建兰花
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建兰花范文第1篇
关键词：建兰；ISSR―PCR；均匀设计
中图分类号：Q949.662
文献标识码：A
文章编号：1007-7847(2007)01-0058-06
建兰(Cymbidium ensifolium(Linn.)Sw.)为兰科(Drchidaceae)兰属(Cymbidium)植物，极具观赏和经济价值，兰科植物广泛分布于各种生态环境，表现有高度特异的形态、结构和生理特性，建兰也不例外，长期的自然杂交以及人工选育，品种间存在很高的遗传分化和种间类型，这为杂交育种选配亲本提供了丰富的种质资源；但同时，仅凭花色、花型、叶色、叶型、花梗等传统的形态指标来辩识品种，则存在很大难度，这不仅给品种的整理和研究带来困难，同时也影响新品种的注册登录和产权保护。
以DNA指纹图谱为指标的分子标记技术，标记的位点数远大于形态标记和生化标记，且不易受环境因素的影响，可弥补或解决形态标记和生化标记中的缺陷或难题，因此，被广泛用于植物品种的鉴定，ISSR(inter-simple sequence repeat，简单序列重复区间)是Zietkiewicz等在SSR(simplesequence repeat，简单序列重复)基础上创建的，基于PCR技术的一种新型分子标记，其基本原理是利用真核生物基因组中广泛存在的SSR来设计引物，而无需预先克隆和测序，用于ISSR-PCR扩增的引物通常为16－18个碱基序列，其主体是2－4个碱基组成的串联重复序列，然后在其5′端或3’端加上1－4个锚定碱基，引起特定位点退火，使引物与相匹配的SSR的一端结合，从而保证ISSR引物能够对SSR之间的DNA序列进行PCR扩增，ISSR分子标记操作简单，可揭示的多态性较RAPD和RFLP、SSR高，重复性较RAPD好。成本较AFLP低，目前已广泛用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、生物进化及分子生态学研究等，显示出了广阔的应用前景。
然而，ISSR分子标记是基于PCR技术的，其反应结果同样受诸多因素的影响，因此在应用IS-SR标记技术时，需针对研究的物种，对ISSR-PCR体系和扩增程序进行优化，以期获得多态性高、稳定性好的扩增结果，确保标记的可靠性，优化IS-SR-PCR体系和扩增程序，目前大多采用单因子试验法，即依经验确定一个起始条件，然后依次调整某个因素，使实验结果接近最佳，单因素试验忽略了因素间的综合效应，结果很难达到预期的最优化，均匀设计是在正交设计的基础上发展起来的一种适用于多因素多水平的试验设计方法，与正交设计对比，均匀设计只考虑试验点在试验范围内的均匀分散，而忽略了整齐对比，其特点是任何一个因素的诸个水平作相同数目的试验，因此，试验次数大大减少，本研究采用均匀设计，对影响ISSR-PCR的主要因素Mg2+、dNTP、引物以及Taq DNA聚合酶浓度等分别进行5水平和3水平两轮优化实验，获得建兰ISSR-PCR体系的优化组合，并在此基础上对ISSR-PCR扩增程序中的退火温度和反应循环次数进行比较筛选，旨在建立适合于建兰的ISSR-PCR条件，进一步为建兰的品种鉴定、种质资源保护和分子辅助育种等的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
实验所用建兰样本取自福建省龙岩市连城县朋口镇福建兰花基地，用手术剪剪取建兰嫩叶，蒸馏水冲洗干净，凉干水分，称0.2g于已灭菌的研钵中，加2mL SDS高盐提取介质和少量石英砂，迅速研磨，匀浆移至离心管，置冰盒中带回实验室，-18℃冰箱保存。
1.2 DNA提取和质量检测
建兰DNA提取和质量检测按文献[11]进行，
1.3 ISSR-PCR体系优化
参考有关DNA模板浓度对ISSR-PCR体系的影响，发现ISSR-PCR对DNA模板浓度不甚敏感，在20μL反应体系中20－60ng的模板均能有稳定而清晰的扩增，为此，本实验在20μL反应体系中，将模板DNA设为定值40ng。
针对4个影响因子：MgM2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶浓度，采用两轮均匀设计对建兰ISSR-PCR体系进行优化。
