免疫组化染色

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免疫组化染色范文第1篇

【关键词】细胞学；薄层液基涂片；染色；方法

【Abstract】objective:tostudythin-layerliquid-basedcytologysmeartechniqueanditsapplicationinImmunohistochemistry.Method:theuseofcomparativesignificanceoftwogroupsofcases.Therewere74casesofadenocarcinomainpleuralfluid-basedsmear.40casesofsmallcell,resolvingphlegmandsmear.Secondgenerationusingimmunohistochemicaltwo-stepdye.Results:adenocarcinomainpleuraleffusionandascitesinathinlayerofliquidbasedsmearsadenocarcinomacellsonCEAantibody-negative,Mesothelialcellstomesothelin(mesothelin)antibody-positivesmallsmallcellundifferentiatedcarcinomacellandresolvingphlegmsmearonCHAantibody-positive.OnLCAantibody-positivelymphocytes.Conclusion:ImmunohistochemicalAntigen-antibodyreactionisahighdegreeofspecificityandsensitivityofbiochemicalreactions,toaspecificantigenrecognitionandstrong.Incells,subcellularleveldetectionAntigenmoleculeisdifficultforotherbiotechnologyandalternative.Onthecytologyhasbroadapplicationprospects.

【Keywords】Cytology;thinlayerliquidbasedsmears;dyeing;method.

【中图分类号】R156.3【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)12-0308-02

免疫组化是用特异性抗体对细胞或组织内的抗原进行定性、定位或定量检测。凡能作为抗原半抗原的物质，都可用免疫组化方法检测，近年免疫组化技术在病理组织学上广泛应用，但少见于细胞学薄层液基涂片的报道。本文总结细胞学薄层液基涂片的免疫组化染色实验，探讨免疫组化技术在细胞学上的应用。

1材料与方法

1.1材料：选用有对比意义的细胞学检材，记有腺癌性胸腹水薄层液基涂片74例，小细胞未分化癌涂片40例，试剂选用迈新公司Elivsionplus免疫组化试剂盒。

1.2方法：免疫组化二代二步染色法：1）胸腹水、痰薄层液基涂片、固定、潮干、PBS液洗涤。2）胰酶消化修复抗原，胶酶浓缩剂与稀释液按1:3滴加，37℃孵育15分钟，PBS液洗涤。3）阻断：滴加3%过氧化氢液，37℃孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS液洗涤。4）免疫反应，抗体依需要自选，滴加后37℃孵育1小时，PBS液洗涤。5增强反应，滴加增强剂，37℃孵育30分钟，PBS液洗涤.6）标记：滴加酶标抗鼠/兔聚合物，37℃孵育30分钟，PBS液洗涤。7）显色，滴加新制DAB液，镜下观察，显色适当后放入蒸馏水中终止反应。8）苏木素复染，中性树胶封固。

2结果

经反复实验总结出以上染色方法，可使阳性细胞液基涂片中的阳性细胞呈黄棕色或棕褐色。74例腺癌性胸腹水离心涂片中，变形未圆形、卵圆形，聚集成团的深染的腺癌细胞，与增生间皮细胞在镜下难以区别；通过免疫组化染色，腺癌细胞对CEA抗体显阳性，间皮细胞对mesothelin（间皮素）抗体显阴性。40例小细胞未分化癌痰涂片中，小细胞未分化癌细胞略大于淋巴细胞，圆形、卵形、短小梭形，核深染，与大淋巴细胞难以鉴别。通过免疫组化染色，小细胞未分化癌细胞对CHA抗体显阳性，淋巴细胞对LCA抗体显阴性，这样可以鉴别开来。

免疫组化染色范文第2篇

在恶性淋巴瘤的诊断与分型中,免疫组织化学染色标记作为辅助诊断的手段越来越重要,甚至已经成为不可缺少的方法之一。目前,在临床病理诊断中使用免疫组化方法主要是在石蜡包埋组织中进行。在组织固定、包埋等处理过程中很多抗原被封闭。部分抗原需要按照抗体使用指南中的方法来做抗原暴露修复,组织中的部分抗原仍然不能完全暴露,由此造成假阴性,从而影响正确诊断。笔者在临床应用免疫组化技术过程中,体会到将部分组织切片采用抗原双次修复的办法[1],让仅一次抗原修复,封闭抗原未能充分暴露的组织能够得到有效的表达。降低了假阴性和假弱阳性,提高了淋巴瘤诊断与分型的准确率。

