杨万里的诗

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杨万里的诗范文第1篇

原诗：坐看深来尺许强，偏於薄暮发寒光。半空舞倦居然嬾，一点风来特地忙。

落尽琼花天不惜，封它梅蕊玉无香。倩谁细橪成汤饼，换却人间烟火肠。

译文：坐看落雪，其深已一尺有余，更在这黄昏时分发散着缕缕寒光。雪花在半空中舞到疲倦，显得轻柔无力，然而些许微风吹过，又翩然起舞。上天浑然不怜惜，让琼花似的雪落尽，将梅蕊、海棠的封存在冰雪之下，花香杳无。有谁能将这高洁的雪做成汤和饼，来涤荡人们满是人间烟火的肠胃。

（来源：文章屋网 ）

杨万里的诗范文第2篇

在此对其赔偿金额之三次变数暂且不提，单说说这5万元的奖励吧。

既是奖励，自然有奖励的理由。在管理心理学中，奖励是对人的某种行为给予肯定与表扬，使人保持这种行为。那么，参照铁路系统对于罹难者的奖励，大抵可以归纳为对罹难者家属的某种行为给予肯定与表扬了。然而，这似乎并不符合逻辑。罹难者家属的什么行为引发了铁路系统的肯定继而表扬呢？且肯定与表扬之下，让惜金如命的铁路系统不惜以5万元的“重金”进行奖励呢？

罹难家属帮忙救人了？并不是。罹难者帮铁路系统发现了安全隐患，继而奖励其家属？说不通。那么，可能存在的原因便是：家属提前签订赔偿协议，使得铁路系统在此次事故中应该承担的责任变小了，其在事故中的错误造成的整个系统的压力变小了，总而言之，铁路系统在事故中最重要的麻烦变少了，这就需要奖励。

当然“奖”远远不够，尚需要“励”！不仅此次不要惹太多麻烦，下次、下下次，以后更多次，（我当然希望这是最后一次，但是，您信吗？）不要再发生此类事故之后给当事单位惹麻烦，这就是奖励机制，通过这种奖励来减少压力、解脱自己。这不能不说是利用人最宝贵的生命来换取“平安符”的丑恶做法，表面是增加了赔偿，实则是轻视生命、不尊重生命的表现。其用心之险恶，“奖励”二字可见一斑！

奖励这个词，自然不是铁路系统随口说出来的，既然已经知道其奖励背后的卑劣目的，自然就知道了其选用这个词的时候是怎样的心领神会：“这是怎样的一个词啊。感谢仓颉先生，造出了这样两个字，太贴切了！”这个目的的存在，实在让他们想不到还有哪个词比“奖励”更能真切地体现他们的处境，以及急于摆脱这种不利处境的迫切心情。

杨万里的诗范文第3篇

关键词：工商管理专业；人才培养模式；监控体系；实践基地

中图分类号：G642 文献标志码：A 文章编号：1002-2589（2016）03-0192-02

随着我国高等教育规模不断扩大，高校学生毛入学率的不断提高，生源质量也不同于精英教育阶段，高等教育已经进入了大众化教育阶段，给高校发展带来机遇的同时，提出了更严峻的挑战。《国家中长期教育改革和发展规划纲要（2010-2020年）》（以下简称《纲要》）[1]中明确指出：“提高质量是教育改革发展的核心任务，树立以提高质量为核心的教育发展观，注重教育内涵发展，鼓励学校办出特色、办出水平，出名师，育英才。”因此，在实际教学过程中，如何实现分类分层教学，如何提高人才培养质量，形成具有本校特色的人才培养模式，是摆在工商管理专业教师面前的一项艰巨任务。

一、工商管理专业人才培养模式的现状

（一）实行弹性学分制

这种人才培养模式主要是针对课程设置而进行的改革，学生可以在八年时间里修完专业要求的所有课程而毕业[2]。这种模式在一定程度上缓解了过去课程设置的弊端，增强了学生选课的自主性，学生可以根据自己的实际情况和兴趣爱好自主选择课程。但是，有很多学生为了尽量早毕业，用大学三年的时间把大学四年要修的课程都修完，这就造成了学生一周之内需要上大量的课程，影响了学生对于知识的消化和吸收，同时也影响了学生的全面发展。

（二）分类分层人才培养模式

这种人才培养模式主要针对学生对专业知识的学习而言[3]。学生进入专业课学习阶段后，学校可以根据学生的自身特点和兴趣，实行分类、分层教学，设置不同的专业课程模块供学生来选修，也可以把专业方向细化为不同的模块，比如人力资源管理、物流管理、生产与运作管理、创业管理等，学生可以根据自己的喜好、优势等情况选择相关模块的课程，通过学习，使学生在某一方面具有较深厚的造诣。

