细胞凋亡

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细胞凋亡范文第1篇

【关键词】 肝细胞

肝细胞凋亡的病理学特征为肝细胞的嗜酸性变，又称嗜酸性坏死。表现为个别肝细胞胞浆的嗜伊红性增强，胞核固缩直至消失，形成嗜酸小体（eosinophilic body），脱离肝细胞索坠入肝窦或窦间隙。周围可出现CTL、枯否细胞，将凋亡小体吞噬、降解。嗜酸性小体主要出现在急性病毒性肝炎或慢性病毒性肝炎活动期，也可出现在药物性肝炎。关于细胞死亡过程的研究，近年来已成为国内外生物学、医学研究的一个热点 ［1～3］。本文复来有关肝损伤与肝细胞凋亡机制国内外文献作如下综述。

肝细胞死亡可分为凋亡和坏死，二者在形态、发生机制以及概念上都有很大的差别。由体内、体外因素触发的细胞内预存的死亡程序而导致细胞程序性死亡的过程称为细胞凋亡（apoptosis，APO）。又称程序性死亡（programmed cell death，PCD）。凋亡属于细胞自主的生理性死亡，主要表现为：细胞皱缩，细胞核染色质浓缩，胞核空泡状，染色质DNA断裂成片段，但细胞膜仍保持完整。凋亡常发生于生理环境。而坏死多由肝细胞受各种致病因素作用导致，表现为细胞肿胀，细胞膜丧失完整性，进而形成噬酸性小体或者溶解。肝脏中有许多刺激可启动肝细胞的死亡，如缺血、再灌等引发的缺氧、活性氧代谢物、药物等毒性化合物以及乙醇、药物、病毒性肝炎等引发的TNF释放和自身免疫型、药物诱导及病毒性肝炎等诱发的Fas-L，Granzyme B等等。一些刺激启动后需要死亡受体（death receptors）及细胞内信号机制的参与，从而引发程序性细胞死亡；而另一些刺激则可能绕过死亡受体参与的级联反应或者直接嵌入级联反应的下游起作用。

肝细胞凋亡的过程，细胞凋亡是一种级联反应。TNF-α或者Fas-L等配体可能引发凋亡，这些配体可与细胞表面的死亡受体结合，也可被细胞内的事件激活并插入级联反应。肝脏中细胞的凋亡发生在各种细胞类型中，包括肝实质细胞、Kupffers细胞、内皮细胞和星状细胞等。研究表明，多种类型的肝损伤，包括暴发性肝衰竭、病毒性肝炎、肝硬化、自身免疫性肝病以及肝脏肿瘤的发病机制都和凋亡密切相关［2］，因此，研究肝细胞的凋亡对各类肝病的治疗有重要意义。

胱冬肽酶（caspase）参与的凋亡途径是细胞很重要的死亡途径。 经典的凋亡级联反应从死亡受体（death receptor）开始。死亡受体包含一个位于胞质内的死亡结构域（death domaine），死亡结构域可与适应蛋白（adaptor protein）结合形成骨架结构，并可使起始或效应胱冬肽酶自我活化。当Fas-L与Fas结合或TNF-α与TNF-R1结合后，单个的受体分子形成三聚体使死亡受体聚集成簇。然后Fas与Fas相关的死亡受体蛋白（Fas associating protein with death domain，FADD），TNF-R1与TNF受体相关的死亡受体蛋白（TNFR associating protein with death domain，TRADD）结合，然后与FADD结合。FADD与caspase 8结合，使其活化。TRADD也与受体相互作用蛋白（RIP）和TNF受体相关因子2（TRAF2）等蛋白质结合。这些结合可活化激酶，继而活化NF-κB等转录因子，从而激活相关基因的转录，使肝细胞对抗TNF-α引起的凋亡。

在凋亡的级联反应中，一类重要的物质就是胱冬肽酶（caspase）。这类蛋白水解酶的活性位点（active site）有还原型半胱氨酸（cys），水解位点位于底物的天冬氨酸（asp）残基后。caspase在细胞内以无活性的酶原形式存在，它们可被分为3组：（1）与细胞因子产生相关的ICE-like caspase （如caspase 1，4，5，13）；（2）死亡信号或者启动caspase，它传送死亡程序，而并无不可逆水解蛋白质的功能（如caspase2，8，9，10）；（3）死亡效应或者执行caspase，它断裂所选择的底物，这样，当细胞本身的修复系统不能发挥作用时，它就可以断裂细胞骨架或细胞核。在不同的细胞类型中，凋亡有两条不同的信号传导途径［3］：（1）启动caspase被激活后，产生一强的信号反应，然后直接活化效应caspase；（2）当启动caspase活化的程度不够充分时，它需要一个放大过程，这一过程通常有线粒体的参与。当起始caspase作用于Bcl-2家族中某些成员（如Bid）或者神经酰胺使之被修饰，然后该分子（Bid或者神经酰胺）在线粒体分子上定位，改变线粒体外膜通透性，使细胞色素C和其他与凋亡相关的线粒体蛋白的前体如凋亡诱导因子（AIF）等由线粒体内释放出来。细胞色素C与胞质骨架蛋白（如apaf-1）和procaspase9结合，这一复合物一般被称作凋亡小体（apoptosome）。在ATP及其水解酶存在时，细胞色素C-apaf-1复合物寡聚化，使得procaspase9（信号caspase）自身活化，然后caspase9激活caspase3（效应caspase）。这样促进了细胞凋亡效应相互的作用。

