抱恙在身
前言：想要写出一篇令人眼前一亮的文章吗？我们特意为您整理了5篇抱恙在身范文，相信会为您的写作带来帮助，发现更多的写作思路和灵感。
抱恙在身范文第1篇
在《基础教育课程改革纲要》中明确提出"要使学生具有初步的环境意识"，新课标也强调，"增强对环境、资源的保护意识和法制意识，初步形成可持续发展的观念，逐步养成关心和爱护环境的行为习惯。因此，在地理教学实践中，应逐步培养学生的环保意识。
1.充分挖掘现行教材中能够进行环保意识培养的内容，通过课堂教学使学生获取环保知识
要讲清中学地理教材中有关自然资源的利用和保护的知识。初中地理教材中的世界气候，自然景观的地区差异，世界的自然资源和中国的气候、河流、湖泊，中国自然资源的合理利用和保护，及中国的区域地理差异等知识。教师讲授时，不仅要讲清楚自然资源的概念，而且要详细讲解有关自然资源的利用和保护的知识。在讲授黄河时，要说明黄河及流域概况的知识，同时要指出，黄河所流经的黄土高原在历史上是一片"草丰林茂，沃野千里的绿洲"，但由于常年毁林开荒，植被遭到严重破坏，造成大量的水土流失和生态失调，导致泥沙淤积下游，形成地上"悬河"，给广大民众带来忧患。同时还应着重介绍，解放以来黄河两岸的人民在党的领导下，坚持治理改造黄河，化害为利，趋利避害，使晋陕等沿河省区出现了田园似锦、棉麦丰收的喜人景象，生态面貌发生了巨大变化。这样既体现了爱国主义教育，又进行了具体生动的环境教育，寓环境保护教育于地理课的教学之中。
新的课程标准把环保、人口、可持续发展等，作为高中地理教学的重点，高中地理教材把人类对生活的地理环境、人类活动与地理环境的关系作为核心内容，使学生树立人与自然协调的可持续发展观念，培养学生关注和保护环境的意识。因此，通过讲解使学生认识到自然资源不是取之不尽，用之不竭的，环境对废弃物的容纳能力是有限的，对资源的无节制掠夺开采，对环境的任意污染与破坏，必然受到自然界的惩罚，通过破坏环境来侵犯他人的利益，危及子孙后代的生存，必将受到社会的谴责，从而明确人对自然的道德责任和义务，树立"保护环境光荣，破坏环境可耻"的新型社会主义荣辱观。
2.在课堂上，通过时事和历史事件让学生认识到环境污染的危害性
科学技术突飞猛进，人类从自然界提取的资源越来越多，排放的废弃物也与日俱增，资源消耗过大，生态破坏加剧，已使地球不堪重负，环境污染和生态破坏对人类生存和发展构成了严重威胁，在地理课堂上通过时事和历史事件问题，适时的渗透在地理教学中，使学生进一步了解环境污染对人类生存的影响，窥视环境问题的严重性。如： 2003年，在我国发生的非典疫情，它与生态环境的变化存在着内在的、必然的联系，环境的急剧恶化诱发水生物、野生动物和致病微生物的突变，而滥捕滥杀、食用野生动物的行为使致病微生物传播到人体，进而危害人类的身体健康。在地理课上通过时事和历史事件的渗透教学，使学生学到地理知识的同时，还接受到环境教育，通过对这些事件的了解研究，让学生学会用地理学知识分析、评价这些事件的形成机制、演变过程与对策。
3.尝试地理教育方式方法的改革，有效培养中学生的环保意识
3.1 通过设计争议性问题开展讨论，培养中学生的环保意识。世界上的事物是复杂的，许多事物的存在既对人类的发展有益，也可能对人类有潜在的危害。科学技术是把双刃剑（如农药的使用、氟利昂利用的兴衰、核能发电等），使学生认识到这点是非常重要的。环境问题的存在往往受多种因素的制约，在不同的地区，不同的时期有不同存在的形式；不同阶层的人对同一环境问题也会有不同的看法，因此，在地理教学中设计争议性问题，组织学生进行多方面的讨论，让他们通过内部矛盾的冲突，深入理解环境问题，提高自身的环保意识。如在讲高中地理 "新能源"一节时，设计"要不要发展核电"这一争议性问题，引导学生进行思考，组织讨论。核电站是全世界公众关注的环境问题焦点之一，有些学生认为核能是一种清洁、廉价、能量密集、地区适应性强、具有巨大发展前景的新能源，应积极发展核电站；另外一些学生则认为前苏联切尔诺贝利灾难性的核事故固然罕见，但人们不能忽视来自具有很高放射性的核废料的威胁，应削减或停止核电发展计划。学生看问题的角度不同，就会产生对核电不同的看法。通过激烈的争论，其意义远不止是让学生知道应该不应该发展核电站。
3.2 重视开放性教学，加强环境教育，培养学生的多方面才能。所谓开放性教学就是指环境教育中利用一些开放性教学材料，这些材料不限于常用的课本，教师不给出固 定格式的结论，而是由教师指导学生通过搜集、阅读文字资料，实地调查问题现状等学习活动，使学生自己得出恰当的结论。
3.3 充分利用各种实践活动，将环境知识转化为环保意识。环境意识的形成必须依赖于学生的实践，而且只有在他们的实践中才能表现出来。如果没有接触过协调环境关系有关的活动，那么热爱环境、保护环境只能是一句空话，所以，在地理教学中必须十分重视理论联系实际，加强环境教育。
（1）把地理知识与周围看得见、摸得着的环境紧密联系起来。如在学习选修五"自然灾害"这册书中，要求学生根据自身的感受，了解我们身边发生的自然灾害，特别是经常影响本地的旱涝，寒潮等灾害性天气，使学生们知道这些主要是由自然原因产生的环境问题，人类只有认识自然规律，趋利避害，按客观规律办事，才能收到事半功倍的效果。
（2）结合参观访问，增加感性知识，深化理性知识的学习。如在学习工业"三废"的危害及治理的内容后，带领学生到中牟县汽车产业园区考察，参观工厂的污水处理设备，并听厂领导的介绍。同学们对工业"三废 "的治理过程有了清晰的了解，不但获得环保的技能知识，而且在亲身的感受中潜移默化地提高了环保意识。
（3）结合春游，让学生在大自然中体会环境保护的必要性。如去年我班到中牟县雁鸣湖景区春游，我就紧紧抓住这个机会，引导学生在观察中思考讨论："雁鸣湖"景区旅游业的现状、发展与环境保护的关系；建造雁鸣湖休闲度假村的实际意义，为什么政府要花这样多的资金造这个庞然大物等等。
