湖北麻鸭乙型肝炎病毒体内模型。另外，将该DHBV重组质粒与不同剂量人类载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽3G(APOBEC3G)真核表达质粒共转染LMH细胞，通过抑制实验以证实该DHBV体外实验模型的初步应用。

1 材料与方法

11 材料

111 质粒 pMD-DHBV为本实验室构建的含有湖北麻鸭（DQ276978）DHBV DNA全长基因组的质粒；pSP65-DHBV16为双拷贝头尾相接的全基因DHBV DNA重组质粒，该克隆质粒(美国 Mandart 教授馈赠)；APOBEC3G真核表达质粒为本实验室构建保存；PCR21载体(美国Invitrogen公司)。

112 DHBV阳性血清 取自扩增出DHBV DNA全长基因组（DQ276978）的阳性血清。

113 细胞 禽类鸡肝癌细胞系LMH，为本室传代保存。

114 工具酶 LA Taq酶、限制性内切酶EcoR I、BamH I、Sac I、Kpn I、Not I及凝胶回收试剂盒(大连 TAKARA公司)；Taq DNA聚合酶(美国Promega公司)；T4DNA连接酶(美国GIBICO公司)。

115 生化及其它试剂 地高辛(DIG)标记及检测试剂盒(德国Roche公司)；Waymouth 细胞培养基(美国Sigma公司)；LipofectineTM2000(美国Invitrogen公司)。DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒(德国QIAGEN公司)；质粒提取试剂盒和动物培养细胞基因组DNA纯化试剂盒(大连TaKR公司)。

12 方法 通过对湖北麻鸭（DQ276978）DHBV DNA的全长克隆质粒的序列限制酶切图谱分析〔1〕，已明确其基因组的结构及与复制相关的重要元件的序列位置，在此基础上运用3片法构建出能自我复制的重组质粒。

121 构建质粒PCR 21-DHBV15 用EcoRI和BamHI双酶切pMD-DHBV，得到目的片段DA（DHBV3024/0nt-1473nt）；设计引物DB1/DB2和DC1/DC2分别经PCR扩增DHBV阳性血清获得目的片段DB（1473nt-2870nt）和DC（1395-3024/0nt）。将上述3片段插入PCR21的相应酶切位点后即得到15倍DHBV全基因重组质粒PCR21-DHBV15。

122 PCR鉴定 引物Ps1/Ps2和Pc1/Pc2为DHBV基因S区和C区的高度保守序列段，引物序列如下：Ps1（1318F）5′-TGGCCTAATCGGATTACTGG-3′，Ps2（1739R）5′-CAGCGTGGCTAATTGAGTTA-3′；Pc1（187F）5′-GCAATCACTAGACCAATCCA-3′，Pc2（397R）5′-GAGATCTATGGTGGCTGCTC-3′。PCR反应液组成：10×Buffer5μl;MgCl2（25mmol/L）3μl;dNTP（10mmol/L）1μl;Ps1/Ps2或Pc1/Pc2各1μl；Taq酶1μl；DHBV模板5μl；加灭菌纯水至50μl。PCR循环参数：94℃5min；94℃50s，61℃45s，72℃50s，40个循环；72℃10min。

123 酶切鉴定 用BamHI，SacI和EcoR I，Not I和EcoRI，Sac I和BamH I分别进行酶切鉴定。

124 序列测定 取一株阳性克隆质粒送上海生物工程技术服务公司测序。

125 脂质体LipofectineTM2000介导的DNA转染 在LMH细胞达到80%～90%融合时进行转染，设未转染LMH细胞对照和pSP65-DHBV16质粒对照。

126 蛋白印迹(Southern Blot)分析 提取转染LMH细胞内总DNA后，用DIG标记的DHBV全长基因组探针杂交，X-ray胶片发光显影。

127 转染细胞上清液中病毒颗粒电镜观察 收集转染细胞的上清液，离心后用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解沉淀，将该沉淀溶解物通过磷钨酸负染法进行电镜观察。