（三）“3+1”人才培养模式

这种人才培养模式是近年来比较盛行的模式[4]，即要求学生在大学前三年主要从事专业学习，在大学的最后一年从事社会实践。这种模式的优点就是能够使学生有足够的时间从事社会实践，但是学生要用三年时间将四年的课程学完，一定程度上增加了学生的学习压力，而且如果学校没有校外实践基地，让学生自己从事社会实践，就必然会导致学生盲目地到企业打工挣钱，从而与专业培养目标相悖。

（四）“3.5+0.5”人才培养模式

这种人才培养模式也受很多高校所推崇，即要求学生用三年半的时间学完大学所有课程，最后半年通过社会实践来撰写毕业论文。这种人才培养模式既能够让学生有足够的时间从事专业知识的学习，又能够抽出一定的时间让学生从事社会实践。但是如果专业课程设置不合理也必然无法实现专业人才培养目标。

（五）“1+2.5+0.5”人才培养模式

这种人才培养模式是在高校专业大类招生情况下实施的，即按照大类专业来招收学生，在大学一年级不分具体专业，到大学二年级学生根据自己的兴趣可以任意选择大类专业下的具体专业进行学习。这种培养模式的优势就是能够让学生通过一年的学习，再根据对自身、专业、社会人才需求的认识，重新进行专业的选择和定位。

二、工商管理专业人才培养模式存在的问题

北方工业大学是一所北京市教委主管的地方院校，目前工商管理专业本科有3个班，专升本有2个班，每一届学生有170人左右。目前，工商管理专业的人才培养模式已逐步从“3.5+0.5”模式向“1+2.5+0.5”模式转化，但从人才培养的过程和培养目标来看，仍然存在一些问题。

（一）培养目标与人才培养过程脱节

学校工商管理专业培养学生的目标是把学生培养成既懂技术又懂管理的复合应用型人才。但是，在人才培养过程中，不仅学生的管理理论素养没能得到提高，学生的实践能力也没有得到锻炼。学生在选择就业单位时，往往感到无所适从，达不到用人单位的高标准、严要求，培养过程质量与培养目标严重脱节。

（二）个别专业课程设置不合理

一般情况下，在大学学习阶段，通识课、专业基础课应当尽量安排大学一、二年级，专业必修课安排在大学三、四年级。学校工商管理专业的课程设置中，部分课程设置不合理，有个别专业课程安排在了大学一、二年级，而且还呈现过度娱乐化，这势必会让学生与其他课程进行对比，从降低了对其他课程学习的积极性。

（三）校外实践基地不健全

学校校内的实践教学内容已经非常丰富，但对于校外实践基地的建设一直落后于同类院校，无法达到教学大纲规定的实践教学目标。因此建立校外实践基地对于工商管理专业学生的培养来讲显得非常重要，也是提高学生实践能力的有力保障。

三、工商管理专业人才培养模式的完善

（一）完善人才培养监控体系

通过对人才培养方案的完善修订，建立健全各类人才培养监测点的考核标准，明确培养计划中专业评价各监测点的内容、目标以及人才培养质量考核的标准和方法，具体体现学校的专业建设特色和专业评价体系的有效实施[5]。在人才培养过程中，应当建立配套的监测点和监控体系，完善工商管理专业的人才培养监控体系，如图1所示。

学校和学院可以通过制订人才培养质量标准、实施方案和相关规章制度，建立起高效优质的人才培养保障、服务和支撑体系，确保人才培养质量监控有效实施，保障人才培养方案的顺利实施。

（二）突出特色，注重质量，提高人才培养质量

工商管理专业是学校的老牌专业，从学校到学院都非常重视学科建设和人才培养模式的改革。为了提高学生的实践能力，实践教学的比重在逐步增大，但是校外实习基地的建设还一直不够健全。因此，加强校外实习基地建设对于突出人才培养特色，提高人才培养质量有着重要的意义。在现有教学实习的模式下，可以逐步与一些大型国有企业建立长期合作关系，定期派学生到企业去实习、锻炼，使学生真正把所学理论知识与企业实践结合起来，从实践中发现问题，再结合所学知识解决问题，实现理论与实践的有机结合，从而更加突出北方工业大学工商管理专业的人才培养特色。