线粒体与肝脏损伤:近年来关于线粒体的研究表明，线粒体在细胞死亡中起着关键的作用。线粒体功能障碍已成为肝脏损伤的一个重要机制，它在细胞凋亡以及坏死过程都起着重要的作用［4］。细胞色素C是线粒体释放的前凋亡（proapoptotic）因素。在细胞质，细胞色素C与凋亡激活因子Ⅰ（apoptotic-activating factor-1）结合，再与ATP（或dATP）结合，激活caspase 9，然后激活caspase 3，caspase 3刺激凋亡的效应途径，导致ADP-核糖聚合酶（PARP）断裂，核小体间DNA水解，细胞皱缩，染色体边缘化，核小叶形成。caspase 也参与线粒体释放细胞色素C的上游过程。TNF-α和Fas-L与其受体的结合激活caspase8。Caspase 8断裂Bid，然后定位至线粒体，诱导细胞色素C的释放。

转贴于

线粒体的瞬时通透性孔道（MPT）［5～7］是线粒体内膜一种可由铜离子诱导的可逆性通道，它在跨膜线粒体蛋白释放至胞液的过程中起到重要作用。MPT使得线粒体内外膜连接处一种复杂的蛋白质大通道开放，该孔道具有非特异性以及高传导性，它允许分子量

与死亡程序相关的另一重要成分是Bcl-2 家族［8］。这一家族的不同成员对凋亡或坏死可能具有促进或抑制两种不同的作用，其主要作用靶点是线粒体。Bcl-2 家族成员或存在于细胞之中，或以非活性态与膜结合。其中主要的抗凋亡成分都是膜结合态的，有一些可与线粒体膜结合。它们的重要功能之一就是调节MPT。Bcl-2家族成员能形成同源或异源二聚体，不同的二聚体可能对凋亡产生不同的作用（诱导或抑制）［9］。除了形成二聚体外，某些成分还具有离子通道的作用，这对促进或抑制线粒体的肿胀具有重要作用。这一家族之间的相互作用及其复杂性提示尚有很多方面值得我们对其去研究。

与肝细胞凋亡相关的基因有数十种，分为凋亡抑制性基因、促凋亡基因和双向调控基因。三者处于动态平衡状态，共同控制着细胞的增殖或凋亡。凋亡抑制性基因主要为Bcl-2，其抗凋亡机制主要为抑制线粒体释放促凋亡因子、维持钙稳定、抑制caspase活化、直接抗氧化及抑制促凋亡蛋白Bax、Bak的细胞毒作用。促凋亡基因的代表为P53基因，主要在细胞周期的G1期发挥作用，如发现DNA有缺陷，则阻止细胞进入细胞周期，同时启动DNA修复机制，如DNA损伤不可修复时，则启动凋亡机制，将损伤细胞清除。当P53发生突变后，则失去促凋亡的功能。P53基因是促使肿瘤发生的癌基因之一。凋亡的双向调控基因c-myc是一种癌基因，即能诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡。

【参考文献】

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细胞凋亡范文第2篇

1　Fas分子

人Fas分子定位于10号染色体q23，cDNA长度为2534bp，编码325个氨基酸残基36KD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子结构包括3个部分，膜外的N末端区，跨膜区和膜内的C末端区. 膜外区为155个氨基酸组成的信号肽区，其氨基酸序列相对保守且具有膜受体特征，当与其配体FasL结合后启动凋亡信号的跨膜传递，跨膜区位于分子结构的中段，由15个氨基酸残基构成，构成胞质区的145个氨基酸残基中的80个在传递凋亡信号中发挥着关键性的作用，故将该区称为“死亡区域”(death dormain)，而Fas分子又被称为“死亡受体”［4］.

人Fas分子主要分布于活化的T，B淋巴细胞上，造血细胞及多种肿瘤细胞上也有表达，尽管正常人肝细胞并不表达Fas分子，但在病变的肝细胞上却有广泛的表达，且其表达强度与肝细胞的损伤程度及肝病的预后有密切的关系［5，6］. 目前已证实，肝脏病变时，肝实质细胞枯否细胞，肝窦内皮细胞和肝内浸润的淋巴细胞均可表达Fas分子或其配体，但因其在表达的部位不同，其生物学意义也各不相同［7］.

2　Fas分子介导的肝细胞凋亡的信号传递机制

Fas分子与其配体，单抗或其自身结合均可形成二聚体而启动凋亡信号的传递，但Fas分子介导的凋亡信号的传递无需细胞核的参与，不伴有基因的活化，并可以导致无核细胞凋亡发生，这与其他凋亡信号的传递有明显的不同.

