胚胎干细胞

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胚胎干细胞范文第1篇

【关键词】胚胎干细胞;临床医学;应用

【中图分类号】R817.4【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）10-0123-01

一、引言

胚胎干细胞是一种存在于囊胚内的原始细胞团或存在于早期胚胎中的原始生殖细胞，在适当的条件下，它能够在体外进行无限次的扩增并保持未分化的状态。可以说，这是一种未分化的全能行细胞，它具有无限增殖性、多向分化性和可塑性等多种优良品质。人体正常的胚胎干细胞含有23对染色体，呈现出胞核大、胞浆小的形态特点，在体外培养时，它们会紧聚在一起，呈一个集落且没有明显的界线，通过适当的引导它可分化成人体所需各种细胞类型。上个世纪末期，美国科学家从早期的胚胎中取出原始生殖细胞，建立了最早的人类胚胎干细胞体系，这成为了人类继“人类基因组计划”之后的又一个热门话题，极大的轰动了国际学术界，目前，胚胎学已经成为了一门基础的医学课程。

从表面看去胚胎学与临床医学之间关系不大，但研究发展，许多疾病都发生在细胞层面、组织层面和分子层面，也就是说胚胎干细胞与临床医学息息相关。随着科学技术的进步，人类的认知能力会越来越强，胚胎学也将发挥越来越重要的作用。那么胚胎干细胞是怎么发展起来的呢，它到底又有什么样的发展前景呢，为此，本文在前人工作的基础上总结了胚胎干细胞的发展过程和临床应用研究。

二、胚胎干细胞的研究进展

人们对胚胎干细胞的研究开始于胚胎癌细胞或者说畸形胎瘤干细胞。1958年，有人把胚胎干细胞移植到小鼠精巢或肾脏的被膜下，能够得到小鼠的相应细胞。1974年，科学家把胚胎干细胞注射到正在发育的胚泡腔后，胚胎干细胞能够发育成胚胎嵌合体。到了70年代末期，人们已经形成了用正常的胚胎干细胞作为遗传物质载体来研究基因对胚胎发育影响的思想。

1981年哺乳动物胚胎干细胞研究进入了它的新纪元时代，这年科学家利用小白鼠胚胎，在体外培养分离出了其干细胞并建立了类胚胎干细胞。在随后的7~8年里，科学家相继用延迟着床的办法建立了仓鼠、兔、羊、猪、牛以及水貂的类胚胎干细胞。1994年，美国科学家分离得到了人类的传2代胚胎干细胞。1998年，科学家用类似的方法分离并克隆出了可以传32代的人类胚胎干细胞，在这研究过程中科学家成功完成了人类胚胎干细胞的冷冻和解冻实验，该项研究成果被美国时代杂志评为上世纪九十年代“世界十大科技进展”之首。

本世纪初，美国科学家卡茨和赫德里克研究培养出了成体干细胞。这种细胞是由从人的大腿或臀部抽取少量脂肪和液体培养而来，它们能够在适当的引导条件下发育成健康的肌肉、骨细胞和软骨，保持了胚胎干细胞发育成各种组织和器官的全能性。这一成果有可能使脂肪组织成为干细胞的主要来源，解决了科学家必须从骨髓或胚胎组织中提取干细胞的难题。

三、胚胎干细胞的临床应用

胚胎干细胞具有良好的自我更新功能，在给予合适的信号诱导或在适当的外界条件下，它可以分化成构建人体的不同细胞，用这类细胞分化成的特定器官进行移植时，排除了免疫排斥过程。所以说，胚胎干细胞作为一种“种子细胞”一定会在临床应用中有重要的应用，目前，应用最多最成熟的还是自体干细胞移植。

有了自体干细胞移植，在病床上躺了三个月的35岁的李先生又重新站了起来。今年上半年，李先生因交通事故，造成第四、第五胸椎粉碎性骨折，神经中枢受损，导致双侧以下失去感觉，大小便失禁，肌肉萎缩，下肢瘫痪。检查表明脊髓呈横贯性损害，医生决定为李先生进行自体骨髓干细胞移植。手术一月后患者的身体感觉平面已经恢复到了膝关节，三个月后下肢肢体触觉全部恢复，在搀扶下可站立10多分钟，并能借助轮椅自理生活。

3.1用于治疗遗传病、癌症等疾病

癌症、遗传病是人类目前最严重的医学难题，发生这些疾病是因为细胞在转化和分化的过程中出现异常。胚胎干细胞技术的出现为弄清细胞分化、发育过程，更深刻的了解细胞分化的奥秘提供了方法，为治疗上述疾病提供了崭新的手段和可能性。科学家已利用胚胎干细胞制造出许多小鼠的疾病模型，并使人的致病基因在小鼠体内表达，为下一步治疗人类疾病奠定了坚实的基础。美国国家神经病研究所分子学实验室用小鼠胚胎干细胞诱导神经上皮细胞，植入脑内得到大量的小突状细胞和神经胶质细胞，设想可用来治疗多发性硬化症。

3.2用于器官组织移植

作为一种被称之为种子细胞的胚胎干细胞，为临床的组织，器官移植提供大量材料。胚胎干细胞经过免疫排斥基因剔除后，再定向诱导终末器官以避免不同个体间的移植排斥。这样就可能解决一直困扰着免疫学界及医学界的同种异型个体间的移植排斥难题。美国ACT公司将人皮肤细胞核移植到去除所有遗传信息的牛卵母细胞中，培育出具全能性的胚胎干细胞。如果能将其成功地应用于临床，将来许多疑难疾病都将得到根治，对其他若干疾病也有理想的治疗效果。