抱恙在身范文第2篇
1、甲醇是易挥发性液体，属于甲类火灾危险性物质，贮存不好或发生泄漏都可能发生燃烧、爆炸。
2、原料液体甲醇经蒸发器加热蒸发后变成甲醇蒸气，蒸发系统不得泄漏，否则在压力作用下甲醇气体以高速喷出，产生静电或遇明火，极易发生火灾爆炸。
3、气态甲醇与空气混合能形成爆炸性混合气体，一旦遇有明火、高温或静电火花就有爆炸、燃烧的危险。
4、气态甲醇的爆炸速度极大，火焰温度在1000℃以上，标准状况下，1平方米气态甲醇完全燃烧，发热量高达数万千焦。
（来源：文章屋网 ）
抱恙在身范文第3篇
2006年初，华晨宝马在中国大陆的本地供应商数量为46家，本地采购额为8.7亿元，到2006年底，本地采购额已达20亿元。目前，本地供应商数量已经发展到超过60家。预计到2007年底，本地供应商数量将达到100家，本地采购额将增长80%，达到36亿元。
华晨宝马汽车有限公司总裁兼首席执行官吴佩德先生表示：“稳步推进本地化采购进程是华晨宝马的长期战略。这不仅仅是为了满足政府对于国产化率的要求，同时也为了提升我们企业产品的市场竞争力。中国是一个拥有巨大商机的市场，华晨宝马将继续遵循高档品牌战略，与供应商保持和扩大共赢的合作伙伴关系，在帮助中国的汽车零部件企业走向世界的同时，不断提高企业的自身实力，努力成为中国高档轿车市场上的领先企业。”
华晨宝马的供应商发展战略建立在三个基石上：宝马集团的全球供应商在中国的独资企业、合资企业和中资企业。不管是现有和潜在的合作伙伴，宝马汽车的供应商必须完全满足两个标准：宝马全球统一的质量标准和全面的竞争力。宝马集团生产材料采购高级副总裁Klaus Richter博士在向华晨宝马的供应商介绍宝马集团全球采购体系时表示,凡是向华晨宝马供货的供应商，都有机会进入到宝马集团全球的采购体系。因为宝马集团的全球采购系统是一个公开透明的平台。所有希望进入这个系统的供应商必须在产品质量上达到宝马全球统一的质量标准，而且要有全面的竞争力。例如，中国的戴卡轮毂制造有限公司马上就成功地进入宝马全球采购体系，为BMW 5系提供轮毂。
由于华晨宝马采用的是宝马集团全球统一的质量标准，所以，中国大陆的供应商如满足质量和竞争力两方面的要求，都将能有机会进入宝马集团全球采购系统。
丰田任命第一位常驻中国本部长
丰田汽车公司（以下简称丰田）于6月22日召开2007年股东大会及董事会议，通过公司重要决议并对公司部分董事成员进行改选任命。
抱恙在身范文第4篇
基金项目：全军十二・五重点课题（BWS12J018）
作者单位：510010 广州，南方医科大学研究生院，广州总医院重症医学科（刘云松）；南方医科大学肿瘤研究所（邓旭斌）；广州总医院重症医学科（苏磊）
通信作者：苏磊， Email：
【摘要】目的 通过观察热打击诱导活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆发性增多对神经元细胞凋亡的影响，探讨重症中暑所致脑损害的发病机理。方法 建立神经元细胞热打击模型，对照组将细胞置于标准37 ℃、5%CO2细胞培养箱，热打击组将细胞置于43 ℃细胞培养箱中热打击2 h，热打击后继续37 ℃、5%CO2细胞培养箱孵育，DCFH法检测热打击后0 h、0.5 h、1 h、2 h细胞内ROS含量；Annexin V-FITC/PI双染色方法和Westen blot检测热打击后0 h、3 h、6 h、12 h细胞凋亡率及caspase-3蛋白表达，同时检测ROS特异性清除剂MnTMPyP对热打击后12 h细胞凋亡的影响。结果 与对照组比较，43 ℃热打击后0 h细胞内ROS增加，2 hROS呈爆发性增多（P
【关键词】重症中暑；脑损害；热打击；热打击模型；神经元细胞；凋亡；凋亡机制；活性氧
The effect of reactive oxygen species on heat stress-induced neuronal apoptosis Liu Yunsong ， Deng Xubing， Su Lei.Department of Intensive Care Unit， General Hospital of Guangzhou Military Command， Key Laboratory of Tropical Zone Trauma Care and Tissue Repair of PLA， Guangzhou 510010， China
Corresponding author： Su Lei， Email：
【Abstract】Objective To observe the effect of heat stress-induced burst out of reactive oxygen on neuronal apoptosis and investigate pathogenesis of brain damage caused by severe heat stroke. Methods Neurons heat stress model is set up. Control group were incubated at 37 ℃，5%CO2，While heat stress group of cells were incubated at 43 ℃ for 2 h，then all the cells were further incubated at 37 ℃ for different time as indicated.The amounts of ROS were assayed by DCFH staining at 0 h， 0.5 