液相色谱

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液相色谱范文第1篇

1仪器与材料

美国waters2695高效液相色谱仪，VWD检测器；鬼针草采自云南红河州、广西，经刘圆副教授和戴斌教授鉴定为菊科鬼针草属植物狼杷草BidenstriparticaLinn.，白花鬼针草BidenspilosaL.var.ratiataSch-Bip.，婆婆针BidensbipinataLinn.，三叶鬼针草BidenspilosaLinn.的干燥全草；槲皮素（批号081-9304，中国药品生物制品检定所，含量测定用）；甲醇为色谱纯；水为二次重蒸水；其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件KrosmasilC18柱（4.6mm×250mm，5μm），柱温30℃，流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液（41∶59），检测波长360nm，流速1ml·min-1。槲皮素峰可以达到基线分离，峰形对称，分离度好，按照槲皮素峰计，理论塔板数不应低于5000。见图1～8。

图1槲皮素对照品色谱图（略）

图2三叶鬼针草（云南产）根色谱图（略）

图3三叶鬼针草（云南产）茎色谱图（略）

图4三叶鬼针草（云南产）叶色谱图（略）

图5狼杷草色谱图（略）

图6白花鬼针草色谱图（略）

图7婆婆针色谱图（略）

图8三叶鬼针草色谱图（略）

2.2供试品溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇配置成0.04mg·ml-1的溶液。

2.2.2样品溶液的制备称取鬼针草药材粉末（过40目筛）约1.0g，精密称定，置圆底烧瓶中加入甲醇-25﹪盐酸溶液（4∶1）25ml，称定重量，加热回流1h，取出，冷却至室温，用上述混合溶液补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45μm的微孔滤膜，作为样品溶液。

2.3线性关系的考察分别精密量取上述对照品溶液0.5，2，4，8，20μl，在上述色谱条件下测定峰面积。以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=3×106X-33404，R2=0.9999(n=5)。结果表明槲皮素在0.02～0.80μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。

2.4精密度实验精密吸取对照品溶（0.04mg·ml-1）10μl，重复进样6次，测得峰面积的RSD为0.97%（n=6）。结果表明精密度良好。

2.5稳定性实验精密量取样品溶液10μl，分别于0，2，4，6，8h测定。按照槲皮素对照品峰面积计算RSD为0.6%（n=6）。结果表明样品溶液在配制后8h内稳定。

2.6重复性实验取同一批样品溶液，精密称取6份，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定槲皮素的含量，RSD为1.6%（n=6），表明重复性良好。

2.7回收率实验精密称取9份已知含槲皮素量的药材粉末0.25g，依次加入低、中、高3种质量浓度槲皮素对照品溶液，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定。结果平均回收率为99.87%，RSD为0.9%（n=9）。

2.8样品含量测定按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按照“2.1”项下方法测定，不同部位测定结果见表1，不同种测定结果见表2。

表1三叶鬼针草不同部位中槲皮素的含量（略）

表2鬼针草属不同种中槲皮素的含量（略）

3讨论

液相色谱范文第2篇

液相色谱其主要优势体现在其能够将复杂混合物进行良好的分离，其分离纯度高，在各个学术领域都得到了广泛的使用。但是这种方式最大的缺点是不能对分离化合物的结构信息进行及时分析，需要在分离后提取化合物的样本再对其进行鉴定，才能对比未知化合物的性质。

质谱技术能够对化合物的结构信息进行高度分析，并且需要的化合物的样本较少，尤其适合用于分析化合物的化学结构以及成分。但是质谱技术需要获得较为纯净的化合物样本。

根据两种方式的使用性质，相关研究人员试图将这两种检测方式进行串联使用，采用取长补短的方式将两种方式的优点更好的发挥出来，弥补缺点。通过这种想法，液相色谱与质谱技术联用技术就此诞生。在这项技术中，将液相色谱作为将化合物进行分离的工具，而质谱检测成为了主要的检测手段。液相色谱与质谱联用接口将色谱与质谱进行连接，利用液相色谱的高度分离能力以及质谱的高灵敏度与选择性，对混合化合物进行分离、检测。这种检测方式已经成为了现代科学检测中一项重要的检测方式。

由于液相色谱与质谱有鉴定、分离的有特点。随着近年来科技的不断发展，这项技术已经在食品安全分析检测中发挥着巨大的作用。国内外也出现了大量关于HPLC-MS对食品中有害成分的安全监测报道。就目前来说，我国也进行了串联四级杆液质联用对粮食种8种真菌毒素进行测定、三重串联四级杆液质混合监测糖果、牛奶中三聚氰胺含量等研究，都取得了良好的研究结果。