128 APOBEC3G真核表达质粒对DHBV的抑制效应实验 质粒PCR21-DHBV15分别与不同剂量（20和40μg）的APOBEC3G真核表达质粒pXF3G-HA通过LipofectamineTM2000共同转染LMH细胞，72h后收集细胞。

2 结果

21 重组质粒PCR21-DHBV15的PCR鉴定 重组质粒PCR21-DHBV15经不同引物C1/C2、S1/S2、DB1/DB2和DC1/DC2扩增后可产生依次为211，452，1 430和1 600的目的片段（图1）。

22 重组质粒PCR21-DHBV15的酶切鉴定 未酶切的重组质粒PCR21-DHBV15为84kb；用SacI和EcoRI双酶切该重组质粒可产生29和55kb的片段；该重组质粒经BamHI限制性内切酶消化后产生31和53kb的目的片段；用NotI和EcoRI双酶切PCR21-DHBV15可产生16和68kb的片段；用SacI和BamHI限制性内切酶消化该重组质粒后则产生16和68kb的目的片段。上述酶切结果均与预期相符（图2）。

23 转染细胞上清液中DHBV病毒颗粒的检测 在转染细胞上清液中检出大量直径为30～65nm的球形颗粒，其中一种为大小较均一，直径为40～50nm的实心病毒，有核心和球形包膜，即完整病毒颗粒；另一种是直径为30～65nm的类球形空心病毒，中央凹陷，未见丝状、管状体，即病毒表面抗原颗粒（图3）。

24 转染细胞内DHBV DNA的检测 分别将pSP65-DHBV16和PCR21-DHBV15转染LMH细胞，72h后收集细胞，提取DNA进行Southernblot检测。结果显示，重组质粒PCR21-DHBV15与双拷贝DHBV全长基因组质粒pSP65-DHBV16一样，均在转染细胞中检出大量DHBV DNA复制中间体（图4）。

M：DL2000 Marker;1：primer C1/C2;2：primer S1/S2;3：primer DB1/DB2；4：primer DC1/DC2

图1 重组质粒PCR21-DHBV15的PCR鉴定（略）

M1：1Kb Marker;1：PCR2.1-DHBV1.5；2：PCR2.1-DHBV1.5/SarI+EcoR I;3：PCR2.1-DHBV1.5/BamH I;4：PCR2.1-DHBV1.5/Not I+EcoR I;5：PCR2.1-DHBV1.5V/Sac I+BamH I;M2：500bp Lad der

图2 重组质粒PCP2.1-DHBV1.5的酶切鉴定（略）

25 APOBEC3G对DHBV核衣壳相关DNA水平具有剂量依赖的抑制效应 重组质粒PCR21-DHBV15分别与不同剂量（20和40μg）的APOBEC3G真核表达质粒pXF3G-HA共同转染LMH细胞，转染后Southern blot检测细胞内的DHBV核衣壳相关DNA的结果显示，APOBEC3G对转染细胞内DHBV核衣壳相关DNA水平具有剂量依赖的抑制效应（图5）。

图3 重组质粒PCR21-DHBV15转染细胞上清液(×60000)（略）

1：pSP65-DHBV16;2:PCR2.1-DHBV1.5;RC：松弛环状DNA；L：线性DNA；SS：单链DNA

图4 Southern blot 检测转细胞内DBBV复制水平（略）

PCR21-DHBV1.5(μg)

20 20 20

pX F3G-HA (μg)

- 20 40

pXF3H(μg)