1 资料与方法

1.1 一般资料 挑选中山大学附属第五医院病理科 2007~2009年淋巴瘤病例37例,其中最终诊断为弥漫大B细胞淋巴瘤的共有23例,套细胞淋巴瘤的共有9例,结外NK/T细胞淋巴瘤,鼻型的共有5例,性别:男20例,女17例,年龄35~72岁。将石蜡组织标本切片后分2组 A组:热修复组;B组:热修复联合胰酶修复组。

UItraSenSitire Tm S P免疫组化试剂盒(A:内源性过氧化酶阻断剂;B:动物非疫血清;C:生物素标记的二抗;D:链霉菌抗生物素蛋白 过氧化酶)。Trypsin 胰蛋白酶修复液 、PBS冲洗液pH7.4。0.01%柠檬酸中性缓冲修复液、日本产家用微波沪、DAB显色剂。鼠抗人单抗CD3、鼠抗人单抗CD45RO、鼠抗人单抗CD20、鼠抗人单抗CD79a、鼠抗人单抗CyclinD1、鼠抗人单抗CD5、鼠抗人单抗CD56。(以上试剂均购自福建迈新试剂公司)

1.2 方法 ①组织常规固定脱水石蜡包埋切片脱蜡至蒸馏水冲洗 PBS冲洗3 min×3次;

②滴加内源性过氧化酶阻断剂15 minPBS冲洗3 min×3次;

③A组:切片放入柠檬酸修复液盒中置微波沪里修复。100℃微波1~2 min、40℃微波3 min修复,取出修复盒、室温下自然冷却。PBS冲洗3 min×3次;

B组:切片在A组修复的基础上进行第二次修复:滴加0.1%胰酶修复液15 min,PBS冲洗3 min×3次;

④甩去PBS冲洗液,切片同时分别滴加血清15 min;

⑤甩去血清,滴加相应抗体,湿盒置37℃温箱中,孵育2~3 h,取出室温下PBS冲洗3 min×3次;

⑥滴加生物素标记二抗,15 min,PBS 3 min×3次;

⑦滴加链霉菌抗生物素蛋白 过氧化酶15 min,PBS冲洗3 min×3次;

⑧滴加DAB显色剂,显色(约5 min)后将切片用水冲洗、苏木素复染、脱水、透明、封片。

2 结果

光镜下观察两组中每一例淋巴瘤的肿瘤细胞胞浆及胞膜,以大于10%的肿瘤细胞胞浆或胞膜出现清晰的棕黄色颗粒为阳性标准,结果如下:

①23例弥漫性大B细胞淋巴瘤组中,CD20用A方法修复的阳性率为34.78%,B方法修复的阳性率为100%;CD79a用A方法修复的阳性率为30.43%,B方法修复的阳性率为91.30%;CD3及CD45RO为T细胞标记,肿瘤细胞不表达。

表1

CD20及CD79a在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的

阳性表达率

分组A方法B方法

CD208/23(34.78%)23/23(100%)

CD79a7/23(30.43%)21/23(91.30%)

注:P值

②9例套区淋巴瘤组中,CD5用A方法修复的阳性率为33.33%,B方法修复的阳性率为88.89%;CyclinD1用A方法修复的阳性率为22.22%,B方法修复的阳性率为88.89%;CD3及CD45RO为T细胞标记,肿瘤细胞不表达。

表2

CD5及CyclinD1在套区淋巴瘤中的阳性表达率

分组A方法B方法

CD5*3/9(33.33%)8/9(88.89%)

CyclinD1**2/9(22.22%)8/9(88.89%)

注:*p值

以上结果经统计学分析均有统计学意义,说明在B细胞淋巴瘤中弥漫性大B细胞淋巴瘤及套区淋巴瘤的诊断免疫组织化学染色中,使用双次抗原修复法修复CD20、CD79a及CD5、CyclinD1的阳性率显著高于一次抗原修复法,同时做T细胞标记,两种修复方法均不易产生假阳性。

笔者还对本科室的5例结外NK、T细胞淋巴瘤,鼻型病例进行同样比对,发现CD56用A方法修复的阳性率为60%,B方法修复的阳性率为100%;由于CD45RO在NK/T细胞淋巴瘤中的表达不稳定,所以用方法修复对比没有差异性;CD20及CD79a为B细胞标记,肿瘤细胞不表达。由于样本数小,不适宜做统计学分析,陈列在此仅供参考!

