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【关键词】 环氧化酶2;内毒素;腹部损伤;火器伤;肝损伤
Abstract: Objective To investigate the changes of expressions of hepatic COX2 and the relationship between hepatic COX2 and intestinal endotoxemia after intestinal firearm wound.Methods A total of 42 ChangBai piglets were randomized into 7 groups: control group and wounded 1,2,4,8,12,24 hour groups.The models of intestinal firearm wound were established in wounded groups.Levels of plasma endotoxin was measured by using chromogenic limulus amebocyte lysate test;Hepatic COX2 expression were measured with immunohistochemical staining and image analysis in all groups.Levels of serum ALT were determined.Results Levels of plasma endotoxin, hepatic COX2 expressions,serum ALT in wounded groups were all significantly elevated compared to control group(P
Key words:cycloxygenase2;endotoxin;abdominal injuries;firearm wound;liver injury
在严重创伤打击下,机体肠道屏障功能破坏可引起肠道细菌移位、内毒素血症的发生,进而可诱发多器官损伤[1],由内毒素刺激产生的多种炎症因子在创伤后多器官功能障碍综合征(MODS)的发生发展中起重要作用。环氧化酶2(cycloxygenase2,COX2)为一种“诱导型酶”,主要在炎症细胞中表达,与疼痛、发热、肿瘤及损伤等关系密切。近年来研究表明,COX2与肝损伤关系密切[2]。本研究在我们已经建立的腹部肠管火器伤模型的基础上[3],观察伤后肝组织COX2表达、肝功能及内毒素变化,探讨COX2在腹部火器伤后继发性肝损伤中的作用及其与肠源性内毒素血症的关系。
材料与方法
1 实验动物及分组
选用解放军63650部队提供的健康长白仔猪42头,2~3月龄,体重27~33kg,平均(31.2±1.4)kg,雌雄不限。实验动物被随机分为7组:对照组和伤后1、2、4、8、12、24小时组,每组6头。
2 腹部火器伤模型[3]
枪伤前动物常规禁食12小时,自由饮水。5%盐酸氯胺酮注射液20mg/kg+0.05%硫酸阿托品注射液0.04mg/kg对猪耳后肌肉注射麻醉后,将猪行走位悬吊于戈壁军用靶场门廊上,四肢自然下垂,完全暴露腹部,于脐水平后方2cm处右侧腹壁皱襞下缘无毛区标记射击点。采用军用54式手枪,7.62mm手枪弹,经专业机构校准:子弹出膛初速度430~435m/s,弹丸重量5.5g,撞击能量508.48~520.37J,专业射手用手枪距猪侧腹壁30cm处瞄准射击点,从右侧腹壁垂直射入,左侧对应位置射出弹头。伤后15分钟内运回动物实验室,常温及动物实验室环境:温度22~24℃,相对湿度50%~60%。对照组除不致伤外,其余步骤与致伤组相同。
3 标本采集