40 20 -

pXF3H：真核表达载体；

pXF3H-HA：APOBEC3G真核表达质粒

图5 APOBE3G对细胞内DHBV核衣壳相关DNA水平的抑制（略）

3 讨论

在HBV己证实，构建13倍加长或头尾相接双拷贝的基因组，可以产生所有HBV转录子，并启动HBV的复制〔2〕。土拔鼠肝炎病毒(WHV)研究也有类似的结果〔3〕。LMH是DHBV稳定表达细胞系〔4，5〕，它能支持DHBV克隆病毒的复制，并能分泌完整病毒颗粒。本实验通过对湖北麻鸭DHBV分离株(DQ276978)的DNA全长基因组核苷酸水平和氨基酸水平的序列分析研究〔1〕，成功构建了15倍加长DHBV基因组重组质粒，经PCR鉴定、酶切鉴定以及序列测定均证明所构建的重组体与预期相符，包含能高效自我启动DHBV复制的全部元件。核酸水平研究和电镜观察也证实该重组质粒能够在LMH细胞中利用DHBV固有的增强子和启动子进 行有效复制、转录及表达，由此也证明所构建的重组体可以用于体内基因免疫，为其后建立鸭体内实验感染标准化模型提供实验依据。另外，我们进一步用本实验室构建的APOBEC3G真核表达质粒和PCR21-DHBV15重组质粒共同转染LMH细胞系进行抑制实验以证实该DHBV体外实验模型的初步应用。APOBEC3G是一种天然免疫分子，具有抗病毒感染的效应〔6，7〕。实验结果显示，APOBEC3G能明显降低DHBV核衣壳相关DNA的水平，并且显示出剂量依赖性，表明APOBEC3G也可能非特异性地抑制DHBV复制，但其作用机制尚待进一步研究。

【参考文献】

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基因重组范文第4篇

【关键词】 肝炎病毒

关键词 :肝炎病毒，乙型;聚合酶链反应;腺病毒科 中图号:Q74 文献标识码:A

0 引言

乙型肝炎是一种常见传染病，危害极大.我们通过PCR及基因重组技术将adr亚型乙型肝炎病毒表面抗原HB-sAg基因克隆到腺病毒穿梭载体，构建了重组HBsAg腺病毒穿梭载体，为制备HBsAg腺病毒疫苗的研制打下了基础.

1 材料和方法

1.1 材料

模板pⅡ1.2（含HBV adr亚型全基因序列）根据《分子克隆》的操作，采用碱裂解法大量制备质粒pⅡ1.2，紫外分光光度法定量.PCR引物的设计用于扩增HBV S区基因的引物，由上海生工公司合成，序列:For:cgtcta-gagggaacaagagctacagcatg.Rev:cgtctagataagggaatagccccaacg 1.2 方法 根据ExpandTM High Fidelity PCR System

（宝灵曼公司）操作说明进行PCR扩增，反应体系:pⅡ1.2100ng，HBsFor及Rev300nmol・L

-1 ，dNTP200mol・L-1 ，总反应体积50μL.循环参数如下:94℃2min;94℃，15s;56℃，30s;68℃，1min;循环30次，72℃，7min.Klenow酶（Promega公司）补平PCR片段，KpnⅠ/HindⅢ（华美公司）双酶切，用T4DNA连接酶（Promega公司）将酶切片段克隆入pUC18载体的相同酶切位点，连接产物转化感受态E.coli JM109，挑单菌落扩增，各取2μL菌液进行PCR反应，并提取质粒用KpnⅠ/HindⅢ双酶切鉴定阳性克隆，重组质粒命名为pUC/HBs.任选一阳性克隆提取质粒进行DNA自动测序.将KpnⅠ/HindⅢ双酶切pUC/HBs所得片段按上述方法亚克隆入pAdCMV载体，转化感受态E.coli JM109，PCR法及KpnⅠ/HindⅢ双酶切鉴定阳性克隆，重组质粒命名为pAdCMV/HBs.

2 结果

经PCR反应扩增出HBV S区基因片断大小约1250bp.随机挑5个转化菌单菌落扩增，其中4个转化菌PCR反应及酶切鉴定同时阳性.随机挑4个转化菌单菌落扩增，4个转化菌PCR反应及酶切鉴定皆阳性.