（三）构建人才培养模块，优化人才培养方案

结合学校工商管理专业特色和社会需求，构建人才培养特色模块。在加强理论教学（通识课+基础课+专业课）的同时，注重实践教学的质量和效果，联系几家大型企业作为学生校外实践基地，在实践中构建“1+2+1”人才培养模块或“1+2+0.5+0.5”人才培养模块，加强课堂教学、实践教学、企业实践的密切联系。

1.“1+2+1”人才培养模块

在学校工商管理专业大类招生背景下，构建“1+2+1”人才培养模块势在必行。在这种人才培养模块中，校外实践基地的建设显得尤为重要。学生在大学期间除了学习专业知识，要用最后一年的时间去企业实习和锻炼，在实践中检验所学专业知识的掌握程度，发现问题，及时补救。

2.“1+2+0.5+0.5”人才培养模块

这种人才培养模块也是符合学校工商管理专业发展和社会需求的。学生在大学期间除了学历理论知识外，在最后一年中用半年时间在企业实习，再用半年的时间结合企业实践撰写毕业论文，从实现理论与实践的有机结合。

3.优化人才培养方案

结合人才培养模块，优化人才培养方案，是实现工商管理专业人才培养目标的重要途径。制订新的人才培养方案应着重从课程设置、专业实习、课程设计、校外实践等几个方面来进行改进。首先课程设置应从学生实际和学校的人才培养目标出发，科学、合理地制订学生在三个阶段的课程，在第一阶段（一年级）应着重通识课程的学习，把数学、外语、专业基础课的学习作为重中之重；在第二阶段（二、三年级）着重专业基础课和专业必修课程的学习，在第三阶段（四年级）重点放在学生的实践方面，努力提高学生的实践能力。其次，专业实习可放在每年的寒假和暑假，学校和与企业达成合作意向，组织学生进入企业调研和实践。课程设计课程的设置根据课程特点和专业培养目标而制订。校外实践基地是专业实习和毕业实践的重要保障，学校应当把建设校外实践基地作为人才培养的重中之重。

四、结语

工商管理是一门实践性非常强的学科，该专业的人才培养目标应该定位于着重培养学生的实践能力、协调沟通能力和创新能力。当前，学校工商管理专业正面临着前所未有的挑战和发展机遇，为实现人才培养目标，应坚持以市场需求为导向，以学生为中心，抓住重点，突出特色，重点培养学生的学习能力、应变能力、适应能力、人际沟通、协调和创新能力，提高学生发现、分析和解决实际问题的能力。

参考文献：

[1]顾明远.国家中长期教育改革和发展规划纲要（2010-2020年）[M].北京：北京师范大学出版社，2010.

[2]程春.论高校弹性学分体质的创新与发展[J].知识经济，2013（24）：153.

[3]梁川.基于动机激发理论的分层教学模式的实践研究[J].辽宁高职学报，2015，17（8）：40-42.

杨万里的诗范文第4篇

（内蒙古师范大学，内蒙古 010020）

【摘　要】随着新媒体的急速发展，媒介融合日益成为社会传播的焦点，2015年央视春晚便是这一融合的新生儿。本文分析媒介融合的内涵，以央视2015年的羊年春晚为例，探讨媒介融合的价值所在。

关键词 传统媒体；新媒介；媒介融合；融合价值

伴随着新型媒介技术的劲爆发展，旧的传媒格局迅速被新的媒介系统侵蚀，在这种情况下，媒介融合的进程表现得紧锣密鼓，短时间内，形成蔚为大观之势。2014年8月18日，中央全面深化改革领导小组第四次会议审议通过了《关于推动传统媒体和新兴媒体融合发展的指导意见》，主席特别强调，要着力打造一批形态多样、手段先进、具有竞争力的新型主流媒体，建成几家拥有强大实力和传播力、公信力、影响力的新型媒体集团。媒介融合被提升至国家层面，映射出它的重要战略意义。

1　媒介融合的内涵解析

媒介融合并非新近几年才出现的样态，它是与人类文明史始终相随的常态过程，只是每个历史时期融合的速率大相径庭。近年来，率先由西方传媒业界提及的媒介融合，再一次成为全球新闻传播界所关注的对象。那么，何为媒介融合，它的内涵究竟怎样呢？

