双向调控

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双向调控范文第1篇

【关键词】金融调控 房地产 金融 双向影响

房地产行业在近年来的发展中取得了较好的经济效益，房地产行业的规模逐渐扩大，对国家的经济建设做出了重要的贡献。但是当前我国的房地产行业发展过快，房价增长过快，这对于房地产行业的长远发展有着十分不利的影响，同时也不利于民生的发展。国家采用金融调控的方式对房地产行业进行调控，稳定房地产行业的发展。金融调控对于房地产行业和金融行业都有着重要的影响，国家应该充分重视金融调控手段的使用，发挥出应有的作用，更好地促进国家经济的发展。

一、当前我国房地产金融调控的政策

随着房价的不断上涨，国家采用一系列政策对房价进行有效的调控，稳定房地产行业的发展。金融调控政策是比较常见的调控政策，对于稳定国家经济的发展有着十分重要的作用。金融调控主要是指国家运用经济法律和行政手段对国家的金融市场进行调节，保障金融体系的稳定运行，稳定物价和国际收支平衡。

当前我国为了更好地抑制房地产行业发展过快，采取了一系列的金融调控政策稳定经济的发展。当前银行的信贷资金渐渐收紧，银行的信贷门槛逐渐增加，这在一定程度上减少了银行贷款，降低了房地产行业的热度。近年来国家逐渐控制买房的银行贷款，对首付的贷款进行严格的限制。同时国家又出台了限购政策，一方面维护市民的利益，另一方面稳定房地产市场的发展。国家采用紧缩性的金融政策维护房地产行业的发展，保持国家经济发展的健康趋势，对于人民生活的稳定和国家的稳定有着十分重要的作用。

二、房地产金融调控对于房地产行业的影响

当前国家对于房地产市场的发展进行了严格的管理和限制，对房地产行业进行规划，维护房地产行业的健康发展有着十分重要的作用。随着国家经济的发展，房地产行业的发展速度过快这不仅不利于房地产市场的长远发展，同时也会影响人民群众的正常生活。国家采用金融政策对房地产行业进行调控对房地产行业的发展主要有以下几个方面的影响：

（一）降低房地产行业发展的风险

近年来房地产行业发展速度过快，房价逐渐升高，不仅给人们的生活造成了影响，同时也对国家经济的发展构成了一定的威胁。国家采用紧缩性的金融政策对房地产行业进行调整在一定程度上可以有效地降低房地产行业发展的风险。房地产行业发展过快，银行贷款逐渐增加，如果房价过高不能及时售出将会引发金融危机，影响房地产行业的发展和国家的经济建设。但是国家采用政策控制房地产行业的银行贷款可以有效降低风险，稳定房地产行业的发展。

（二）规范房地产行业的发展

当前房地产行业的发展竞争十分激烈，房地产行业的发展缺少相应的规范，这对于房地产行业的长远发展有着十分不利的影响。加强房地产行业的金融调控可以有效地规范房地产行业的发展。对房地产行业的规模进行有效的控制，对一些不合理的房地产企业进行有效的调整和规划，促进房地产企业的良性健康发展，稳定房地产市场。

三、房地产金融调控对于金融行业的影响

金融调控作为国家调控政策的主要手段之一，对于稳定国家的经济发展有着十分关键的作用。金融调控政策对于调控房地产行业的发展有着重要的作用，同时对于金融行业的发展也有着十分重要的作用。

（一）有利于防范金融风险

随着国家银行贷款业务的发展，商业银行在房地产行业中占据着十分重要的位置，商业银行基本上参与了房地产开发的全过程。金融调控政策可以有效地降低房地产行业的贷款金额，对于降低贷款风险，维护商业银行的利益有着重要的作用。这在一定程度上可以降低金融风险，保障市场经济的发展。

（二）有利于促进商业银行的结构调整

国家采用紧缩性的金融政策降低房地产行业的贷款数额，对于商业银行的影响是很大的，商业银行的贷款业务减少，在一定程度上影响了商业银行的经济效益。商业银行为了维护银行的利益会考虑开展多种银行业务，保障商业银行的发展。这对于商业银行的业务结构调整，促进商业银行的发展有着重要的促进作用。

四、结语

我国的房地产行业对于国家的经济建设做出了重要的贡献，房地产行业也取得了较好的经济效益。当前房地产行业的规模逐渐扩大，房地产行业的竞争也逐渐激烈，但是房地产行业为了扩大规模，贷款数额逐渐增加，这对于国家的经济发展和银行的发展造成了一定的威胁。国家应该积极利用金融政策对房地产行业进行相应的调整，保障房地产行业的健康发展。房地产金融调控政策是国家调整房地产行业发展采用的主要措施，金融调控政策对于房地产行业的发展和金融行业的发展都有着十分积极的作用。今后房地产行业的发展还需要国家金融政策的进一步调整和巩固，维护市场经济的健康发展。

参考文献

[1]刘樱.中国房地产行业融资问题及对策研究[J].时代金融，2006（07）.