实验各组分别于伤后1、2、4、8、12、24小时各时间点用无热原注射器抽取猪耳缘静脉血,对照组回实验室后立即抽血,一部分置入无热原肝素抗凝试管,离心提取血浆,置入无热原试管-80℃保存用于内毒素检测,一部分置入肝生化负压储血管,用于ALT检测。对照组抽血后立即开腹,实验组回实验室后于相应时间点抽血后麻醉开腹,每组动物均取肝左中叶下段肝组织,10%中性甲醛固定。
4 免疫组化图像分析法检测COX2的表达
COX2抗体为福州迈新公司产品(工作浓度1:100),按SABC法免疫组化试剂盒说明书操作。0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。用Imagepro Plus5.0医学图像分析软件检测每组细胞阳性染色的累积光密度值,用来表示COX2表达相对量。每张切片随机选取5个不重叠的高倍镜视野分析,分析过程中所有切片的放大倍数(×400)光源强度均相同。
5 肝脏血清酶学测定
取血静置30分钟后离心,东芝全自动生化分析仪(TBA40FR)测血清ALT水平。
6 血浆内毒素测定
显色基质鲎试剂试管法测定内毒素含量,操作按说明书进行。所用试剂为厦门鲎试剂厂产品。
7 统计学处理
实验数据以±s表示,用 SPSS13.0行单因素方差分析,LSDt检验进行两两比较,两变量相关分析用Pearson直线相关分析,检验水准α=0.05。
结果
1 动物存活情况
对照组和伤后1、2、4、12小时组动物全部存活,伤后8、24小时组各死亡1头。
2 剖腹探查
各组动物于伤后相应时间点开腹,探查均未见活动性出血及实质脏器破裂,腹腔内有约50~300ml淡黄色、淡红色至红色血性渗液,原发伤道区多发小肠穿孔破裂2~9处,伴或不伴有小肠边缘系膜破裂,结肠0~3处穿孔或破裂,表面附有粪便等肠内容物或伴有脓苔、血肿,穿孔肠壁外翻、部分坏死。腹压较高、臭味明显,腹膜炎较重。各组肠穿孔的平均数经方差分析无统计学差异,可认为各组伤情一致。
3 肝组织COX2表达的变化
COX2的阳性表达以肝细胞、枯否细胞、血管内皮细胞和胆管内皮细胞为主,黄色或棕黄色颗粒主要位于胞浆内,少数位于核膜(图1a)。对照组仅见少量肝细胞阳性表达(图1b),火器伤后肝组织COX2表达明显增强。用医学图像分析系统检测各组肝组织COX2的表达,经统计学处理,伤后各组肝组织COX2的表达均明显高于对照组(P<0.05),并于伤后2小时和12小时出现2个高峰,第2个高峰值>第1个高峰值(P<0.05)(见表1)。
a.伤后24小时
b.对照组
图1 COX2在肝组织中的表达(SABC ×400)(略)
4 血清转氨酶的变化
伤后各组血清ALT水平均高于对照组(P<0.05),并于伤后2小时和12小时出现2个高峰,第2个高峰值>第1个高峰值(P<0.05)(见表1)。
5 血浆内毒素的变化
实验组各组的血浆内毒素水平均高于对照组(P<0.05),并于伤后8小时达到高峰,伤后12小时仍维持在高峰值水平(P
6 相关性分析
相关分析表明,伤后肝组织COX2的表达与血浆内毒素及血清ALT水平均呈正相关,相关系数分别为0.718、0.850,P
表1 肝脏COX2的表达及血浆内毒素、血清ALT水平的变化(略)
与实验组各组比较:aP<0.05;与本组前一时间点比较:bP<0.05
讨论
肠道是机体最大的细菌和内毒素贮库,被认为是MODS始动器官,在创伤和感染等应激情况下,肠道的屏障功能受到削弱或损害,可使大量细菌和内毒素经由门静脉和肠系膜淋巴系统侵入血液循环,造成肠源性内毒素血症和细菌移位[4]。
本实验发现,伤后1小时开始血浆内毒素水平即明显升高,于伤后8小时达到高峰水平,伤后12小时仍维持在高峰值水平(P
COX2是一种诱导型酶,当细胞受到炎症等刺激时可高表达,是炎症介导的细胞毒性重要的决定因素之一,近年来研究证实,COX2在各种形式的肝损伤肝组织中表达均明显升高,在肝损伤的发生、发展过程中起重要作用[7-9]。本实验证实,腹部肠管火器伤后肝组织COX2表达明显增强,并于伤后2小时和12小时出现2个高峰,第2个高峰值>第1个高峰值(P<0.05)。考虑伤后2小时高峰可能与急性创伤有关,伤后12小时高峰的形成主要与伤后腹腔感染所致内毒素血症的形成有关。LPS可以诱导肝细胞多种炎症相关因子的表达[10],是诱导COX2的主要因素之一。相关分析表明,伤后肝组织COX2与血浆内毒素水平呈正相关,相关系数为0.718,(P