试验研究

本文采用液相色谱与质谱联合检测方式对核桃油中19种游离氨基酸进行检测，现报道如下。

氨基酸标准品。19种纯氨基酸为： 纯氨基酸标准品：甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）、脯氨酸（Pro）、撷氨酸（Val）、苏氨酸（Thr）、半肤氨酸（Cys）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、天冬酞胺（Asn）、天冬氨酸（Asp）、赖氨酸（Lys）、谷氨酸（Glu）、蛋氨酸（Met）、组氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）、精氨酸（Arg） ，酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）。

样品处理。取核桃油样品1ml，加入10ml甲醇与水体积比例1：9溶液，提取核桃油样本中的氨基酸。将溶液进行搅拌5min，保证溶液混合均匀后静置15min等待提取，采用12000rpm离心转速进行离心，温度控制在5°C，时间应控制在15min。待离心完成后，采用氮气进行吹干，并采用2mL0.1%乙酸与甲醇体积比1：1溶液进行复溶，采用0.22μm的滤膜进行过滤测量。

结果。在上述条件中，采用色谱与质谱优化，将19种氨基酸进行提取，绘制其标准曲线，具体结果如表2。结果表明，在线性范围0.1―2.5μg/mL以内。R>0.99，从而可以检测出限为0.001-0.05μg/mL。

讨论。在此次研究中，采用了高效液相色谱与质谱进行联用的检测技术，对核桃油中19N游离氨基酸含量进行了检测。并对其中直接采用了体积比为19：1的0.1%甲酸以及乙氰作为流动相，对其进行C8柱反向液相色谱分离，并采用电喷雾对其中的离子源进行离子化处理，从而使其能够进行三重四级质谱测定，从而提高检测效果。在这项测量研究中，测量线性范围为0.1-2.5μg/mL，R>0.99，其中检出限为0.001-0.05μg/mL。这种检测方式能够更加简便的对氨基酸进行检验和测量，对试验结果的影响较小。

总结

食品是人们进行生命活动的物质基础，而食品安全对于人们的身体健康来说也是至关重要的。现代社会中，食品安全问题也频频发生，人们对食品的安全以及营养健康的要求也越来越严格。所以，采用高水平的检测技术作为食品安全的保障支柱是现代科学研究中一项不可或缺的工作。就目前来说，食品类型以及混合物也愈加复杂化，对食品中的多含量进行同时分离和检测，对类似物进行区分与检测也是食品成分分离检测中的一项重点研究内容，也是食品检测工作的难点所在。

液相色谱范文第3篇

[关键词]高效液相色谱法、色谱柱、检测器、矫正

中图分类号：O657.7+2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）11-0365-01

高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、重现性好、准确度和灵敏度高等优点，其应用范围之广，是其它分析仪器所不能比拟的。随着仪器的普及和蒸发光散射检测器、质谱检测器的商品化，本法已成为生药含量测定的首选和主流方法。

1.对仪器的一般要求

（1） 色谱柱 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。

填充剂的性能以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在15nm以下的填充剂适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填充剂。

以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH2～8的流动相。当pH大于8时，载体硅胶会被溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用 pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。这些特殊的色谱柱已有商品供应。

（2） 检测器最常用的检测器为紫外检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检测器、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关。示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关。二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱测定和色谱峰的纯度检查。

紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液的浓度通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。

不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应至少符合紫外 - 可见分光光度法对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。

（3） 流动相 可采用固定比例（等度洗脱）或按规定程序改变比例（梯度洗脱）的溶剂组成作为流动相系统。由于C-18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。

2.系统适用性试验

色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。

通常用规定的对照品对色谱系统进行系统适用性试验。

（1） 色谱柱的理论板数（n）在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位） 和半高峰宽（Wh/2），按n=5.54（tR/W h/2）2计算色谱柱的理论板数。

（2） 分离度 （R） 无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。

（3） 重复性取对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%。

（4） 拖尾因子（T）为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合相关规定。

3.测定法

（1） 内标法加校正因子测定供试品中某个成分含量精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照品溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：

校正因子（f）=式（3-8）

式中As为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；CS为内标物质溶液的浓度；CR为对照品溶液的浓度。

再取含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：

含量（Cx）=f×式（3-9）

式中Ax为供试品峰面积或峰高；Cx为供试品溶液的的浓度；A′s为内标物质的峰面积或峰高；C′s为内标物质的浓度。f为校正因子。

当配制校正因子测定用的对照品溶液和含有内标物质的供试品溶液，使用等量同一浓度的内标物质溶液时，Cs=C′s，则配制内标物质溶液不必精密称 （量）取。

（2）外标法测定供试品中某个成分含量 精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图。

由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某成分含量时，以定量环或自动进样器进样为好。

（3）面积归一化法 是测量色谱图上某色谱峰和除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算某色谱峰占总面积的百分率。该法通常用于对照品纯度的检查。