h， 1 h， 2 h after heat stress. Apoptosis was analyzed by flow cytometry using Annexin V-FITC/PI staining and expression of caspase-3 were determined by westen blotat 0 h、3 h、6 h、12 h after heat stress. In addition， MnTMPyP is the specificscavengers of ROS，which effect on apoptosis is also studied at 12 h after heat stress.Results Compared with control group，amounts of ROS was significant increased at 0 h after heat stress，the burst out of it was at 2 h after heat stress（P
【Key words】Severe heat stroke； Brain damage；Heat stress；Heat stress model；Neuron；Apoptosis；Apoptosismechanism； Reactive oxygen species
重症中暑是威胁健康的严重疾病，表现为中心体温升高超过40 ℃以及各种中枢神经系统功能障碍如谵妄、抽搐、昏迷等[1]。由高热引起的中枢神经系统损害是重症中暑的主要特征之一，其损害程度也直接决定了重症中暑的病情及预后[2]。目前，重症中暑中枢神经系统损害的病理生理机制尚不明确。凋亡在中暑发病中的作用已逐渐受到重视，越来越多的研究发现高热可诱导机体大量细胞凋亡[3-4]。到目前为止，关于中枢神经细胞在中暑热打击中发生凋亡的研究较少，国外仅Vogel观察到了热打击后神经元细胞凋亡的现象[5]，国内未见相关报道。本研究观察热打击后神经元凋亡以及细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆发性增加与神经元凋亡的相关性，探讨ROS在重症中暑中枢神经系统损害中的作用。
1 材料与方法
1.1 仪器A200144
CO2孵箱（中国上海艾测电子科技有限公司）；倒置相差显微镜（德国Leica）、荧光显微镜（德国Leica）、数据处理系统（ DMR） 图像分析（德国Leica）；流式细胞仪为美国BD公司产品；酶标光度计为美国BIO-RAD产品；贝克曼GS-15R高速冷冻离心机（美国）；ECL化学发光检测试剂盒购自Amersham公司。
1.2 SD大鼠大脑皮层神经元细胞株培养
SD大鼠大脑皮层神经元细胞购于赛业（广州）生物科技有限公司，在南方医科大学肿瘤研究所实验室进行培养。培养液由含600 mg/mL葡萄糖的DMEM加10%马血清、终质量浓度为100 μg/mL 的转铁蛋白、5 μg/mL胰岛素、20 nmol孕酮、100 μmol/L腐胺、30 nmol/L二氧化硒及
100 U/mL双抗组成，将神经元细胞置于37 ℃、体积5%CO2及饱和湿度条件的孵箱中培养。约2～3 d进行1次传代，传代按1∶2至1∶3的比例进行。细胞长至对数生长期后进行实验。
1.3 热打击及细胞存活率测定
取对数生长期神经元细胞，按5×104/孔密度铺入可拆卸96孔板，待细胞贴壁稳定后进行热打击处理。对照组将细胞置于标准37 ℃、5%CO2细胞培养箱2 h，热打击组分别置于39 ℃、41 ℃、43 ℃及45 ℃细胞培养箱中2 h，各组分别设置5个复孔。热打击后继续在37 ℃、5%CO2细胞培养箱孵育12 h后加入CCK8（碧云天） 10 μL/孔，具体操作参考说明书进行。用酶联免疫检测仪于450 mm处读取OD值，计算细胞存活率。实验分别独立重复3次。
1.4 Annexin V /PI流式细胞仪检测细胞凋亡
热打击组为将细胞置于43 ℃ 2 h，对照组37 ℃ 2 h，热打击后分别继续在细胞培养箱孵育0、3、6、12 h。使用Annexin V/PI试剂盒（invitrogen），按说明书进行操作。在不同时间点收集细胞，调整待检测细胞浓度为1×106/mL，冰PBS润洗两次2次，将细胞重悬于100 μL含 2 ulAnnexin-V-FITC（20 μg/mL） 缓冲液中轻轻混匀，避光室温放置15 min。转至流式检测管，加入400 μL PBS，每个样品临上机前加入1 μL PI（50 μg/mL），2 min后迅速检测。流式细胞仪检测激发波长EX=488 nm；发射波长Em=530 nm。
1.5 Westen blot 检测凋亡相关蛋白caspase-3表达
Westen blot参考文献[6]说明进行。一抗使用caspase-3兔来源激活型抗体（1∶1000，碧云天），二抗使用结合有辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体（1∶5000， 碧云天）。抗体孵育完成后使用化学发光剂ECL进行反应、曝光。
1.6 细胞内ROS检测
使用DCFH-DA法检测细胞内ROS，按照说明书操作，分别收集热打击组及对照组细胞，用终质量浓度10 μmol/L的DCFH-DA分子探针（碧云天）悬浮收集后的细胞，细胞浓度调整为107/mL，并将细胞置入37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，每隔3～5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。热打击组将细胞置于43 ℃ 2 h，对照组37 ℃ 2 h，按照0、0.5、1、2 h时间点，使用激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=525 nm检测荧光的强弱。