尽管Fas分子介导的细胞凋亡的信号传递的详细分子生物学机制还未完全明确，目前认为其主要过程包括以下步骤［8-12］. ①死亡受体分子的活化：由于Fas分子中的死亡结构域有相互聚集的倾向，死亡配体与其相应的死亡受体(Fas-FasL)结合后诱导Fas分子中的死亡结构域与转接器蛋白(adaptor portein)分子中的死亡结构域结合，转接器蛋白又称Fas分子相关蛋白(Fas-associated death dormain， FADD). ②凋亡酶体(apoptosome)的形成：FADD分子的另一端含有可与胱冬酶原-8(pro-csapase-8)相结合的死亡效应器结构域(death effector dormain， DED)，诱导两者的结合. 这样由Fas-FasL-FADD-Pro-caspase 8串联构成的复合物称为“凋亡酶体”. ③胱冬酶(caspase-8)家族的活化：胱冬酶被认为是凋亡效应器酶，凋亡酶体中由于胱冬酶原的聚集而导致自身的水解与活化形成有活性的胱冬酶-8(caspase-8)，并可以依次激活其同源酶家族中的其他酶原形成自身激活瀑布(如caspase-8...caspase 6，7...caspase 3)，而胱冬酶-3可以激活DNA降解酶，降解DNA为特异性片段导致细胞凋亡的发生.

3　Fas分子在肝内表达的生物学意义

肝内多种细胞可以被诱导而表达Fas分子，但其表达的细胞不同，强度不同而具有不同的生物学意义.

3.1　在肝实质细胞上的表达　Weintraub et al［13］在Fas和FasL基因双缺陷小鼠(B6/lprgld)模型上发现，尽管小鼠能正常的发育与生长，但在无任何炎 症刺激时肝内即有大量的炎性细胞浸润，而向肝实质细胞内导入微量的Fas并给以弱刺激即可以诱导广泛的肝实质细胞凋亡，提示Fas分子在肝实质细胞的表达对肝细胞的功能调节具有极其重要的意义. 最近的研究还证实Fas分子介导的肝细胞凋亡是各型肝病的肝细胞损伤与死亡的主要机制之一，Fas分子在肝实质细胞上的表达强度与HBV和HCV在体内的复制程度有关，并与肝实质细胞的损伤程度相一致. 显然，病毒性肝炎时Fas分子在肝实质细胞上的表达的生物学意义在于清除病毒感染细胞而避免诱发过度的炎症反应而使非感染细胞受累. 业已证明Fas分子介导的肝细胞凋亡，即肝实质细胞的损伤是原位肝移植后排斥反应时肝实质细胞的损伤的主要机制［14］.

3.2　在肝星型细胞上的表达　在肝组织损伤过程中，肝星型细胞(hepatic stellate cell， HSC)从静止型向激活型转变，并成为肝组织损伤修复过程中细胞外基质的主要来源. Saile et al［5］对体外体内的FSC激活后的转归研究发现，静止的FSC无凋亡现象，但随着时间的延长，凋亡现象逐渐增加，过度型8%+5%，激活型18%+8%，同时伴有Fas/FasL表达的增加. FSC的凋亡可以被Fas阻断型抗体完全阻断，而给以Fas激活型抗体则95%的FSC呈现凋亡现象. 据此，Eischen et al［15］认为，肝组织损伤修复后激活的FSC转归可能有以下两个方面：①通过Fas/FasL途径凋亡，②转回静止状态. 前者可能是清除激活过量FSC的一个主要方式.

3.3　在枯否细胞和肝窦内皮细胞上的表达　Muschen et al［7］在内毒素刺激的小鼠原代培养枯否细胞，肝窦内皮细胞和肝实质细胞上发现，内毒素刺激后，枯否细胞和肝窦内皮细胞上FasL分子表达增加，并可见可溶性Fas的分泌，而肝实质细胞上仅见Fas分子表达的增加，未见Fas分子表达的改变，这提示枯否细胞和肝窦内皮细胞是Fas分子介导肝实质细胞凋亡的主要调节者，即枯否细胞和肝窦内皮细胞表达FasL的强度部分决定肝实质细胞凋亡及损伤的程度. 其生物学意义可能还包括清除肝内激活的过多的淋巴细胞，促进其凋亡，避免对肝细胞的过度损伤. 而血清可溶性Fas分子升高的意义可能在于阻断FasL的生物学作用，避免过度的肝细胞凋亡的发生.

3.4　在肝内浸润淋巴细胞上的表达　FasL主要表达在激活的NK及T淋巴细胞上，以旁分泌机制介导周围细胞的细胞毒活性，或以自分泌机制启动激活诱导的细胞凋亡(activation-induced cell death， AICD)而“自杀”. RT-PCR检测小鼠新鲜分离的肝内NK细胞显示，肝内未受抗原刺激的NK细胞具有结构性表达FasL的功能，能杀死转染Fas的淋巴细胞，而对Fas表达阴性的间质细胞无作用，在给以可溶性Fas分子的Fc片段可以阻断这种杀伤［15］. 人静息的NK细胞并不表达FasL，但被刺激和诱导(如IL-2诱导)后可以表达，并特异性地杀伤表达Fas的细胞，血清IL-2浓度的升高是细胞免疫激活的标志，这提示炎症时肝内NK细胞的激活可以杀伤表达Fas的肝实质细胞，参与肝细胞损伤的调节.

4　肝细胞Fas分子表达的干预与调节

由于Fas分子系统在肝细胞上表达的广泛性与复杂性，参与肝细胞凋亡的调控，在肝细胞功能稳态的调节中具有重要意义，因此，调节肝细胞Fas分子的表达及其信号传递就具有及其重要的意义.