3 讨论

恶性淋巴瘤的病理诊断与鉴别诊断是临床病理诊断中最困难的领域,随着免疫学的发展,免疫组织化学技术不仅在诊断方面提供了有力的依据,而且在具体分型及指导用药方面也起着重要作用。但由于淋巴结本身的结构特点及在石蜡标本制作过程中,组织中的一些抗原容易被封闭,导致免疫标记表达不理想或阴性表达,从而混淆诊断医师的思路,延长诊断时间,甚至误诊!笔者在学习了免疫组化染色中抗原双重暴露法后[1],应用于恶性淋巴瘤的诊断。

长期临床工作中,笔者发现修复的时间与方法不到位时,组织中抗原无法完全暴露。常规应用高温微波修复,设定温度100℃修复10~15 min,组织中部分抗原能够暴露,但薄切的组织切片会破碎、脱落,影响观察诊断。经反复、设定多个修复时间段实验(15、10、5、3、1 min),发现高温100℃修复1~2 min,组织切片形态完整,此时继续再用40℃温度,保持3 min修复,组织中抗原能达到一定限度的暴露。部分淋巴瘤肿瘤标记表达较困难,我们用(温度100℃时间1~2 min;温度40℃时间3 min)在微波炉中进行热修复后,再用0.1%胰酶修复15 min。通过两次修复后,组织中抗原与抗体结合点位增多,免疫标记敏感性进一步加强,组织中抗原充分暴露。同时又没有破坏免疫标记的准确性和特异性。组织染色后,假阴性表达减少,为医生提供了准确的辅助诊断信息,确保淋巴瘤诊断与分型的准确性。

免疫组化染色范文第3篇

 

关键词： 胸腔积液;冰冻切片;免疫组化

1 资料与方法

1.1 临床资料 2006年5月—2008年12月我们共收集胸水标本64例，其中男性28例、女性36例，年龄32～82岁，平均年龄51.6岁。经组织学或结合临床资料证实腺癌12例，鳞癌8例，恶性上皮型间皮瘤4例，间皮增生40例。

1.2 方法 ①将送检的胸水直接用一次性吸管吸取下面沉淀的部分30 ml于试管内，2 500 r/min，离心10 min。将上清液去掉，离心沉淀物涂片1张、HE染色。沉淀的部分放在冰冻切片机上冷冻头上，然后加入OCT包埋剂进行切片。②胸水离心沉淀物少就直接倒去上清液，先在冰冻切片机的冷冻头上加入OCT包埋剂，然后将胸水离心沉淀物放在上面进行切片。③胸水离心沉淀物常规切片6张：1张HE染色，5张免疫组化染色。④制作免疫组化染色的冷冻切片必须冷藏保存，然后根据需要进行免疫组化染色。⑤免疫组化染色标记细胞角蛋白(cytokeratin，CK)、上皮膜抗原(EMA)、肺癌相关抗原(LCA)、间皮细胞、波形蛋白(vimentin)。免疫组化染色方法：采用即用型快捷免疫组化MaxvislonTM试剂盒，试剂及抗体和免疫组化阳性片均由福建迈新生物技术公司提供，阴性对照采用PBS作为一抗。

染色步骤：①切片室温干燥后，入4℃丙酮固定10 min，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3 min。②根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复，除细胞角蛋白用胰酶消化外，间皮细胞、vimentin、LCA、EMA都要柠檬酸高温修复(按说明操作)。 ③每张切片加1滴3%过氧化氢，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min。 ④每张切片加1滴自选1抗体，室温下孵育60 min。⑤PBS冲洗3次，每次3 min。⑥除去PBS液，每张切片加2滴新配制的DAB溶液10 min。⑦自来水洗，苏木素复染直至中性树胶封固。

1.3 统计学处理 采用χ2检验，检验水准α=0.01，P<0.01认为差异有统计学意义。所有统计均由SPSS 10.0软件完成。

2 结果

送检的64例胸水直接离心涂片HE染色诊断阳性细胞7例，阴性39例，可疑18例。应用冰冻切片技术联合免疫组化检查结果阳性细胞24例，阴性38例，可疑阳性仅2例;χ2=22.13，P<0.01，见表1。冰冻切片免疫组化标记结果见表2。表1 64例胸水单纯涂片与冰冻切片诊断结果表2 冰冻切片免疫组化标记结果

