nk细胞
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nk细胞范文第1篇
异基因造血干细胞移植后，供者细胞可产生强大而持久的免疫治疗功效，其中异源反应性nk细胞活性是T细胞异源反应活性以外的，具有显著抗肿瘤/白血病活性的自然免疫现象，并逐渐受到人们的重视。已证实，NK细胞通过其受体与靶细胞MHC分子特异性的识别机制参与移植物抗白血病（GVL）作用并影响移植物抗宿主病（GVHD）的发生。异基因造血干细胞移植后异源反应性NK细胞输注已从动物实验逐渐应用于临床。本文就NK细胞异源反应性及其在异基因造血干细胞移植中的作用进行综述。
【关键词】 异基因造血干细胞移植；NK细胞；移植物抗白血病；移植物抗宿主病
Role of NK Cells in Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation ——Review
Abstract
After allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT)，the donor cells present a profound immunization therapy efficiency. Among these effector cells，allo-reactivity natural killer (NK) cell activation are concerned with the graft-versus-host disease (GVHD) and graft-versus-leukemia (GVL) effect . As known，GVHD is primarily a T-cell-mediated event but not initiated by NK cells. NK cells may significantly enhance GVL immune response by using an integration of activating and inhibitory receptors. Allo-reactivitive NK cell infusion after allo-HSCT already transits from experiments to clinic. In this review the background on NK cells，and their clinical roles in Allo-HSCT were summarized.
Key words
allogeneic hematopoietic stem cell transplantation; natural killer cell; graft-versus-leukemia; graft-versus-host disease
异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是治疗多种恶性病及一些非恶性病的有效方法，尤其在治疗急性白血病方面，可使50%患者长期无病生存。研究发现，异基因造血干细胞移植后，供者免疫系统在受者体内的重建可产生移植物抗白血病（graft versus leukemia，GVL）作用，但也产生危及患者生命的移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）及迟发的免疫功能障碍。随着对NK细胞功能及活化机制的了解，其在allo-HSCT后造血重建及免疫重建中的作用越来越受到重视。许多的动物实验和临床观察均提示allo-HSCT后，供者NK细胞的异源反应活性通过促进植入、阻止T细胞介导的GVHD、攻击宿主白血病细胞发挥GVL效应。上述现象最初发现于单倍不相合移植，而后研究提示在HLA相合有血缘关系及非血缘关系供者移植中均有体现［1，2］。但最近国外也有研究发现，KIR-配体不相合引起的NK细胞异源反应性与移植相关死亡率（transplantation related mortality，TRM）升高及总存活率下降有关［3，4］，故在这方面的研究仍是热点，存在许多争议。本文就NK细胞异源反应性的形成机制、NK细胞在allo-HSCT中的作用等问题的研究新进展综述如下。
NK细胞群
NK细胞及来源
NK细胞是淋巴细胞谱系中不同于T、B淋巴细胞的一类大颗粒淋巴细胞，其代表性表型为CD3-、CD56+、CD16+。它是天然免疫系统的主要效应细胞，无需抗原预先致敏，与靶细胞混合后4小时内即可发挥杀伤作用，表现为速发效应，因此位于机体抵御肿瘤和病毒感染的第一道防线，同时又能通过早期分泌多种细胞因子和趋化因子来调节获得性免疫，故也是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁［5，6］，在机体免疫调节、造血调控、抗肿瘤和抗感染等方面发挥着重要的作用。Cooper等［7］根据NK细胞上CD56分子表达密度的不同将NK细胞分为CD56bright和CD56dim两个亚群，在正常人外周血单个核细胞主要参与NK细胞细胞毒作用。NK细胞来源于骨髓CD34+造血干细胞，其发育、成熟需要骨髓微环境包括骨髓基质及其来源的细胞因子。NK细胞与T细胞来自同一祖细胞，这种分化上的亲缘性可能解释了NK细胞活化也受协同刺激信号的影响，及胞内信号传导通路与T细胞极为相似等现象。但与T细胞不同，NK细胞的发育成熟不依赖于胸腺，在骨髓微环境中，IL15与其配体C-kit（KL）和flt-3（FL）的协同作用是NK细胞发育的关键生理调节因素，在其最初发育期，NK祖细胞在早期基质细胞活化生长因子KL、FL作用下发育为NK细胞前体，该前体细胞在IL-15作用下发育成熟为功能性NK细胞。