4.1　诱导Fas分子的表达，促进肝细胞的凋亡　细胞凋亡是宿主清除病毒感染细胞的有效抗病毒机制，可以被CTL所触发，也可以被炎性细胞因子或病毒裂解细胞的产物所诱导. 某些病毒如Bcl-2同源病毒E1B19K编码的病毒蛋白可以抑制Fas分子凋亡信号传递的效应酶——胱冬酶的激活而抑制病毒感染细胞的凋亡，使病毒感染细胞不能被清除而导致病毒感染的慢性化. Bertin et al［16］发现，马疱疹病毒Ⅱ型(EHV-2)和软疣病毒MC-159编码的E-8蛋白和MC-159蛋白是含有死亡效应序列的抗凋亡蛋白，可与FADD结合而抑制Fas介导的凋亡信号的传递，导致感染病毒细胞 的凋亡抑制，造成病毒感染的持续与慢性化. HBV和HCV感染的慢性化是否与病毒诱导的抗凋亡蛋白的产生有关目前尚无报道，但诱导病毒感染细胞的Fas分子的表达显然有助于病毒感染细胞的清除与肝纤维化的逆转.

不可修复的细胞凋亡与肿瘤的发生与发展有关. Kubo et al［17］对35例肝癌标本进行DNA末端标记及Fas/FasL免疫组化的检测发现，肝癌组织肝细胞凋亡明显较周围正常肝组织为少，Fas/FasL在癌组织的表达也明显低于癌周组织(P＜0.0001)，这提示促进肝癌细胞Fas/FasL表达有助于肝癌的治疗. 业已证明Fas分子在细胞上的表达可以被细胞因子所调节. Zhou et al［18］发现，人周围血T细胞对Fas介导的凋亡信号不敏感，但给以IL-2 10kU/L处理后，T细胞即恢复对Fas敏感的表型，提示IL-2可以上调Fas分子的表达，促进Fas介导的凋亡信号的传递.

4.2　抑制Fas分子的表达，阻断凋亡信号的传递　肝移植失败的主要机制是由CTL介导的免疫排斥，目前认为Fas分子介导的细胞凋亡是肝移植排斥反应中CTL主要的细胞毒机制［19］. 因此，抑制肝移植后肝实质细胞Fas分子的表达对抗排斥反应具有极其重要的意义. 已证实cyclosporin A可以阻断Ca2+依赖性磷酸化酶，而抑制Fas分子的表达，酪氨酸激酶抑制剂(herbimycin A)可以抑制Fas分子介导的凋亡信号的传递的启动［5］.

胱冬酶是Fas/FasL诱导肝细胞凋亡的主要效应酶，Jones et al［12］发现该酶抑制剂Ac-DEVD-CHO在极低浓度下(1μm/L-10μm/L)对肝细胞凋亡即具有强有力的抑制作用，提示胱冬酶特异性蛋白酶抑制剂可能是将来新的一类“保肝药”，而被用于各型肝细胞损伤的治疗。

总之Fas分子系统作为目前肝病领域里新的研究热点，进展十分迅速，但以下问题仍未解决：①慢性HBV和HCV感染时，Fas分子表达增强，但凋亡信号的传递却明显受抑，其分子机制是什么. ②慢性肝病时肝纤维化发生过程中HSC的抗凋亡机制是什么. ③调节Fas分子信号传递的更有效药物. ④安全、稳定、高效的Fas/FasL质粒载体的构建. 以上问题的解决显然将成为肝病研究和治疗上新的里程碑.

综上所述，抑制肝细胞Fas表达将有助于减轻肝细胞损伤的程度，提高肝移植的成活率，而促进肝细胞Fas分子的表达将为肝癌和肝纤维化的治疗开辟新的途径.

5　参考文献

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11 Salvesen GS， Dixit VM. Caspase; intracellular signal by proteolysis. Cell. 1997;91:443

12 Jones RA， Johnson VL， Buck NR， Dobrota M， Hinton RH， Chow SC， Kass GE. Fas mediated apoptosis in mouse hepatocytes involves the processing and activation of caspases. Hepatology. 1998;27:1632

13 Weintraub JP， Godfrey V， Wolthusen PA， Cheek RL， Eisenberg RA， Cohen PL. Immunological and pathological consequences of mutations in both Fas and Fas ligand. Cell Immunol. 1998;186:8

14 Yokoyama I， Hayakawa A， Hayashi S， Kobayashi T， Negita M， Takagi H. Fas antigen expression of hepatocytes and its modification by immunosuppressants. Dig Dis Sci. 1997;42:2471

15 Eischen CM， Leibson PJ. Role of NK cell associted Fas ligand in cell-mediated cytotoxicity and apoptosis. Res Immunol. 1997;148:164

16 Bertin J， Armstrong RC， Ottilie S， Martin DA， Wang Y， Banks， S， Wang GH. Senkevich TG. Alnemri ES， Moss B， Lenardo MJ， Tomaselli KJ， Cohen JI. Death effector domain-containing herpesvirus and poxvirus proteins inhibit both Fas and TNFR1-induced apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94:1172

17 Kubo K， Matsuzaki Y， Okazaki M- Kato A， Kobayashi N， Okita K， The Fas system is not significantly involved in apoptosis in human hepatocellular carcinoma. Liver. 1998;18:117

细胞凋亡范文第3篇

ISSN Print: 2168-3832

ISSN Online: 2168-3840

Aims & Scope

Open Journal of Apoptosis (OJApo) is an open access journal published quarterly. The goal of this journal is to provide a platform for scientists and academicians all over the world to promote, share, and discuss various new issues and developments in different areas of apoptosis. 

