杨万里的诗

前言：想要写出一篇令人眼前一亮的文章吗？我们特意为您整理了5篇杨万里的诗范文，相信会为您的写作带来帮助，发现更多的写作思路和灵感。

杨万里的诗范文第1篇

原诗：坐看深来尺许强，偏於薄暮发寒光。半空舞倦居然嬾，一点风来特地忙。

落尽琼花天不惜，封它梅蕊玉无香。倩谁细橪成汤饼，换却人间烟火肠。

译文：坐看落雪，其深已一尺有余，更在这黄昏时分发散着缕缕寒光。雪花在半空中舞到疲倦，显得轻柔无力，然而些许微风吹过，又翩然起舞。上天浑然不怜惜，让琼花似的雪落尽，将梅蕊、海棠的封存在冰雪之下，花香杳无。有谁能将这高洁的雪做成汤和饼，来涤荡人们满是人间烟火的肠胃。

（来源：文章屋网 ）

杨万里的诗范文第2篇

在此对其赔偿金额之三次变数暂且不提，单说说这5万元的奖励吧。

既是奖励，自然有奖励的理由。在管理心理学中，奖励是对人的某种行为给予肯定与表扬，使人保持这种行为。那么，参照铁路系统对于罹难者的奖励，大抵可以归纳为对罹难者家属的某种行为给予肯定与表扬了。然而，这似乎并不符合逻辑。罹难者家属的什么行为引发了铁路系统的肯定继而表扬呢？且肯定与表扬之下，让惜金如命的铁路系统不惜以5万元的“重金”进行奖励呢？

罹难家属帮忙救人了？并不是。罹难者帮铁路系统发现了安全隐患，继而奖励其家属？说不通。那么，可能存在的原因便是：家属提前签订赔偿协议，使得铁路系统在此次事故中应该承担的责任变小了，其在事故中的错误造成的整个系统的压力变小了，总而言之，铁路系统在事故中最重要的麻烦变少了，这就需要奖励。

当然“奖”远远不够，尚需要“励”！不仅此次不要惹太多麻烦，下次、下下次，以后更多次，（我当然希望这是最后一次，但是，您信吗？）不要再发生此类事故之后给当事单位惹麻烦，这就是奖励机制，通过这种奖励来减少压力、解脱自己。这不能不说是利用人最宝贵的生命来换取“平安符”的丑恶做法，表面是增加了赔偿，实则是轻视生命、不尊重生命的表现。其用心之险恶，“奖励”二字可见一斑！

奖励这个词，自然不是铁路系统随口说出来的，既然已经知道其奖励背后的卑劣目的，自然就知道了其选用这个词的时候是怎样的心领神会：“这是怎样的一个词啊。感谢仓颉先生，造出了这样两个字，太贴切了！”这个目的的存在，实在让他们想不到还有哪个词比“奖励”更能真切地体现他们的处境，以及急于摆脱这种不利处境的迫切心情。

杨万里的诗范文第3篇

关键词：工商管理专业；人才培养模式；监控体系；实践基地

中图分类号：G642 文献标志码：A 文章编号：1002-2589（2016）03-0192-02

随着我国高等教育规模不断扩大，高校学生毛入学率的不断提高，生源质量也不同于精英教育阶段，高等教育已经进入了大众化教育阶段，给高校发展带来机遇的同时，提出了更严峻的挑战。《国家中长期教育改革和发展规划纲要（2010-2020年）》（以下简称《纲要》）[1]中明确指出：“提高质量是教育改革发展的核心任务，树立以提高质量为核心的教育发展观，注重教育内涵发展，鼓励学校办出特色、办出水平，出名师，育英才。”因此，在实际教学过程中，如何实现分类分层教学，如何提高人才培养质量，形成具有本校特色的人才培养模式，是摆在工商管理专业教师面前的一项艰巨任务。

一、工商管理专业人才培养模式的现状

（一）实行弹性学分制

这种人才培养模式主要是针对课程设置而进行的改革，学生可以在八年时间里修完专业要求的所有课程而毕业[2]。这种模式在一定程度上缓解了过去课程设置的弊端，增强了学生选课的自主性，学生可以根据自己的实际情况和兴趣爱好自主选择课程。但是，有很多学生为了尽量早毕业，用大学三年的时间把大学四年要修的课程都修完，这就造成了学生一周之内需要上大量的课程，影响了学生对于知识的消化和吸收，同时也影响了学生的全面发展。