3.3用于新药研制和开发

应用胚胎干细胞研究可以大大改变研发药品及其安全性检验。因为从理论上讲胚胎干细胞可以在体外培养出人体的210种不同类型的细胞。故可以对不同药物进行不同细胞类型的细胞水平的致畸形实验和药物筛选，使药品研制过程更趋合理有效并避免消耗大量实验动物。如应用胚胎干细胞培养成大量心肌细胞，将有助于心脏病药物的开发等。此外，胚胎干细胞还将用于出生缺陷、不孕、流产的控制与检测等方面。

四、结语

展望本世纪，生物医学工程将是一个被高度发展的世纪，现在人们意识不到的许多事件都将会出现在人们的面前，如生物经济将取代目前的网络经济。胚胎干细胞技术的应用价值不可估量，目前，其已成为了各国研究焦点之一。不过，从胚胎干细胞研究到实际临床应用之间还会有很长的一段路要走。

胚胎干细胞研究不是一个潮头，它将是一个巨大的推动力，推动着生物医学深刻革命，给人类带来更多的福音!到那时，如人们的某组织器官失灵了，完全可以像更换机器零件那样，用自身的成体干细胞定向诱导分化形成的组织器官替代失灵器官，而不担心供体不足的问题，更不用担惊受怕移植排斥的问题。

参考文献

胚胎干细胞范文第2篇

近日，英国伦敦帝国学院（Imperial College London）的科学家成功地利用人类胚胎干细胞培养出了软骨细胞，这为在将来某一天进行软骨移植提供了很好的契机。

研究结果发表在《组织工程》杂志中，文章详细阐述了帝国学院研究小组将胚胎干细胞变成软骨细胞的过程。这样，医生将可培养软骨细胞并将其移植到许多受损或患病的组织中，即使因运动产生的损伤也可用新的软骨取而代之，甚至是进行整容手术。

软骨（Cartilage）是骨间非常密集的结缔组织，允许关节之间进行平滑的移动。

文章的第一作者Archana Vats博士说：“利用干细胞培养软骨的技术在临床研究中具有巨大的应用价值。目前英国的老龄化问题越来越严重，长寿不可避免地成为备受关注的话题。在此之前，医生也能进行关节移植，却不能移植软骨。而更换软骨后就可以避免再对关节进行移植。”

研究人员在特定系统实验室的有盖培养皿中培养人类胚胎干细胞，进而促使其变成软骨细胞。与生长中的胚胎干细胞相比，在干细胞与软骨的混合物中存在较高含量的胶原质和软骨蛋白。

科研人员将这些胚胎干细胞移植到老鼠体内的特定生物活性部位，之后进行了35的观察。当干细胞脱离活性部位后，研究人员发现这些细胞形成了新的软骨，研究结果显示这些软骨还可以被成功移植到活体组织中去。

胚胎干细胞范文第3篇

【摘要】

为了探讨Ras信号通路对小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem cells， ES cells)造血分化的影响，将突变型基因RasN17转染小鼠ES细胞，免疫印迹检测RasN17的表达对Erk1/2及Akt磷酸化的作用，应用半定量RTPCR检测ES细胞在分化过程中与造血相关的基因的表达。结果表明：Ras N17的表达能抑制Erk1/2和Akt的磷酸化，携带RasN17基因的ES细胞在分化过程中Runx1 、SCL 及betamajor珠蛋白等基因的表达被显著抑制， 而FLK1的表达不受影响。结论：ES细胞体外造血分化需要Ras通路的活化。

【关键词】 胚胎干细胞； 造血分化； Ras

Suppression of Ras Mediated Signaling Attenuates Hematopoietic Differentiation of Embryonic Stem Cells of Mice In Vitro

Abstract

To investigate the possible involvement of Ras signaling in the hematopoietic differentiation of embryonic stem cells (ES cells)， ES cells were transfected with RasN17， the dominantnegative mutant of Ras. Western blot was used to test the effect of RasN17 expression on Erk1/2 and Akt phosphorylation， semiquantitative RTPCR was used to detect expression of gene related to hemalopoiesis in differentiation of ES cells. The results showed that the expression of RasN17 in the ES cells remarkably downregulated the phosphorylation of Erk1/2 and Akt simultaneously. Moreover， the expression of several markers related with hematopoiesis including Runx1， SCL and betamajor globin， were significantly suppressed in the EB expressing RasN17， whereas the transcription of Flk1， a gene required earlier than SCL in development of hematopoietic and endothelial lineages， was not influenced. It is concluded that the activation of Ras is pivotal for in vitro hematopoietic differentiation of ES cells.