All manuscripts must be prepared in English and are subject to a rigorous peer-review process. Generally, accepted papers will appear online within 3 weeks followed by printed hard copy. Topics to be covered by this journal include, but are not limited to:

· Apoptosis DNA fragmentation· Apoptosis implication in aging· Apoptosis implication in AIDS· Apoptosis implication in autoimmune disease· Apoptosis implication in cancer· Apoptosis implication in cardiovascular disease· Apoptosis implication in neurodegenerative disorders· Apoptosis implication in osteoporosis· Apoptosis implication in viral infection· Apoptosis in plants· Apoptosis pathways· Caspase independent apoptosis· Defective apoptotic pathways· Hyperactive apoptosis· Inhibition of apoptosis· Programmed cell death

We are also interested in:

1) Short reports—2-5 page papers where an author can present an idea with theoretical background, but has not yet completed the research needed for a complete paper or an author presents preliminary data;

2) Short communications—2-5 page papers; 

3) Technical notes—2-5 page papers;

4) Letters to the Editor (the number of pages is not restricted);

5) Reviews or book reviews—comments and critiques (the number of pages is not restricted);

细胞凋亡范文第4篇

【关键词】血红素氧合酶-1;肾;汞;凋亡;大鼠

氯化汞（HgCl2）是一种肾毒性药物，常用于制作急性肾功能衰竭的动物模型。近年研究揭示，汞能促进细胞线粒体产生大量H2O2等活性氧，后者进一步诱导的细胞凋亡在汞所致的急性肾衰中起着重要作用［1-2］。血红素氧合酶-1（HO-1）是一种抗氧化酶，广泛参与各种组织细胞应对氧化应激时的防御机制，是机体拮抗氧化应激损伤最重要的内源性保护物质，但HO-1能否抑制汞介导的肾细胞凋亡及急性肾损伤罕见报道。为此，我们拟应用血晶素与锌原卟啉Ⅸ（Zn-PPⅨ）分别特异性诱导与抑制HO-1，以探明HO-1对HgCl2引起大鼠肾细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。

1材料与方法

1.1药品与试剂

血晶素、ZnPPⅨ为Sigma公司产品。肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（TAOC）、兔抗鼠多克隆HO-1IgG抗体及Bcl-2IgG抗体、SABC免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂等均购自武汉博士德生物工程有限公司。TUNEL法凋亡检测试剂盒购于Boehringer公司，其它试剂均为分析纯。

1.2动物分组与标本采集

选用健康雄性Wistar大鼠64只（体重250～310g），随机分为4组:对照组、单纯染汞组、HO-1诱导组和HO-1抑制组，每组16只。预先分别给各组大鼠腹腔注射等量生理盐水、空白液（由0.1mmol·L-1NaOH和0.1mmol·L-1PBS液按体积比1∶24配制而成的混合溶液）、溶于空白液中的血晶素（30mg·kg-1）及ZnPPⅨ（20mg·kg-1），8h后，每组均任挑8只处死，取肾脏，一部分肾置于4%的中性甲醛液中固定作HO-1免疫组化染色，其余部分于-80℃保存待测HO-1活性。余鼠除对照组经腹腔注射等量生理盐水外，其余3组均经腹腔注射HgCl2（2mg·kg-1）溶液，动物自由进食饮水，24h后各组大鼠经2%戌巴比妥钠40mg·kg-1腹腔注射麻醉，开腹经下腔静脉抽血检测肌酐（Cr）、尿素氮（BUN），然后迅速摘出肾脏，取部分肾组织置于4%的中性甲醛液中固定，剩余肾组织于-80℃保存待测各项生化指标。

1.3免疫组化检测

取上述甲醛液固定肾组织，常规石蜡包埋切片（厚6μm），二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，于1g·L-1TBS中微波修复抗原10min，再置于3%H2O2中15min，灭活内源性酶，PBS液反复冲洗3次，采用SABC法按试剂盒说明书分别滴加HO-1或Bcl-2抗体（抗体滴度均为1∶200），DAB显色，封片，400倍镜下随机选择5个不重叠视野观察肾小管上皮细胞，胞浆见棕色颗粒者为阳性染色细胞。HO-1蛋白表达量采用CD-8病理彩色图像分析系统测定平均光密度值表示，Bcl-2蛋白表达量采用阳性染色指数（PI）表示，PI（%）=阳性染色细胞数/视野内所有细胞数×100%。

1.4生化指标检测

血Cr、BUN分别采用苦味酸法和二乙酰法，按试剂盒说明书测定。肾组织TAOC和MDA采用化学比色法，操作按试剂盒说明书进行。另取各肾组织标本约0.5g，加蔗糖Tris缓冲液制成组织匀浆，差速离心法分离微粒体，考马亮蓝法测定蛋白浓度，根据HO-1降解血红素生成胆红素的原理，参照何洁［3］的方法测定HO-1活性，以1mg蛋白1h催化血红红蛋白降解生成胆红素的量表示肾组织HO-1活性（nmol·mg-1·h-1）。

1.5TUNEL法检测细胞凋亡

肾组织经4%中性甲醛液固定过夜，脱水，透明，石蜡包埋，切片（厚6μm），置于包被有多聚赖氨酸的载玻片上，严格按试剂盒说明书进行操作，最后用苏木素复染细胞核，400倍光镜下观察，胞核染成棕黄色者为凋亡细胞，每张切片选10个不重叠视野，每个视野连续计数100个肾小管上皮细胞，以凋亡细胞所占的百分比作为凋亡指数（AI）。