（二）分类分层人才培养模式

这种人才培养模式主要针对学生对专业知识的学习而言[3]。学生进入专业课学习阶段后，学校可以根据学生的自身特点和兴趣，实行分类、分层教学，设置不同的专业课程模块供学生来选修，也可以把专业方向细化为不同的模块，比如人力资源管理、物流管理、生产与运作管理、创业管理等，学生可以根据自己的喜好、优势等情况选择相关模块的课程，通过学习，使学生在某一方面具有较深厚的造诣。

（三）“3+1”人才培养模式

这种人才培养模式是近年来比较盛行的模式[4]，即要求学生在大学前三年主要从事专业学习，在大学的最后一年从事社会实践。这种模式的优点就是能够使学生有足够的时间从事社会实践，但是学生要用三年时间将四年的课程学完，一定程度上增加了学生的学习压力，而且如果学校没有校外实践基地，让学生自己从事社会实践，就必然会导致学生盲目地到企业打工挣钱，从而与专业培养目标相悖。

（四）“3.5+0.5”人才培养模式

这种人才培养模式也受很多高校所推崇，即要求学生用三年半的时间学完大学所有课程，最后半年通过社会实践来撰写毕业论文。这种人才培养模式既能够让学生有足够的时间从事专业知识的学习，又能够抽出一定的时间让学生从事社会实践。但是如果专业课程设置不合理也必然无法实现专业人才培养目标。

（五）“1+2.5+0.5”人才培养模式

这种人才培养模式是在高校专业大类招生情况下实施的，即按照大类专业来招收学生，在大学一年级不分具体专业，到大学二年级学生根据自己的兴趣可以任意选择大类专业下的具体专业进行学习。这种培养模式的优势就是能够让学生通过一年的学习，再根据对自身、专业、社会人才需求的认识，重新进行专业的选择和定位。

二、工商管理专业人才培养模式存在的问题

北方工业大学是一所北京市教委主管的地方院校，目前工商管理专业本科有3个班，专升本有2个班，每一届学生有170人左右。目前，工商管理专业的人才培养模式已逐步从“3.5+0.5”模式向“1+2.5+0.5”模式转化，但从人才培养的过程和培养目标来看，仍然存在一些问题。

（一）培养目标与人才培养过程脱节

学校工商管理专业培养学生的目标是把学生培养成既懂技术又懂管理的复合应用型人才。但是，在人才培养过程中，不仅学生的管理理论素养没能得到提高，学生的实践能力也没有得到锻炼。学生在选择就业单位时，往往感到无所适从，达不到用人单位的高标准、严要求，培养过程质量与培养目标严重脱节。

（二）个别专业课程设置不合理

一般情况下，在大学学习阶段，通识课、专业基础课应当尽量安排大学一、二年级，专业必修课安排在大学三、四年级。学校工商管理专业的课程设置中，部分课程设置不合理，有个别专业课程安排在了大学一、二年级，而且还呈现过度娱乐化，这势必会让学生与其他课程进行对比，从降低了对其他课程学习的积极性。

（三）校外实践基地不健全

学校校内的实践教学内容已经非常丰富，但对于校外实践基地的建设一直落后于同类院校，无法达到教学大纲规定的实践教学目标。因此建立校外实践基地对于工商管理专业学生的培养来讲显得非常重要，也是提高学生实践能力的有力保障。

三、工商管理专业人才培养模式的完善

（一）完善人才培养监控体系

通过对人才培养方案的完善修订，建立健全各类人才培养监测点的考核标准，明确培养计划中专业评价各监测点的内容、目标以及人才培养质量考核的标准和方法，具体体现学校的专业建设特色和专业评价体系的有效实施[5]。在人才培养过程中，应当建立配套的监测点和监控体系，完善工商管理专业的人才培养监控体系，如图1所示。

学校和学院可以通过制订人才培养质量标准、实施方案和相关规章制度，建立起高效优质的人才培养保障、服务和支撑体系，确保人才培养质量监控有效实施，保障人才培养方案的顺利实施。

（二）突出特色，注重质量，提高人才培养质量

工商管理专业是学校的老牌专业，从学校到学院都非常重视学科建设和人才培养模式的改革。为了提高学生的实践能力，实践教学的比重在逐步增大，但是校外实习基地的建设还一直不够健全。因此，加强校外实习基地建设对于突出人才培养特色，提高人才培养质量有着重要的意义。在现有教学实习的模式下，可以逐步与一些大型国有企业建立长期合作关系，定期派学生到企业去实习、锻炼，使学生真正把所学理论知识与企业实践结合起来，从实践中发现问题，再结合所学知识解决问题，实现理论与实践的有机结合，从而更加突出北方工业大学工商管理专业的人才培养特色。