双向调控范文第2篇

据媒体披露，从4月底开始，天津陆续有滨海新区差别化限购和天津放开三套住房限购的传闻传出。根据中原地产研究部统计数据显示，截至5月20日，已出台及传闻将出台救市措施的城市超过10个，其中明确出台救市措施的城市包括南宁、无锡、宁波、温州、徐州等。

尽管已是初夏，但中国楼市的“倒春寒”却愈演愈烈。虽然住建部尚未公开表态，但各地政府或明或暗的救市措施，正在从传言变成事实，舆论对此褒贬不一。而在“双向调控”的背景下，地方政府或将取代中央政府成为今后房地产的调控主体。

房价“滞涨”，各地救市

5月下旬，在宁波举办的2014年杭州湾论坛上，瑞银证券中国证券研究主管侯延琨表示，中国的房价不会大幅下跌，但他认为目前的状态非常糟糕。“现在中国的房地产库存和销售量比已经到了2008年以来最糟糕的阶段，”他谈道，“最根本的问题是新开工面积下滑。假如这一数据无法恢复的话，（受此拖累）明年GDP增速跌破5%是非常有可能的。”

据国家统计局公布的数据，今年一季度，房屋新开工面积2.9亿平方米，同比下降25.2 %。《中国经济周刊》记者查阅各地统计局数据发现，一季度广东此数据同比下降35.0%；前4个月云南同比下降41.0%；而在河南平顶山市，今年1―4月份，商品房开工面积同比减少60.9%。

各地新开工面积的急剧下滑，显示出开发商的担忧，而房地产行业的低迷直接体现在房价上――5月18日国家统计局公布的4月70个大中城市房价指数显示，新建商品住宅价格环比上涨的城市为44个，较3月减少12个，创下2012年11月至今的最低值。从环比涨幅中位数看，新建商品住宅价格环比涨幅为0.1%，房价已经进入“滞涨”状态。

在土地市场，也同样表现出低迷状态。21世纪不动产向《中国经济周刊》提供的一份资料显示，截至5月26日，随着浦东新场商住用地和宝山罗店商业用地出让时间延后，上海5月经营性土地市场交易已经落下帷幕，整月仅有两块经营性土地出让，创2012年3月至今的最低值，合计出让面积3.5万平方米、出让金额32.4亿元，环比分别下滑90.2%和50.9%，同比则分别下滑91.9%和81%。

“5月土地市场遇冷的主要原因在于近期上海土地供应收缩，开发商显得更为谨慎理性。”21世纪不动产上海区域市场研究部副总监黄河滔分析称。

在经济下行的压力下，市场传闻的地方政府救市政策出台，不难理解。5月下旬，数家媒体引述住建部人士非正式表态称：“除北上广深之外，其他城市的限购政策可以自行调节，尤其是库存过大的地方，但不会明确发文。”住建部传达的调控方向是，希望市场能自我调整。但在房产税、遗产税等经济手段没有出台之前，一些中心城市的部分行政调控手段不能退出。

至本文截稿时，住建部尚未对上述消息做出正式回应。“如果上述消息属实，意味着非一线城市或将全面松绑限购政策。”黄河滔认为，“近期二三线城市纷纷出台救市政策，其中不乏或明或暗松绑限购政策，如果中央政府不喊停，限购政策或将分城、分阶段逐级淡出。”

政府是否该救市？舆论现分歧

面对楼价的下跌，各地政府是否应该救市？

在2014年杭州湾论坛上，2013年诺奖得主、耶鲁大学教授罗伯特・席勒（Robert Shiller）给出了肯定的答案。他认为“尽管中国房地产市场目前处于大幅的波动，但是这并不代表世界末日，只要政府让市场尽可能地稳定，在合理的干预下能够保证市场稳定就没有问题”。

在同一场合与席勒对话时，侯延琨认为，“各地政府最近出台救市措施，是一个非常合适的时机，但政府的刺激是不是能够有效托底，却让人怀疑。”

房地产专家韩世同也认为政府此时该救市，他说，如需要救市，应该先做基本判断：现在是否已经有房价暴跌甚至崩盘的危险，从而影响经济、金融安危？一种答案是肯定的，一种答案是否定的，如果认为未来不可能出现崩盘、泡沫破碎的危机，就不需做任何动作。“这个基本判断中，我倾向于前者，（政府）现在就必然要采取措施。”他对《中国经济周刊》记者说。

在接受《中国经济周刊》专访时，上海财经大学陈杰教授的观点却截然相反。他认为地方政府不仅不应该救市，而且目前救市的时机也完全不当。他认为目前经济还没有恶化到需要救市的程度，政府应该给市场一个长期的稳定预期，如果政府都是随行就市，市场参与者难有长远预期，经济就难以稳定发展。

“政府人为地用短期化的手段去调节市场，其实像打激素。政府不应当改变市场机制，而应该让市场自我调整。”陈杰说，“应该顺应市场本身的规律，不管投资者是个人也好，开发商也好，如果决策失误，就应该受到市场的惩罚。”