参考文献

液相色谱范文第4篇

【摘要】

目的： 建立夏枯草的指纹图谱分析方法，并对不同产地的夏枯草进行指纹图谱的比较研究。方法：以齐墩果酸为参照，采用高效液相色谱法，色谱柱为Hypersil C18，流动相为甲醇：水：醋酸（86：14：0.1），检测波长为208nm，流速为1ml/min。结果： 标出10个主要共有峰，方法学考察表明，本研究建立的分析方法有较好的重现性，比较了不同产地夏枯草药材与标准药材指纹图谱的相似性。结论： 方法稳定、可靠、简便，为提高夏枯草药材质量控制提供依据。

【关键词】 夏枯草； 高效液相色谱； 指纹图谱

夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，我国各地均产，主产于江苏、浙江、安徽、河南等地［1］。夏枯草临床应用广泛，药典中载有“清火、明目、散结、消肿”［2］之功效，现代研究表明夏枯草还具有降血脂，降血糖，免疫抑制以及抗肿瘤等作用［3］。目前，市场上夏枯草产地多，质量不一，缺乏统一质量检测标准，通常采用测定其中一、两种化合物含量的方法来进行质量评价，不足以全面反映药材的整体质量。本研究利用高效液相色谱法对夏枯草进行了指纹图谱的研究，结果表明，本方法稳定、可靠、重现性好，可为夏枯草药材质量控制提供有效的参考依据。

1 仪器与试药

日立高效液相色谱仪，DAD检测器，EZChrom Elite色谱工作站；KQ100A型超声波清洗器；电子天平。

夏枯草对照药材及齐墩果酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。夏枯草药材分别购自各地药材市场和药店，经鉴定为夏枯草药材的干燥果穗。

甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil C18，4.6*250mm，10μm；流动相：甲醇：水：醋酸（86：14：0.1）；检测波长为208nm；流速为1ml/min。

2.2 供试品溶液的制备

将夏枯草药材择去杂质，60℃恒温干燥，粉碎机粉碎，粉末过40目筛，反复进行，直至药材粉碎全部过筛为止。精密称定夏枯草药材粉末约1g，加入90%甲醇20ml，超声30min，过滤，洗涤，合并滤液和洗液，挥干溶剂，残渣加流动相溶解定容至10.00ml，溶液用微孔滤膜过滤，得夏枯草液，10μl进样。

2.3 流动相的选择

试验过程中，系统比较了不同配比的甲醇水（80：20；84：16；86：14；88：12）和乙腈水（80：20；85：15；90：10）及添加剂的用量。结果表明，以甲醇：水：醋酸（86：14：0.1）为流动相系统效果较佳。

2.4 检测波长的选择

试验采用DAD检测器，在波长190～400nm范围内进行夏枯草样品的吸收情况考察。通过比较各不同保留时间的峰的紫外吸收光谱，得知多数峰的最大吸收在203～210nm范围，少数在230nm附近，综合比较各波长处的色谱图，最终确定208nm作为检测波长。

2.5 参比峰的选择

为消除测定结果的系统误差，选取与其它组份分离较好、峰形对称、保留时间24.617min的色谱峰作为参比峰（经与标准品色谱图谱及紫外吸收图谱对照，得知此组份为齐墩果酸），以便计算夏枯草药材共同特征组份的相对保留时间和相对含量［4］。

夏枯草标准药材的色谱图及齐墩果酸标准品色谱图见图1和图2。

2.6 方法学验证

2.6.1 精密度试验 同一夏枯草样品液，在相同条件下，重复进样5次，得到色谱图，计算保留时间和峰面积的RSD%。结果见表1。

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2.6.2 重现性试验 同一夏枯草样品在相同条件下平行提取5份，分别进样，得到色谱图，计算保留时间和峰面积的RSD%。结果见表2。

2.6.3 稳定性试验 同一夏枯草样品液分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h进样，计算所得色谱图中各相对应的保留时间和峰面积的RSD%。结果见表3。

图1 夏枯草标准药材色谱图（略）

图2 齐墩果酸标准品色谱图（略）

表1 精密度试验（略）

表2 重现性试验（略）

表3 稳定性试验（略）

2.7 夏枯草HPLC指纹图谱的建立

按供试品的制备和检测方法，对31份夏枯草药材分别测定色谱图。比较各夏枯草药材的色谱图，结合各组份峰的紫外吸收特征，确定相同组份峰，计算各组份相对保留时间及相对峰面积。

αi=ti / ts ，α为相对保留时间，ts为内参峰保留时间，ti为其它组分保留时间。

Ar=Ai×100/∑A ，Ar为相对面积值，Ai为各组分面积值，ΣA为总峰面积。

选取10个主要共有峰为特征峰，其面积和占到总面积的99%以上，建立夏枯草样品药材的HPLC相对保留值指纹图谱。结果见表4，其中αi为31种样品谱图中相同组份的相对保留时间值的平均值。