3 讨论

胸腔积液是多种胸部疾病特别是恶性肿瘤的常见伴发体征，甚至为患者首发症状。通过胸腔积液对明确病变性质及类型有重要意义，对疾病的治疗也有重要指导意义。一般的胸水病理检查仅仅行单纯离心、涂片、HE染色，光镜下观察，但由于细胞分散、染色效果不理想，又因细胞容易堆积成团，其诊断的阳性率较低，特别是小细胞肿瘤难以和间皮瘤、淋巴瘤、未分化肿瘤细胞区别。

免疫组化染色范文第4篇

【摘要】：本文对免疫组化的优点作了简要介绍，同时介绍了其在病理诊断中的应用，有支持、鉴别诊断的作用，检测激素受体与生长因子，对预后及治疗产生重要意义。文中还叙说了免疫组化的结果对肿瘤细胞增生和分期具有评价作用，并对免疫组化应该注意的事项也逐一列举。

当免疫学的理论和技术进一步成熟发展后，就产生了免疫组织化学技术，将这一方法应用在病理诊断上就称为诊断免疫组织化学。在现代医学基础和临床研究中免疫组织化学对疾病尤其是对肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机制的研究提供了强有力的手段。

（一） 免疫组化的优点

（1） 特异性强

免疫组化是利用抗原、抗体可以特异性结合，也就是“一对一”的结合的原理。

（2） 敏感性高

现在免疫组化的ABC法、SP法的问世，抗体可以稀释成千上万倍甚至上亿倍，仍可发生抗原抗体的结合。

（3） 定位精确

免疫组化的反应可在组织和细胞中进行，抗原实现了准确的定位观察，对于病理学的诊断和研究具有非常重要的意义。

（二） 免疫组织化学的应用

（1） 免疫组化对病理诊断具有支持和鉴别诊断的作用。

在病理诊断比较明确的情况下，应用组化标记可以起到支持诊断的作用。有时无法判断肿瘤来源时，组化的应用将起到极大的帮助，可以鉴别肿瘤的来源和性质。

（2） 激素受体与生长因子的检测对预后及治疗具有十分重要的意义

激素受体的检测对于乳腺癌的研究已有了较明确的结论，雌激素受体阳性的乳腺癌患者预后优于阴性表达者，同时阳性表达者对内分泌治疗效果好，患者生存期延长。

（3） 组化结果对肿瘤细胞增生的判断和评价。

反应增生程度的指标有Ki67、PCNA，其阳性表达细胞数多者，其肿瘤恶性程度高，预后不良。

（4） 免疫组化对肿瘤分期具有意义

在判断肿瘤是原位还是浸润生长方面具有重要意义，能为临床治疗提供依据。如采用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的单克隆抗体可以清楚地显示基底膜的主要成分，如果证实肿瘤突破了基底膜，那就是浸润性肿瘤而不是原位癌了，其预后是不同的。

（5） 对肿瘤的治疗具有指导作用。

很多肿瘤对化疗不敏感，由于瘤细胞内的多药耐药基因编码的酶活性增加所导致，用免疫组化的方法可以检查细胞内的这些酶或糖蛋白来研究肿瘤是否具有抗药性，比如检测P-糖蛋白、MRP、LRP、TOPOⅡa、GST、TS等。

（三） 免疫组化结果的注意事项

（1） 必须设立阳性和阴性对照

每批染色都要有已知的阳性和阴性对照，这样才能保证结果的可靠性，没有对照的阳性和阴性结果是不可信的。

（2） 非特异性染色的干扰

非特异性染色属于假阳性又称背景染色，它的存在干扰结果的判断，因此在染色过程中要减少背景着色。

（3） 抗原的联合标记

免疫组化染色范文第5篇

【摘要】近年来分子生物学技术以及其它高、新技术在病理领域得到广泛的应用，同样作为体育界的基础研究学科运动人体科学的发展已经不能满足简单的宏观的研究，越来越多的医学检验以及病理学实验技术在运动人体科学广泛应用，尤其是组织病理学技术中定位技术，例如免疫组化、原位杂交等。本文就以上三种病理学常用的定位技术的方法进行综述。

【关键词】组织病理学；技术；运动人体科学

【中图分类号】 R818.02【文献标识码】A【文章编号】1005-1074(2009)04-0045-01

1免疫组织化学实验技术

随着免疫组织化学染色技术的广泛应用，病理学研究产生了划时代的飞跃。免疫组织化学是病理学实验中常用的方法，是在蛋白质水平用各种特异性抗体检测细胞内各种抗原物质。根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术、免疫酶细胞化学技术、免疫铁蛋白技术、免疫金-银细胞化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。