“双向调控”促地方政府成调控主体

对于房地产调控，政府将如何作为？今年“两会”期间，住建部部长姜伟新在回答记者提问时抛出了“双向调控”的理念，这与“分类调控”一起成为今年地产界的热词。

此后，住建部副部长齐骥就“双向调控”做出了解释：所谓双向调控亦可称分类指导，即对一线城市继续增加供应，抑制投机性需求，限购政策不退出；而对于库存量比较大的城市，要控制供地结构。

此番各地政府的救市之举似乎正回应了上述两个热词。黄河滔认为，在此政策背景下，中央和地方在调控中所扮演的角色也正在发生转换。

双向调控范文第3篇

【关键词】电子商务 经济增长 协调发展 控制模式

一、电子商务复杂大系统的特征

（一）复杂大系统的特征

从现代经济发展的大趋势来看，复杂大系统具有开放性、层次性、动态性、复杂性特征。一般来说，复杂大系统都是有人、机、环境三大要素来构成的，要素之间的沟通需要借助环境所赋予的各项参数进行，因此社会经济系统必须是一个开放性的系统，否则其会失去生命力。构成复杂大系统的要素通常是许多小系统，这些小系统在独立发挥作用时是呈现层次性的，这也体现了复杂大系统的层次性。社会经济是不断发展变化的，这也使得复杂大系统的稳定状态是动态的，社会经济因素的变动带动系统的变动。复杂性则可分为三个层次，即物理层的复杂性、生物层的复杂性、社会经济层的复杂性。

（二）电子商务的大系统特征

电子商务的大系统是社会经济复杂大系统的重要组成部分，可视作是其子系统，因此电子商务的大系统除具备复杂大系统的主要特征之外，还具有电子商务系统的特征。电子商务的大系统是开放状态的，它面向的是所有企业与个人，在开放的环境中完成物质交换与信息交换。系统通常包含若干个子系统，这是由其商务活动的性质决定的，比如企业投入的资源、各职能部门等。系统的子系统种类繁多且复杂，由于电子商务大系统具有开放性特征，这使得构成或参与电子商务活动的要素很多，每个要素都可能成为一个子系统，这造成了子系统的种类繁多且具有复杂性特征。

二、电子商务与经济增长协调发展控制理论与方式

（一）电子商务协调发展的大系统递阶结构

电子商务系统是社会经济大系统的子系统，因此其可按照大系统的多层递阶结构思想来建立多层管理模式，即将电子商务系统按照构成要素分成相互独立的多个子系统，每个子系统相互关联，通过统计指标分析可建立三层结构的递阶结构系统：局部控制级（直接控制层，最低决策级）、递阶控制级（最优化层、中间决策级）、协调控制层（自适应层，最高决策级）。根据国民经济控制原理，这种三层结构的电子商务递阶结构系统更有利于实现国民经济的协调控制，促进产业组织结构的优化，改善企业经营管理。递阶结构的电子商务系统体现较强的双向控制特征，即电子商务与经济增长的双向控制。

（二）电子商务与经济增长间的协调发展指数模型

要研究电子商务对经济增长的协调控制评价，需要建立电子商务与经济增长的协调控制指数模型，该模型需要满足两个要素，即协调度与发展量。首先，根据电子商务与经济发展的特征与相互关联，建立电子商务与经济增长的协调发展评价指数，并对该指数进行无量纲处理，使该模型能够实现量化分析；其次，据大系统的协调原则，即关联预估原理，计算每个指标的状态变量指标的协调变量，并对无量纲指标进行标准化处理，并进行加权加法，最终得到协调发展指数模型：

（三）电子商务协调控制模型

在研究电子商务与经济增长的协调控制时，可将电子商务视作一个大系统，将其构成要素视为其的子系统，那么从电子商务与经济增长的实际出发，通过分析电子商务大系统的各个子系统模型，并在内在关联的作用下生成整体的模型结构。即：

从模型的构建来看，其计算过程如下：①收集研究对象的资料，并根据构建模型的需求统计单个指标；②根据上述模型计算时变参数θij（k）；③在确定好各项参数后，结合实际情况采取最为合理的方法对参数进行估计与预测；④采用状态方程的自适应预测与控制；⑤进行电子商务大系统的自适应协调控制。

三、电子商务与经济增长协调发展及双向控制

（一）电子商务―经济增长协调发展控制

要想分析电子商务―经济增长协调发展，必须设计出电子商务系统控制指标与经济系统控制的指标，然后计算协调度指标。电子商务―经济增长协调发展控制指标体系主要包括信息资源开发效率指标、信息资源投入效率指标、信息资源利用效率指标、协调度指标。协调度指标主要包括管理运行协调度、企业文化适宜度。将所有指标明确后，经过无量纲化处理，即可实现对电子商务―经济增长协调发展控制的评价。