NK细胞受体及杀伤活性调节
NK细胞功能的发挥主要依赖于其识别靶细胞的受体。它有两种受体：一类是激发NK细胞杀伤作用的杀伤细胞活化受体（killer activatory receptor，KAR），如CD94/NKG2C、NKP-P1、KIR-3Dshort；另一类是抑制NK细胞杀伤作用的杀伤细胞抑制受体（killer inhibitory receptor，KIR），如CD94/NKG2A、KIR-3Dlong。按分子结构，也可将与NK细胞杀伤作用相关的受体分为免疫球蛋白样受体（immunoglobulin-like receptor）和凝集素样受体(lectin-like receptor)。一般认为，NK细胞可同时表达活化和抑制受体，其杀伤功能取决于表面抑制性受体与活化受体所传递信号的综合。抑制性受体KIR的配体为MHC-Ⅰ类分子。由于抑制性受体与其配体结合的亲和力大于活化受体，因此通常以抑制性信号占优势。正常情况下，机体组织细胞表面表达自身MHC-Ⅰ类分子，NK细胞KIR识别自身MHC-Ⅰ类分子，产生杀伤抑制信号，该信号在胞内起主导作用，能阻断杀伤信号的传递，表现为自身组织细胞不被破坏。只有当靶细胞表面MHC-Ⅰ类分子表达降低、丢失或发生变异（如细胞发生恶性转化、病毒感染等）时，NK细胞才能活化并启动杀伤作用，此即NK细胞的丢失自我（missing self）识别模式，即“杀伤自身MHC抗原减少或消失的细胞”［8］。
异基因造血干细胞移植中的NK细胞作用
NK细胞的“有利作用”
在异基因造血干细胞移植中，根据上述“丢失自我机制”，大部分情况下供者NK细胞KIR与受者靶细胞MHC分子的特异性识别表现为KIR-配体不相合性（少数情况下供受者KIR基因可能相合），可激活供者NK细胞，产生异源反应性NK细胞。KIR-配体不相容性与供者NK细胞的异源反应性密切相关。研究证实，此机制已参与移植物的植入、GVL作用及GVHD的发生，并对异基因造血干细胞移植产生有利影响，现分述如下。
NK 细胞与移植物的植入
无论供者、受者NK细胞都对移植物的植入有一定影响。受者方面，尽管在鼠类的研究显示了抗放射性宿主NK细胞在抵抗骨髓植入中的重要性，但临床干细胞移植中宿主NK细胞介导的抗植入现象却很有限。移植前抑制受者免疫的强化处理方案及大量植入的干细胞数量可基本抵消受者NK细胞的抗植入作用。供者方面，越来越多的研究发现，allo-HSCT过程中供者异源反应性NK细胞可主动攻击宿主细胞，辅助供者干细胞成功植入。供者来源的NK细胞（无论是原本存在于移植物中的还是由植入干细胞新分化发育的）都对促进植入有重要作用。当供受者KIR不相合引发供者NK细胞异源反应性时，供者NK 细胞通过识别杀伤受者残留淋巴细胞和造血细胞而发挥强有力的促植入作用［9］。Peters等［10］的临床研究发现，5例高危急性白血病患者经单倍相合异基因造血干细胞移植后，输注纯化的供者NK细胞可增加稳定嵌合体的形成，进一步证实了供者NK细胞可巩固移植物植入。
NK细胞与GVHD
GVHD的发生主要由T细胞介导。这一过程始于供者T细胞伴随造血干细胞进入受者体内与受者抗原相遇。启动GVHD的关键的第一步是抗原呈递细胞（APC）向供者CD8+T细胞呈递主要和次要组织相容性抗原。NK细胞并不引发GVHD。研究发现，在鼠类供受者H-2相合但仍可发挥供者NK细胞异源反应性的干细胞移植实验中，无GVHD出现，而且给受体鼠大剂量输注不相合NK细胞克隆也不引发GVHD［11］。进一步在临床移植观察中，单倍相合的allo-HSCT后的供者NK细胞输注是可耐受的，并不导致GVHD。然而，由于GVHD诱发的细胞表面分子上调并通过NKG2D配体激活NK细胞，使得NK细胞可能促进靶细胞的损伤。另一方面，在HLA不相合干细胞移植中，供者NK细胞可通过表达LFA-1（淋巴细胞功能相关抗原1，是一种黏附分子，介导NK细胞与靶细胞结合）的造血系统特异靶细胞减轻GVHD。供者异源反应性NK细胞可于输注后数小时之内杀灭受者淋巴细胞、骨髓细胞及APC［11］。理论上APC为启动GVHD所需，故输注异源反应性NK细胞应可以减轻GVHD。临床研究数据支持这一假说：在单倍相合和非亲缘供者异基因造血干细胞移植中，存在NK细胞异源反应性的供-受者的GVHD发生率确实低于KIR相合者［12］。
转贴于 NK细胞与GVL