1.6统计学分析

所得数据均为计量资料，以x-±s表示，组间比较采用F及q检验，应用SPSS11.5软件进行统计分析。

2结果

2.1肾组织内HO-1蛋白表达与活性

免疫组化染色显示，仅HO-1诱导组出现HO-1明显表达，主要定位于肾小管上皮细胞的胞浆中，表现为肾小管上皮细胞胞浆普遍被染成棕褐色，对应的HO-1活性也显著升高。而其余3组肾内HO-1表达较少，染色极浅，对应的HO-1活性也较低，其中HO-1抑制组HO-1活性显著降低。组间比较见表1。表1各组HO-1蛋白表达与活性水平比较（略）

2.2肾组织及血生化指标检测结果

与对照组比较，单纯染汞组及HO-1抑制组TAOC降低而MDA、Cr、BUN均明显升高，HO-1诱导组则TAOC明显升高（P<0.01），MDA、Cr、BUN虽有升高趋势，但无显著性差异（P>0.05）。与单纯染汞组比较，HO-1诱导组TAOC明显升高，而MDA、Cr、BUN均显著下降，HO-1抑制组则相反，TAOC明显下降，而MDA、Cr、BUN均显著升高。HO-1诱导组与HO-1抑制组间各指标均有显著性差异（均P<0.01）。见表2。表2各组血生化检测结果比较（略）

2.3Bcl-2蛋白表达

对照组肾内几乎不表达Bcl-2，单纯染汞组Bcl-2阳性染色细胞在近曲小管较常见，远曲小管相对较少，HO-1诱导组肾小管Bcl-2阳性染色细胞显著增多，而HO-1抑制组肾小管Bcl-2阳性染色细胞则较少，各组间比较见表3。表3各组Bcl-2蛋白表达及细胞凋亡情况比较（略）

2.4细胞凋亡检测结果

对照组肾内凋亡细胞数少见。单纯染汞组见凋亡细胞，主要为近曲小管上皮细胞出现凋亡，与之相比较，HO-1诱导组细胞凋亡明显减少，而HO-1抑制组细胞凋亡则显著增多，组间比较见表3。

3讨论

肾脏是无机汞攻击的主要靶器官，但汞致肾损伤的确切分子机制尚未完全阐明。已有研究显示，给予HgCl2能够显著增加肾内H2O2等活性氧生成［4］，降低肾内重要抗氧化剂谷胱甘肽的含量，并降低肾内超氧化物歧化酶的活力，同时生成过量的脂质过氧化产物丙二醛［5-6］。当给予外源性抗氧化剂或自由基清除剂，则可明显减轻HgCl2所致的肾损伤，从而提示促氧化应激是汞致急性肾损伤的重要机制［5］，进一步研究发现，活性氧除直接引起生物膜脂质过氧化导致细胞不可逆损伤外，还可通过激活P38MAPK等多途径介导细胞凋亡［7］。本研究结果也显示，单纯染汞组较对照组肾内TAOC显著降低，MDA生成增多，出现肾小管上皮细胞凋亡增加和肾功能降低，从而证实了HgCl2的氧化应激性肾损伤机制。HO-1是近年倍受重视的细胞内源性抗氧化酶，本质上属于应激蛋白，能在各种氧化应激状态下出现适应性表达，发挥抗氧化等多种细胞保护作用。HO-1的抗氧化性源于其对促氧化的游离血红素的降解及生成具有强大抗氧化能力的胆红素，后者能非特异性清除多种自由基［8］。本研究结果显示，预先应用血晶素诱导HO-1蛋白表达及活性升高后，可明显升高肾组织TAOC，降低MDA生成，抑制细胞凋亡并改善肾功能，而预先抑制HO-1蛋白的活性，则会加重汞所致的氧化应激损伤，增加细胞凋亡并使肾功能恶化，从而支持抗氧化作用是HO-1抗汞所致细胞凋亡和肾功能损伤的重要机制。

曹秉振等［9］报道，汞可能通过下调Bcl-2蛋白表达、激活caspase-3，从而引起大鼠小脑颗粒细胞凋亡。本研究中，我们也对肾组织内Bcl-2的变化作了检测，结果显示，预先诱导HO-1蛋白表达可以显著上调肾内Bcl-2表达，反之，抑制HO-1表达则下调Bcl-2表达水平。Bcl-2是迄今发现最重要的抗凋亡蛋白之一，主要通过抑制Bax的促凋亡作用、维持细胞钙稳定、抑制细胞色素C进入细胞浆等，最终抑制由凋亡蛋白酶（caspase）激活所介导的细胞凋亡［10］。因此，HO-1上调Bcl-2表达水平可能是其抗汞致肾细胞凋亡的另一重要机制，至于HO-1如何上调Bcl-2表达尚不清楚。文献资料提示，HO-1通过降解血红素生成的另一重要产物CO可能是其抗细胞凋亡作用的重要执行者［11］。

【参考文献】

［1］Carranza-RosalesP，Said-FernandezS，Sepulveda-SaavedraJ.MorphologicandfunctionalalterationsinducedbylowdosesofmercuricchlorideinthekidneyOKcellline:ultrastructur-alevidenceforanapoptoticmechanismofdamage［J］.Toxi-cology，2005，210（2-3）:111-121.