1.7 ROS特异性清除剂MnTMPyP干预
MnSOD活性类似物MnTMPyP（Calbiochem公司）为ROS特异性清除剂，对照组和热打击组神经元细胞在进行热打击处理前使用浓度为10 μmol/L的MnTMPyP预处理1 h，热打击2 h后继续培养12 h，Annexin V/PI流式细胞仪检测细胞凋亡率，Westen blot 检测caspase-3蛋白的表达。
1.8 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件包进行分析。计量资料在方差齐性的基础上应用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间差异用LSD法比较，以P
2 结果
2.1 热打击后神经元细胞活力下降
39 ℃热打击对神经元细胞活力无影响，但随着热打击温度的增高（41～45 ℃），神经元细胞的活力呈现进行性下降，与对照组（37 ℃）比较差异有统计学意义（P
与对照组比较，aP
图1 不同温度热打击神经元细胞存活率
Fig 1 Cell viability of neurons at different temperature during heat stress
2.2 热打击后神经元细胞凋亡增加
与对照组37 ℃比较，43 ℃热打击细胞2 h后立即检测（0 h）未发现细胞凋亡增加，但在热打击3 h后细胞凋亡开始明显增加，细胞凋亡显示出热打击后时间依赖性增加（热打击后12 h神经元凋亡达43.2%）（图2），与对照组（37 ℃）比较差异有统计学意义（P
图2 热打击后不同时间点神经元细胞凋亡率比较
Fig 2 Comparison ofapoptoticneuronal at different time during heat stress
2.3 热打击导致神经元细胞内爆发性ROS增加
Pucciariello等[7]研究已发现遭受热打击可诱导细胞内ROS水平增加。为了证实神经元细胞遭受热打击后是否也会导致ROS水平的增加，本研究使用DCFH-DA法检测细胞内ROS水平，发现遭受热打击后神经元细胞内ROS水平爆发性增加，热打击后0 h即明显增加，2 h增加了近8倍（与对照组37 ℃比较，P
图3 热打击后不同时间点神经元细胞caspase-3蛋白比较
Fig 3 Comparison of caspase-3 inneurons at different time during heat stress
图4 热打击后不同时间点细胞内ROS比较
Fig 4 Comparison of ROS inneurons at different time during heat stress
2.4 ROS特异性清除剂MnTMPyP明显抑制了热打击诱导的神经元细胞凋亡和caspase-3蛋白的表达
为了证实ROS在热打击诱导的神经元细胞凋亡中的作用，研究使用了MnSOD活性类似物MnTMPyP（Calbiochem公司），对照组和热打击组神经元细胞在进行热打击处理前使用浓度为10 μmol/L的MnTMPyP预处理1 h，热打击2 h后继续培养12 h，检测细胞凋亡和caspase-3蛋白的表达。发现ROS清除剂MnTMPyP明显抑制了热打击诱导的细胞凋亡，凋亡细胞从47.42%将至18.45%，MnTMPyP处理热打击组与热打击组比较差异有统计学意义（P
A：MnTMPyP对不同温度热打击神经元细胞凋亡率的影响；B：MnTMPyP对不同温度热打击神经元细胞caspase-3表达的影响
图5 MnTMPyP对不同温度热打击神经元细胞凋亡的影响
Fig 5 The effect of MnTMPyP in apoptotic neurons at different temperature during heat stress
3 讨论
目前研究已证实，高温和热辐射诱导细胞凋亡在重症中暑病理生理过程中起着非常重要的作用[3]。本实验结果发现43 ℃热打击后2 h神经元细胞内ROS水平爆发性增加，43 ℃热打击后12 h可导致神经元细胞大量凋亡，进一步研究发现细胞内ROS水平与热打击诱导的神经元细胞凋亡密切相关。
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，这一过程广泛存在于高级的哺乳动物乃至人类，由各种死亡信号包括低氧、氧化应激、药物等触发[8-9]。细胞受各种凋亡信号刺激后通过一个复杂的多水平的调控，多种因素相互作用介导凋亡过程[9]。目前研究已发现，caspase 家族成员是细胞凋亡中核心的启动者和执行者，信号传递到核内切酶而执行死亡功能。在哺乳动物中已发现14种同源分子caspase1-14，其中caspase-3是细胞凋亡的主要执行者，通过特异性地裂解一套底物而导致细胞凋亡[10]。一旦caspase3 活化，细胞凋亡不可避免[10-11]。本研究显示43 ℃热打击后12 h，caspase-3活化程度与细胞凋亡趋势一致，推测热打击诱导的凋亡是通过caspase途径介导的。