（二）企业电子商务协调发展评价

企业电子商务协调发展评价既是将电子商务大系统所有指标进行加权量化，一般采用多级模糊综合评价方法进行。涉及评价的指标主要包括内生信息资源产出率、外生信息资源产出率、电子商务收益率、电子商务销售收益率、信息基础设备使用率、电子商务需求效率、电子商务应用效率、电子商务利用率、专利成果利用率、电子商务人员业绩、电子商务系统运行调度、企业文化适宜度、管理运行协调度等。对所有指标因素进行量化加权后，通过综合分析，可实现电子商务经济协调发展评价。

（三）电子商务与经济增长的协调控制思路

电子商务与经济增长之间的关联程度可直观的反应企业经济活动水平，电子商务系统质量则决定了电子商务系统的运行效率与经济效益，因此在进行电子商务与经济增长协调控制时，应考虑电子商务系统控制的目标，即提高区域经济系统的电子商务资源配置效率，提高经济增长层次。

参考文献

[1]杨哲.电子商务对经济增长贡献的评价与控制研究[J].商场现代化.2014.10.

双向调控范文第4篇

1.1半定量RT-PCR检测VEGF的表达提取RNA方法如下：将50mL细胞培养瓶中细胞达到80%融合时，倒掉培养液，加入1mLTrizol。将培养瓶内Trizol吸取至1mLEP管中，室温静置5min。加入200μL氯仿，剧烈摇晃数次，室温静置5min，11000转/分，4℃离心15min。取上清液加入新1mLEP管中，加入500μL异丙醇后摇晃数次。室温静置10min，11000转/分，4℃离心10min。弃上清液加1mL75%乙醇后混匀。7500转/分，4℃离心5min。弃上清液风干，加入20μL无RNA酶水，58℃加温10min，-70℃冻存。将mRNA逆转录成cDNA，50μL反应体系PCR反应。VEGF（682bp）引物序列：5''''ggctctagatcgggcctccgaaaccat3''''和5''''ggctctagagcgcagagtctcctcttc3'''';β-actin（434bp）引物序列：5''''tgtgcccatctacgaggggtatgc3''''和5''''ggtacatggtggtgccgccagaca3''''。反应条件：95°C变性，30s；VEGF63.5°C退火，27循环，45s；或β-actin57°C退火，25循环，30s；72°C延伸30s。收集PCR产物1.5%琼脂糖电泳。凝胶成像系统半定量分析。以上结果均重复3次。

1.2统计学处理采用SPSS11.5统计软件进行统计处理，计量指标用（x軃±s）表示，ANOVA方差分析，student-Newman-Keuls检验，方差齐性检验进行显著性检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1细胞毒性活力检测ACC-M和ACC-2细胞在不同浓度的SNAP作用4h后细胞的活力，在0μmol/L~500μmol/L浓度的SNAP作用下，细胞的活力均保持在88%以上（表1）。经浓度100ng/mL的LPS预刺激12h后，用500μmol/L的SNAP分别作用不同时间ACC-M和ACC-2细胞活力，其活力均保持在86%以上。

2.2不同浓度SNAP对ACCs细胞中VEGF的mRNA表达水平的影响半定量RT－PCR的结果表明（图1、图2），在31.25μmol/LSNAP刺激下ACC-M和ACC-2细胞中VEGF的mRNA平均水平显著升高，为2.32±0.10和2.14±0.15，分别是对照组细胞（0μmol/L）mRNA水平的4.14倍和6.90倍，差异有统计学意（P<0.01）。随着SNAP刺激浓度升高，mR－NA水平逐渐回落：62.5μmol/LSNAP仍可明显上调VEGF的mRNA水平（P<0.01），但不及31.25μmol/L的SNAP显著；125μmol/L和250μmol/LSNAP对VEGFmRNA影响差异无统计学意义；而500μmol/LSNAP则显著下调ACCs细胞中VEGF的mRNA水平（P<0.01），仅为基础mRNA水平的0.23倍和0.17倍（表3）。One－WayANOVA检验和Student–Newman-Keuls检验比较31.25μmol/L、62.5μmol/L及500μmol/L浓度组与0对照组mRNA表达差异有统计学意义。

2.3SNAP时间依赖性抑制100ng/mLLPS诱导的VEGF的表达水平随着500μmol/LSNAP作用时间的延长，ACCs细胞中LPS诱导的VEGFmRNA水平显著下降（P<0.01）；当500μmol/LSNAP作用4h后，仅可检测到极微弱的VEGFmRNA条带，其mRNA的平均表达水平显著低于LPS诱导12h后SNAP作用0小时组的mRNA水平（表4）。半定量RT－PCR的结果（见图3、图4）。One－WayANOVA检验和Student-Newman-Keuls检验比较其他各时间组与0对照组mRNA表达差异有统计学意义（P<0.05）。