Key words

embryonic stem cell; hematopoiesis differentiation; Ras

Ras是由1条多肽链组成的低分子量蛋白，由原癌基因ras编码而命名，包括K，N，H 3种类型。Ras的活性取决于其与GTP及GDP的结合，与前者的结合是其活化形式。 它是MAPK(Erk1/2)及PI3K等信号通路上游的重要组成成分，并通过参与调控这些信号通路而影响细胞的增殖与分化。最近研究发现，Ras及其下游信号分子均参与调控小鼠的胚胎发育，并且不同类型的Ras对胚胎发育特别是造血发育发挥不同的调控作用［1］。胚胎干细胞(embryonic stem cell， ES cell)是一种具有全能分化特性的细胞，其体外造血分化可以模拟并重现体内胚胎造血过程。报道表明：Ras及其下游的信号通路对ES细胞体外培养过程中全能性的维持非常重要［2］。但Ras蛋白能否调控小鼠ES细胞体外造血分化并不明确。为此，本研究探讨了Ras信号通路阻断对ES细胞造血分化的影响。

材料和方法

材料

DMEM、IMDM、胎牛血清、L谷氨酰胺、非必需氨基酸、胰蛋白酶均为Hyclone公司产品。硫代甘油（MTG）为Sigma公司产品。丙酮酸钠、无蛋白杂交瘤培养液Ⅱ（PFHM Ⅱ）购自GibcoBRL公司。小鼠白血病抑制因子（mLIF）购自Chemicon公司。小鼠干细胞因子（SCF）为PeprotTech公司产品。小鼠将CCE细胞接种于Co60照射后的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上，于5% CO2、饱和湿度、37℃条件下进行维持培养。维持培养体系组成为：DMEM 含15%胎牛血清、2 mmol/L L谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、100 μmol/L MTG 及mLIF 1 000 U/ml。在造血分化培养前48小时将细胞传代于预分化培养体系，即将维持培养体系内DMEM更换为IMDM，其他成分不变。预分化培养48小时后按常规传代收集细胞并计数，细胞按2×103接种于直径35 mm的Petri dish，培养体系为：IMDM含15%胎牛血清、0.9%的甲基纤维素、2 mmol/L L谷氨酰胺、150 μmol/L MTG、1 mmol/L的丙酮酸钠、2 mmol/L PFHMⅡ、50 ng/ml的SCF，培养条件同维持培养。

ES细胞的pCMVRasN17及 pCMV质粒转染

质粒pCMVRasN17购自Clontech公司，pCMV质粒空载体为本室构建并鉴定。传代贴壁培养12小时的ES细胞应用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司产品)按说明书进行转染。24小时后传代于含neo基因的MEF（neoMEF）之上，并同时加800 μg/ml的G418筛选阳性克隆。 7 天后挑取不同细胞克隆扩增后鉴定外源基因的表达。

相关基因的RTPCR检测

TRIzoL（Sigma公司产品）提取细胞总RNA，按AMV及Ex Taq试剂盒 (TaKaRa)说明书进行半定量RTPCR以检测相关基因的表达，即每份样本分别取0.02 μg（0.01×），0.2 μg（0.1×），2 μg（1×）RNA进行逆转录反应，然后取1 μl的cDNA进行30循环的PCR。引物序列、退火温度及所扩增基因片段长度见附表。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统扫描电泳条带。

Western blot

ES细胞用0.25%胰蛋白酶消化后离心洗涤，应用维持培养体系贴壁再培养45分钟后收集悬浮细胞并用PBS洗涤； EB按上述分化方法培养并收集。以上样品加入细胞裂解液（BioRad）置冰上反复吹打裂解，煮沸5-10分钟，10 000×g，4℃离心10分钟，取上清，应用Pierce公司试剂盒(BCATM Protein Assay Kit)测蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂牛奶，0.1% tween20的TBS（TBST）封闭1小时， 用TBST洗膜，5分钟，共3次。之后分别按说明书用一抗、二抗（Cell Signaling）孵育带有目的蛋白的硝酸纤维素膜。按检测试剂盒（Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate， Pierce）说明书检测目的蛋白。

结

果

ES细胞分化过程中Ras下游的MAPK和PI3K通路发生活化

收取ES细胞及分化不同时间的EB进行Western blot的检测，结果如图1所示。ES细胞内MAPK通路的Erk1/2及PI3K下游的Akt处于高水平磷酸化状态，可能是由于维持培养过程中加入的LIF可以激活这两条通路所致［3］。而分化第6天的EB内Erk1/2及Akt的磷酸化水平同前一时间点相比有显著升高。与此相对应，永久造血分化在第6天时发生。以上结果提示，作为上游信号的Ras可能通过活化这两条通路参与调控ES细胞的造血分化。

Figure 1. Activation of Erk1/2 and Akt during EB differentiation. ES and EB cells harvested at the indicated time points were subjected to Western blot.

RasN17在ES细胞内的表达下调MAPK(Erk1/2)及Akt的磷酸化水平

RasN17属于HRas，其第17位的Ser被突变成Asp，它的表达可使细胞内源性Ras失活，从而阻断Ras参与的信号通路的活化，起到与基因敲除类似的效应。应用Lipofectamine2000将质粒pCMVRasN17及pCMV转染CCE，经G418筛选后Neo基因的表达及Ras蛋白表达量的上调标志转染成功(图2A、 B)。Nanog和Oct4的表达是ES细胞处于未分化状态的两个重要标志，这两个基因的表达说明RasN17不影响ES细胞的维持培养(图2A)。ES细胞的克隆形态也不受RasN17的影响(图3A，D，G)，ALP是ES细胞处于未分化状态的另外一个标志，它的表达同样说明RasN17不影响ES细胞的维持培养（图3B，E，H）。如图2B所示，转染RasN17后ES细胞内Erk1/2 及Akt的磷酸化水平同时降低，说明其能够同时抑制MAPK及PI3K两条通路的活化。