1.1免疫组织化学实验步骤免疫组化技术是在组织化学的方法上结合免疫学的理论和技术发展起来的一门新技术。其原理是利用免疫学的核心――抗原体特异性结合的原理，用标记抗体追踪抗原，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等显示一定的颜色，并借助显微镜、荧光显微镜、电镜对其颜色进行观察，以达到检测抗原物的目的[1]。

1.2免疫组化技术的优点免疫组化技术的优点：①特异性强，免疫组化中抗体与组织细胞中的抗原的结合是特异的。如白细胞共同抗原（LCA）显示淋巴细胞成分。②敏感性高，而今，由于抗生物素―生物素（ABC）法和链酶素―过氧化物酶连接（SP）法的出现，使抗体的稀释度(代表敏感度)达到了上千、上万，甚至上亿倍，使免疫组化技术更加可靠。③定位准确，由于抗原抗体的结合是特异的，因而免疫组化技术可在组织和细胞内准确定位，对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，将形态与功能相结合，对疾病进行深入的研究。

2原位杂交实验技术

原位杂交是将组织化学与分子生物学技术结合来检测合定位核酸的技术。它是用一段已知序列的核苷酸片断来检测细胞内是否存在欲检测物质的DNA或RNA，是比免疫组化更加灵敏而深入一个层次的检验方法。根据所选探针和待测靶序列的不同，核酸原位杂交有DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交、RNA-RNA杂交等。

2.1原位杂交技术的应用原位杂交由于不需要从待测组织中提取核酸，可完好的保存组织、细胞的形态结构，将形态学与基因功能活动的变化相结合进行多层面的研究。主要应用：①细胞特异性mRNA转录的定位可用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究；②感染组织病毒DNA/RNA的检测和定位；③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的监测；④基因在染色体上的定位；⑤检测染色体的变化；⑥间期细胞遗传学的研究。

2.2原位杂交技术与免疫组化的比较

2.2.1两者的区别原位杂交与免疫组化染色技术相比较，这两种方法的共同之处均具有定位检测的功能，且均有较高的敏感性和特异性，所不同的是免疫组化染色是用的是抗体，其检测对象是抗原，机制是抗原-抗体的特异性结合，是蛋白质表达水平的检测；原位杂交使用的是探针，遵循碱基互补配对的原则与待测靶序列结合，是DNA或mRNA水平的检测。从实验方法来看，免疫组化染色操作相对简单，成本相对较低，受外界因素的影响相对小；原位杂交技术无论从实验设计上，还是从实际操作上均较免疫组化染色复杂，成本的高低与试剂的种类和来源密切相关。一般而言，直接选用商品化的标记探测和检测试剂盒的实验成本较高；荧光标记探针较非荧光标记探针的成本高，对样本及实验条件的要求较高，也更容易受到外界因素的影响。

2.2.2免疫组化与原位杂交双标技术双标技术是在同一张组织切片上标记两种不同的抗体或同时应用两种不同的检测手段，如免疫组化和原位杂交技术，在不同层次来检测同一细胞上某些物质的表达是否有相关性的一种实验方法。与传统的单项检测相比，双标记具有无可比拟的优越性，可以克服由于切片间各种差异而引起的时间或空间的样本误差。实验方法上先进行原位杂交会减少免疫组化过程中对待测DNA或RNA的破坏或影响，一般目前均推荐先进行原位杂交后进行免疫组化标记[2，3]。具体的操作跟单纯的免疫组化和原位杂交各自的方法一致。需要注意的问题就是：①所用的实验设备必须经DEPC水浸泡或200℃烤箱过夜，操作时须带口罩及手套；②当杂交步骤完成后，切片必须认真浸泡及长时间洗涤至少超过30min。③作免疫组化的各步骤时间均须适当延长，以增加抗原抗体间的结合，杨青春等人研究发现每个步骤均延长2～3倍时间。④免疫组化显色后不需要用苏木精复染，以免遮盖核信号。

参考文献

[1]纪小龙，施作霖.诊断免疫组织化学[M].北京：军事医学科学出版社，1997.5.

[2]许良中.实用肿瘤病理方法学[M].上海：上海医科大学出版社，1997:222-223