3讨论

一氧化氮（NO）是一种极不稳定的生物自由基，其生成依赖于细胞内的一氧化氮合成酶（nitricoxidesynthaseenzyme，NOS）。它能通过传递电子的反应参与机体的氧化还原反应，在生物体内发挥重要生理作用。目前越来越多的研究证实，NO在肿瘤细胞中发挥着双向调节的作用。研究发现，肿瘤微血管内皮细胞和肿瘤基质细胞中NOS的高表达，能抑制肿瘤的生长和局部浸润。而另一些研究表明，NO具有促进肿瘤血管发生和局部侵袭性。不同的NO浓度是其在肿瘤调控中发挥着截然相反作用的主要原因。高浓度的NO在生物体内形成过氧亚硝基（OONO-）和N3O2，能氧化或硝化DNA导致DNA单链断裂、抑制DNA的合成以及核苷酸还原酶的活性，并能抑制体内的磷酸化信号通路的活化促进肿瘤细胞的凋亡。而低浓度的NO被证实与肿瘤微血管发生、肿瘤浸润和转移相关。因此将NO作为肿瘤治疗的重要手段的同时，应充分认识低浓度的NO对肿瘤促进作用。本实验证明NO的供体SNAP对ACCs细胞有着双向调控作用，当SNAP的刺激浓度在31.25μmol/L时能显著上调血管发生相关因子的表达，而当SNAP的刺激浓度在500μmol/L时血管发生相关因子的表达被有效抑制。

大量研究证明，NO诱导的血管发生相关因子的异常表达，在促进肿瘤微血管发生方面发挥着重要的作用。Jenkins等[8]首次报道在人肿瘤细胞中，转入iNOScDNA阅读框后肿瘤生长加速，且伴随着大量微血管的发生。Ambs等的实验证实，在异种种植瘤内NO能诱导VEGF表达增高，促进肿瘤微血管发生。可见在ACC中，相对低浓度的NO可能通过上调VEGF表达来促进肿瘤微血管发生。

双向调控范文第5篇

【关键词】 PTEN 双向电泳 基质辅助激光解 电离飞行时间质谱 肽质量指纹图谱

ABSTRACT: Objective To study protein variation between PtenL/LMEFs and Pten/MEFs cells. Methods Twodimensional electrophoresis (2DE) was employed to compare the differential expression proteins between PtenL/LMEFs and Pten/MEFs cells. Six differential expression proteins were digested in gel by enzyme and the mass of generated peptides was measured by matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDITOFMS). The data obtained from peptide mass fingerprinting (PMF) were searched using the Internet available database and five proteins were identified. Results Compared with that of PtenL/LMEFs， expression level of proteins including phosphoglycerate mutase 1 (PGAM1) and peptidylprolyl cistrans isomerase C (PPIC) was upregulated， whereas expression level of Transgelin 2 was downregulated in Pten/MEFs cells. B and F proteins were both identified to be peroxiredoxin6. They had similar molecular weight but different PI which might be caused by posttranslation modification. B protein was only expressed in Pten/MEFs cells. Conclusion The protein profile of Pten/MEFs cells displayed obvious difference compared to that of PtenL/LMEFs cells. The results implied that various distinct different proteins might lead to cancer.

KEY WORDS: PTEN; twodimensional electrophoresis (2DE); matrix assisted laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry; peptide mass fingerprinting

第10号染色体同源缺失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten， PTEN)是第一个被发现的其产物具有磷酸酶活性的抑癌基因，它通过负调控多种信号转导途径包括PI3K/Akt途径、FAK途径和MAPK途径调节细胞生长、增殖、生存及转移。研究发现PTEN在多种肿瘤中存在缺失或突变 [12]。培育PTEN基因敲除小鼠及细胞系是研究PTEN基因功能的最重要的手段。永生化的小鼠胚胎成纤维细胞系PtenL/LMEFs细胞和PTEN基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞系Pten/MEFs是研究PTEN功能的理想体外细胞模型。Pten/MEFs细胞的建系方法：首先培育并永生化来自PtenloxP/loxP小鼠的胚胎成纤维细胞(PtenL/LMEFs细胞)，此小鼠的Pten基因的外显子5两旁各插入一段loxP序列，但Pten的转录不受影响，因此PtenL/LMEFs细胞可作为Pten表达正常的对照细胞；此细胞系在体外条件下被瞬时转染Cre重组酶，Cre重组酶可识别并剪切由loxP序列所标记的序列，经过筛选而获得Pten缺失的细胞系Pten/MEFs[3]。Freeman等[3]利用以上细胞系研究了PTEN对p53的作用，提出了PTEN同p53相互作用的新机制：PTEN可同p53直接物理性结合，影响p53结合DNA的能力，调控p53的转录活力。Chang等[4]利用以上细胞系的研究发现PTEN通过Mdm2的P1启动子调节Mdm2的表达。Li等[5]利用以上细胞系的研究发现一种分泌性的生长因子Pleiotrophin在PTEN缺失后表达上调，抑制该蛋白的表达后PTEN缺失细胞的生长和致瘤能力降低。为了更好地了解PTEN调控细胞功能的机制，本研究应用蛋白质组技术比较了PtenL/LMEFs与Pten/MEFs细胞系的蛋白质表达谱，鉴定出一些差异表达的蛋白，为阐明PTEN调控细胞功能的机制提供了新的线索。