基因重组范文第5篇

关键词：uPA；GFP；腺相关病毒载体；基因转染

中图分类号：Q786　文献标识码：A　文章编号：1007－7847(2007)03－0242－06

尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase typeplasminogen activator，uPA)自身有直接降解基底膜及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的作用，uPA还可通过激活纤溶酶及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)降解ECM，uPA激活肝细胞生长因子间接对损伤肾脏起保护作用，因此uPA在降解ECM、逆转纤维化方面起重要作用，肾脏纤维化的病理改变主要是肾小球硬化和，肾小管间质纤维化，是肾脏ECM合成与降解失衡，导致ECM过度积聚的结果，因此，我们设想采用高效表达载体-腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)载体，将uPA基因全长序列转移到有纤维化病变的部位，以增强病变局部uPA的表达，发挥其降解ECM的作用，从而缓解肾纤维化的进程，为临床治疗肾脏纤维化提供理论基础。

1　材料和方法

1．1　材料

AAV Helper-Free System(#240071)、pAAV-IRES-hrGFP(#240075)、AAV-293细胞(#240073)和XL10-Gold感受态细菌(#200314)购自美国Stratagene公司，TRIzol regent(15596-018)购自美国invitrogen公司，Reverse Transcription System(A3500)、pGEM-T EasyⅡ(A1380)，L4 DNA ligase(#M1801)、Wizard PureFection Plasmid DNA Pu-rification System(A1330)购自美国Promega公司，DNA Ladder Mix(#SM033 1)、Taq DNA polymerase(EP0404)、dNTP Mix(R0191)购自美国Fermen-tas MBI公司，限制性核酸内切酶BamH](R0136V)、Xho I(R0146V)购自美国NEW ENG-LAND Biolabs公司，Gel Extraction Mini Kil(Z0021A)购自中国长沙安比奥公司，引物For-ward Primer：5′-TYCGGATCCCCATGAGAGTCTG-GCTTGC-3′，Reverse Primer：5′-TGGCTCGAGTCAGAAGGCTAGGCCATTC-3′，由上海生工生物技术有限公司合成，测序由上海生工生物技术有限公司完成，兔抗Flag M2抗体(F1804-200UG)购自美国Sigma公司，2周龄SD雄性大鼠购自中南大学湘雅二医院动物实验中心，肾小管上皮细胞由中南大学湘雅二医院小儿肾脏病研究室保存。

1．2　方法

1．2．1　大鼠肾脏uPA基因的获得

取Spragoc-Dawleg 2周龄雄性幼鼠，按TRI-ZOL一步法提取肾脏总mRNA，逆转录合成eD-NA第一链，PCR法特异扩增uPA cDNA，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，uPA cDNA为1299bp，用GelExtraction Mini Kit回收酶切产物，置pH8.0 TE缓冲液中，uPA cDNA-20℃保存。

1．2．2　pGEM-T-uPA重组质粒的构建

将uPA cDNA用T4 DNA ligase连接到pGEM-T Easy载体上，并转染到JM 109感受态细菌，涂于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，置37℃恒温箱倒置培养14～16h，作氨苄青霉素抗性筛选，挑选固体平板上长势良好的白色菌落6个，分别接种于3mLLB培养液内(Amp)，于37℃摇床内培养14h增菌，将6管菌液各取1.5mL，按Puprep PIasmid Miniprep Kit说明书提取质粒，得到pGEM-T-uPA重组质粒，将重组质粒用BamHI/Xho I双酶切后，证实含相应的uPA基因片断，用Gel Extraction Mini Kit回收uPA基因片断，-20℃保存。