RasN17表达下调ES细胞分化过程中造血相关基因的表达水平

提取分化7天的EB细胞总RNA进行半定量RTPCR，结果显示：转染RasN17的ES细胞在形成的EB的分化过程中，Runx1、scl基因、betamajor珠蛋白的表达下调(图4)， 而Flk1的表达没有明显变化。可见，RasN17可以下调ES细胞造血分化过程中某些相关转录因子及分化标记的表达，提示Ras通路的活化为ES细胞正常造血分化所必需。

讨

论

Ras下游信号通路包括MAPK（Erk1/2）及PI3K通路等。Ras活化后可以通过激活其下游不同的信号通路来调节ES细胞自我更新与分化［2］。Erk1/2的活化促进小鼠ES细胞的分化并且是ES细胞分化所必需的［2］，当Erk1/2的活化被阻断后，小鼠ES细胞在体外分化过程中不能形成中胚层及胚外内胚层，则ES细胞不能形成正常的EB［4，5］。PI3K通路的活化不仅为ES细胞体外培养过程中全能性的维持所必需［3］，同时也是ES细胞正常分化所必需的。例如， bFGF激活的PI3K通路参与ES细胞向EB分化过程中中胚层的形成［6］。此外，PI3K通路的活化参与调控小鼠胚胎发育过程中的永久造血分化，当将该通路上游的p85α基因敲除后，小鼠胎肝红系造血发生缺陷［7］。由此可见，Ras可通过调控多条信号通路来影响ES细胞体外正常分化及小鼠胚胎的正常发育。

ES细胞体外可以分化产生各系造血细胞，其造血分化过程可以模拟并重现小鼠胚胎造血发育。ES细胞造血分化过程伴随诸多造血相关转录因子及蛋白的表达，这些因子的表达既可作为造血分化的标志同时又是正常造血分化所必需的。其中，Runx1是一种与DNA结合的转录因子，其表达是小鼠胚胎造血发育过程中永久造血开始的标志之一。runx1-/-小鼠胚胎的永久造血缺失［8］；runx1基因的丢失同样可以阻断ES细胞体外分化过程中永久造血细胞的产生［8，9］。scl（stem cell leukemia）基因在小鼠胚胎发育过程中为中胚层向造血细胞分化所必需。该基因缺失可导致胚胎由于造血分化异常而死亡，scl 基因缺失后ES细胞不能进行造血分化［10］。betamajor 珠蛋白是永久红细胞的标志。Flk1是VEGF的受体之一，在小鼠胚胎发育早期的中胚层细胞开始表达，其缺失导致胚胎发育过程中卵黄囊血岛不能形成，同时血管系统的发育出现异常［11］。我们的结果显示，RasN17可以下调ES细胞造血分化过程中Runx1、 scl及betamajor珠蛋白的表达，这表明Ras通路的活化是ES细胞造血分化所必需的。

与以往报道RasN17只阻断Erk1/2通路［5］不同，本研究中转染RasN17的ES细胞内Erk1/2及Akt磷酸化水平同时降低的结果表明：RasN17可能通过同时阻断MAPK(Erk1/2)和PI3K两条通路的活化影响ES细胞的造血分化。

本研究中，RasN17可能通过以下机制下调EB细胞内造血标志的表达：第一，使ES细胞不能形成正常的EB，则造血分化缺乏合适的微环境而发生缺陷；第二，MAPK(Erk1/2)和Akt信号通路的抑制直接影响造血细胞的产生；第三，以上两种机制同时存在。然而，RasN17抑制ES细胞造血分化的具体机制有待进一步明确。

【参考文献】

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5YoshidaKoide U， Matsuda T， Saikawa K， et al. Involvement of Ras in extraembryonic endoderm differentiaion of embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun， 2004;313:475-481

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7Huddleston H， Tan B， Yang FC， et al. Functional p85α gene is required for normal murine fetal liver erythropoiesis. Blood， 2003;102:142-145

8Okuda T， vanDeursen J， Hiebert SW， et al. AML1， the target of multiple chromosomal translocations in human leukemia， is essential for normal fetal liver hematopoiesis. Cell， 1996; 84:321-330

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胚胎干细胞范文第4篇

【关键词】  人参皂苷rg1;胚胎神经干细胞;增殖

effects of ginsenoside rg1 on the proliferation of neural stem cells cultured in vitro zhou zhi-huan, wang xiu-yun, zhong pei-ru, et al (tianjin university of tcm, tianjin 300193, china)

abstract：objective to explore the effect of ginsenoside rg1 on proliferation of neural stem cells (nscs) in vitro. methods the nscs cultures were generated from the brain of embryonic day 16 sd rat. primitive nscs were cultured, proliferated and passaged. the nscs were identified by the immunocytochemical (icc) staining of nestin. the icc staining of brdu was adopted to characterize the proliferation of nscs. according to limited dilution method, the effect of ginsenoside rg1 on the proliferation of nscs was observed. results the nscs were successfully cultured and proliferated in vitro. different dosages (100, 4, 8 μmol/l) of ginsenoside rg1 could promote the proliferation of nscs in vitro. compared with the control group, the numbers of nerurospheres of the three dosage ginsenoside rg1 groups (40, 4, 0.4 μmol/l) were increased obviously. conclusions ginsenoside rg1 significantly promote the proliferation of nscs in vitro.