1 材料与方法

1.1 材料 PtenL/LMEFs细胞系和Pten/MEFs细胞系由美国加州大学洛杉基分校Hong Wu博士馈赠，本实验室保存；IPG干胶条(pH 3-10，18cm)，蛋白定量试剂盒(2D Quant Kit)购自Amersham Pharmacia公司；蛋白酶抑制剂(Protease inhibitor cocktail tablet)购自Roche公司；低分子量标准购自Promega公司；Trisbase购自Sigma公司；PTEN/AKT信号转导通路检测试剂盒购自Cell Signaling公司(含磷酸化PTEN多克隆抗体、AKT多克隆抗体、磷酸化AKT473多克隆抗体、磷酸化AKT308多克隆抗体、磷酸化GSK3β多克隆抗体，均为兔抗小鼠的多克隆抗体)；山羊抗小鼠PTEN多克隆抗体、荧光显色试剂购自Santa cruz公司，HRP标记的兔抗山羊多克隆抗体购自中山生物试剂公司；PVDF膜购自Biorad公司；等电聚焦仪为EttanTM IPGphorTM(Amersham Pharmacia)；垂直板电泳仪为Protean Ⅱ Xi(BioRad，美国)；质谱仪为Reflex Ⅲ MALDITOF MS(Bruker)。

1.2 细胞培养和蛋白样品制备 PtenL/LMEFs和Pten/MEFs细胞按常规方法培养，用含100mL/L胎牛血清，终浓度为100u/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养液，置于37℃、50mL/L CO2培养箱中恒温恒湿培养；当细胞达到指数增长期后，胰酶消化细胞并用PBS缓冲液洗涤3遍；1×107个细胞中加入100μL的裂解缓冲液(8mol/L尿素，40g/L CHAPS，40mmol/L Trisbase)并加入蛋白酶抑制剂，用超声仪超声裂解细胞；加入10μL RNA酶(10μg/μL)，4℃放置30min，4℃ 12000r/min离心15min去除不溶性沉淀；取上清用蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，按照每管1mg分装，-70℃保存备用。

1.3 双向电泳 参照文献[7]进行。分别在1mg PtenL/LMEFs和Pten/MEFs细胞蛋白样品中加入溶涨液(8mol/L尿素，20g/L CHAPS，体积分数为0.5% pH 3-10 IPG缓冲液，20mmol/L DTT和极少量的溴酚蓝)定容至350μL，充分混匀。用18cm IPG胶条(pH 3-10)于20℃在IPGphor(Amersham Pharmacia Biotech)上等电聚焦(每个胶条在30V电压下聚焦6h，500V电压下聚焦1h，1000V电压下聚焦1h，8000V电压下聚焦5h，每个胶条电流不超过50μA)。胶条经2次平衡后，在垂直胶电泳系统(BioRad protean Ⅱ Xi， BioRad laboratories)上用125g/L的SDSPAGE进行双向分离。电泳完成后，用考马斯亮蓝G250染色液过夜染色，用10mL/L冰乙酸脱色。

1.4 图像扫描和分析 用ImageScanner扫描仪扫描，用PDQUEST 7.0软件进行图像分析。

1.5 胶内酶切 切取胶上的蛋白质点，用50μL脱色液(25mmol/L碳酸氢氨+体积分数为50%乙腈)于室温脱色至胶块无色。真空离心后加入2μL溶于20mmol/L碳酸氢氨的胰蛋白酶(10ng/μL，Roche测序级)，4℃吸涨1h后37℃作用10-12h。加入8μL体积分数为5%三氟乙酸，37℃温育1h，将液体吸净，移至干净的离心管中。再加入8μL溶液(体积分数为2.5%三氟乙酸+体积分数为50%乙腈)，30℃温育1h，吸出液体，与前一次的抽提物合并。真空离心干燥肽段提取液，用2μL溶液(体积分数为0.5%三氟乙酸+体积分数为30%乙腈)充分溶解肽段，进行质谱鉴定。

1.6 MALDITOF质谱鉴定及数据库检索 基质为溶于体积分数为0.1%三氟乙酸/体积分数为50%乙腈的饱和α氰基4羟基肉桂酸，利用Reflex Ⅲ MALDITOF MS质谱仪(Bruker)在加速电压为20kV，反射电压为23kV的条件下进行MALDITOF MS测定。质谱数据利用Bruker的标准肽段或胰蛋白酶自裂解片段进行校正。将质谱所测肽质量指纹图谱数据输入互联网上的Mascot数据库(matrixscience.com)进行检索。检索时，物种选择小鼠，可接受的肽段相对分子质量误差为0.4ku，固定修饰方式(fixed modifications)选择Carbamidomethyl(C)，可变的氨基酸修饰方式(Variable modifications)选择Oxidation(M)，Max missed cleavage为1，最少匹配肽段4个。分值大于54为检索结果具有统计学意义(P