首先，对4个影响因子，各设置5水平进行考察(表1)，根据均匀设计表U20(54)安排第1轮实验(表2)。
对第1轮实验结果进行分析，初步筛选出优化组合，并以此作为第2轮均匀设计的依据，第2轮均匀设计的因素和水平见表3，选择均匀设计表U12(3sup>3)安排实验(表4)。
以提取的建兰DNA为模板，UBC836为引物，根据表2和表4分步制备总体积为20μL，内含40ng模板DNA的ISSR-PCR体系，在Biometra T型Thermoeycler仪上进行扩增，扩增程序为：94℃预变性5min；接着进行32个循环：94℃变性35s，56℃退火45s，72℃延伸90s；循环结束后，在72℃延伸10min，于4℃=保存，扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶中电泳，溴乙锭染色后，于凝胶成像仪上观察并照相记录，实验设置一个空白对照。
1.4 ISSR-PCR扩增程序优化
以第2轮均匀设计优化的反应体系为基础，对建兰ISSR-PCR扩增程序中的循环次数和退火温度进行筛选优化，循环次数设3个梯度：30、32和35次；退火温度范围为50－56℃，变化梯度为1℃。
1.5 优化的反应体系和扩增程序的验证
通过增加模板数量、更换引物以及重复实验对优化的反应体系和扩增程序进行验证。
实验所用引物，参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第9套ISSR引物序列。由上海生工生物工程有限公司合成，Mg2+，dNTP和TaqDNA
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2 结果与分析
2.1 ISSR-PCR体系的均匀优化
第1轮4因素5水平均匀设计共20个处理组合的ISSR-PCR体系的扩增结果见图1.从图1可以看出，不同因素水平组合的ISSR-PCR体系的扩增结果差异显著：组合1和9没有扩增，组合4和18有少量扩增产物，但无法辨识；组合2和15扩增带谱弥散，难以区分；组合7、8和19扩增带谱强，但有拖带现象，辨识困难；组合5、6、13、14、16、17和20扩增带谱少，其中组合5和6带谱也很弱；综合扩增带谱的数目、强弱、清晰度和可分辨率等指标，组合11是比较理想的模式，因此，初选组合11(20μL反应体系中，含Mg2+1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，引物0.5μmol/L，Taq DNA聚合酶lU，模板DNA 40ng)作为第1轮均匀设计优化的结果。
为获得理想的ISSR-PCR体系，在组合11对应的因素水平基础上，进行第2轮均匀设计筛选，图2为第2轮4因素3水平均匀设计共12个处理组合的ISSR-PCR体系的扩增结果，由图2知，12个组合中，组合3、4、8和12扩增带谱少且弱，效果差；组合1和2扩增带谱数较多，强弱较均匀且清晰可辨，是比较理想的扩增模式，相比而言，组合2较组合1，带谱强弱差异更小、明晰可辩，故确定组合2(20μL反应体系中，含Mg2+2.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，引物0.25μmol/L，Taq DNA聚合酶1.5U，模板DNA 40ng)为建兰ISSR-PCR体系的第2轮均匀设计筛选结果。
2.2 循环次数和退火温度对ISSR-PCR的影响
PCR循环次数的多寡，对扩增结果的影响十分显著，理论上，循环次数越多，扩增产物产率越高，但实际上，扩增产率会受反应体系中各反应组分用量的限制，如循环次数超过40，则酶的消耗达到一个平台，产率很难再提高，为获得理想的扩增效果，以第2轮均匀设计优化的反应体系，在原扩增程序的基础上，分别测试了30、32和35个循环(其它条件不变)对建兰ISSR-PCR扩增结果的影响，图3 A、B和C分别为30、32和35次循环的ISSR-PCR扩增结果，不难看出，随着循环次数的递增，扩增带谱由弱变强，表明随着循环次数的增加扩增产率呈较明显的递增趋势，比较而言，32次循环对建兰ISSR-PCR的扩增是适宜的。