key words：ginsenoside rg1;embryonic neural stem cells;proliferation

神经干细胞(neural stem cell,nscs)具有自我更新能力和多向分化潜能[1],在神经系统疾病或损伤的修复中起着重要的作用。研究调节nscs增殖分化的影响因素,诱导其增殖和定向分化为中枢神经系统损伤修复和退行性变的治疗带来了希望。因此,nscs的体外培养、增殖、诱导定向分化的研究已成为神经科学的一个研究热点。本研究对体外培养胎鼠nscs进行增殖鉴定,观察了人参皂苷rg1对nscs增殖能力的影响,为开发对nscs具有保护效能的治疗药物、探索神经系统疾病新的治疗方法打下基础。

1 材料与方法

1.1 培养基、试剂及药物

dmem/f12(1∶1)培养基(lot.no atb31223,hyclone,u.s.a);hbss液(无钙离子和镁离子,lot.no 01118197,lonza,u.s.a);b27添加物(lot.no 311624,gibco/invitrogen);青霉素-链霉素溶液(双抗,100×)(每毫升含有10 000 u青霉素以及10 mg链霉素,cat.no p4333,sigma);重组人碱性成纤维细胞生长因子(bfgf,cat.no cyt-218,prospec-tany,israel);人表皮生长因子(egf)(lot.no 3860501000,strathmann biotec,germany);人参皂苷rg1、丹酚酸b(天津中一制药)。

1.2 大鼠胎鼠神经干细胞原代培养及传代

取孕龄16天孕鼠,脱臼处死,75%乙醇浸泡消毒3～5 min,无菌条件下打开腹腔,取出串珠状子宫,浸泡于冷hbss液中。取出胎鼠,置于另一含有冷hbss液的培养皿内,小心剥离外层骨膜,取出大脑皮质并去除软脑膜,冷hbss液漂洗2次后,转移至离心管。加入一定量冷hbss液后吹打至肉眼看不到明显组织块,使液体呈均匀悬浊状。过200目(70 μm)筛网,1 000 r/min离心8 min,弃上清,全培基(含2%b27、20 μg/l bfgf、20 μg/legf的dmem/f12,1%双抗)重悬,约3～4个胎鼠/75 cm2的密度种入培养瓶中,37 ℃、5%co2培养箱中培养。每2～3 d半量换液,收集培养液到50 ml离心管中,静置3～5 min,然后收集上清(管底约留1～2 ml)转入另一离心管,500 r/min离心3 min。弃约一半上清液,补充入相同量的新鲜的全培基(含1%双抗, 2%b27、20 μg/l bfgf、20 μg/l egf的dmem/f12),重悬种置。

约5～9 d传代1次。500 r/min 离心3 min,收集培养的神经球,沉淀细胞用1 ml全培基重悬,用23号(内径0.65 mm)注射器轻轻吹打5次,避免产生气泡,静置3～5 min使未吹散的细胞沉底。收集上清,管底的细胞再加1 ml继续吹打5～8次,收集细胞补加全培基,以1×105个/ml的密度全培基重悬种入培养瓶或培养板。

1.3 神经干细胞及增殖鉴定

采用abc法进行nestin免疫组化染色鉴定nscs。染色步骤：盖玻片放入6孔板内,每孔加多聚赖氨酸处理60 min;将细胞悬液接种于多聚赖氨酸处理过的盖玻片的6孔板内,贴壁生长2 h;4%多聚甲醛固定20 min;3%h2o2 37 ℃,30 min;加入封闭血清,37 ℃孵育30 min;甩去余液;滴加anti-nestin抗体(阴性对照不滴加一抗),4 ℃过夜;滴加生物素标记的二抗,37 ℃孵育30 min;滴加abc复合物,室温孵育30 min;滴加dab显色2 min;50%甘油封片,显微镜下观察照相。

用brdu标记nscs进行增殖能力的鉴定。染色步骤：盖玻片放入6孔板内,每孔加多聚赖氨酸处理60 min;将细胞悬液接种于含多聚赖氨酸处理过的盖玻片的6孔板内,贴壁生长2 h;4%多聚甲醛固定20 min;0.3%h2o2 37 ℃,30 min;2 mol/l hcl,37 ℃变性30 min;0.1 mol/l硼酸中和2次,每次10 min;加入封闭血清,37 ℃孵育15 min,甩去余液;滴加单克隆anti-brdu抗体(阴性对照不滴加一抗),4 ℃过夜;滴加生物素标记的二抗,37 ℃孵育1 h;滴加abc复合物,室温孵育30 min;滴加dab显色2 min;50%甘油封片,显微镜下观察照相。

1.4 稀释法筛选人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用

将nscs克隆球制成1×105个/ml的细胞悬液,将该细胞悬液稀释240倍,加入不同剂量的中药(人参皂苷rg1)种入2个24孔板,每组4孔。第一板实验分组为：对照组、丹酚酸b组(0.035 μmol/l)、人参皂苷rg1组(浓度分别为100、20、4、0.8 μmol/l);第二板的实验分组为对照组、丹酚酸b组(0.035 μmol/l)、人参皂苷rg1组(浓度分别为10、2、0.4、0.08 μmol/l)。常规培养4 d后对神经球进行计数(包含细胞≥5)。