在相同预处理条件下，allo-HSCT治疗恶性血液病的复发率低于自体造血干细胞移植。目前认为，其主要原因是异源反应性NK细胞、T细胞所产生的GVL效应［13］。NK 细胞与T细胞的异体反应性的区别显示，在HLA不相合移植中T细胞是GVHD的主要效应细胞，而NK细胞在移植物植入及GVL中起主要作用。前面已提到造血细胞对NK细胞的攻击很敏感，根据“丢失自我”识别模式，当NK细胞遇到KIR不相容的白血病细胞（靶细胞）时，就会显示出强大的细胞毒作用，而在KIR相合或自体造血干细胞移植中无此作用。将人类异源反应性NK细胞克隆输注到已植入人AML细胞转染性NOD/SCID小鼠D的实验研究发现：未治疗组及给予人无异源反应性NK细胞克隆组小鼠均于3周内死亡；而输入人异源反应性NK细胞组（即使输入的细胞数很少），这些异源反应性NK细胞即可清除白血病细胞并使小鼠存活120天。动物实验及临床移植均证实由KIR不相合产生的异源反应性NK细胞是allo-HSCT预后的有利因素。
NK细胞的“不利影响”
如前所述，异源反应性NK细胞在allo-HSCT中有许多有利作用，目前这方面的理论研究及临床实践很多。但近期一些临床研究也得出一些KIR-配体不相合引起的异源反应性NK细胞对移植的不良影响。一方面，Ruggeri等［14］最近仍报道单倍相合造血干细胞移植后，异源反应活性NK细胞介导的供者抗受者异源性反应可减少AML患者复发危险，改善植入，减轻GVHD；并进一步提出临床应用中可通过供者及受者高分辨HLA基因配型，积极鉴定供者KIR基因，甚至在一些病例中根据供者NK细胞克隆功能评价选择单倍体供者，均可能有助于增强巩固供者抗受者的NK细胞异源反应性。但另一方面，Nguyen等［15］在10例AML经单倍相合造血干细胞移植患者中研究移植后的NK细胞重建，发现尽管10例中8例KIR配体不相合，10例AML患者单倍相合造血干细胞移植后NK细胞恢复中未观察到GVL效应。且干细胞移植后产生的NK细胞表现出不成熟的表型：细胞毒性CD3(-) CD56(dim)亚型很少，表达KIR、NKp30 减少，而表达CD94/NKG2A增加。这些结果揭示，单倍相合干细胞移植后产生的NK 细胞 被阻滞在一种具有特殊表型特点的非成熟阶段，功能不全，对免疫应答及抑制恢复有潜在影响。不成熟的NK细胞，及NKG2A的抑制作用减轻了GVL效应。同时，Malmberg等［3］，Schaffer等［4］在190例非亲缘供者造血干细胞移植中（KIR-配体不相合者167例，相合者23例）的最新研究发现，KIR-配体不相合引起的NK细胞异源反应性与TRM升高及总存活率下降有关。这主要由严重感染引起，考虑由KIR-配体不相合引起的同种异源反应性NK细胞的存在可能潜在地阻碍了机体对移植后早期感染的有效免疫。目前看来，allo-HSCT后的造血重建与免疫重建非常复杂，其中NK细胞作用有待进一步探讨。伴随供者干细胞进入受者体内的成熟NK细胞与由供者干细胞在受者体内逐渐发育分化而来的NK细胞对移植后免疫是否有不同的影响，仍需进一步研究；同时，KIR-配体不相合在移植中的意义有待进一步评价。
临床展望
从临床应用来说，虽然对于异源反应性NK细胞在allo-HSCT中的作用仍存在许多争议，但根据其有利的作用，供者NK细胞输注已从实验动物研究开始逐渐用于临床，目前报道未出现明显不良反应［10］。对临床治疗思路有几方面启示： 首先，移植前进行供受者HLA配型并结合KIR基因鉴定，尽可能为选择更合适的供者提供依据；其次，NK细胞可加速APC从受者骨髓、脾脏等部位的清除，减轻GVHD，因而可无需使用针对T细胞的免疫抑制处理方法，这为降低GVHD发生设计了另类策略［16，17］。再次，联合供者异源反应性NK细胞输注，有望降低异基因造血干细胞预处理强度，更进一步扩大适应症范围，使得高龄及临床状况差的患者也得到治疗机会。
结语
随着对移植免疫学及NK细胞生物学效应产生机制的深入研究，人们对NK细胞在allo-HSCT中的作用逐渐了解。NK细胞受体（NKR）中KIR与配体（MHC-Ⅰ类分子）的不相合是激活NK细胞杀伤作用、在异基因移植中产生异源反应性NK细胞的关键，因此这也成为目前研究的热点。大部分研究结果显示，异源反应性NK细胞有利于异基因造血干细胞植入，可减少GVHD，并发挥GVL作用。但对移植后免疫重建及患者总生存率的影响研究较少，临床病例也缺乏长期观察，故这些方面还有待进一步阐明。在临床治疗中，纯化供者NK细胞的输注已在干细胞移植及恶性实体瘤生物治疗等方面取得了良好效果，并对干细胞移植治疗策略产生了重大影响。如何更好的发挥NK细胞功能，将是allo-HSCT治疗及肿瘤免疫治疗的研究重点。
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nk细胞范文第2篇
题目：表观遗传学调控NK细胞分化及功能的研究进展
表观遗传学 (epigenetics) 是指在基因核苷酸序列不发生变化的情况下, 通过对转录表达的调控和转录后的调控使基因表达发生变化, 包括DNA甲基化、组蛋白共价修饰、染色质重塑、基因印记、及非编码RNA、微小RNA (miRNA) 、反义RNA转录后调控等[1]。环境、年龄改变、压力、疾病状态等, 均可以引起免疫细胞表观遗传学改变, 造成免疫系统功能紊乱, 导致疾病的发生与进展。因此, 表观遗传学逐渐成为免疫学研究的热点。