ROS是需氧生物在氧气代谢的过程中产生的一类比氧气的性质更活泼的物质[11]。许多促凋亡信号如环境不利因素、损伤、辐射等都可使细胞内源性或外源性ROS升高或氧化还原平衡改变，这种改变既可能作为信号触发凋亡信号转导途径，也可能在凋亡启动后，加速凋亡过程[12]。近年来许多研究已证实热打击细胞可以导致细胞内ROS水平爆发性增加，并且认为ROS直接介导了细胞凋亡的发生[13-15]。中暑动物模型研究发现，遭受热打击后的动物脑内ROS水平明显升高[16]，但目前没有直接的证据支持热打击后ROS的升高是否直接与中枢神经系统损害相关。本实验使用MnTMPyP（ROS特异性清除剂）干预了热打击后神经元细胞内ROS的水平后发现，MnTMPyP可明显抑制43 ℃热打击后12h诱导的神经元细胞凋亡相关蛋白caspase-3的活化以及凋亡的发生，提示热打击后神经元细胞内ROS水平爆发性增加直接介导了细胞凋亡的发生。
参考文献
[1]苏磊.重症中暑防治回顾与启示[J].医学杂志，2011，36（9）：883-885.
[2]Boersma LVA，Leyten QH，Meijer JWR，et al.Cerebral hemorrhage complicating exertional heat stroke[J]. Clin Neurol Neurosur，1998，100（2）：112-115.
[3] Roberts GT， Ghebeh H， Chishti MA，et al. Microvascular Injury， Thrombosis， Inflammation， and apoptosis in the pathogenesis of heatstroke： a study in baboon model[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2008，28（6）：1130-1136.
[4]Pallepati P， Averill-Bates DA. Mild thermotolerance induced at 40 ℃ protects HeLa cells against activation of death receptor-mediated apoptosis by hydrogen peroxide[J]. Free Radical Bio Med， 2011， 50（6）： 667-679.
[5] Vogel P，Dux E，Wiessner C.Evidence of apoptosis in primary neuronal cultures after heat shock[J].Brain Research，1997，764（1/2）：205-213.
[6]刘晓敏，肖军军，董晓敏，等.应用细胞培养、流式细胞技术和Western Blot 检测氮杂糖化合物SZL在体外抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖与诱导凋亡的效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11（42）：8536-8540.
[7]Pucciariello C，Banti V，Perata P.ROS signaling as common element in low oxygen and heat stresses[J]. Plant Physiol Bioch， 2012，59：3-10[Epub].
[8] Sorrentino G， Mioni M， Giorgi C， et al. The prolyl-isomerase Pin1 activates the mitochondrial death program of p53[J].Cell Death Differ， 2013， 20（2）：198-208.
[9] 张贵斌，徐运兰，王伟，等.细胞周期抑制剂对局灶性缺血缺氧性脑损伤后神经细胞凋亡的影响[J].中华急诊医学杂志，2006，15（1）：15-18.
[10]Hsu YL，Yu HS，Lin HC，et al.Heat shock induces apoptosis through reactive oxygen species involving mitochondrial and death receptor pathways in corneal cells[J].Experimental Eye Research， 2011， 93（4）：405-421.
[11]焦俊霞，高维娟.细胞凋亡的信号转导机制研究进展[J].中国老年学杂志，2010，30（6）：853-856.
[12] 周海燕，李伟，周益锋，等.氯胺酮对沙土鼠脑缺血 - 再灌流损伤后细胞凋亡及Caspase-3、c-os的影响[J].中华急诊医学杂志，2003，12（7）：454-456.
[13] Li Z， Shi KJ，Guan LY，et al.ROS leads to MnSOD upregulation through ERK2 translocation and p53 activation in selenite-induced apoptosis of NB4 cells[J].FEBS Letters，2010，584（111）：2291-2297.
[14] 刘卉，刘延香.细胞凋亡与活性氧[J].现代肿瘤学杂志，2008，16（10）：1830-1832.
[15]Mustafi SB，Chakraborty PK，Dey RS，et al.Heat stress upregulates chaperone heat shockprotein 70 and antioxidant manganese superoxide dismutase through reactive oxygen species （ROS），p38MA PK，and Akt[J].Cell Stress and Chaperones，2009，14（6）：579-589.