1．2．3　pAAV-hrGFP-uPA重组质粒的构建

将上一步骤中获得的uPA基因片段用T4DNA ligase连接到pAAV-IRES-hrGFP质粒的多克隆位点，并转染到XL 10-Gold感受态细菌，涂于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，置37℃温箱倒置培养14～16h，作氨苄青霉素抗性筛选，挑选固体平板上长势良好的白色菌落6个，分别接种于3mL LB培养液内(Amp)，于37℃摇床内振摇培养14～16h增菌，将6管菌液各取1.5mL，按Puprep Plasmid Miniprep Kit说明书提取质粒，得到DAAV-hrGFP-uPA重组质粒，将重组质粒用BamH I/Xho I双酶切后，证实含uPA基因片断，DAAV-hrGFP-uPA重组质粒送检测序，准备足够的pAAV-hrGFP-uPA重组质粒和其他两个辅助质粒oAAV-RC和pHelper，用Wizard Pure FectionPlasmid DNA Purification System提取超纯质粒，供下一步转染实验。

1．2．4　AAV-293细胞培养

AAV-293细胞来源于普通的HEK293细胞系，但是可以产生较高的病毒滴度，HEK293是转染了腺病毒5型DNA的人胚胎肾细胞，AAV-293细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中生长，AAV-293细胞贴壁不牢，轻吹大瓶壁即可传代，在细胞达到50％融合时传代，且传代不宜超过20代，同时注意传代和接种时不要让细胞

成块。

1．2．5　pAAV-hrGFP-uPA的产生及鉴定

接种3×106个AAV-293细胞于100mm培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，培养2d细胞达到70％～80％融合时，吸取每个质粒溶液pAAV-hrGFP-uPA质粒、pAAV-RC和pHelper(浓度均为1g/L)各10μg加入到15mL柱状试管中，再加入1mL 0.3mol/L的CaCl2，轻轻混匀，加入1mL 2×HBS于另一柱状试管中，滴加上述1.03mL DNA/CaCl4混合物，反复吹打混匀，以点滴方式加入DNA/CaCl2/HBS悬液于AAV-293细胞的培养皿中，旋转均匀分散该DNA悬液，将培养皿放人37℃的培养箱中培养6h，培养结束后，添加10mL新鲜的含10％胎牛血清的DMEM培养基，继续在37℃培养箱中培养72h，培养结束后，收集培养基和细胞于15mL的柱状试管中，经过4次冰冻和解冻(37℃)循环，每次持续10min，然后于室温中离心(10000g)10min，转移上清(初病毒储存液)于另一新的试管中置-80℃保存，Buffer TE代替质粒作阴性对照，转染后48h倒置荧光显微镜观察GFP表达，以确定转染成功；转染后72h收集病毒颗粒，并将获得的病毒颗粒再次感染AAV-293细胞，以确定其感染能力。

1．2．6　病毒载体的纯化与滴度测定

对重组的pAAV-hrGFP-uPA用亲和层析、离子交换层析和分子筛层析进行纯化：纯化后用斑点杂交方法检测重组病毒的滴度；利用高压液相层析(HPLC)法检测重组病毒的纯度，具体方法参照文献。

1．2．7　uPA基因转染肾小管细胞及其表达的测定

按每孔1.5×105个肾小管细胞接种于12孔培养平板中，培养细胞达到70％融合，每孔添加终浓度为4mol/L羟基脲和1mol/L丁酸纳，混匀后，放人培养箱中继续培养5～6h，吸出培养基，加入1.5mL预温的含20％小牛血清的DMEM/F12培养基和相应的病毒存储液0.5mL，继续培养48h，培养结束后。倒置荧光显微镜观察GFP表达，uPA基因的表达以Flag标记蛋白进行免疫组化染色来判断，一抗为兔抗Flag M2抗体(1:200)，二抗为生物素化的羊抗兔抗体，加SABC孵育后进行DAB显色。

2　结果

2．1　uPA cDN段的获得

用RT-PCR法扩增大鼠uPA eDNA 1299 bP片段，琼脂糖凝胶电泳证实所得到的基因片段是正确的(图1)。

2．2 pAAV-hrGFP-uPA重组质粒的酶切鉴定

pAAV-hrGFP-uPA重组质粒经BamH I/Xho I双酶切后得到1299 bp的uPA基因片段，表明pAAV-hrGFP-uPA重组质粒的构建正确(图2)。