“媒介融合”（Media Convergence）这一概念最早由美国马萨诸塞州理工大学的Ithiel De Sola Pool教授在1983年出版的《自由的科技》一书中论及。他认为：数码电子科技导致泾渭分明的传播形态聚合，致使各种媒介呈现出多功能一体化的趋势。由于时代的局限性，他对媒介融合的定义还停留在传统传播介质的视域内。时至今日，媒介融合的定义仍未达成共识，专家学者的诠释日趋多元、深邃，给人以启迪。美国学者Andrew Nachison认为，“媒介融合应是印刷的、音频的、视频的、互动性数字媒体组织之间的战略的、操作的、文化的联盟”；道尔（Doyle）认为媒介融合是指电子通讯技术、计算机技术和媒体的融合；詹金斯（Jenkins）详细阐述了媒介融合的五种形式：技术融合、经济融合、社会或组织融合、文化融合和全球融合；美国西北大学教授Rich Gordon对媒介融合进行了详细地探讨和划分，称融合应包括所有权融合、策略性融合、结构性融合、信息采集融合和新闻表达融合。与此同时，国内学者也纷纷进行了热烈探讨，清华大学熊澄宇教授认为，媒介融合是指“所有的媒介都向电子化和数字化这种形式靠拢，这个趋势是由数字技术驱动的，并在网络技术的推动下变得可能。”中国人民大学蔡雯教授将媒介融合定义为，“在以数字技术、网络技术和电子通讯技术为核心的科学技术的推动下，组成大媒体业的各产业组织在经济利益和社会需求的驱动下通过合作、并购和整合等手段，实现不同媒介形态的内容融合、传播渠道融合和媒介终端融合的过程。”

学者们对媒介融合的定义均有可取之处，却因立足的媒介文化环境和媒介研究视角不同，显得媒介融合定义难下定论。笔者认为，媒介融合涉及到的相关系数较为庞杂，但“它肇始于技术创新，加速于制度创新，深化于市场创新，最终表现为产品创新”的规律是不变的。因此把握好媒介融合的内涵比下定义更为合理。有鉴于此，笔者将媒介融合的内涵囊括于三个维度之下：

一是，传播介质方面的融合。介质作为一种有形的物质存在，是承载传播信息和观念的基础工具，媒介融合就是要将报纸、电视等传统传播介质与借助网络技术发展起来的新型媒体技术相融合，实现“你中有我，我中有你”，优势互补的全媒体平台。

二是，业务经营方面的融合。新老媒介的融合必将冲击传统的业务操作与媒介经营，媒介融合要求传媒业者必须提升自身素质，学会并掌握融媒体下的新闻采写技能、摄影摄像技能、不同媒介的编辑与传输技能等，还得树立融媒体的工作视眼，将工作实践立足于媒体融合大格局之下。媒介融合也改变着经营管理方式，机构的兼并与重组、资本的运作与经营等具体操作，都需要依据媒介融合的要求进行整合与联动，以破除独立经营的弊端。

三是，价值理念的融合。媒介融合不仅要改变原有媒介形态，催生新的媒介形态，还要践行融合理念，而不是简单相加。媒介融合需要一个漫长的磨合过程，是系统性工程，它有自身发展规律，需要学界和业界共同探讨与摸索。这一过程中，需要我们改变定势思维，呼唤制度与理念创新，使不同媒介与融合大势相匹配，真正产生融合实效。

2　媒介融合的成功典范：2015年央视羊年春晚

央视春晚历经33年的发展，已经成为中国百姓春节不可缺少的年度盛宴。三十多年来，央视春晚始终紧随时代脉搏，不断推陈出新，给观众留下了深刻的印象。近年来，在新媒体巨浪的卷携下，央视春晚同其它传统媒体一样，受众受到瓜分，收视率连年下跌。然而，2015年央视春晚却不拘一格，改头换面，充分将多媒体炫酷科技嫁接到联欢晚会，在媒介融合大潮下成功涅槃。

借力新型媒介，创新媒介产品，强化品牌文化。媒介融合是信息技术不断创新与应用的结果，它没有终极目标，只有不断地推进与演化，其特征多趋向为：“多媒体信息在同一平台上的能量互补；各类媒体之间的信息能量交换；信息传播者与信息接受者之间的信息能量交互；外部产业对传媒业的能量支持。”央视春晚作为一档品牌节目，过去几十年间，缺乏品牌形象意识，被业界笑称只会“联欢”的节目。2015年羊年春晚一反常态，有效地将新媒体应用嵌入荧屏，并借助多维媒介科技，大力开发媒介产品，形成了宣传曲、宣传片、吉祥物等一系列媒介产品，使观众生动地了解春节与春晚的同时，也助推了自身品牌文化的传播。特别是微信红包的发放，以及春晚首个吉祥物“阳阳”的开发，不仅传递了传统春节文化，寄寓了新年愿望，还极大地跃动了观众的欲望与激情，更重要的是通过媒介产品研发，潜移默化地塑造了春晚栏目形象，增强了品牌的识别度。