（三）构建人才培养模块，优化人才培养方案

结合学校工商管理专业特色和社会需求，构建人才培养特色模块。在加强理论教学（通识课+基础课+专业课）的同时，注重实践教学的质量和效果，联系几家大型企业作为学生校外实践基地，在实践中构建“1+2+1”人才培养模块或“1+2+0.5+0.5”人才培养模块，加强课堂教学、实践教学、企业实践的密切联系。

1.“1+2+1”人才培养模块

在学校工商管理专业大类招生背景下，构建“1+2+1”人才培养模块势在必行。在这种人才培养模块中，校外实践基地的建设显得尤为重要。学生在大学期间除了学习专业知识，要用最后一年的时间去企业实习和锻炼，在实践中检验所学专业知识的掌握程度，发现问题，及时补救。

2.“1+2+0.5+0.5”人才培养模块

这种人才培养模块也是符合学校工商管理专业发展和社会需求的。学生在大学期间除了学历理论知识外，在最后一年中用半年时间在企业实习，再用半年的时间结合企业实践撰写毕业论文，从实现理论与实践的有机结合。

3.优化人才培养方案

结合人才培养模块，优化人才培养方案，是实现工商管理专业人才培养目标的重要途径。制订新的人才培养方案应着重从课程设置、专业实习、课程设计、校外实践等几个方面来进行改进。首先课程设置应从学生实际和学校的人才培养目标出发，科学、合理地制订学生在三个阶段的课程，在第一阶段（一年级）应着重通识课程的学习，把数学、外语、专业基础课的学习作为重中之重；在第二阶段（二、三年级）着重专业基础课和专业必修课程的学习，在第三阶段（四年级）重点放在学生的实践方面，努力提高学生的实践能力。其次，专业实习可放在每年的寒假和暑假，学校和与企业达成合作意向，组织学生进入企业调研和实践。课程设计课程的设置根据课程特点和专业培养目标而制订。校外实践基地是专业实习和毕业实践的重要保障，学校应当把建设校外实践基地作为人才培养的重中之重。

四、结语

工商管理是一门实践性非常强的学科，该专业的人才培养目标应该定位于着重培养学生的实践能力、协调沟通能力和创新能力。当前，学校工商管理专业正面临着前所未有的挑战和发展机遇，为实现人才培养目标，应坚持以市场需求为导向，以学生为中心，抓住重点，突出特色，重点培养学生的学习能力、应变能力、适应能力、人际沟通、协调和创新能力，提高学生发现、分析和解决实际问题的能力。

参考文献：

[1]顾明远.国家中长期教育改革和发展规划纲要（2010-2020年）[M].北京：北京师范大学出版社，2010.

[2]程春.论高校弹性学分体质的创新与发展[J].知识经济，2013（24）：153.

[3]梁川.基于动机激发理论的分层教学模式的实践研究[J].辽宁高职学报，2015，17（8）：40-42.

杨万里的诗范文第4篇

团聚前夕慈父走失，央视主持人心碎了

2012年8月12日，唐山一家酒楼，一场热闹非凡的婚礼正在举行。宾朋们都对新郎孙昊霖的励志故事赞叹不已。曾经，他只是唐山歌舞团一名普通员工。2006年，他进京发展，数年积累后一鸣惊人：2012年勇夺央视《星光大道》月冠军，随后进入央视军事・农业频道，担任《美丽中国乡村行》栏目主持人。女友于乐游是一家家具公司职员，两人相恋4年，感情甚笃。这一天也是父亲孙国轩最激动的一天。一对新人在台上笑靥如花，孙国轩在台下也合不拢嘴。婚后第三天，孙吴霖和于乐游要返回北京。他想让父亲和自己一起去北京生活，父亲却摇了摇头：“现在还不是时候。等你在北京买了房，有了孩子，爸就过去帮你们带孩子。”

2012年11月9日，孙昊霖刚走出央视演播大厅就接到大姐的电话：‘快，爸突发脑溢血，在医院抢救！’孙昊霖连夜赶回唐山，了解到父亲发病的经过：天气转冷，父亲准备买煤在家烧暖气过冬。本来―个电话煤厂就能将蜂窝煤送到家，但父亲为了省120块钱运费，硬是自己踩着三轮车往返5趟往家运煤。父亲运最后一趟时，突发脑梗塞。唐山人民医院里，父亲躺在病床上，陷入昏迷……孙昊霖握着父亲干枯而又冰冷的手，泪流满面。