［2］BasnakianAG.KaushalGP，ShahSV，etal.Apoptocticpathwaysofoxidativedamagetotubularepitheclialcells［J］.AntioxidRedoxSignal，2002，4（6）:915-924.

［3］何洁，张敏，刘俊昌，等.血红素氧化酶-1在离体大鼠心肌缺血预处理中的作用［J］.中国病理生理杂志，2001，17（10）:932-934.

［4］NathKA，CroattAJ，LikelyS，etal.Renaloxidantinjuryandoxidantresponseinducedbymercury［J］.KidneyInt，1996，50（3）:1032-1043.

［5］SenerG，SehirliAO，Ayanoglu-DulgerG.Melatoninprotectsagainstmercury（II）-inducedoxidativetissuedamageinrats［J］.PharmacolToxicol，2003，93（6）:290-296.

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［7］DonnahooKK，ShamesBD，HarkenAH，etal.Reviewarti-cle:theroleoftumornecrosisfactorinrenalischemia-reper-fusioninjury［J］.JUrol，1999，162（1）:196-203.

［8］TakahashiT，MoritaK，AkagiR，etal.Hemeoxygenase-1:anoveltherapeutictargetinoxidativetissueinjuries［J］.CurrMedChem，2004，11（12）:1545-1561.

［9］曹秉振，田辉，常高峰，等.大鼠汞中毒时小脑颗粒细胞凋亡与半胱氨酸蛋白酶-3及Bcl-2的关系［J］.临床神经病学杂志，2004，17（5）:348-350.

细胞凋亡范文第5篇

【关键词】 ，细胞凋亡;，新生血管化，病理性;，癌，鳞状细胞;，抗原，CD34;，口腔肿瘤

摘要: 目的 探讨口腔鳞状细胞癌凋亡与肿瘤血管生成的关系。 方法 60例口腔鳞状细胞癌组织为恶性组，10例口腔良性肿瘤为良性组，10例正常人牙龈组织作为正常组，观察口腔鳞状细胞癌的凋亡指数(AI)与癌灶内微血管密度(IMVD)的关系。肿瘤癌灶内IMVD的检测采用CD34抗原SP免疫组织化学染色;凋亡检测采用DNA原位末端标记检测法(TUNEL法)。 结果 3组IMVD差别有统计学意义;TNM分期与IMVD有关;IMVD与口腔鳞状细胞癌的颈淋巴结转移有密切的关系。恶性组AI低于正常组及良性组(P0.05)。TNM分期与AI有关;颈淋巴结转移与AI无明显相关。 结论 口腔鳞状细胞癌的IMVD不仅与肿瘤的TNM分期、分化程度、颈淋巴结转移有关，而且与其AI也有密切的关系。

关键词: 细胞凋亡; 新生血管化，病理性; 癌，鳞状细胞; 抗原，CD34; 口腔肿瘤

细胞凋亡是活体细胞独特的生物学特征，其调节的失衡是细胞癌变的分子机制之一。实体瘤组织中富有微血管网络，供给肿瘤细胞养分和氧气。肿瘤组织的血管生成是肿瘤赖以增殖和转移的重要条件之一。口腔鳞状细胞癌(鳞癌)的组织中血管丰富，其细胞凋亡与肿瘤血管生成之间可能有一定的关联。笔者探讨口腔鳞癌的凋亡与癌灶内微血管密度(intratumoral micrevessel density，IMVD)的关系，进而了解两者在肿瘤发生发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 病例选择 60例口腔鳞癌的组织切片标本为恶性组，男性38例，女性22例，年龄(45±6.5)岁(38~64岁)。其中舌癌20例，颊癌20例，口底癌10例，牙龈癌10例。按TNM临床分期，Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期23例，Ⅳ期15例。其中颈淋巴结转移者31例，无颈淋巴结转移者29例。按鳞癌病理分级法进行病理分级，其中高度分化的20例，中度分化的12例，低度分化的28例。另外选择10例口腔良性肿瘤为良性组，10例正常人牙龈组织作为正常组。

1.2 材料 单克隆CD34抗体SP试剂盒、原位细胞凋亡检测试剂盒(福州迈新生物技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 IMVD检测 采用CD34抗原SP免疫组织化学染色，第一抗体选用单克隆CD34抗体，方法参照文献[1]。凋亡检测采用原位DNA缺口末端标记检测方法(TUNEL)，方法参照文献[2]。

1.3.2 IMVD计算 任何与附近微血管肿瘤细胞以及其他结缔组织明显分离的褐染的内皮细胞或内皮细胞簇即为CD34阳性，均被认为是单个的微血管。于显微图象分析仪下进行测量，低倍镜下(×40)任意寻找3个区域，再分别于高倍镜下(×400)、面积为0.5024 mm2下依顺序测量每个区域的3个视野，共得出9个数据，取其平均值作为每个标本的血管密度(血管数目/mm2)。

1.3.3 凋亡指数(apoptosis index，AI)计算 每张切片选10个高倍视野进行计数，细胞呈蓝色染色为凋亡阳性细胞计算凋亡细胞数，按下列公式计算即为凋亡指数(AI):