自然杀伤细胞 (natural killer cell, NK) 是天然免疫细胞, 主要来源于造血干细胞, 全身广泛分布。NK细胞通过一系列细胞生物学过程获得激活信号, 包括胞外钙离子内流、细胞骨架重排以及与靶细胞接触部位免疫突触形成, 最终通过分泌细胞因子、趋化因子及释放毒性颗粒执行清除病毒、肿瘤细胞以及发挥免疫调节功能。NK细胞功能异常导致多种疾病发生, 包括感染、肿瘤及自身免疫疾病[2,3]。近年来, 有很多学者先后报道了表观遗传学改变对NK细胞增殖、分化及功能的影响, 为NK细胞研究提供了新思路, 为新药的临床应用奠定了理论基础。本文对NK细胞的表观遗传学研究进展作一综述。
1 表观遗传学对NK细胞分化的影响
人类NK细胞表面特异性表达CD56或CD16分子, 根据其表达水平将NK细胞分为CD3-CD56bright CD16- (CD56bright) 、CD3-CD56dimCD16+ (CD56dim) 、CD3-CD56-CD16+3个亚群[4]。其中CD56bright亚群为调节性NK细胞, 可以参与适应性免疫调节, 通过分泌细胞因子和趋化因子 (IFN-、TNF-、IL-10、IL-13和GM-CSF) 对树突状细胞 (DCs) 、调节性T细胞 (Tregs) 、辅T细胞 (Ths) 及细胞毒性T细胞 (CTLs) 等进行免疫调控[5]。在类风湿关节炎中, NK细胞可以通过分泌IFN-诱导B细胞活化, 促进DC细胞成熟, 并可抑制T细胞向Th17细胞分化[6]。NK细胞分泌IFN-可以促进DC细胞分泌IL-27, 而IL-27可促进IFN-分泌, 这种正反馈参与抑制Th17介导的自身免疫疾病[7]。人和小鼠NK细胞均可通过分泌IFN-可以抑制CD4+T细胞向Tregs分化[8]。CD56dim为功能性NK细胞, 通过穿孔素/颗粒酶途径、Fas/FasL途径、TNF-а/TNFR-1途径、以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用 (ADCC) 完成对靶细胞的直接杀伤。近期也有研究者发现, 功能性NK细胞参与适应性免疫的调节, 直接杀伤适应性免疫细胞, 如Th17及滤泡辅T细胞 (Tfh) [9]。而CD3-CD56-CD16+亚群目前研究较少, 目前认为主要发挥ADCC作用。
表观遗传学修饰在NK细胞的分化、成熟中发挥了重要作用。早期的研究显示, IL-15受体信号通路对NK细胞的分化成熟至关重要, E4BP4 (NFIL3) 在其中发挥调节作用, 促进了造血干细胞 (HSC) 向NK细胞分化。动物实验显示, E4BP4基因缺陷小鼠NK细胞减少、功能下降, 而过表达E4BP4可增加Id2和Gata3的转录, 从而促进HSC向NK细胞分化增加[10]。在NK细胞发育中, 组蛋白甲基化也具有重要调控作用。Yin等[11]研究了zeste基因增强子同源物2 (EZH2) 对早期NK细胞分化的影响。EZH2作为重要的表观遗传修饰酶, 是PcG (polycomb group) 蛋白家族的重要成员, 在调控基因表达的过程中起关键作用[12]。EZH2主要对组蛋白H3K27进行甲基化, 从而沉默下游基因, 在细胞增殖、分化及肿瘤形成方面都有重要作用[13]。研究者[11]发现, 在小鼠及人中, 选择性失活EZH2或用小分子抑制其活性后, 可以增加IL-15受体 (CD122+) 阳性的NK祖细胞数量, 并促进成熟NK细胞增殖。NK细胞的扩增及杀伤作用还与CD122及NKG2D有关, NKG2D缺失可降低EZH2抑制剂对促进NK细胞增殖及分化的作用。另外, Tsuyama等[14]研究报道, NKT细胞淋巴瘤患者存在组蛋白去甲基化酶KDM6A基因突变, 此基因与血液肿瘤关系密切, 可能影响NK细胞的增殖。
FcRIIIA (CD16a) 由FCGR3A编码, 为NK细胞在成熟过程中获得。研究发现, 在CD16a+细胞中, FCGR3A启动子中转录起始位点的甲基化水平较CD16a-细胞和中性粒细胞明显降低。此外, 研究者还发现miR-218是NK细胞CD16a转录后的负调控因子。在NK细胞中过度表达miR-218可降低CD16a的mRNA和蛋白表达水平, miR-218在CD16a-细胞中水平明显高于CD16a+细胞。因此, 研究者推断, FCGR3A的转录起始位点甲基化及转录后miR-218的调控作用可以通过改变CD16a的表达来调节NK细胞的分化成熟[15]。
记忆性NK细胞的概念由Sun等[16]最早提出。这类NK细胞可以长期存活, 具有免疫记忆功能, 当再次接触到记忆抗原时被激活。多种病毒可以诱导记忆性NK细胞产生, 目前报道的有巨细胞病毒, 单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒等[17,18]。记忆性NK细胞表达CD57和NKG2C, 不表达FcR、SYK、DAB2、ETA-2、PLZF和ILZF2。FcR、ETA-2、SYK的缺乏均有表观遗传学机制的参与[19,20]。IL-12信号通路通过其下游转录因子信号和转录因子4 (STAT4) 的激活影响记忆性NK细胞的扩增。Rapp等[21]发现Runx1和Runx3的启动子区域是STAT4的结合位点, 在NK细胞活化过程中, STAT4的结合会诱导RUNX基因位点的表观遗传学修饰, 从而导致表达增加。在病毒感染中, Runx1和Runx3或它们的伴侣分子表达减低是影响NK细胞扩增及记忆NK细胞形成障碍的原因。该研究证明, STAT4介导的Runx转录因子表观遗传学修饰可以调节NK细胞对病毒的适应行为。