ISSR引物对PCR退火温度极为敏感，同一引物，对不同的物种其退火温度不尽相同；同样，对同一物种，不同的引物其退火温度亦不尽相同，因此，不同引物退火温度的筛选需反复调试，本实验从100个ISSR引物(UBC公布的第9套引物)中筛选出扩增条带清晰、重复性较好的14个引物用于PCR扩增，14个ISSR引物的退火温度在52－56℃之间，其中，引物UBC807、UBC836、UBC857的退火温度为56℃；引物UBC828、UBC835、UBC841、UBC845、UBC852、UBC853的退火温度为54℃；引物UBC814、UBC815的退火温度为53℃；引物UBC808、UBC825、UBC827的退火温度为52℃，
2.3 优化的反应体系和扩增程序的验证
应用上述优化的ISSR-PCR体系和扩增程序，用筛选的14个引物，对36个建兰品种的DNA进行PCR扩增，均能获得丰富、清晰可辨的DNA带谱，图4是引物UBC828对36个建兰品种DNA的扩增结果。
3 讨论
均匀和正交设计可以解决多因素、多水平试验中，各因素、水平间的交互效应，与正交设计对比，均匀设计的最大优点是试验次数大大减少，如本研究的第1轮实验，若运用正交设计，实验处理组合数为100，是均匀设计处理组合数20的水平数(5)倍，对于水平数高的多因素试验，运用均匀设计显然可以事倍功半。
本研究应用均匀设计，只经两轮实验，就获得了建兰ISSR-PCR体系的优化组合，但由于实验结果的评判指标是定性的，无法用数学方法进行定量分析，因此实验结果未必是最佳，进一步的改进，可以从以下几方面着手：1)将扩增产物量化，量化后可用线性回归等数学方法对结果进行计算分析，从中求得最佳；2)增加试验重复次数，重复次数增大，可供选优的几率增加，但工作量也将成倍增加；3)缩小各因素水平问的差值，水平间的差值减小，结果的评判指标差异缩小，对优选有益，但上作量随之增加，结果评判的人为影响亦增大。
由于ISSR引物较长(16－18个碱基序列)，以及5′端或3′端1－4个锚定碱基与互补的SSR序列的耙定作用，要求退火温度较RAPD高，另外，不同ISSR引物对退火温度的要求不一，因此，对IS－SR-PCR扩增程序中的退火温度，应针对不同引物进行筛选，以期获得稳定、可靠的标记结果。
建兰花范文第2篇
1、墨兰的花期一般在每年的10月到次年的3月，也就是冬春季节，香味中等，在上午10点，晚上7点左右的时候是最佳的观赏时间。
2、当然墨兰也有秋季开花品种，如秋榜，秋香。有冬末春初开花的，如大明系兰花，墨兰什么时候开花和温度关系很大，温度高开得早，温度低开得迟。
3、墨兰要一年多开一次花，至于多多少没有严格的数字。不过随着温度的变化，花期也会略有不同。墨兰在南方地区，可以在春节前后开花，而在浙江地区花期与春兰相似。
（来源：文章屋网 ）
建兰花范文第3篇
车子停在村口，才发现酝酿了大半天的雨云早已按捺不住，纷纷扬扬地下起了小雨。过了棋盘村，迎面是江南水乡特有的穿村而过的半河半街。然而，上庄的河街又与别处不同，河与街都不窄，且直溜平顺，行人往来自感舒畅。但此时却无人走动，霏霏细雨中，街面更觉得宽绰而清冷了。清冷的雨水落在河里、屋瓦间、马头墙上，也悉悉索索地敲在伞面上，雨滴滑落下来，不断在脚前碎成雨花。低着头，执伞缓行，脑中浮现的是先生谦和儒雅的笑容。
先生，是我幼时最喜欢的一位乡贤。当时所有的印象，仅仅来自于先生那首脍炙人口的《兰花草》、书本上先生谦和儒雅的肖像照，以及32个博士头衔的大名号。老实说，念大学之前读先生的作品很少，一是那时手头的书籍不多，二是先生的作品大多是学术著作，也啃不动。后来读先生的《四十自述》，看到先生记述自己少时体弱，不曾养成活泼游戏的习惯，无论在什么地方，总是文绉绉的，家乡老辈都说他“像个先生样子”。我马上想起自己少时的相似遭际，心里不免又亲近了几分，之后才开始逐渐阅读先生的著述。每读一部，便对先生的敬意增添一分。
跟着向导，在白墙灰瓦、绿苔映墙的细雨曲巷中穿行，不觉间就到了故居门前。尽管来前就有朋友劝告过“故居没什么好看的”，心里也早有了准备，但初见还是陡然一惊――因为眼前的这个小院落太不起眼了。只有门额上一块写着“兰惠书屋”的木匾，才使人觉得此处的住家是通些文墨的。除此之外，它被放在徽州任何一个旧村落里，也是太寻常不过的一处屋舍。若不见门首检票处的牌子，谁会想到这是大名鼎鼎的先生的故居呢？