伤后肝组织COX2与血清ALT水平均呈正相关,相关系数为0.850,P
综上所述,腹部肠管火器伤后可导致肝组织COX2高表达,COX2参与了火器伤后继发性肝损伤的形成,内毒素血症可能在诱导肝组织COX2的产生中起重要作用。这为我们深入探讨腹部肠管火器伤后继发性肝损伤的发生机制提供了实验依据。
参考文献
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1 病例介绍
患者,男,64岁,主因发热喘憋3日于2010年10月11日收入我院ICU。入院查体:体温38.4℃,脉搏148次/min,呼吸32次/min,血压94/51mmHg。既往脑梗死病史3年。于10月11日行气管插管接呼吸机辅助呼吸,于10月18日行气管切开。病人卧床不能进食,遵医嘱给予留置胃管及颈内静脉置管、予胃肠外营养+胃肠内营养治疗。在鼻饲液的供给方面为了使病人能够适应,每次推注8Oml;为了保持鼻饲液的温度每次用开水间接加热;为了保持鼻饲液的清洁卫生,避免污染,容器每次清洗消毒,喂食器每24小时更换1个,每次使用后彻底清洗并用开水烫洗、分离、放在专用的清洁盘内,晾干,干净纱布覆盖,备用。未使用的营养餐放入冰箱冷藏保存,保存时限24小时。病人鼻饲后出现了严重的腹泻,每天5次~8次,为黄色水样便,同时患者腹胀,胃肠功能紊乱,便培养未示菌群失调。使用多种药物进行调整,如乳酶生、舒丽启能、双歧三联活菌(培菲康)、易蒙停等,症状均未改善。腹泻长达l3 d,病人只能禁食行胃肠减压,完全靠胃肠外营养支持。使用鼻饲糊化薏米汁效果良好。
2 方法及效果
取薏米40g,将薏米炒熟,打碎,煮粥,制成500ml糊化薏米汁,装入已消毒的容器内,分6次鼻饲,每次间隔2小时,控制温度在37-40℃,同时配合全身治疗,抗感染、扩张冠状动脉、纠正电解质紊乱、纠正低蛋白血症及积极对症支持治疗等。病人腹胀、腹泻症状改善,鼻饲液由每次80mL逐渐增至125 mL,大便1 d 1次或2 d 1次,为糊状便,生命体征维持稳定。
3 讨论
3.1 薏米的药理作用 薏米为禾本科植物薏苡的干燥种仁,又称薏苡仁,薏仁米,药玉米等,具有很好的药用价值。明代李时珍《本草纲目》所载主治,可以看出其应用的广泛,谓:“薏苡仁”甘,微寒,无毒。主治筋急拘挛,不可屈伸,久风湿痹,下气。久服,轻身益气,除筋骨中邪气不仁;利胃肠,消水肿,令人能食。炊饮,作面食,主不饥,温气;煮饮,止消渴,杀虫。治肺痿,肺气,积脓血,咳嗽,涕唾,上气。煎服,破脓肿,去干湿脚气,大验。健脾益胃补脾清热,去风胜湿。炊饭食,治冷气。煎饮治小便热淋”[1]。可见薏米有益胃健脾、除痹胜湿、止泻排脓的功效,也有解热、镇痛、抗炎、抗病毒等作用。薏米还含有丰富的多种维生素和矿物质,能够起到促进新陈代谢和减少胃肠负担的作用,一直被作为病中或病后体弱患者的补益食品。
3.2 米汁保护胃黏膜 将薏米打碎熬制的米汁粘度较直接熬制黏度更高,能在胃肠道黏膜表面形成一种保护膜[2],保护胃肠粘膜,为后期经胃肠道补充能量打下基础。
3.3 糊化作用 将薏米炒熟糊化,通过加热引起淀粉的化学结构、聚合度和晶体构象方面发生改变,在冷却中淀粉颗粒再聚集成晶体结构而形成抗性淀粉。抗性淀粉是一种新型的膳食纤维,能够增加水的吸收,具有抗腹泻的功能,能够改变大肠肠道菌群的构成,存进肠道益生菌的生长和繁殖。[3]可以控制肠道细菌增殖和细胞调亡,抑制潜在的病原体,从而增强机体的免疫功能。[4]
3.4 薏米富含膳食纤维,膳食纤维具有润肠通便的生理功能。
3.5 薏米矿物质丰富,能够补充因腹泻丢失的电解质。
参考文献
[1] 李时珍.本草纲目.点.校本[M].北京:人民卫生出版社,1978:1490.
[2] 李春花.脑出血早期进食小米汁防治应激性溃疡.护理研究,2005,19(6):1053.