2．3　pAAV，hrGFP-uPA重组质粒DNA序列分析

证实pAAV-hrGFP-uPA序列完全正确，无碱基突变。

2．4　pAAV-hrGFP-uPA的产生

分别取 pAAV-hrGFP-uPA和pAAV-RC、pHelper质粒各10μg，经磷酸钙沉淀法共转染AAV-293细胞2～3d，Buffer TE代替质粒转染细胞作阴性对照，阴性对照平皿中AAV-293细胞长满后有少量细胞漂浮，但平皿上一直布满细胞，培养基变成桔黄色，提示阴性对照没有病毒颗粒产生，转染质粒的AAV-293细胞逐渐聚集成团并漂离平皿，培养基中有大量漂浮细胞，培养基的颜色由桔黄色变为黄色，细胞肿胀、变圆，将质粒转染组在倒置荧光显微镜下观察，可见细胞呈绿色，表明转染成功(图3、4)。

2．5　uPA基因转染肾小管上皮细胞及其表达

AAV-293细胞产生的病毒颗粒转染肾小管上皮细胞，48h后在倒置荧光显微镜下观察约60％～70％的肾小管上皮细胞表达绿色荧光蛋白，免疫组化法观察到肾小管上皮细胞可有效表达flag蛋白，细胞质中具有较多的棕黄色颗粒，阴性对照组均没有绿色荧光蛋白和flag蛋白的表达(图5、6)。

3 讨论

肾小球硬化和肾间质纤维化归根结底是肾脏ECM合成与降解失衡导致ECM过度积聚的结果，目前已知参与ECM降解的酶主要有3类：1)丝氨酸蛋白酶；2)基质金属蛋白酶；3)半胱氨酸蛋白酶，其中主要是前两类，uPA属于丝氨酸蛋白酶家族，uPA的主要作用是器官形态发生、组织修复和肿瘤浸润，uPA自身有直接降解基底膜及ECM的作用，uPA还能切断纤溶酶原中脯氨酸-甘氨酸-精氨酸-缬氨酸序列中的精氨酸-缬氨酸连接，催化无活性的纤溶酶原转变为纤溶酶，uPA对纤溶酶原的激活是一个正反馈逐级放大效应，纤溶酶是一广谱蛋白酶，能够降解存在于基底膜和，ECM的各种糖蛋白包括血纤维蛋白、粘连蛋白、层连蛋白和蛋白多糖中的核心蛋白，进而溶解血管内的纤维蛋白凝块和ECM成分，并形成细胞外局部溶解区。构成细胞转移的通道，有利于新生的内皮细胞迁移、生长进入周围基质，形成新的微血管；uPA又可激活MMPs，该酶是锌依赖性内肽酶，是参与基质降解的主要成分；还能激活肝细胞生长因子，肝细胞生长因子是一个有力的抗纤维化因子，对损伤肾脏有保护作用，基因治疗器官组织纤维化已成为慢性疾病治疗领域的研究热点，利用各种有效的和组织特异性的载体系统将降解ECM的外源基因导入细胞内，到达纤维化的组织和器官，可缓解纤维化程度，有研究报道腺病毒携带人uPA基因可诱导实验性肝硬化动物模型的肝硬化缓解，uPA促进HGF从基质中释放并活化，缓解肺纤维化，因此，利用基因转移技术增强uPA基因的表达可能会大大降解ECM成分，缓解肾脏纤维化。