拓展传播渠道，争取市场份额，扩大栏目影响。多元传播渠道的共融与多维声像技术的集成应用是媒介融合带来的最显著变化。这种变化看似新媒体对老媒体进行冲击，实质是新老媒体的一种交混与更新、优化与培植，关键在于媒体顺势而为，传播渠道和方式的拓展与运筹。以往央视春晚只在央视、卫视频道，以及个别海外媒体播出，而今年破格将直播权授予像爱奇艺这样的视频网站，并加深了与微信、微博、客户端、You Tube等社交媒体的合作，呈现出多渠道融通与联动的繁荣，扩大了央视春晚的声势影响。索福瑞数据统计显示：2015年春晚的荧屏总收视率为29.6%，虽不及去年，但人均收视时长较往年大幅增加，是2014年的2倍有余，达155.55分钟/人。央视春晚栏目组为了扩大海外声势，还特意邀请美联社、路透社等国际媒体参加首次春晚海外推荐会，并与TWITTER、FACEBOOK等海外社交平台合作，开展2015年春晚预热活动。此外，在海外播发宣传片和广告、组织春节活动等方面也做了巨大努力，有效扩展了春节文化和央视春晚的传播渠道，获取了更多的“注意力”，而这种“注意力”正是媒介市场化时代的制胜法宝。

更新价值理念，增强受众体验，提升春晚价值。媒介技术的发展使信息传播由大众传媒的“点对面”向传媒分众的“点对点”过度，媒介受众由以往的单向阅听的被动角色转变为传媒为其量身定制资讯、娱乐服务的用户。这种传媒趋向直接引发社会阶层和文化需求的“碎片化”，“使原有的社会阶层经由社会观念达到集体行动的逻辑发生了某种断裂，社会观念的利益化和个性化倾向明显”。为了适应“碎片化”、“个性化”的时代要求，媒体只有揣度与满足消费者的需求，转变“传者至上”的价值理念，才可能获得受众认可。2015年羊年春晚之所以获赞，就是栏目组能够站在媒介受众的角度去思考节目设置，从而较好地满足了受众需要。春晚期间，央视通过微信“摇一摇”平台，与观众互动总量超过110亿次，微信祝福在185个国家之间传递了约30000亿公里，相当于往返地月370余万次。再如“晒晒全家福”，观众通过新型媒介，将全家福上传到央视演播现场，直接拉近了与春晚现场的距离，有一种宾至如归的亲切感。这样的媒介创制，不仅激发了全民跨屏互动的热情，传递了新年夙愿，还把“溜走”的观众再次拉回荧屏，提升了央视春晚的价值，堪称传统媒体携新媒体的一次华丽亮彩。

3　媒介融合的意义

新媒体携领传统媒体奏演的融合之势如火如荼，它刷新了媒介发展历史，催生了新的社会变革力量，改变着社会的多维发展，特别是在社会互动、媒介内容、媒介运营模式等方面，凸显出巨大的融合价值。

有利于打造无界的社会互动空间。媒介融合肇始于技术创新，而媒介技术发展带来最显著的变化就是信源泛化和信息传播的裂变呈现，这些新的信息传播特点，改变了过去独占信息的权力中心，自上而下的线性传播变得岌岌可危，民主化、扁平化、去中心化的无界信息传播成为潮流。媒体融合大势之前，传统媒体掌握着信息的主动权，信息传播和渠道选择受制于国家利益和精英阶层，公众无法看到信息的天然状貌。新媒体的出现，打破了信息的绝对垄断，呈现出多元化的传受趋势，公众对信息公开透明和主动传播的欲望加强，更重要的是，他们借助网络互动平台，将长期压抑的情绪释放出来，崩发出他们对社会的长期关切。媒介融合大势正迎合了他们参与社会、重置话语权的期望，有效连接了“上下层”的平等对话，缓解了社会气压。

有利于开发高品质的媒介传播内容。传统媒体形态比较单一，技术手段应用也相对有限，新型媒介技术的开发，使媒介形态变得繁华，为内容、产品、技术、管理、平台和人才的一体化提供了先决基础，媒体融合可以将拥有高品质内容的传统媒体与高技术的新型媒介进行统和，对传媒内容进行多角度、全方位的二次加工、处理和采编，进而满足各类人群的个性化需求，增强了他们的媒介体验，从而有效地提升了媒介信息产品的档次和品味，最大地实现传播效果。