1.5 稀释法检测人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用

将nscs克隆球制成1×105个/ml的细胞悬液,将该细胞悬液稀释240倍,加入不同剂量的中药(人参皂苷rg1)种入24孔板,共5组,每组4孔。实验分组为对照组、丹酚酸b组(0.035 μmol/l)、人参皂苷rg1组(浓度分别为40、4、0.4 μmol/l)。常规培养4 d后对神经球进行计数(包含细胞≥5)。

1.6 统计学方法

实验数据用x±s表示,采用spss11.5统计软件作方差分析,进行组间比较。

2 结果

2.1 神经干细胞培养鉴定及增殖鉴定

对传代nscs进行nestin染色,细胞胞浆呈棕黄色,为阳性(细胞阴性对照则不被黄染),表明本实验所培养细胞为nscs。对传代nscs进行brdu标记后染色,与brdu阴性对照比较, nscs细胞核被黄染,表明经传代后nscs依然具有体外分裂增殖能力。nscs鉴定结果见图1。

nestin普通染色(阳性) nestin普通染色(阴性对照)

brdu普通染色(阳性) brdu普通染色(阴性对照)

图1 nscs增殖鉴定

2.2 人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的剂量筛选(见表1、表2)

与对照组相比,人参皂苷rg1 4 μmol/l以及0.8 μmol/l组神经球数明显增加,差异有统计学意义(p<0.01);人参皂苷rg1 100 μmol/l组神经球数明显增加,差异有统计学意义(p<0.05);其他剂量组神经球生成数目没有明显改变。通过实验结果分析,拟选定人参皂苷rg1 40、4、0.4 μmol/l作为高、中、低剂量进行进一步实验研究,重复3次。表1 人参皂苷rg1对神经球生成数目影响的剂量筛选(第一板)表2 人参皂苷rg1对神经球生成数目影响的剂量筛选(第二板)

2.3 不同剂量人参皂苷rg1对体外培养胚胎神经干细胞增殖作用的影响(见表3)表3 不同剂量人参皂苷rg1对神经球生成数目的影响(x±s)

第1次实验结果显示,与对照组相比,人参皂苷rg1中、低剂量组神经球数生成数目明显增加,差异有统计学意义(p<0.01)。第2次实验结果显示,与对照组相比,人参皂苷rg1高、中剂量组神经球生成数目明显增加,经统计学分析,差异有统计学意义(p<0.05),人参皂苷rg1低剂量组神经球生成数目明显增加,差异有统计学意义(p<0.01)。第3次实验结果显示,与对照组相比,人参皂苷rg1高、中、低剂量组神经球生成数目明显增加,差异有统计学意义(p<0.01)。

3次实验结果综合分析表明,人参皂苷rg1可以明显增加神经球生成数目,具有促进胚胎神经干细胞体外增殖的作用,其中以低剂量(0.4 μmol/l)作用更为显著(均p<0.01)。

3 讨论

nscs具有在成体中枢神经系统中可分化为神经元的能力,改变了以往神经科学的固有观念,在临床和神经医学领域受到了普遍关注。nsc培养体系的建立和完善,使nsc增殖、分化以及迁移得以迅速发展。目前,对nscs的增殖研究国内外大部分集中于细胞因子对nscs的影响,利用传统中药内源性诱导nscs研究较少。中药的神经保护作用广泛且具有机制的多样性,因此,应用中药诱导nscs的增殖,促进神经再生和神经功能的修复与重建,可望为中药治疗缺血性脑损伤开辟全新的治疗途径。

人参是传统的补气中药,人参在许多神经系统疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、周围神经损伤的治疗中,发挥着积极的作用[2]。人参皂苷rg1是人参活性成分中已提纯的单体成分,是人参中主要活性成分之一。人参皂苷rg1主要药理作用为改善微循环、提高组织抗缺氧能力,具有ca2+拮抗作用、抗疲劳作用,改善学习记忆技能,促进dna、rna和蛋白质合成作用,对中枢神经有兴奋作用。rg1因亦存在于三七当中,故其活血消瘀、改善循环、抑制血小板聚集的作用也很明显[3]。

本研究选取补气健脑生药提取成分人参皂苷rg1,考察其对nscs增殖的诱导作用机制。通过体外培养大鼠胚胎nscs,免疫组化法进行nscs的鉴定及增殖鉴定,表明本试验所培养细胞为nscs,对传代nscs进行brdu标记后染色,与brdu阴性对照比较,nscs细胞核被黄染,表明经传代后nscs依然具有体外分裂增殖能力。本研究证实了具有补气健脑作用的中药有效成分人参皂苷rg1可以作用于nscs,对nscs的增殖有明显的诱导促进作用。人参皂苷rg1高、中、低剂量均明显增加神经球的生成数目,以低剂量作用更为显著。表明临床可预期应用以补气为主的人参皂苷rg1诱导nscs的增殖和定向分化,为许多疑难脑病的治疗提供新的选择。

【参考文献】

  　[1] gage fh. mammalian neural stem cells[j]. science,2000,287：1433.