AI=凋亡细胞数/(10×0.5024)mm2

1.4 统计学处理 方差分析，相关分析。

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2 结果

2.1 CD34表达 恶性组可见血管内皮细胞质中CD34点状分布，呈褐色;正常组及良性组则仅见黏膜下少量微血管散在分布。恶性组的鳞癌组织中IMVD明显增多，集中分布于细胞增殖旺盛区域的间质内(图1)。

2.2 凋亡细胞表达 正常组凋亡细胞多分布于上皮的表层细胞层内，散在不均匀，呈蓝色;良性组除了在上皮的表皮细胞层有阳性细胞分布外，在棘细胞层内也有散在分布;而恶性组则多分布在癌巢中(图2)。

2.3 组织内IMVD及AI的比较 见表1。

图1 口腔鳞状细胞癌CD34阳性的肿瘤血管表达(SP染色 ×400)（略）

Fig 1 Immunohistochemical staining of CD34 in oral squamous cell carcinomas

图2 恶性组凋亡细胞在癌巢分布(TUNEL法 ×400)（略）

Fig 2 TUNEL staining from oral squamous cell carcinomas showed apoptotic cells in carcinoma lesion

表1 3组标本组织内癌灶内微血管密度及凋亡指数的比较（略）

Tab 1 The correlation of intratumoral micrevessel density and apoptosis index in three groups

与正常组比较，:P＜0.05； 与良性组比较，：P＜0.05.

2.4 不同临床分期的IMVD及AI分布 见表2。

表2 不同临床分期的癌灶内微血管密度及凋亡指数分布（略）

Tab 2 IMVD and AI in different clinic stagesTNM

与Ⅰ期比较，:P＜0.05； 与Ⅱ期比较，：P＜0.05.

2.5 颈淋巴结转移与IMVD及AI的关系 见表3。

表2 颈淋巴结转移与癌灶内微血管密度及凋亡指数的关系（略）

Tab 2 IMVD and AI in cervical lymphatic metastasis positive or negative

与阳性组比较，:P

2.6 口腔鳞状细胞癌IMVD与AI的关系 将35例凋亡细胞阳性的口腔鳞状细胞癌病例的IMVD与其相应的AI绘制成散点图，显示两者呈反向相关的直线趋势(图3)。经统计学分析，相关系数及回归系数具有统计学意义(P

Y=77.3303-0.1276X，r=0.7059，P

图3 口腔癌癌灶内微血管密度及凋亡指数关系（略）

Fig 3 The relation of IMVD and AI in oral cancer

3 讨论

3.1 本实验中恶性组的IMVD较正常组及良性组明显高，主要集中在肿瘤的周边区和癌灶基底细胞层邻近的间质内，癌灶内分布很少，表明肿瘤内新生血管丰富，随着口腔鳞状细胞癌TNM分期的发展，癌灶内的IMVD也随之增加，Ⅲ、Ⅳ期病例的IMVD比Ⅰ、Ⅱ期明显增多，由于Ⅲ、Ⅳ期口腔鳞状细胞癌的体积及浸润范围的扩大，为了维持肿瘤发展的营养需要，血管生长加快，提供肿瘤细胞氧气及营养。口腔鳞状细胞癌颈淋巴结转移病例的IMVD要高于无颈淋巴结转移病例，提示口腔鳞状细胞癌的IMVD的高低与颈淋巴结转移有关，IMVD高的口腔鳞状细胞癌可能易发生转移。肿瘤细胞要发生转移，首先要进入血管，并定居于靶器官的微血管结构内，在靶器官内增殖，诱发新生血管形成。Ⅲ、Ⅳ期的口腔鳞状细胞癌其癌灶的新生血管结构不成熟，易被肿瘤细胞穿透，进入血液循环。

3.2 本研究显示口腔鳞状细胞癌的IMVD与癌灶的AI呈负相关，IMVD表达高者其AI低，IMVD表达低者AI高，表明血管生成时肿瘤细胞的凋亡随着减少。当肿瘤血管发生时，由新生血管运送到肿瘤区的内皮细胞、巨噬细胞和宿主细胞等产生生长因子(如纤维细胞生长因子、肝素结合上皮生长因子等)，并导致旁泌性作用[3]，这些生长因子持续作用在肿瘤细胞上，剥夺了诱导成片细胞凋亡的能力，因此凋亡的抑制是肿瘤血管生成的结果之一。

3.3 在IMVD低的肿瘤组织中，因为IMVD较低，供氧少，肿瘤组织处于相对缺血缺氧的状态，在早期肿瘤组织可能通过提高肿瘤细胞的凋亡水平，减少组织对氧及营养的需求，以满足肿瘤组织对氧及血供的要求，同时缺氧可诱导血管内皮细胞生长因子的表达和血管生成。但随着肿瘤体积的增加，肿瘤中血管内皮细胞的营养供给减少，虽然IMVD表达较高，但实际增加的血管管径小，血流速度及流量的均值甚至不及IMVD表达低的肿瘤。肿瘤微循环相对不足且低效[4]，这种不良的肿瘤生长环境可导致bcl2等凋亡抑制基因的激活[5]，抑制肿瘤细胞的凋亡。因此IMVD表达较高的口腔鳞状细胞癌临床分期多在Ⅲ、Ⅳ期，凋亡指数低，而IMVD表达较低者则多集中在Ⅰ、Ⅱ期，凋亡指数较高。

参考文献

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