父亲一生坎坷，因家里穷38岁才结婚，妻子曾有过一段婚姻，带着两个儿子两个女儿嫁过来。父母婚后第一年生下了孙昊霖。在他童年的记忆里，虽然家境贫困，但一家人过得平静和睦。孙昊霖10岁那年，母亲因心肌梗塞去世。其后，父亲欲再婚，但少不更事的孙吴霖坚决阻止，直到他20岁考入唐山歌舞团，父亲才重组家庭，脸上也多了笑容。不料2009年继母意外溺水身亡，父亲十分悲伤，每天早晨7点就去公园拉二胡，一边拉一边落泪。

第二天，父亲终于苏醒。老人睁开眼，第一句话竟是：“你和乐游工作那么忙，我给你们添麻烦了。”孙昊霖失声痛哭：“爸，等你病好了跟我们去北京吧！我再也不把你一个人扔下了！”

接下来短暂的几天，在孙昊霖的记忆中盈满为数不多的温馨。他教父亲唱歌，给他讲述这些年的“北漂”经历。

几天后的一个早晨，孙吴霖从医院食堂买回早餐，孙国轩突然愣愣地望着他，带着几分怯意问：“你是？”孙吴霖傻了：“爸，你怎么了？”然而父亲忽然挣扎着起身，要往外走：“这是什么地方？我怎么在这里？”孙昊霖赶紧按床头呼叫铃。主治大夫赶来一问，孙国轩又叫出了孙昊霖的名字，昨晚聊天内容也记得一清二楚。孙昊霖一头雾水。大夫解释：“这种情况属典型的小脑萎缩，是脑梗塞后遗症造成的。”孙昊霖心如刀绞，他决定尽快将父亲带到北京医治。11月20日，孙国轩病情得到控制，孙昊霖为父亲办理出院手续，将他托付给大姐照顾后，火速返回北京，着手将租住的单间换成一套两居室。11月28日下午，孙昊霖打扫好新房间，正准备动身回唐山，大姐忽然打来电话：“爸上午去超市买东西，到现在还没回来！”

孙昊霖疯狂地打电话给唐山所有的亲戚……

从央视辞职寻父，有一种孝心叫义无反顾

当晚，孙吴霖的二姐和两个哥哥也相继赶到。他们召集30多位亲友，明确分工：兄妹5人分别带领一个小组，以家为中心在周边20公里范围内搜寻。孙昊霖连夜印了500份寻人启事，在社区、公园、街道、火车站、汽车站张贴。不知不觉天就亮了，孙昊霖无力地靠在路边的栏杆上，他第一次感到人生像幻觉―样。他不停地鼓励自己，也许下一刻，父亲就会在晨曦中出现，笑吟吟地看着他……来不及合眼，孙昊霖又逐一找到父亲的老同事询问，向在公园经常听父亲拉二胡的老人打听。一位扫马路的大姐告诉他，11月28日上午，她看见孙国轩骑车往519国道方向去。孙昊霖一个激灵，立即带领几位亲友沿国道两侧的餐厅、旅店、超市寻找。每一份希望都激动人心，又都在极度盼望中逐一被现实磨灭。3天后，哥哥姐姐带领的搜索小组也失望返回唐山。几天几夜没吃饭的孙吴霖有气无力地回到家中。

报警后，孙昊霖又在唐山电视台寻人启事。等待数日，绝望将他紧紧包裹，无法喘息。在众人的劝说下，12月4日，他黯然返回北京。白天，孙昊霖要打起精神主持节目；晚上，他靠在床上暗自落泪。父亲的走失几乎摧毁了孙昊霖的生活。

2013年2月9日黎明，孙昊霖又一次被噩梦惊醒。世界安静得像梦一样，窗外正飘着雪花。孙昊霖慢慢从床上坐起来，孙昊霖披衣而起，和着泪水写了一首歌《爸爸你去哪儿了》：“老爸你去哪啦/你可知道儿子在牵挂/老爸你去哪啦/儿永远等你回家/十岁那年妈妈走了/留下我和我的老爸老爸虽没啥文化脚含辛茹苦将我养大……”歌词饱蘸泪水，一个念头也油然而生：放下一切，去寻找父亲1