胚胎干细胞范文第5篇

转变的信号

全能分化的干细胞无疑对于人类是一件很大的幸事，因为干细胞在治疗白血病、癌症、白癜风、心脏病、帕金森氏综合征、糖尿病、皮肤烧伤、老年性痴呆等人类许多顽症方面都有不可替代的重大作用。在上个世纪末的1999年，美国《科学》杂志甚至把干细胞研究评为21世纪10项重要的研究领域之首，而且位居人类基因组计划之上。

但是，干细胞研究一直被伦理困扰。因为，要获得全能分化的干细胞似乎非胚胎干细胞莫属。而从胚胎中提取干细胞又为世界多数国家的伦理和文化所不容。美国虽然引领着世界科技的潮流，但在干细胞研究上被伦理卡得最死。这体现在总统布什两次否决议会的推进和批准干细胞的议案。

布什于2006年7月19日首次否决了支持胚胎干细胞研究的法案，理由是这项法案支持利用无辜的人类生命为其他人牟取医学利益，谋杀(胚胎)是错误的。为了科研目的，给予生命，又让它死去，这是让人无法接受的。2007年6月20日，布什再次否决了国会提交的放宽联邦政府资助胚胎干细胞研究的法案，理由始终如一：这样的法案一旦通过并变成法律，美国纳税人的钱就会“被迫用于故意摧毁人类胚胎”，而这是他本人“不能跨越的道德底线”。

与其说这是布什的底线，倒不如说是人类伦理底线的一种反映，因为相当多的人认同布什的这一观点。于是，研究人员开始寻找其他途径。最先寻求突破的是在世界上首先创造出克隆羊多利的科学家威尔穆特。

2007年11月17日威尔穆特公开宣布不再进行细胞核转移研究。他认为，利用日本科学家的新技术可以在5年内提供一种更好的、伦理上更能被接受的医用克隆胚胎。所谓新技术指的就是日本京都大学山中伸弥教授等人研究的一种将体细胞进行基因改造而成为类似干细胞的技术，这种技术已在实验鼠身上做过试验。

威尔穆特认为，将体细胞转成千细胞的新技术是今后治疗疑难病症的关键技术，比使用胚胎干细胞更具潜在优势。

条条道路通罗马

威尔穆特的决定并非只是因为年底得知日本研究人员的研究结果才改弦易辙的，早在2007年1月和6月，干细胞研究的转身动作就基本成形，效果不错。

2007年1月7日，美国的德・科皮等人就宣布，从羊水中可以分离出多能干细胞(能分化为多种类型的干细胞)。这一发现似乎是继胚胎干细胞和成体干细胞之外的另一种获取干细胞的途径。羊水干细胞能激活人体内已知的220种专有干细胞中的绝大多数干细胞，让这些干细胞发挥作用。而且，羊水干细胞比较容易取得，可以通过产前例行的羊水诊断取得足量的羊水；另外还可在产妇生完孩子后取得。例如，现在美国每年就会有400万婴儿降生，中国每年有更多的婴儿诞生。同时，羊水干细胞不仅容易获取，还能避开伦理的争议，也就有了比较广泛的研究和医疗应用前景。

而在2007年6月美日三个研究小组就成功地把老鼠皮肤细胞改造成类似胚胎干细胞的细胞。这实际上已经为把人的皮肤细胞转成干细胞奠定了基础。因此，将人体皮肤细胞改造成几乎与胚胎干细胞具有同样功能的干细胞便是顺理成章的事。

2007年11月20日，美国和日本的两个科学小组同时宣布，他们成功地将人体皮肤细胞改造成了几乎可以和胚胎干细胞媲美的干细胞。美国威斯康星大学詹姆斯・汤姆森等人的研究发表在《科学》杂志，而日本京都大学教授山中伸弥领导的研究小组把报告发表在《细胞》杂志。两个研究小组都借助逆转录病毒为载体向皮肤细胞中植入一组4个基因，通过基因重新编码，使皮肤细胞具备胚胎干细胞的功能。而被改造过的细胞被称作“诱导性多能干细胞”(iPS细胞)

汤姆森领导的小组，从自己独自确定的14种新的候选重组基因中，最终选择出4个基因，实现了在人体细胞内的基因重组，其中前两个基因与山中伸弥小组是相同的，即0CT3和SOX2，而另两个基因是NANOG和LIN28。不过，汤姆森等人利用的是胎儿皮肤细胞以及一个新生儿的包皮细胞。与日本研究人员相比，汤姆森等人这项研究需要1万个细胞才能分离出1个iPS细胞系。汤姆森认为，虽然这一个iPS细胞系比日本研究人员的少，但从一个单独的实验足以创造出几个iPS细胞系。值得一提的是，汤姆森实验室iPS研究组的主要成员中有华裔女科学家俞君英。

而日本京都太学的山中伸弥小组使用逆转录病毒把4种基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和K1f4转移到人的成体细胞中，而这些基因在以前对小鼠实验就获得成功，把小鼠的成体细胞转化为了iPS细胞。这一次他们实现了在人体细胞内的基因重组并把成体细胞转变为iPS细胞。成体细胞分别来自一位36岁妇女的表皮和一位69岁男性的结缔组织。相比之下，日本研究人员的成体细胞转化为iPS细胞的效率更高一些。因为，利用他们的技术，大约每5000个细胞就能制造1个iPS细胞系，这种高效能保证他们在每项实验中都能得到数个iPS细胞系。

iPS细胞成果扩大

干细胞研究的漂亮转身并不仅限于把人的成体细胞转变为iPS细胞，在此之后和之前，还有一些干细胞研究的出色成果。

紧接着皮肤细胞转为干细胞后，美国马萨诸塞州怀德海特生物医学研究所的雅各布・汉纳等人用皮肤干细胞对小鼠实验治疗镰状细胞贫血，获得初步成功。研究人员首先从患有镰状细胞贫血症的老鼠尾部提取细胞。随后在提取的患病细胞中植入4个基因，使细胞基因重新编排，变成具备胚胎干细胞功能的皮肤干细胞。通过在实验室中进一步诱导分化，研究人员把这些皮肤干细胞培养为成血细胞，以弥补引发镰状细胞贫血症的基因缺陷，并把成血细胞注入病鼠体内。结果显示，这些病鼠血液和肾功能都开始恢复正常。接受干细胞治疗的患病老鼠，在一个星期内就几乎完全痊愈。