[16]Iida R，Ueki M，Yasuda T.A novel transcriptional repressor， rhit， is involved in heat-inducible and age-dependent expression of Mpv17-like protein， a participant in peactive oxygen species metabolism[J].2010，30（10）：2306-2315.
抱恙在身范文第5篇
【摘要】 【目的】 探讨不同温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用。【方法】 将4株临床分离菌株分别接种于SDA、PDA、BHI、50 mg/kg羊血BHI及5 mg/kg GSBHI 5种培养基平皿上，每种培养基接种5个平皿，分别置于25 ℃、35 ℃、36 ℃、37 ℃及38 ℃含体积百分数为5%CO2的恒温箱中培养。观察菌落生长情况并计算酵母细胞转化率。【结果】 在38 ℃，平皿转化率为25%(只有1株菌发生了转化);在35 ℃和37 ℃时，平皿转化率分别是60%和85%;而在36 ℃时平皿转化率仅为45%。使用50 mg/kg羊血BHI和0.5%GSBHI培养基培养，65%培养皿上的菌株发生了酵母相转化，使用BHI培养基培养，45%培养皿上的菌株发生了酵母相转化，而使用SDA和PDA培养基培养，只有20%培养皿上的菌株发生了酵母相转化。37 ℃时，有3株菌在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基上的酵母细胞转化率均达到90%，1株菌在SDA、PDA和BHI培养基上的转化率均低于10%。【结论】 温度是影响申克孢子丝菌酵母相转化的关键因素，培养基的营养成分亦是影响转化效果的重要因素。
【关键词】 申克孢子丝菌; 酵母相转化; 温度; 培养基
Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of temperature and media on mycelium-to-yeast transformation of Sporothrix schenckii. 【Methods】 The clinical isolates 4 were inoculated on plates of media after reactivation. Each isolate was inoculated on plates of SDA， PDA， BHI， 50 mg/kg goat blood BHI and 5 mg/kg GSBHI， and 5 plates of each media were prepared because isolates of each meida were incubated at 25 ℃， 35 ℃， 36 ℃， 37 ℃， and 38 ℃. Growth of Sporothrix schenckii was observed and rates of transformation were calculated. 【Results】 At 38 ℃， the transformations rates were 25%(the only one Strain converted yeast). At 35 ℃ and 37 ℃， the transformations rates were 60% and 85%， respectively. At 36 ℃， the transformations rates were 45%. There were 13 of 20 plates converting yeast when 5% goat blood BHI and 0.5%GSBHI were used， 9 of 20 plates when BHI was used， 4 of 20 plates when SDA and PDA were used. At 37 ℃， transformation rates of 3 isolates reached 90% on medium of BHI， 50 mg/kg goat blood BHI和5 mg/kg GSBHI; However， the transformation rates of 1 isolate were less than 10% on SDA， PDA， and BHI. 【Conclusion】 Temperature is the key factor that affects mycelium-to-yeast transformation of Sporothrix schenckii， nourishments of media may also be necessary for transformation.
申克孢子丝菌属于双相型真菌，在自然界或室温培养为菌丝相，在体内或37 ℃培养为酵母相。申克孢子丝菌感染可导致孢子丝菌病，不仅可以引起皮肤组织的病变，还可侵犯内脏器官引起系统性病变，严重危害着人类的健康[1-2]。酵母相是申克孢子丝菌的致病相，申克孢子丝菌在体内从菌丝相到酵母相的转化是致病的一个关键步骤[3-4]。目前关于酵母相转化的研究多集中在基因水平[5-6]，而对于与致病性同样紧密相关的生化特点研究较少。本文研究了不同温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验菌株
菌株SUMS0382、SUMS0383、BMU02035和BMU00471经形态学和分子生物学鉴定为申克孢子丝菌。SUMS0382和SUMS0383分离自我科淋巴管型孢子丝菌病患者，BMU02035和BMU00471由北京大学真菌和真菌病研究中心惠赠，亦分离自孢子丝菌病患者。
1.2 培养基
沙堡弱琼脂(Sabouraud?蒺s agar， SDA)基、马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar， PDA)基、脑心浸汁琼脂(brain heart infusion agar， BHI)基、含50 mg/kg去纤维蛋白羊血清的脑心浸汁琼脂基(brain heart infusion agar plus 50 mg/kg goat blood， 50 mg/kg羊血BHI)及含5 mg/kg葡萄糖脑心浸汁琼脂基(brain heart infusion agar plus 5 mg/kg Glucose， 5 mg/kg GSBHI)，pH值均为7.0，购自广州市迪景微生物技术有限公司。