2013年春节后，孙昊霖向大姐宣布：“我准备辞职找咱爸。”哥哥姐姐坚决反对：“你从北漂歌手到今天容易吗？爸不见了，我们也还得让生活越来越好啊！”然而无论他们怎么劝，也无法动摇孙昊霖的决心。正当孙吴霖犹豫着以何种方式将计划告诉妻子时，于乐游已从大姐那里得知消息。2013年3月6日，孙昊霖下班回到家，于乐游问：“大姐说的都是真的吗？”孙昊霖不吱声，于乐游一下子火了：“你还想要宝宝，到时拿什么养孩子？你不仅要对你爸负责，也得对我负责啊！”孙昊霖轻轻抱住妻子：“我们来日方长……”挣扎了两日，孙昊霖还是瞒着妻子向领导递交了辞呈。半个月后，孙昊霖的辞职报告批下来了。他不敢止诉于乐游，回家后轻轻地压在床头柜上。于乐游发现后彻底愤怒了，当即提出离婚，并搬进了单身宿舍。看着衣柜空了一边，孙吴霖才从恍惚中回过神来。

第二天一早，孙昊霖煲了一罐乌鸡汤送到妻子公司。此时，于乐游的怨气已消弭许多。孙吴霖难过地拉住她的手：“我妈走后，很多人给爸介绍对象，家里只要一来陌生女人，我就用弹弓夹石子弹人家……上高中时，我爱好音乐，做梦都渴望拥有一把吉他。爸爸抚养5个孩子，经济非常拮据。整整一个冬天，他下班后靠在雪地里拉砖头，挣了100元钱给我买了吉他，但他手上被冻裂的血口子又深又长，夹得住硬币……”孙昊霖数度哽咽落泪。于乐游的眼睛也红了，没有再挣脱他的手。

2013年5月，孙昊霖花3万元去二手车市场淘回一辆二手金杯车。他将后排座椅拆掉，加装一个折叠沙发，打开就是一张小双人床；一个塑料箱用来放衣服、被褥及生活用品。他还在车身两侧，用蓝色不干胶张贴“寻父大篷车”5个抢眼大字。5月16日，夫妇俩驾驶“导父大篷车”从北京出发，踏上悲壮的寻父征程。

“寻父大篷车”走天涯，20万里孝心找回父亲

夫妻俩设计的路线为：河北、山东、河南、山西。他们寻找的第一站，是与唐山交界的廊坊。到达廊坊，孙昊霖与于乐游分头行动：他向公安机关和社会救助站备案、求助，调取走失流浪人员的视频资料；于乐游去车站、市场、公园张贴寻人启事……夜里，两人相拥挤在车里的小沙发床上。

但让孙昊霖怎么也没有想到的是，几天后，于乐游突然感觉身体不适，到附近的社区诊所检查，竟然发现怀孕了！近1个月来，小两口饿了啃冷面包，渴了喝矿泉水，孙昊霖想到就羞愧难当。他揽住妻子单薄的双肩，眼里一下子蒙了一层泪。于乐游反而劝他：“继续找吧，你一个人在外面，我也不放心。”

寻父继续。廊坊没有发现父亲的踪迹，孙昊霖夫妇转而赶往与唐山毗邻的沧州。7月4日，孙昊霖夫妇在沧州泊头镇派出所调阅2012年12月26日的监控录像。当一个模糊的影像出现时，孙昊霖失声叫了出来。那不是父亲吗！上午9点至11点的视频中，孙昊霖隐约看到父亲沿着泊头中学往东走。夫妻俩跑出派出所，又开始疯狂寻找。遗憾的是，整整半个月，两人寻遍了沧州的每个角落，也没发现父亲的踪影。

沧州与山东交界，也许父亲已经离开河北达到山东？孙昊霖决定临时改变路线，放弃河北境内的秦皇岛、衡水等地，直奔山东。

两天后，“寻父大篷车”行驶至山东德州。一位卖西瓜的大爷告诉孙昊霖，滨德高速公路立交桥下有个拾荒老人，已在那里住两个月了。孙吴霖以最快的速度找到拾荒老人，可根本不是父亲。孙昊霖默默将200元钱放在老人身边，怅然离去……

颠沛流离中，4个月过去了。夫妻俩出门时带的3万元花得精光。未来的路，要寻父、要养子，孙昊霖不得不沿途在酒吧和夜总会唱歌。

11月上旬，夫妇俩来到山东泰安。傍晚在翻越莲花山时，车子爆胎环在了半山腰。孙昊霖拨打救援电话，因说不出准确位置，夫妇俩在车里困了大半宿。转眼大半年，寻父之旅每天都在进行却又毫无进展，经济更加窘迫。于乐游和孙昊霖商量：“昊霖，过几个月孩子就出生了，你不能完全将事业丢在―边。”孙昊霖十分惭愧。2013年12月，孙昊霖听说北京有个演出能挣5000多元钱，他就去参加。演出完毕，又第一时间赶来与妻子会合……就在如此艰难的环境中，2014年1月，孙昊霖参加央视大型娱乐节目《黄金100秒》比赛，竟一举夺得冠军。