镰型贫血症是由基因突变导致的遗传性血液疾病。异常的血红蛋白聚合，使红细胞呈现镰刀状，降低红细胞携带氧气的能力。由于血红蛋白不正常，从而产生供血供氧不足，导致患者贫弱，呼吸困难，也可能出现周期性的剧烈疼痛感，甚至肾脏也会受损，提早死亡。骨髓移植能够治疗这种疾病，但也可能引发

致命的排斥反应。

而医学界首次采用源自患病体自身细胞组织的千细胞来治疗这种遗传疾病，成功回避了利用外来血液或细胞组织可能产生的移植排斥反应。同时，把老鼠尾部细胞转变成干细胞，也避免了采用胚胎干细胞进行治疗的伦理争议。这意味着，人类镰型贫血病的治疗指日可待。

但是，如果要在人身上试用这种干细胞技术必须解决载体的安全问题。对小鼠的实验是用逆转录病毒作载体，把特殊的基因导入小鼠的皮肤细胞中，然后让皮肤细胞转变成iPS细胞，而这种细胞与胚胎干细胞几乎完全相同，能生成200多种细胞。在实验中是用化学物质使这些iPS细胞长成健康的血液干细胞，并把血液干细胞移植到老鼠的骨髓中，使老鼠体内健康的红细胞不断增加，最后治愈镰型贫血。

但是，如果进行人体实验治疗，现在还不能保证逆转录病毒这种载体对人是安全的，经过诱导的iPS细胞也有可能转变成癌细胞。如何解决载体物质是下一步要解决的问题。但已经有研究人员提出，可以用脂肪分子来代替逆转录病毒，把特殊基因带进需要改造的细胞中，诱导它们成为iPS细胞。

干细胞转身之后的兵分两路

目前，可以把干细胞研究分为两大类，一类是利用胚胎提取和创造干细胞，无论是人胚胎，还是人畜、混合的胚胎，以及灵长类的胚胎：另一种就是对成体细胞加以转基因诱导，使其转变为干细胞，即iPS细胞。

与胚胎干细胞相比，iPS细胞当然在效率上占了优势。例如，2007年11月22日，美国俄勒冈国家灵长类研究中心舒克拉特・米塔利波夫及同事在英国《自然》杂志上报道他们成功地克隆出恒河猴胚胎，并提取出胚胎干细胞。这个成果表明人类在克隆人类胚胎的道路上迈出了更为重要一步。但是，这种途径与iPS细胞相比可以说效率十分低下，而且遭遇伦理困境。米塔利波夫从14只母猴那里搜集了304个卵细胞。最终才获得了两个胚胎干细胞系。这意味着，其成功率只有可怜的0.7％。

因此，克隆先驱威尔穆特表示，“考虑到这么低的效率，你会怀疑，需要多长时间，细胞核转移技术才能培育出有用的生命。”相比之下，日本京都太学教授山中伸弥采用的体细胞克隆技术要“有意思100倍”。对胚胎干细胞持否定态度的美国政府也由衷地对iPS细胞的成功表示了赞美。2007年11月20日，美国白宫就此项研究发表声明，称“这是一项在符合伦理的研究中取得的重大进展。这次人体皮肤细胞‘直接改造’技术跨越伦理障碍，令在实验室中培育出人造人体器官的梦想更近了一步。布什总统也为此感到高兴”所以，美国政府认为这才是干细胞研究的“正道”。

但是，这是否意味着iPS细胞就会从此成为主流并一花独秀呢?当然，情况并非如此。就连成功地用iPS细胞治疗小鼠镰型贫血的汉纳也表示，在继续深化iPS细胞研究的同时，应继续胚胎干细胞研究，兵分两路或多点开花也许能更早出成果。因为iPS细胞尚不能完全取代胚胎细胞克隆技术。而且，很多研究人员认为，iPS细胞实际上还只是干细胞研究的一个分支。

对这个问题的解读是，尽管iPS细胞是一个漂亮的转身，但其自身仍存在不少问题，需要数年时间才可能把这项技术安全应用于临床。其一，iPS细胞现阶段的实验方式存在潜在副作用。研究所使用的逆转录病毒载体可能使基因产生变异，引发肿瘤。因此，需要评估其安全性，并采用新的方法。

其二，尽管iPS细胞没有胚胎干细胞那样的伦理争论和阻力，但它也可能产生新的伦理问题。例如，应用这项技术，或许能通过皮肤细胞制造和卵子，可以帮助那些有生育问题的患者。但也会出现滥用问题，因此有必要在制造和利用人体干细胞方面做出适当规范。

胚胎干细胞也不示弱

尽管胚胎干细胞存在很大的伦理困境，但这一领域的研究成果同样精彩。有一些已经进入临床治疗实验。