1.7 Western印迹 提取细胞总蛋白质，取100μg上样行100g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜。50g/L脱脂奶粉室温封闭膜2h，一抗4℃孵育过夜。所用一抗分别是：PTEN多克隆抗体、磷酸化PTEN多克隆抗体、AKT多克隆抗体、磷酸化AKT473(PAKT473)多克隆抗体、磷酸化AKT308(PAKT308)多克隆抗体、磷酸化GSK3β多克隆抗体。用HRP标记的第二抗体室温孵育2h后，发光底物显迹法进行显迹，经显影、定影后分析杂交信号，并以同一张膜上重复杂交β肌动蛋白(ACTIN)作为对照。

2 结果

2.1 Western blot检测结果 Western blot检测证实PTEN在PtenL/LMEFs中表达水平较高且有磷酸化的PTEN(PPTEN)存在而在Pten/MEFs细胞中检测不到PTEN和PPTEN蛋白(图1)，表明细胞系PtenL/LMEFs正常表达PTEN蛋白，而Pten/MEFs细胞PTEN蛋白表达缺失。PTEN/AKT信号转导通路中关键分子的蛋白表达检测发现：PTEN缺失后细胞内AKT在473位和308位的磷酸化水平均显著增加，GSK3β磷酸化水平增加(图2)。

图1 Western blot 检测PtenL/LMEFs和Pten/MEFs细胞中PTEN和PPTEN蛋白的表达（略）

Fig.1 Expression of PTEN and PPTEN in PtenL/LMEFs and Pten/ MEFs cells

2.2 PtenL/LMEFs和Pten/MEFs细胞的蛋白质双向电泳图谱分析 PtenL/LMEFs和Pten/MEFs细胞总蛋白质双向凝胶电泳重复3次，代表性图谱如图3和图4所示。用PDQUEST 8.0.1软件分析蛋白图谱。每张电泳图显示约900个蛋白点。对差异表达的蛋白点A、B、C、D、E和F(图3、图4)进行质谱鉴定。

图2 Western blot 检测PtenL/LMEFs和Pten/MEFs细胞中PTEN/AKT信号转导通路中关键蛋白的表达（略）

Fig.2 Expression of key moleculors of PTEN/AKT signal transduction pathway in PtenL/LMEFs and Pten/MEFs cells

2.3 双向凝胶差异蛋白点的肽质量指纹谱鉴定 对差异表达的蛋白点A、B、C、D、E和F进行MALDITOFMS测定肽质量指纹谱。通过Mascot搜寻软件直接上网(matrixscience.com)进行搜寻，查询结果见表1。除D蛋白由于检测分值(protein score)小于54，其余的蛋白检测结果都有意义。

图3 PtenL/LMEFs(A)和Pten/MEFs(B)细胞的2DE双向凝胶图谱（略）

Fig.3 Twodimensional electrophoretic (2DE) maps of PtenL/LMEFs(A) and Pten/ MEFs(B) cells

图4 PtenL/LMEFs和Pten/MEFs细胞的双向电泳凝胶的局部图，箭头所指的蛋白在两个细胞中差异表达（略）

Fig.4 Segments of twodimensional gels of PtenL/LMEFs and Pten/MEFs cells. Arrowed are six protein spots that are differentially expressed

表1 PtenL/LMEFs和Pten/MEFs细胞中6个差异表达蛋白进行质谱鉴定，通过在SWISSPROT 数据库中检索肽质量指纹图谱数据，5个蛋白得到鉴定（略）

Table 1 Six differentially expressed proteins in PtenL/LMEFs and Pten/MEFs cells were analyzed with MALDITOF MS and five proteins were identified by PMF searching in SWISSPROT database

*Protein score is -10×Log(P)， where P is the probability that the observed match is a random event; Protein scores greater than 54 are significant (P

3 讨论

PTEN蛋白是双重底物特异性磷酸酶，具有脂磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性。PTEN蛋白主要通过它的脂质磷酸酶活性对PI3K途径起着负调控的作用。PTEN缺失导致3，4，5，三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)水平上升，PIP3的聚集引起各种蛋白激酶的活化，包括PDK1和PKB/AKT丝/苏氨酸激酶。AKT是PTEN调控途径中的关键分子，AKT的丝氨酸-473和苏氨酸-308位点磷酸化后使AKT激活，参与细胞的转录、翻译，抵抗凋亡。PI3K/AKT是重要的信号通路，AKT能够通过磷酸化它的底物从而导致细胞周期进程的加速、促进细胞生长、存活、迁移、血管生成、蛋白合成和糖原代谢等[6]。PTEN蛋白是脂质磷酸酶，能使PIP3脱磷酸，阻断PI3K/AKT通路。如果PTEN蛋白失活，PI3K/AKT持续活化，将导致细胞分裂、体积增大、凋亡阻滞和肿瘤血管生成等[7]。本研究发现PTEN缺失细胞Pten/MEFs中AKT蛋白在其473位和308位的磷酸化水平明显升高，说明PTEN的缺失导致AKT的激活(图1、图2)。GSK3β是AKT调控的重要底物之一。研究发现GSK3β的磷酸化水平在PTEN缺失后水平升高(图2)。GSK3β被AKT磷酸化后，其活性受到抑制，将导致Cyclin D1上GSK3β作用位点的磷酸化程度降低，进而阻滞Cyclin D1的蛋白降解，促进细胞增殖[8]。