2014年2月28日，夫妇俩到达河南新乡。孙昊霖下车去集贸市场张贴寻父启事，于乐游在驾驶室里等丈夫。中午时分，于乐游腹部忽然袭来一阵剧痛，宝宝要降生了！她挣扎着给孙昊霖打了个电话。孙昊霖赶紧驾车赶往县医院。颠簸中，于乐游感到撕心裂肺的剧痛，接着身子一空。孙吴霖回头一看，不禁两腿发软，儿子在车上出生了！1个星期后，孙昊霖将妻儿送回北京，请岳母帮忙照顾。6月，他依依不舍地告别妻儿，再次返回河南寻父。

2015年3月，孙昊霖开着他的“大篷车”，赶赴山西长治武乡县。他接到当地一个养蜂人的电话，称这里有位老人很像他父亲。3月17日，到达武乡县后，孙昊霖第―时间与养蜂人联系。他被带到一户平常的农舍前。像往常每一次心怀希望一样，他紧张地看着门被敲开，希望那一瞬间洞开奇迹。

一位老人出现了。孙昊霖忽然身体发直，失声痛哭：“爸――”终于见到了朝思暮想的父亲！然而父亲愣愣地看着孙昊霖，已经不认识他。一阵哭诉之后，孙昊霖被请进家门。原来，收留孙国轩的是一位名叫王玉庭的孤寡老人，与孙国轩同龄。第二天，孙昊霖开着他的“大篷车”，将父亲接回北京。孙昊霖的哥哥姐姐闻讯赶来，一家人喜极而泣。

杨万里的诗范文第5篇

关键词：甲烷古菌； Hungate除氧系统； 富集； 滚管分离； 纯培养

中图分类号：Q939文献标识码：A 文章编号：1006-3315（2014）04-170-003

厌氧微生物的分离是黔南民族师范学院微生物课程开放性实验项目之一。目前国内高校多数实验室对严格厌氧菌分离纯化主要采用焦性没食子酸法、厌养罐法、厌养培养箱法等[1]。焦性没食子酸法进行厌养菌分离培养,由于其方法简单，操作容易,在大专院校微生物实验教学中仍广泛使用,但操作过程厌氧条件不易控制，特别是对严格厌氧的甲烷古菌分离效果差。厌养罐法能够为厌氧菌生长提供严格厌氧的环境，但不能为整个分离纯化操作过程提供厌氧环境，使用受到限制。厌养培养箱法虽然能为厌氧菌分离培养提供严格厌氧环境，需要特制设备,在厌氧箱中操作也不方便，由于价格昂贵，因而其应用受到一定限制。为此，为了改进厌氧细菌的分离纯化方法，结合对厌氧消化器中甲烷古菌的分离与纯化开放性实验，借助Hungate除氧系统进行稀释滚管分离，收到了很好的效果，现将有关技术介绍如下。

一、材料用具

1.接种物

取自黔南民族师范学院微生物实验室厌氧发酵缸（厌氧消化器）底部的沉积物。

2.仪器用具

2.1Hungate除氧系统。Hungate除氧系统由高纯氢气、高纯氮气，铜柱，加热套，不锈钢分支管，橡皮胶管，注射器及9号针头等组成。铜柱结构直径30～50mm、长300～500mm的石英玻璃管，两端加工成漏斗状，便于连接胶管，玻璃管中装入碎铜丝（长10～20mm，直径0.5mm），压紧，铜丝下面垫上玻璃纤维以防止碎铜丝散落，上端留出50mm左右的空间。铜柱外缠绕加热带，铜柱顶端用胶管与具有分支的不锈钢通气总管连接。不锈钢总管下的各分支管用橡皮胶管连接，橡皮胶管的另一端连接1mL塑料质注射器，注射器再与9号针头连接（图1）。

图1Hungate厌氧操作系统示意图

2.2其它器具。高压灭菌锅，恒温水浴锅，恒温培养箱，荧光显微镜，厌氧管（16×160mm），厌氧瓶（100mL），光波炉，3000 mL三角瓶，各种规格的注射器（1mL、2mL、5mL）等。

二、方法

1.获取无氧N2、H2、CO2气体

甲烷菌是严格厌氧微生物，都能利用H2和CO2合成CH4，一般分离甲烷菌都用H2和CO2作为营养。其分离过程需要人工保持一个无氧环境进行操作和供其生长繁殖。用于分离严格厌氧微生物使用的气体虽然是高纯气体（99.999%），但仍然含有微量的O2，利用Hungate铜柱除氧系统可除掉这些微量的O2，提供和保持无氧环境。