1.3 菌株活化
将实验菌株接种于 PDA 斜面培养基上，在含体积分数为5%的CO2 25 ℃恒温箱中培养，每隔7 d传代1次，连续传代2次，光镜下检查菌落形态，以保证菌株的纯度和生长活力。
1.4 酵母相转化
于超净工作台内，采用划线接种法将每株菌分别接种于SDA、PDA、BHI、50 mg/kg羊血BHI及5 mg/kg GSBHI 5种培养基上，每种培养基接种5个平皿，分别置于25、35、36、37及38 ℃含5%的体积分数为CO2恒温温箱中培养。观察菌落生长情况，每5 d传代1次，连续传代3次。
在所有平皿上的菌株传代3次生长至第5天时，用接种环挑取少量菌落，置于灭菌载玻片上，滴加乳酸酚棉兰或酚红染色后，置于光学显微镜下观察菌落形态。参照文献[7]计算每个平板上菌株的酵母细胞转化率，转化率 > 10%为酵母相转化成功。
1.5 统计学分析
利用精确概率法对所有菌株在不同温度和培养基下转化率的差异进行统计学分析，统计软件使用SPSS 16.0， P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 菌株活化
4 株申克孢子丝菌经活化后均生长良好，形成棕褐色有皱褶的典型菌落。
2.2 酵母相转化
2.2.1 申克孢子丝菌在不同温度的酵母相转化
在25 ℃的培养条件下，5种培养基上生长的菌株均表现为明显的丝状菌落，不能转化为酵母相。在38 ℃时，25%培养基平皿上的菌株发生了酵母相转化(为菌株BMU00471，其余菌株均不能生长)。35 ℃和37 ℃时分别有60%(12/20)和85%(17/20)培养基平皿上的菌株发生了酵母相转化。36 ℃时仅有45%(9/20)培养基平皿上的菌株发生了酵母相转化(表1)。菌株在各温度下的转化率的差异具有统计学意义(P < 0.001)。在光镜下计数不同温度时50 mg/kg羊血BHI培养基上生长的4株申克孢子丝菌酵母细胞的转化率，发现所有菌株在35 ℃和37 ℃的转化率均明显高于36 ℃和38 ℃，对于菌株BMU00471，其在35 ℃和37 ℃的转化率均可达到90%;38 ℃时所有菌株的转化率最低，菌株SUMS0382、SUMS0383、BMU02035均低于10%(图1)。不同温度下的酵母相菌落均在转种后的第2天开始出现，在第2 ～ 4天生长迅速，在第5天生长变得缓慢。在含5%去纤维蛋白羊血清的BHI培养基上，菌株BMU00471在35、36、37和38 ℃均可以转化为酵母相。在35 ℃和37 ℃时，酵母细胞生长良好，光镜下观察发现90%的菌丝可转化为酵母细胞;在36 ℃，酵母相菌株生长相对缓慢，光镜下仍可见到较多的菌丝片段和孢子;在38 ℃，菌株生长速度较36 ℃时快，但在光镜下发现转化的酵母细胞数量较36 ℃少(图2)。
2.2.2 申克孢子丝菌在不同培养基上的酵母相转化
在营养丰富的50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基平皿上，酵母相转化率均为65%，且生长最为旺盛;BHI培养基次之为45%;SDA和PDA培养基最少均为20%，且菌株在不同培养基上的转化率的差异具有统计学意义(P = 0.002，表2)。35 ℃时，在SDA和PDA培养基上菌株以菌丝相生长，而在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基上则以酵母相生长。36 ℃时，在SDA和PDA培养基上菌株不能生长，在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基上则以酵母相生长。37 ℃时，菌株SUMS0382、BMU02035和BMU00471在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基上的酵母细胞转化率均达到90%;菌株SUMS0383在SDA、PDA和BHI培养基上的转化率均低于10%(图3)。不同培养基上的酵母相菌落均在转种后的第2天开始出现，在第2 ～ 4天生长迅速，在第5天生长变得缓慢。 在35 ℃时，菌株BMU00471在BHI、50 mg/kg羊血BHI及5 mg/kg GSBHI培养基上均可转化为酵母相，且生长良好，光镜下观察可见转化良好的呈“雪茄”样的酵母细胞(图4);而在SDA及PDA培养基上，菌株BMU00471呈现不典型的丝状菌落，并可产生棕素，光镜下可见大量的菌丝及“梅花”样孢子(图4)。
3 讨 论
本研究发现在36 ℃时4株申克孢子丝菌临床分离株均可以转化为酵母相，而在以往仅Lima等[8]报道1株申克孢子丝菌在动物体内传代以后才具备在36 ℃发生酵母相转化的能力。在我们的研究中，36 ℃时有45%培养基平皿上的申克孢子丝菌发生了酵母相转化，但其酵母细胞转化率明显低于35 ℃和37 ℃时的转化率。36 ℃时菌株转化数量及转化率却同时低于35 ℃和37 ℃，其内在机制在进一步研究中。
本研究发现，35 ℃和37 ℃是申克孢子丝菌酵母相转化的适宜温度，与以往的研究相符[7]。在35 ℃和37 ℃，无论是发生转化的菌株数量还是酵母细胞的转化率，均明显高于36 ℃和38 ℃。但35 ℃和37 ℃哪个更适合申克孢子丝菌的酵母相转化呢?我们的研究显示，在37 ℃而不是35 ℃，发生酵母相转化的菌株数量最多，酵母细胞转化率最高，与Dixon等[7]研究显示的35 ℃适合申克孢子丝菌环境分离株的酵母相转化，而37 ℃适合临床分离株的转化现象一致。也有学者发现分离自固定型孢子丝菌病的菌株只能在35 ℃发生酵母相转化，分离自淋巴管型孢子丝菌病的菌株无论在35 ℃还是37 ℃均可发生酵母相转化[9]。本研究中分离自皮肤淋巴管型孢子丝菌病患者的菌株SUMS0382和SUMS0383，既可在35 ℃也可在37 ℃发生酵母相转化。在38 ℃仅菌株BMU00471可以转化为酵母相，其余菌株不能生长。Ghosh等[10]的研究显示申克孢子丝菌在30 ～ 37 ℃生长良好，在40 ℃生长受到了抑制，并没有明确指出在38 ℃申克孢子丝菌是否能够生长和发生转化。有学者证明钙调蛋白激酶可以调控申克孢子丝菌从菌丝相到酵母相的转化[4]。我们推测温度在申克孢子丝菌酵母相转化过程中的作用可能与钙调蛋白激酶的活性有关。