迈步入内，是一个空旷简净的院子，地面由整齐简朴的小方石铺就，不事雕琢，却干净清爽。院内只有一尊先生的塑像；左边是两间十平方米的狭小展厅，陈列不多；右边是旧居的正房，砖雕门楼，石砌门框，门侧悬挂着沙孟海先生手书的“故居”竖牌。穿过一个浅浅的天井即到了前厅堂，除了先生的画照，这里与古徽州普通住家的陈列并无殊异。
故居几处陈列对我的吸引倒不大，其简而净，倒颇使我深思、感慨。据说，先生的父亲铁花先生就对建筑装饰提出过“略事雕刻，以存其朴素”的要求。这种看法非常符合中国传统文化崇尚天然淳朴、宁静淡雅的审美情趣。庄子说“朴素而天下莫能与之争美”，这与德国现代主义设计大师密斯・凡德罗“少即是多”的简约主义有着很多相合之处。我心里微微一颤：先生的旧居简而净，不是恰如其分吗？何必一定要屋宇恢宏、陈列繁复呢？何必客若潮涌、访者如云呢？
我避过讲解员和同伴，独自在旧居穿行，来到一间陈列着先生半身塑像的厢房。望着先生那张谦和儒雅的笑脸，倏尔想起那首《兰花草》的歌来，“我从山中来，带着兰花草，种在小园中，希望花开早。一日看三回，看的花过时，兰花却依然，苞也无一个⋯⋯”，伫立良久。
很多时候，我们对一位名人的怀念，往往并非出于一种本心的敬意，或者常常让我们的拜访变了味。寻访先贤，每每变成“猎奇”或者“猎艳”――探寻陈列品中的奇特，搜闻并津津乐道于名人的婚恋逸事。有位朋友说，“去故居的路上有座曹佩声墓和一棵开花的树”。这种追缠于名人婚恋的想法是我所厌恶的。然而，我就敢说自己跳出了这个俗浅的“圈子”？譬如，我乍到时对简净的故居遗憾的情绪是高明的么？
先生著作等身，学问自不必说。其待人谦和、隐忍勤勉、乐于助人的品格亦令人肃然起敬。李敖先生从台湾大学毕业后，以孤傲反叛、爱“骂人”的青年思想者姿态崛起于台湾，从而也树敌不少。然而，在他经济窘迫、孤立无援时，先生本着爱才之心资助李敖千元救急。锦上添花者，人人愿做；雪中送炭者，往往缺席。李敖对胡先生此举一直感恩在心，后来不断提及；胡先生生前却只字未提，视如平常。“简净”，不就是先生一生道德品行的写照吗？
建兰花范文第4篇
1、米兰喜欢温暖的气候，所以一般温室养，夏季可以放在外面，但是要注意遮阴。一般温度保证在25摄氏度左右，夏季最热的时候适当浇水降温。冬季不能低于10摄氏度，不然会冻伤。
2、米兰喜欢湿润，所以需要适时浇水，特别是生长期，不过不能发生水涝。一般一天2次浇水即可，而且夏天的时候需要对叶子进行适当的洒水。
3、在开花后需要及时的施加一点肥料，不能过多。
修剪方法:
建兰花范文第5篇
大海摇曳起秋的航帆，看金色的桅杆，行驶在茫茫人海上。年轻的舵手，执着，冷静，沉稳地把舵着自己的小船，朝着太阳升起的方向驶去。船帆在微风中展露笑脸，上面写着八个字——珍惜友谊，真爱永恒！
远方，海与天的尽头，太阳正一步一步地升起，金灿灿的阳光一点点将海水忧郁的蓝色吞没……
是他，那张稚气又童真的笑脸，洋溢着所有的欢乐，散发着太阳的光芒！有他的陪伴，从此我不再孤单。晨光中，他对着我微笑，他的赞许，让我感觉到这个世界是爱我的。我转过身，悄悄拭去蓝色的泪水，然后闭上双眼，嘴角露出一丝感激的微笑。
我是一只小小的蓝色蛹，用生命的丝线织茧而栖，沉沉而睡。生命被无尽期的黑暗覆盖，沉埋于寂静之中。梦中，我在哭泣……
后来我认识了他，因为他，我爱上了世界！
黑色的潮水向我涌来，但我挺住了。在万籁的黑暗中，我咬破茧子，羽化成蝶。转过头，我惊奇的看到了一双金色的翅膀，原来我在一步一步的接近爱！
我用重生来拒绝死亡，我穿越了生死的界限，让生命得以绚烂！因为他，我心头的生命之弦穿越虚与实的空间。我一直在等他。千年之前，我织丝成茧，我一直在沉睡，做着一个蝶梦——我相信总有一天，我会破茧成蝶，我会见到他那如夏花般绚烂的笑容！
千年的等待，千年的期盼，千年的孤独，千年的悲伤……是何其漫长！
我终于等到了他，我真正称得上朋友的朋友！
用爱的眼睛看世界，一切都是那么美丽！
金色的蝴蝶飞舞在三叶草之间，无意中，他发现了四叶花，他寻找到了第四片叶子的幸福——友谊的可贵。
天空中无翼的落落飞翔，带走了所有的不快，留下了一段亘古不变的美丽传说——真爱永恒。
因为他，我的世界从此五彩缤纷，黑夜里，他用自己太阳般的心照耀着我，那温暖，让我的内心不再孤寒。
他是我的柏拉图，他出自本能的真诚，清明，淳朴，透明，真诚，和谐，让我禁锢的心释放，成为一种坚贞的盘古不变的友谊的永恒！
爱在山花烂漫时，情在海枯石烂中！