2.铜柱除氧与还原

铜柱除氧原理：实验使用的高纯气体（N2、H2、CO2）中含有微量的O2，当气体经过铜柱时，这些气体中的微量O2与Cu反应生成CuO（O2＋CuCuO），从而流出铜柱的气体则为无O2气体。

铜柱还原：铜柱使用后，里边的Cu被氧化为CuO不能继续与O2发生化合反应，失去除氧能力。此时，关掉其它气体，通入H2，同时使铜柱升温（达350℃），当H2通过高温铜柱时，铜柱内CuO与H2反应（CuO＋H2Cu＋H2O）生成单质Cu，CuO在加热条件下（350℃）被H2还原为Cu，铜柱恢复除氧能力可反复使用。

操作步骤：打开Hungate铜柱除氧系统通气橡皮管的通气开关（止水夹），开启H2钢瓶，H2气流通过铜柱，从铜柱里流出的H2用橡皮管引出室外。此时接通电热套电源，铜柱升温，温度达到350℃左右，20～30min后，铜柱内的碎铜丝被H2还原，由黄黑色变为纯铜铮亮色，当铜柱里面的水蒸气被排出完全后，关闭H2钢瓶，铜柱还原结束。

3.获取无氧N2、H2和CO2气体

无氧N2用于厌氧菌分离操作和培养过程中驱赶空气，保证局部无氧环境。在铜柱还原结束后，立即打开N2钢瓶，气流大小控制以针头对准操作者手背5cm距离明显感觉到气流为宜，并随时注意控制气流的大小。此时铜柱内的碎铜丝处于还原状态的单质铜，当通入高纯N2（99.999%）时，其中所含的极微量氧与单质铜反应，氧被固定下来（形成CuO），流出铜柱的则是无氧N2。利用无氧N2气流驱赶厌氧管、血清瓶等培养容器和培养基中的空气，以及挑菌时保证无氧环境。使用完毕后，先关紧N2钢瓶，接着用止水夹封闭所有橡皮管。无氧H2、CO2的获取方法操作步骤相同。

2.制备无氧培养基

2.1培养基配方（详见表1）

表1培养基配方表[2]

注：微量元素溶液配制时先溶解氨三乙酸，NaOH调pH于6.5左右。依次溶解其它化合物，最后调pH于7.0。

3.制备方法

按照配方称取药品置于事先放有适量蒸馏水的三角瓶中溶解后，加入1mL的1‰刃天青液（W/V），0.4g的盐酸半胱氨酸，用NaOH调节pH值，加足需要水量，用记号笔在三角瓶外壁标上记号，加入一定量的蒸馏水作蒸发量后，置于光波炉加热煮沸10min后，通入无氧N2（驱赶空气，保持培养基为无氧状态）煮沸至培养基颜色变白后再煮10min左右进行分装。用9号针头连接的橡皮管，将无氧N2引入待装培养基的厌氧管和厌氧瓶（16×160mm厌氧管、100mL厌氧瓶）洗管、瓶（用无氧N2换出瓶中空气，使容器中无氧分子存在），用培养基分液器进行分装，厌氧管装4.5mL，厌氧瓶装45mL，待装好培养基后取出N2管塞上橡胶塞，旋紧盖子。转好培养基的厌氧试管用专用布袋装好与厌氧瓶一起置121℃，0.1MPa灭菌20min待用。（厌氧瓶内的培养基使用前加入无菌无氧1%Na2S溶液0.1mL和10%NaHCO30.1mL，厌氧管内培养基使用前加入1%Na2S溶液0.02mL和10%NaHCO30.02mL）。

4.甲烷菌富集

用水样取样器取沼气底泥5克于上述装有45mL培养基的厌氧瓶中，利用Hungate厌氧系统，按H2/CO2体积比为40/10的比例分别加入H280mL、CO220mL，置30℃恒温培养30天，用化学吸收法[3]检测厌氧瓶是否有甲烷气体产生，在甲烷菌生长对数增长中期，从产甲烷气体的富集瓶中取样进行滚管分离。

5.滚管分离和纯化培养

5.1滚管分离培养。对检测有甲烷菌存在的富集处理，进行第1次滚管分离。在分离培养基中补加琼脂粉（20g/L），分装于厌氧试管（16 mm×160mm，4.5mL培养基/管），灭菌。灭菌后置55℃水浴中保持液态，每支厌氧管中分别加入1%Na2S溶液0.02mL和10%NaHCO30.02mL。用1mL无菌无氧注射器取富集的样品液0.5mL，作10-1～10-9梯度稀释，重复3次，每支试管上下倒2～3次（注意不要产生气泡），使样品与培养基充分混匀并立即将稀释管置于装有4℃以下冰水的磁盘中迅速滚管，使培养基与样品均匀光滑无气泡凝固于管壁上。