本研究首次发现在临床常使用的PDA和SDA培养基上，申克孢子丝菌可以转化为酵母相，然而营养丰富的BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基上发生酵母相转化的申克孢子丝菌数量和酵母细胞的转化率明显高于PDA和SDA培养基，可见营养成分是影响申克孢子丝菌酵母相转化的重要条件。以往文献[10-12]报道申克孢子丝菌的酵母相转化使用的培养基有胱氨酸葡萄糖血琼脂基、BHI、含50 mg/kg去纤维蛋白羊血的BHI和胰蛋白酶大豆琼脂基，均可获得较好的转化率，我们利用含5 mg/kg葡萄糖的BHI培养基对申克孢子丝菌进行酵母相转化，其转化菌株的数量和酵母细胞转化率与含50 mg/kg去纤维羊血BHI培养基的一致，值得在临床推广。
研究显示不同培养基上的酵母相菌落均在转种后的第2天开始出现，在第2 ～ 4天生长迅速，在第5天生长变得缓慢，与Robert[13]在电镜下观察到的时间一致。但Hempel[14]将豚鼠的外周巨噬细胞加入培养基中，可将申克孢子丝菌酵母细胞的转化时间缩短至24 h。
总之，本研究通过探讨不同温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用，明确了温度是影响申克孢子丝菌酵母相转化的关键因素，培养基的营养成分亦是影响转化效果的重要因素，从而进一步证实了申克孢子丝菌酵母相转化条件的多样性，为抑制申克孢子丝菌在体内的酵母相转化，阻断其致病机制提供了研究基础。
参考文献
Agarwal S， Gopal K， Umesh， et al. Sporotrichosis in Uttarakhand (India)： a report of nine cases [J]. Int J Dermatol， 2008， 47(4)： 367-371.
Ramos-e-Silva M， Vasconcelos C， Carneiro S， et al. Sporotrichosis [J]. Clin Dermatol， 2007， 25(2)： 181-187.
Toledo MS， Levery SB， Straus AH， et al. Dimorphic expression of cerebrosides in the mycopathogen Sporothrix schenckii [J]. J Lipid Res， 2000， 41(5)：797-806.
Aquino-Pinero E， Rodriguez-del Valle N. Characterization of a protein kinase C gene in Sporothrix schenckii and its expression during the yeast-to-mycelium transition[J]. Med Mycol， 2002， 40(2)： 185-199.
Valentin-Berrios S， Gonzalez-Velazquez W， Perez-Sanchez L， et al. Cytosolic phospholipase A2： a member of the signalling pathway of a new G protein alpha subunit in Sporothrix schenckii[J]. BMC Microbiol， 2009， 9： 100.
Valle-Aviles L， Valentin-Berrios S， Gonzalez-Mendez RR， et al. Functional， genetic and bioinformatic characterization of a calcium/calmodulin kinase gene in Sporothrix schenckii [J]. BMC Microbiol， 2007， 7： 107.
Dixon DM， Salkin IF， Duncan RA， et al. Isolation and characterization of Sporothrix schenckiifrom clinical and environmental sources associated with the largest U.S. epidemic of sporotrichosis [J]. J Clin Microbiol， 1991， 29(6)： 1106-1113.
Lima RF， Santos Brito MM， Schaffer GM， et al. Evaluation of the in vitro and in vivo dimorphism of Sporothrix schenckii， Blastomyces dermatitidis， and Paracoccidioides brasiliensis isolates after preservation in mineral oil [J]. Can J Microbiol， 2004， 50(6)：445-449.
Kwon-Chung KJ. Comparison of isolates of Sporothrix schenckii obtained from fixed cutaneous lesions with isolates from other types of lesions[J]. J Infect Dis 1979， 139(4)： 424-431.
Ghosh A， Maity PK， Hemashettar BM， et al. Physiological characters of Sporothrix schenckii isolates[J]. Mycoses， 2002， 45(11-12)： 449-454.
Trilles L， Fernandez-Torres B， Dos Santos Lazera M， et al. In vitro antifungal susceptibilities of Sporothrix schenckii in two growth phases[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2005， 49(9)： 3952-3954.
Lane JW， Grrison RG， Field MF. Ultrastructural studies on the yeastlike and mycelial phases of Sporotrichum schenckii [J]. J Bacteriol， 1969， 100(2)： 1010-1019.