2 表观遗传学对NK细胞功能的影响
NK细胞的功能主要包括杀伤及免疫调节作用。有研究显示, 在NK细胞活化过程中, 81%的主要位点出现CpG去甲基化, 生物学分析显示差异甲基化位点主要集中在免疫调节功能中 (如TNFA、LTA、IL-13、CSF2等) [22], 这提示表观遗传学修饰参与了NK细胞的活化, 并与NK细胞功能关系密切。
2.1 表观遗传学修饰对NK细胞表面受体的调节作用
NK细胞表面激活性受体与抑制性受体的相互平衡, 在NK细胞功能中发挥了重要调节作用。如激活性受体表达占优, 则NK细胞活化, 反之, NK细胞处于静止状态。
有学者[23,24,25]检测了NK细胞免疫球蛋白样受体 (KIR) 启动子的甲基化水平, 结果发现, 处于静息状态的人NK细胞92细胞系中KIR2DL1、KIR2DL2/L3高甲基化, 同时, 细胞表面的KIR表达降低。当应用5-氮杂胞苷进行去甲基化处理后, KIR启动子去甲基化, NK细胞表面KIR表达明显增加。另外, KIR的表达受miRNA调节。PIWI样RNA可以诱导KIR双向启动子KIR3DL1产生KIR反义转录本, 影响双链DNA的合成, 可减少90%的KIR表达[25]。
NKG2D是NK细胞激活性受体, 其表达增加可增强NK细胞功能。NKG2D通过识别不同的配体家族 (MICA、MICB、ULBPs 1-6等) 参与激活效应细胞、溶解靶细胞。NKG2D基因在NKG2D+NK细胞中去甲基化, 并与组蛋白H3赖氨酸9乙酰化 (H3K9Ac) 相关。用组蛋白乙酰转移酶 (HAT) 抑制剂 (姜黄素) 可以明显下调NKG2D基因H3K9乙酰化水平, 进而下调NKG2D的转录, 导致NKG2D表达减低, NK细胞杀伤功能下降。此研究提示NKG2D在NK细胞表面表达差异是由表观遗传学机制调节的, 并可以通过表观遗传治疗改善[26]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸 (VPA) 通过激活基因启动子中组蛋白K9的高甲基化和DNA甲基化, 从而下调NKG2D的表达[27]。同样, miRNA也可发挥对NKG2D的调节作用。在HCV感染患者的NK细胞中, miR-182与对照组相比过表达, miR-182表达升高可降低NKG2D的mRNA水平, 而miR-182抑制剂能降低抑制性受体NKG2A的mRNA水平[28]。
2.2 表观遗传学修饰对NK细胞细胞因子分泌水平的调节作用
NK细胞分泌细胞因子同样受到表观遗传学修饰的调节。Luetke-Eversloh等[29]报道, NK细胞受到刺激后, IFN-及T-bet位点转录增加, 并发生去甲基化, 从而增加IFN-的分泌。Li等[30]发现, 在NK细胞激活过程中, 组蛋白去甲基化酶及甲基转移酶发生明显变化。在NK92细胞系中, 与NK细胞激活密切相关的PI3KCA, 、NFATC1及TNFSF9等基因, 经PMA和依诺霉素刺激可出现H3K4me3和H3K27甲基化修饰, 从而调控上述基因表达。采用H3K4和H3K37的特异性抑制剂可以增加NK细胞脱颗粒及IFN-、TNF-的分泌[22,30]。Cribbs等[31]用染色质甲基化及乙酰化的小分子抑制剂进行筛选, 并通过基因敲除方法确定了Jumonli型组蛋白H3K27脱甲基酶是NK细胞分泌细胞因子的关键调节因子。JMJD3/UTX (含有Jumonji结构域的蛋白3) H3K27去甲基化酶抑制剂GSK-J4可引发细胞因子转录起始位点H3K27甲基化, 并造成NK细胞IFN-、TNF-、GM-CSF、IL-10分泌下降。GSK-J4可以明显抑制类风湿性关节炎患者外周血或组织中分离出的NK细胞的细胞因子分泌, 抑制破骨细胞形成及骨破坏。除甲基化外, 组蛋白乙酰化修饰也对NK细胞细胞因子分泌起调节作用。VPA可抑制NK细胞对白血病细胞的溶解, 并且有剂量依赖性。VPA预处理可降低NK细胞IFN-分泌, 破坏CD107A脱颗粒, 并通过激活PD-1/PD-L1途径诱导细胞凋亡[27]。
H3K4me3脱甲基酶KDM5A调节基因转录并参与肿瘤的发生。Zhao等[32]研究证明KDM5A缺陷使IFN-产生减少, 并损害NK细胞的活化。KDM5A (-/-) 小鼠对单核细胞增生李斯特氏菌 (LM) 感染高度敏感。在NK细胞活化过程中, KDM5A的缺失影响STAT4磷酸化和核定位, 并增加了细胞因子信号转导抑制因子1 (SOCS1) 的表达。进一步研究揭示其机制为KDM5A与P50结合, 并与静止NK细胞中的SOCS1启动子区结合, 抑制染色质重塑, 导致在SOCS1启动子中H3K4me3修饰显著减少。
另外, Lee等[19]在研究记忆性NK细胞时发现, 人巨细胞病毒感染后, NK细胞Syk转录起始位点甲基化, Syk基因沉默, 可引起表达IFN-水平升高。BHLHE40为转录调节因子, 在活化的NK细胞中去甲基化, 诱导细胞因子分泌 (如IL-2、IL-12、IL-15、IFN、TNFA等) , 增强NK细胞功能。NFAT转录因子家族通过与启动子及增强子区域结合来增加NK细胞因子的表达。在活化的NK细胞中, NFATC1内含子9明显去甲基化, 可调节NK细胞分泌细胞因子[22]。