有利于推进高级的媒介运营模式。新媒体技术的应用使本来清晰的媒体边界变得模糊不堪，媒介市场的激烈竞争，迫使独立运作的媒体企业与其它媒体合作，重新划分利益地盘，带来组织结构和营销方式的调整。媒体融合的好处之一就是让不同媒体之间相互借力，扬长避短，共同架构高效的媒介组织与营销方略。中央电视台的电视技术、电视设备和技术应用都走在了世界前沿，在向新兴主流媒体转型的过程中，发现自己有内容研发和节目生产的优势，但在多屏传播上存在欠缺，因此电视台有针对性地改进了组织管理体系和产业经营体系，如研发了全流程的采编播体系，建立起了央视影音、央视新闻、央视体育、央视乐动为核心的媒体融合产品体系，搭建了全产业链的版权开发体系和跨媒体的传播效果考评体系，有效地做到了传统媒体和新兴媒体优势互补、一体发展。

参考文献

［1］蔡雯.新闻传播的变化融合了什么[J].中国记者，2005（09）.

［2］朱天，彭泌溢.试论媒介融合中的“加减之道”——时代华纳与美国在线“世纪婚姻”终结对我国“三网融合”的启示.http：//media.people.com.cn[OL/J].

［3］高钢.媒体融合:追求信息传播理想境界的过程[J].国际新闻界，2007，3.

［4］数据来源：2015年央视春晚索福瑞数据统计[Z].

杨万里的诗范文第5篇

关键词：甲烷古菌； Hungate除氧系统； 富集； 滚管分离； 纯培养

中图分类号：Q939文献标识码：A 文章编号：1006-3315（2014）04-170-003

厌氧微生物的分离是黔南民族师范学院微生物课程开放性实验项目之一。目前国内高校多数实验室对严格厌氧菌分离纯化主要采用焦性没食子酸法、厌养罐法、厌养培养箱法等[1]。焦性没食子酸法进行厌养菌分离培养,由于其方法简单，操作容易,在大专院校微生物实验教学中仍广泛使用,但操作过程厌氧条件不易控制，特别是对严格厌氧的甲烷古菌分离效果差。厌养罐法能够为厌氧菌生长提供严格厌氧的环境，但不能为整个分离纯化操作过程提供厌氧环境，使用受到限制。厌养培养箱法虽然能为厌氧菌分离培养提供严格厌氧环境，需要特制设备,在厌氧箱中操作也不方便，由于价格昂贵，因而其应用受到一定限制。为此，为了改进厌氧细菌的分离纯化方法，结合对厌氧消化器中甲烷古菌的分离与纯化开放性实验，借助Hungate除氧系统进行稀释滚管分离，收到了很好的效果，现将有关技术介绍如下。

一、材料用具

1.接种物

取自黔南民族师范学院微生物实验室厌氧发酵缸（厌氧消化器）底部的沉积物。

2.仪器用具

2.1Hungate除氧系统。Hungate除氧系统由高纯氢气、高纯氮气，铜柱，加热套，不锈钢分支管，橡皮胶管，注射器及9号针头等组成。铜柱结构直径30～50mm、长300～500mm的石英玻璃管，两端加工成漏斗状，便于连接胶管，玻璃管中装入碎铜丝（长10～20mm，直径0.5mm），压紧，铜丝下面垫上玻璃纤维以防止碎铜丝散落，上端留出50mm左右的空间。铜柱外缠绕加热带，铜柱顶端用胶管与具有分支的不锈钢通气总管连接。不锈钢总管下的各分支管用橡皮胶管连接，橡皮胶管的另一端连接1mL塑料质注射器，注射器再与9号针头连接（图1）。

图1Hungate厌氧操作系统示意图

2.2其它器具。高压灭菌锅，恒温水浴锅，恒温培养箱，荧光显微镜，厌氧管（16×160mm），厌氧瓶（100mL），光波炉，3000 mL三角瓶，各种规格的注射器（1mL、2mL、5mL）等。

二、方法

1.获取无氧N2、H2、CO2气体

甲烷菌是严格厌氧微生物，都能利用H2和CO2合成CH4，一般分离甲烷菌都用H2和CO2作为营养。其分离过程需要人工保持一个无氧环境进行操作和供其生长繁殖。用于分离严格厌氧微生物使用的气体虽然是高纯气体（99.999%），但仍然含有微量的O2，利用Hungate铜柱除氧系统可除掉这些微量的O2，提供和保持无氧环境。