将滚管分离样品的厌氧管置于试管架上，按H2/CO2体积比为40/10的比例分别加入H240mL、CO210mL，置30℃恒温培养30天，在管壁的培养基上有明显的菌落出现，用化学吸收法检测是否有甲烷气体产生。对有甲烷气体产生的管子，置于荧光显微镜下观察菌落，对有荧光反应的菌落用记号笔画圈作出记号，待进一步分离培养。

5.2甲烷菌纯化。纯化过程是多次挑取单菌落、稀释滚管培养的过程。截取细玻璃管（内径0.5cm、外径0.8cm，长15cm），两端塞上脱脂棉，在酒精灯的火焰上加热并拉成毛细管，高温灭菌并烘干。在无氧条件下挑菌：将有荧光反应菌落的管子置于铁架台上固定，打开管口，用无氧N2吹入管中，使管内保持无氧状态。取毛细管一端与橡胶管连接（橡胶管一端用夹子封住，含在口中），另一端（2mm左右处）在酒精灯火焰上加热并使之弯成约90℃，用它的弯头接触到有荧光记号的菌落，轻吸一口气，使菌落进入毛细管，移出毛细管并快速放入有4.5mL培养基的无氧管子中，迅速塞上胶塞的同时折断毛细管并旋上外盖。按H2/CO2体积比为40/10的比例分别加入H240mL、CO210mL，置30℃恒温培养30天，在管壁的培养基上有明显的菌落出现，用化学吸收法检测是否有甲烷气体产生。

通过单菌落分离获取的菌液经培养后底部有沉淀出现，用吸收法检测管中有无甲烷气体产生。对有甲烷气体的菌管，用上述方法再进行2次滚管分离，则可获得甲烷菌的纯培养。挑取纯培养菌落进行液体培养30d后，置4℃条件下进行保藏，同时进行鉴定。

6.甲烷菌鉴定

6.1菌落荧光反应检测。利用产甲烷古菌在特定波长（420nm）激发下能产生特有的蓝绿荧光，对分离到的样品管进行菌落荧光反应检测，有荧光反应的样品管证明其有甲烷菌存在。

6.2产甲烷气体检测。利用甲烷菌能产生甲烷气体的特性，将有荧光反应的样品管用气相色谱仪或化学吸收法进行产甲烷气体检测，有甲烷气体产生的样品管，再一次证明样品中有甲烷菌存在。

6.3产甲烷菌纯度检测。用1mL注射器抽取有荧光反应的样品液置荧光显微镜下观察，菌体有荧光产生，物气体杂菌，则为甲烷菌纯菌，并将置常温冰箱4℃保藏，待进一步研究或应用。

三、结果与小结

1.结果

1.1利用稀释滚管分离法从厌氧消化器中分离获得99支甲烷古菌纯培养，经产甲烷气体和荧光反应鉴定证明是甲烷菌（图2）。

甲烷杆菌属甲烷短杆菌属甲烷球菌属甲烷微球菌属

Methanobacterium Methanobrevibacter Methanococcus Methanobacterium

（1000×） （1000×）（1000×）（1000×）

图2采用稀释滚管分离纯化法得到的甲烷菌图片

1.2甲烷菌分离纯化技术流程

经上述试验，归纳建立甲烷菌分离纯化技术，其流程如下：

第一次滚管分离

第二次滚管分离

第三次滚管分离

1.3小结

采用Hungate厌氧操作系统清除氧气彻底，操作过程能及时发现和控制无氧环境。培养基中加入对氧气敏感的刃天青指示剂，能及时观察操作过程的无氧状态，使整个操作过程和培养都在无氧状态，满足严格厌氧的要求。建立的稀释滚管分离法操作简便、利用荧光显微镜观察，菌落易于辨认，易挑取，操作过程不易污染，分离效率高等优点。只要满足厌氧微生物的营养需求，样品中的厌氧微生物都能分离出来。

基金项目：黔教高发[2012]426号；黔南民族师范学院微生物学重点学科[2011.6]；黔南民族师范学院教学质量工程项目院教发[2011]5号。

参考文献：

[1]庞德公,杨红建.产甲烷菌的分离纯化培养及其培养基对于菌株的选择作用[J]中国畜牧兽医,2010，37(6)：32―35