3 引起NK细胞表观遗传学变化的因素
多种疾病状态下, NK细胞的表观遗传学修饰会发生变化, 如巨细胞病毒感染会激活NK细胞, 引起81%的位点发生DNA去甲基化[22]。在儿童哮喘患者中, NK细胞DNA去甲基化, 引起NK细胞活性升高[33]。在类风湿关节炎及强制性脊柱炎中, NK细胞均存在表观遗传学改变[31,32,33,34]。
一些药物可以引起NK细胞的表观遗传修饰变化。Misale等[35]报道, 糖皮质激素可以通过影响H3K27me3来降低IFN-的表达, 从而抑制NK细胞的免疫功能。5-氮杂胞苷可引起NK细胞DNA去甲基化, 诱导相关基因激活, 促进NK细胞活化[36]。
运动也可以引起NK细胞表观遗传学修饰发生改变。Zimmer等[37]选取30例非霍奇金淋巴瘤患者及10名健康人, 干预组每人每天骑车运动30min。运动组的患者血清巨噬细胞游走抑制因子 (MIF) 及IL-6水平升高, NK细胞组蛋白H3、H4乙酰化水平降低。近期, 研究者再次证明运动可以通过升高组蛋白乙酰化水平及NKG2D的表达, 改善正常人NK细胞活化状态[38]。
压力及年龄的增长对NK细胞的表观遗传学也有明显影响。创伤后应激综合征可以加速NK细胞由年龄造成的甲基化水平升高, 从而影响机体免疫状态[39]。
综上所述, 表观遗传学修饰影响着NK细胞的增殖、分化、杀伤、免疫调节等, 在NK细胞调控中, 扮演重要角色。但目前, NK细胞表观遗传学研究多集中在基础实验阶段, 在临床疾病中的应用很少。NK细胞参与肿瘤、自身免疫疾病及感染的发病, 其异常是否与表观遗传学修饰有关?进一步研究NK细胞表观遗传学异常在疾病发生中的作用, 将基础研究向临床应用转化, 开拓疾病中NK细胞功能异常的新思路, 并为新型药物在临床中的应用提供研究基础, 将是本课题组今后努力的方向。
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nk细胞范文第3篇
【关键词】NK细胞：CIK细胞；γδT细胞：化疗：小细胞肺癌
【中图分类号】R59
【文献标识码】A
【文章编号】1674-0742（ 2015） 06（b）-0059-02
肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，致死率及发病率在恶性肿瘤中居高不下，成为当前威胁人类生命健康安全的头号杀手。据不完全数据分析，小细胞肺癌（SCLC）发病率占肺癌发病率的15%～20%，多发于中老年男性，与吸烟关系密切，约90%以上的患者存在吸烟史。该疾病早期症状具有一定隐匿性，多数患者以咳嗽、气促、疼痛、咯血、乏力等表现为主，部分因未出现上述症状而延迟病情诊断，错过最佳时间。当前越来越多研究报道显示，SCLC患者存在多种免疫细胞功能缺陷，故研究者将探讨方向转移至改善患者免疫状态上，希望以此开辟新途径，提高SCLC患者治疗效果，延长其生存时间。该研究整群选取2009年8月一2014年12月间该院收治的94例小细胞肺癌患者为研究对象，以此为方向展开讨论，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
整群选取该院于2009年8月-2014年12月收治的94例小细胞肺癌患者为研究对象，均通过病理检杏及细胞诊断，符合《NCCN临床肿瘤治疗指南（2010年第1版）》中小细胞肺癌相关诊断及分期标准。根据患者人院顺序分成联合组（A组，n=47）和对照组（B组，n=47）两组，A组中男25例，女22例；年龄19～62岁，平均（48.3±4.4）岁；Karnofsky功能状态（KPS）评分（80.1±3.8）分；体力状况ECOC评分（1.1±0.5）分；病情发展：局限期29例，广泛期18例。B组中男24例，女23例；年龄20～63岁，平均（48.6±4.5）岁；KPS评分（80.3±3.9）分；ECOC评分（1.3±0.6）分；病情发展：局限期28例，广泛期19例。两组患者在一般资料对比上差异无统计学意义（P>0.05），具有可比降。
1.2 纳入标准
①符合小细胞肺癌相关诊断标准者；②符合《NCCN临床肿瘤治疗指南（2010年第1版）》中相关化疗指证（KPS≥70分且Ps≤2分）者；③临床资料完整者；④预计存活期超过3个月者；⑤自愿签署的知情同意书者。
1.3 排除标准
①合并其他严重疾病、功能障碍或恶性肿瘤者；②相关治疗禁忌症者；③精神障碍、意识障碍或语言障碍者；④中途退出治疗或随访期失联者；⑤未成年患者或年龄超过65岁者。
1.4 治疗方法
1.4.1 B组予以单纯化疗方案①依托泊苷注射液（规格：5mLO.Ig，批准文号：国药准字05253H823），100m/m?，生理盐水稀释后静脉滴注，浓度30min，dl-3；②注射用顺铂（规格：1Omg，批准文号：国药准字H20073652），75mg/m?，与5%葡萄糖注射液稀释后静脉滴注，滴注时间>30min，dl；局限期患者治疗4周，广泛期患者治疗6周后观察效果。