由于肾脏细胞的有丝分裂指数较低，肾脏基因的转移效率至今仍不理想，因此，我们以新型的无辅腺相关病毒AAV-2作为载体，采用基因克隆技术，成功构建了携带uPA基因和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)基因的腺相关病毒重组质粒，用来转移基因，本实验中所选用的pAAV-IRES-hrGFP质粒作为携带目的基因的主要载体，能同时表达目的基因蛋白、GFP和Flag蛋白，质粒中的GFP可作为病毒颗粒转染细胞成功与否及细胞定位的有效标记，Flag蛋白仅作为标签提示目的基因蛋白的表达，还可用来分析未知基因表达的情况，腺相关病毒(adeno-asso-ciated virus，AAV)属微小病毒科，能高效转染到各种宿主细胞中，AAV作为基因治疗载体的优势主要有：1)AAV是一种人源性的病毒，对人体无

致病性，免疫反应轻微，有利于体内转染；2)可定点整合至人的19号染色体，并能较稳定的存在，从而避免了其它病毒随机整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因激活的危险；3)AAV携带的外源基因可以长期持续稳定表达，并可调控；4)AAV的宿主范围很广，包括分裂期和非分裂期的多种细胞：5)具有较好的热稳定性和抗酸碱性(pH 3.0～9.0)以及抗有机溶剂处理的特点，便于储存，AAV基因组具有两个开放的阅读框架(ORF)，两端各有1个145bp的末端反向重复序列(ITR)，ORF编码非结构性蛋白(Rep)和衣壳蛋白(Cap)，Rep蛋白在病毒的整合、复制、包装中起重要作用，Cap蛋白是包装成完整病毒所需的衣壳蛋白，因此，重组AAV载体(rAAV)是用外源目的基因单位(包括启动子)替换AAV两端ITR系列之间的基因系列(Rep和Cap基因)而产生，传统制备rAAV载体包装系统主要包括：重组载体、辅助质粒(如Ad8)、辅助病毒(如Ad5)和宿主细胞，该方法的缺点是可导致腺病毒蛋白的污染，容易导致机体对载体的免疫反应，各项研究通过改造AAV载体基因结构、包装细胞以及改进病毒颗粒的纯化方法，可达到更高的病毒产率，rAAV载体经过不断改进和完善，已经克服了容量小和解决无腺病毒辅助的大量包装和复制问题：近年来又由于包装细胞系的诞生，加上其固有的优点，因而成为治疗遗传性疾病和慢性疾病最有前途的基因载体。

本实验在培养的肾小管上皮细胞中直接观察到GFP的表达，提示病毒颗粒成功转染细胞，pAAV-hrGFP-uPA能高效在肾小管细胞中表达，大约有60％～70％的肾小管细胞可感染此病毒颗粒，并整合到肾小管细胞中稳定、高效表达，Flag蛋白的表达反应了uPA蛋白表达的情况，GFP可在450-490nm的蓝光激发下发出绿光，GFP的多肽中含有丝氨酸-脱氢酪氨酸-甘氨酸的环化结构，使GFP具有强烈的荧光性，GFP作为一种基因表达的标记物优于传统的报告基因，如LacZ、CAT、luc等编码酶蛋白的基因，GFP优点在于：1)GFP基因序列短、分子质量小、融合后不影响目的基因的表达和靶蛋白生理功能，不干扰细胞的生长和功能，且对细胞无毒性作用，因而能在活细胞状态下检测基因表达；2)观察更为方便，GFP是一种能在活细胞内直接观测、无需底物和内对照的报告基因，将GFP基因转染至真核细胞中表达后，可以方便地通过观察活细胞中GFP融合蛋白的绿色荧光分布，分析未知基因表达蛋白在细胞中的分布和定位，因此GFP作为一种极具潜力的标记物为研究基因功能及表达调控提供了极大的便利。

本实验成功构建了高效转染多种宿主细胞的重组载体质粒，为今后建立AAV-μPA基因治疗的体内肾纤维化模型奠定了良好的基础，并且为无特殊标记细胞移植治疗提供了一种稳定、有效的标记方法，可以追踪该细胞在体内的分布或分化情况。