2.铜柱除氧与还原

铜柱除氧原理：实验使用的高纯气体（N2、H2、CO2）中含有微量的O2，当气体经过铜柱时，这些气体中的微量O2与Cu反应生成CuO（O2＋CuCuO），从而流出铜柱的气体则为无O2气体。

铜柱还原：铜柱使用后，里边的Cu被氧化为CuO不能继续与O2发生化合反应，失去除氧能力。此时，关掉其它气体，通入H2，同时使铜柱升温（达350℃），当H2通过高温铜柱时，铜柱内CuO与H2反应（CuO＋H2Cu＋H2O）生成单质Cu，CuO在加热条件下（350℃）被H2还原为Cu，铜柱恢复除氧能力可反复使用。

操作步骤：打开Hungate铜柱除氧系统通气橡皮管的通气开关（止水夹），开启H2钢瓶，H2气流通过铜柱，从铜柱里流出的H2用橡皮管引出室外。此时接通电热套电源，铜柱升温，温度达到350℃左右，20～30min后，铜柱内的碎铜丝被H2还原，由黄黑色变为纯铜铮亮色，当铜柱里面的水蒸气被排出完全后，关闭H2钢瓶，铜柱还原结束。

3.获取无氧N2、H2和CO2气体

无氧N2用于厌氧菌分离操作和培养过程中驱赶空气，保证局部无氧环境。在铜柱还原结束后，立即打开N2钢瓶，气流大小控制以针头对准操作者手背5cm距离明显感觉到气流为宜，并随时注意控制气流的大小。此时铜柱内的碎铜丝处于还原状态的单质铜，当通入高纯N2（99.999%）时，其中所含的极微量氧与单质铜反应，氧被固定下来（形成CuO），流出铜柱的则是无氧N2。利用无氧N2气流驱赶厌氧管、血清瓶等培养容器和培养基中的空气，以及挑菌时保证无氧环境。使用完毕后，先关紧N2钢瓶，接着用止水夹封闭所有橡皮管。无氧H2、CO2的获取方法操作步骤相同。

2.制备无氧培养基

2.1培养基配方（详见表1）

表1培养基配方表[2]

注：微量元素溶液配制时先溶解氨三乙酸，NaOH调pH于6.5左右。依次溶解其它化合物，最后调pH于7.0。

3.制备方法

按照配方称取药品置于事先放有适量蒸馏水的三角瓶中溶解后，加入1mL的1‰刃天青液（W/V），0.4g的盐酸半胱氨酸，用NaOH调节pH值，加足需要水量，用记号笔在三角瓶外壁标上记号，加入一定量的蒸馏水作蒸发量后，置于光波炉加热煮沸10min后，通入无氧N2（驱赶空气，保持培养基为无氧状态）煮沸至培养基颜色变白后再煮10min左右进行分装。用9号针头连接的橡皮管，将无氧N2引入待装培养基的厌氧管和厌氧瓶（16×160mm厌氧管、100mL厌氧瓶）洗管、瓶（用无氧N2换出瓶中空气，使容器中无氧分子存在），用培养基分液器进行分装，厌氧管装4.5mL，厌氧瓶装45mL，待装好培养基后取出N2管塞上橡胶塞，旋紧盖子。转好培养基的厌氧试管用专用布袋装好与厌氧瓶一起置121℃，0.1MPa灭菌20min待用。（厌氧瓶内的培养基使用前加入无菌无氧1%Na2S溶液0.1mL和10%NaHCO30.1mL，厌氧管内培养基使用前加入1%Na2S溶液0.02mL和10%NaHCO30.02mL）。

4.甲烷菌富集

用水样取样器取沼气底泥5克于上述装有45mL培养基的厌氧瓶中，利用Hungate厌氧系统，按H2/CO2体积比为40/10的比例分别加入H280mL、CO220mL，置30℃恒温培养30天，用化学吸收法[3]检测厌氧瓶是否有甲烷气体产生，在甲烷菌生长对数增长中期，从产甲烷气体的富集瓶中取样进行滚管分离。

5.滚管分离和纯化培养

5.1滚管分离培养。对检测有甲烷菌存在的富集处理，进行第1次滚管分离。在分离培养基中补加琼脂粉（20g/L），分装于厌氧试管（16 mm×160mm，4.5mL培养基/管），灭菌。灭菌后置55℃水浴中保持液态，每支厌氧管中分别加入1%Na2S溶液0.02mL和10%NaHCO30.02mL。用1mL无菌无氧注射器取富集的样品液0.5mL，作10-1～10-9梯度稀释，重复3次，每支试管上下倒2～3次（注意不要产生气泡），使样品与培养基充分混匀并立即将稀释管置于装有4℃以下冰水的磁盘中迅速滚管，使培养基与样品均匀光滑无气泡凝固于管壁上。