本研究应用蛋白质组技术比较了PtenL/LMEFs与Pten/MEFs细胞系的蛋白质表达谱，PtenL/LMEFs与Pten/MEFs细胞系的电泳图各显示约900个蛋白点(图3)。质谱鉴定了差异表达的蛋白中的6个蛋白，经数据库的检索5个蛋白点得到确认，它们分别是磷酸甘油酸变位酶1(phosphoglycerate mutase 1， PGAM1)、肽脯氨酰顺反异构酶C(peptidylprolyl cistrans isomerase C， cyclophilin C)、Transgelin 2和过氧化物氧化还原酶6(Peroxiredoxin6)蛋白，其中蛋白点B和F经检索得知它们都是过氧化物氧化还原酶6(表1)。

小鼠的肽脯氨酰顺反异构酶C 即Cyclophilin C属于Cyclophilin家族。Cyclophilin (CyP)即环孢素A结合蛋白，是环孢素A(CyclosporinA，CsA)的细胞内蛋白受体。Mi等[9]发现Osteopontin的COOH(-)末端片段与另一细胞转移功能的标志蛋白Cyclophilin C作用并结合到CD147细胞表面糖蛋白上，从而激活AKT1/2和基质金属蛋白酶2。体外分析实验中，在Cyclophilin C存在时Osteopontin的COOH(-)末端片段促进4T07和4T1细胞的迁移和浸润。Nabeshima等[10]报道Cyclophilin(A，B，C，D)的过表达及其与CD147蛋白的相互作用与胰腺癌、乳腺癌及非小细胞肺癌细胞的增殖、转移能力的增强有关。这些实验结果表明Cyclophilin C在细胞内发挥着重要的作用。Cyclophilin C在Pten/MEFs细胞表达上调，它在PTEN缺失后的细胞中的功能还有待进一步的研究。

小鼠Transgelin 2与SM22β基因都编码同一个199个氨基酸的蛋白，分子质量约为22.4ku，小鼠SM22β与小鼠SM22α蛋白的氨基酸序列有68%的同源性。在平滑肌细胞中小鼠SM22β与小鼠SM22α蛋白共定位于actin肌丝蛋白上[11]。含有突变的SM22α基因的小鼠其含有平滑肌细胞的组织及动脉、静脉的组织学或超微结构没有明显的改变，说明在平滑肌细胞中可能存在与SM22α一起表达的其他蛋白可能能够代替其基本的功能，SM22β可能就是该类蛋白[1112]。Gabr等报道大鼠气管内滴入肝素后24h将引起DJ1/PARK7蛋白的显著上调和Transgelin 2(TAGLN2)显著下调。DJ1/PARK7蛋白是PTEN蛋白的负调控蛋白，也是肿瘤潜在的标志物[13]。这提示PTEN的抑制与Transgelin 2(TAGLN2)的下调可能有关。Transgelin 2在Pten/MEFs细胞表达下调，Transgelin 2同PTEN的关系及其在肿瘤发生中的作用值得深入研究。

PGAM1是一种参与糖酵解的酶，可能在肿瘤细胞的代谢和增殖中起作用。最近的研究表明，肿瘤细胞的生存有赖于糖酵解途径，PGAM1 可作为潜在的肿瘤治疗的新靶点 [14]。Chen等[15]报道PGAM1在肺腺癌组织中高表达且与不良预后有关。PGAM1在Pten/MEFs细胞表达上调，它在PTEN缺失后细胞的代谢和增殖中的作用值得进一步研究。

Peroxiredoxin6蛋白是一种抗氧化蛋白，起细胞保护作用。在Pten/MEFs细胞中表达的两个蛋白点B和F经质谱鉴定和数据库检索发现它们都是Peroxiredoxin6蛋白，B点在PtenL/LMEFs细胞中检测不到(图3、图4)，提示Peroxiredoxin6蛋白在Pten/MEFs细胞中可能发生了翻译后修饰，其意义值得研究。

通过比较蛋白质组学的研究，我们发现PTEN缺失的小鼠胚胎细胞系Pten/MEFs细胞与PTEN表达正常的对照小鼠胚胎细胞系PtenL/LMEFs细胞在蛋白表达水平上存在明显差异。已经鉴定的差异性蛋白质涉及细胞的代谢、氧化应激、侵袭转移、信号传导等细胞生物学过程。进一步研究它们在PTEN缺失后细胞癌变过程中的作用，这对深入阐明肿瘤发生机理及寻求抗肿瘤新靶点具有重要意义。

参考文献

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