2.8 夏枯草HPLC指纹图谱相似度的计算

以10批夏枯草对照药材的HPLC图谱为标准，用计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件计算31个夏枯草样品药材的HPLC图谱与对照药材的相似度。结果见表5。

表4 夏枯草样品药材的HPLC相对保留值指纹图谱（略）

表5 样品相似度计算结果（略）

3 讨论

对夏枯草的高效液相色谱条件进行了考察，包括流动相的组成、配比等，并依据不同保留时间峰的紫外吸收特征确定检测波长。确定色谱条件为：流动相为甲醇水醋酸（86：14：0.1）；流速为1ml/min；进样量为10μl；检测波长为208nm。在此色谱条件下，基线稳定，各峰得到了较好的分离，峰形、保留时间等也较好。

对中药夏枯草的HPLC指纹图谱进行了系统的研究，建立了31种夏枯草样品药材的HPLC相对保留值指纹图谱，并进行了夏枯草样品药材与标准药材相似度的研究。为夏枯草药材的质量控制提供了依据，为建立规范化的夏枯草种植基地提供了有效的质量控制手段。

【参考文献】

1 郑汉臣，蔡少青．药用植物学与生药学.北京：人民卫生出版社，2004，389．

2 国家药典委员会，中华人民共和国药典（一部）.北京：化学工业出版社，2005，197～198．

液相色谱范文第5篇

材料与方法

仪器。戴安3000；旋涡混合器；离心机。

试剂。甲基氰（色谱纯）；乙酸铵（分析纯）；NaCl（分析纯）；脱氢乙酸（99.9%）。

测定方法。①色谱条件：流动相为15：85的甲基氰（0.02mol/ml）、乙酸铵溶液；流速为1.0 mL/min；进样量为10μL；柱温为35℃。②实验方法：实验样品为市售不同品牌的果汁、酱菜、糕点，分别做如下处理。果汁：准确称量5.00g于50mL离心管中；酱菜、糕点：预先均匀，称取2～3g于50mL离心管中，加入饱和NaCl溶液5mL，1：1的盐酸溶液1mL，在旋涡混合器中混合处理1min，精确添加甲基氰10 mL，再次混合处理3min，然后以3000转/min的速度离心处理15min，取上清液，用0.45μm规格的过滤器进行过滤，待用。③色谱分析：根据上述色谱条件，利用外标法分析样液，保留时间定性，根据峰面积定量，计算脱氢乙酸含量（mg/mL）。

结果与讨论

检测波长的确定。由扫描结果得知，脱氢乙酸在230nm处出现强吸收，但基体干扰较多；在297nm处出现次强吸收，基体干扰较少，因此，选择297nm作为检测波长。

流动相的选择。以甲基氰+水作为流动相时，色谱峰出现拖尾，以0.02mol/L的乙酸铵替代水时，峰形明显改善。甲基氰的比例对出峰时间和响应有一定影响，比例较低时，保留时间长，响应也比较低，反之则出峰时间短，响应较高。经多次试验得出，当甲基氰与乙酸铵（0.02mol/L）的比例为15：85时，可以取得较好的效果。

提取液的选择。脱氢乙酸对水难溶，但脱氢乙酸钠易溶，通常利用水、NaOH溶液、NaCO3溶液等作为提取液，但提取后需要先净化后才能使用。本文研究中，以甲基氰作为提取液，原因是脱氢乙酸可以溶于甲基氰，且甲基氰的水溶性有助于将酸性样液中的脱氢乙酸彻底溶解，而且甲基氰能够沉淀蛋白质，与脂肪不溶，通过离心即可获得纯度较高的提取液。

色谱分离。在上述色谱条件下，脱氢乙酸的保留时间为5.775min，峰形和组分的分离情况比较好，色谱图如下：

标准曲线。将70%的甲基氰水溶液作为溶剂，制作不同浓度的脱氢乙酸标准液，得到若干测定结果（见表1）。利用峰面积对脱氢乙酸的浓度做回归方程分析，得Y=2.39X×108-1.33×105，R=0.9997，线性结果良好。然后，对各浓度标准液连续进样5次，所得峰面积及保留时间的相对标准偏差依次为0.35%和0.24，表明此测定方法具有较高的定性及定量准确度。

回收率及精密度试验。取未添加脱氢乙酸的腐乳样品3份，每份3g，分别加入0.1mg、0.2mg、0.4mg、0.6mg、1.0mg脱氢乙酸标准液，利用1.3所述方法及步骤进行处理，最终测定结果显示，加标回收率为96.1～99.5%，平均回收率为98.5%。

取含有脱氢计算的腐乳样品1份，以同样的方法和步骤测定6次，得到下列测定值：0.192、0.195、0.194、0.198、0.195、0.193g/kg，相对标准偏差为1.08%。