将滚管分离样品的厌氧管置于试管架上，按H2/CO2体积比为40/10的比例分别加入H240mL、CO210mL，置30℃恒温培养30天，在管壁的培养基上有明显的菌落出现，用化学吸收法检测是否有甲烷气体产生。对有甲烷气体产生的管子，置于荧光显微镜下观察菌落，对有荧光反应的菌落用记号笔画圈作出记号，待进一步分离培养。

5.2甲烷菌纯化。纯化过程是多次挑取单菌落、稀释滚管培养的过程。截取细玻璃管（内径0.5cm、外径0.8cm，长15cm），两端塞上脱脂棉，在酒精灯的火焰上加热并拉成毛细管，高温灭菌并烘干。在无氧条件下挑菌：将有荧光反应菌落的管子置于铁架台上固定，打开管口，用无氧N2吹入管中，使管内保持无氧状态。取毛细管一端与橡胶管连接（橡胶管一端用夹子封住，含在口中），另一端（2mm左右处）在酒精灯火焰上加热并使之弯成约90℃，用它的弯头接触到有荧光记号的菌落，轻吸一口气，使菌落进入毛细管，移出毛细管并快速放入有4.5mL培养基的无氧管子中，迅速塞上胶塞的同时折断毛细管并旋上外盖。按H2/CO2体积比为40/10的比例分别加入H240mL、CO210mL，置30℃恒温培养30天，在管壁的培养基上有明显的菌落出现，用化学吸收法检测是否有甲烷气体产生。

通过单菌落分离获取的菌液经培养后底部有沉淀出现，用吸收法检测管中有无甲烷气体产生。对有甲烷气体的菌管，用上述方法再进行2次滚管分离，则可获得甲烷菌的纯培养。挑取纯培养菌落进行液体培养30d后，置4℃条件下进行保藏，同时进行鉴定。

6.甲烷菌鉴定

6.1菌落荧光反应检测。利用产甲烷古菌在特定波长（420nm）激发下能产生特有的蓝绿荧光，对分离到的样品管进行菌落荧光反应检测，有荧光反应的样品管证明其有甲烷菌存在。

6.2产甲烷气体检测。利用甲烷菌能产生甲烷气体的特性，将有荧光反应的样品管用气相色谱仪或化学吸收法进行产甲烷气体检测，有甲烷气体产生的样品管，再一次证明样品中有甲烷菌存在。

6.3产甲烷菌纯度检测。用1mL注射器抽取有荧光反应的样品液置荧光显微镜下观察，菌体有荧光产生，物气体杂菌，则为甲烷菌纯菌，并将置常温冰箱4℃保藏，待进一步研究或应用。

三、结果与小结

1.结果

1.1利用稀释滚管分离法从厌氧消化器中分离获得99支甲烷古菌纯培养，经产甲烷气体和荧光反应鉴定证明是甲烷菌（图2）。

甲烷杆菌属甲烷短杆菌属甲烷球菌属甲烷微球菌属

Methanobacterium Methanobrevibacter Methanococcus Methanobacterium

（1000×） （1000×）（1000×）（1000×）

图2采用稀释滚管分离纯化法得到的甲烷菌图片

1.2甲烷菌分离纯化技术流程

经上述试验，归纳建立甲烷菌分离纯化技术，其流程如下：

第一次滚管分离

第二次滚管分离

第三次滚管分离

1.3小结

采用Hungate厌氧操作系统清除氧气彻底，操作过程能及时发现和控制无氧环境。培养基中加入对氧气敏感的刃天青指示剂，能及时观察操作过程的无氧状态，使整个操作过程和培养都在无氧状态，满足严格厌氧的要求。建立的稀释滚管分离法操作简便、利用荧光显微镜观察，菌落易于辨认，易挑取，操作过程不易污染，分离效率高等优点。只要满足厌氧微生物的营养需求，样品中的厌氧微生物都能分离出来。

基金项目：黔教高发[2012]426号；黔南民族师范学院微生物学重点学科[2011.6]；黔南民族师范学院教学质量工程项目院教发[2011]5号。

参考文献：

[1]庞德公,杨红建.产甲烷菌的分离纯化培养及其培养基对于菌株的选择作用[J]中国畜牧兽医,2010，37(6)：32―35