1.4.2 A组采用细胞免疫联合化疗方案①化疗方案同B组一致；②过继性细胞免疫治疗：治疗第1天采集患者白体外周血单个核细胞，体外培养扩增后于2周后回输NK细胞、CIK细胞及γδT细胞，持续6d，维持治疗至疾病进展。
1.5 评估标准
1.5.1 疗效评估标准参考《实体瘤新的疗效评价标准（解读1.1版RECIST标准）中相关标准。以患者无进展生存期（PFS）及总生存期（os）长短评估疗效。
1.5.2 观察指标行为期2～5年随访，比对两组患者总生存期及无进展生存期差异，记录其相关不良反应发生情况。
1.6 统计方法
应用统计学软件SPSS14.0分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料以百分率表示，采用X2检验，P
2 结果
2.1 生存率及生存期对比情况分析
A.B两组的局限期患者在PFS及1年生存率对比上差异无统计学意义（P>0.05）；A组局限期患者Os及2年生存率优于B组，差异有统计学意义（P
2.2 不良反应发生情况对比分析
两组患者不良反应发生率对比差异无统计学意义（P>0.05）；详细见表3。
3 讨论
nk细胞范文第4篇
目的: 探讨nkg2d配体在不同发育阶段树突状细胞（dc）表面的表达及其对自然杀伤（nk）细胞杀伤活性的影响。方法: 用细胞因子（rh il-4、 rhgm-csf、 tnf-α）体外诱导培养单核细胞来源的未成熟树突状细胞（idc）和成熟树突状细胞（mdc）并鉴定形态和表型, 免疫磁珠法分离纯化nk细胞。流式细胞术（fcm）检测idc和mdc表面nkg2d配体mica/b、 ulbp1-3的表达。用ldh释放法检测nk细胞对idc和mdc的杀伤活性以及抗nkg2d单克隆抗体(mab)阻断nk细胞后的杀伤活性。结果: 培养的idc和mdc具有典型的细胞形态和免疫表型特征。idc表面表达mica、 micb、 ulbp1、 ulbp3, 表达率分别为(32.39±8.30）%、 (17.75±3.40)%、 (26.71±6.48)%、 (38.37±6.89)%; mdc表面表达mica 、 ulbp3, 表达率分别为(7.82±2.67)%、 (8.36±2.42)%, 比idc表面相应配体表达率低（p<0.01）。各效靶比nk细胞对idc的杀伤活性均比对mdc的杀伤活性高, 差异有统计学意义(p<0.01)。抗nkg2d mab阻断nk细胞后对idc杀伤活性比阻断前减弱(p<0.05); 对mdc的杀伤活性与阻断前相比无统计学意义(p>0.05)。结论: nkg2d配体在idc表面表达高, 介导了nk细胞对idc的杀伤, 而对mdc的杀伤无影响, 是nk细胞对idc选择性高杀伤的分子机制之一。wWw.133229.cOm
【关键词】 nkg2d配体 自然杀伤细胞 树突状细胞
expression of nkg2d ligands on dendritic cells at different development stages and its effect on cytotoxicity of nk cells
tu san-fang, guo kun-yuan*, hu liang-shan, mei jia-zhuan, zhou jian, sun ming
department of hematology, zhujiang hospital, southern medical university, guangzhou 510282, china
［abstract］ aim: to investigate the expression of nkg2d ligands on dendritic cells（dc） at different development stages and its effect on cytotoxicity of natural killer（nk） cells. methods: the monocytes were cultured into immature dendritic cells（idc） and mature dendritic cells（mdc） with cytokines. nk cells were obtained from normal peripheral blood by cd56 antibody magnetic isolation.the expression of nkg2d ligands (mica/b, ulbp1-3) was detected by flow cytometry. cytotoxicity of nk cells and the nk cells blocked with anti-nkg2d mabs against idc and mdc was tested using ldh-releasing method. results: idc and mdc were of typical morphology and phenotypes. mica, micb, ulbp1, and ulbp3 were expressed on idc and their expression rate was (32.39±8.30)%, (17.75±3.40)%, (26.71±6.48)%, (38.37±6.89)%, respectively. mica and ulbp3 were expressed on mdc and their expression rate was (7.81±3.33)% and (8.36±2.42)%, respectively, which was lower than that on mdc (p<0.01). at the each e∶t ratio cytotoxicity of nk cells against idc was stronger than that against mdc (p<0.01). cytotoxicity of nk cells blocked with anti-nkg2d mab against idc was decreased compared with that of nk cells unblocked (p<0.05) while cytotoxicity of nk cells blocked with anti-nkg2d mab against mdc showed no decrease compared with that of nk cells unblocked (p>0.05). conclusion: the expression of nkg2d ligands on idc is higher than that on mdc, which plays an important role in the cytotoxic effect of nk cells against idc, but has no effect on that aginst mdc. nkg2d-nkg2d ligands shows one of the moleculer mechanisms that nk cells kill idc selectivly.
［keywords］nkg2d ligand; natural killer cell; dendritic cell
树突状细胞（dc）和自然杀伤（nk）细胞是机体免疫系统最重要的组成部分, 二者之间存在相互作用［1］。ruggeri等［2, 3］研究发现在异基因造血干细胞移植中供者nk细胞可以通过杀伤宿主dc来降低移植物抗宿主病（gvhd）的发生。但nk细胞杀伤dc的作用机制仍未完全明确。nk细胞主要通过表面受配体结合起杀伤作用, 本研究旨在通过检测nkg2d配体在不同发育阶段dc表面的表达水平来探索nkg2d受配体识别途径是否参与介导了nk细胞对不同发育阶段dc的杀伤, 为临床运用nk细胞降低gvhd的发生提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料 rpmi1640培养基和胎牛血清购自gibco公司。重组人白细胞介素-4 ( rh il-4)、 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子( rhgm-csf)和肿瘤坏死因子（tnf-α）均为pep rotech公司产品。抗cd56免疫磁珠抗体、 macs磁柱和macs细胞分选仪均为miltenyi公司产品。杀伤活性检测试剂盒（cytotox96 non-radioactive cytotoxocity assay）为promega公司产品。cd3fitc、 cd16pecd56pe mab为bd公司产品。fitc或pe标记的鼠抗人cd80、 cd86、 hla2dr、 cd83、 cd1a单克隆抗体(mab)及其同型对照均为ebiosience公司产品。鼠抗人nkg2d、 mica、 micb、 ulbp1、 ulbp2、 ulbp3 mab和fitc标记的兔抗鼠igg1购自rnd公司。facscabilur型流式细胞仪为beckman-coulter公司产品。
1.2 方法
1.2.1 人外周血单核细胞来源的idc与mdc体外诱导培养与鉴定 常规分离健康志愿者外周血单个核细胞, 以4×109/l细胞密度接种在6孔板中, 置于37℃、 50 ml/l co2培养箱中贴壁培养4 h后, 去除非贴壁细胞, 加入含20 μg/l rhil-4、 50 μg /l rhgm-csf、 100 ml/l胎牛血清的rpmi1640培养液, 置于培养箱培养, 隔天半量换液, 补充等量细胞因子。第6天补加80 μg /l的tnf-α, 共培养9 d。每天倒置显微镜下观察细胞形态。收集第6天和第9天细胞用25 ml/l戊二醛固定, 漂洗, 脱水, 乙酸异物脂置换, 干燥, 喷金后上机用扫描电子显微镜观察鉴定其形态。同样收集第6天和第9天细胞计数后分管, 分别加cd80pe、 cd86 pe-cy5、 hla-drpe、 cd1afe、 cd83fitc mab 4度标记, 对照管加同型对照igg1, 用流式细胞术（fcm）检测各分子的表达, 不同时间点重复3次。
1.2.2 人外周血来源的nk细胞分离 分离另外3位健康志愿者外周血单个核细胞, 每107个细胞加入80 μl pbs和20 μl抗cd56免疫磁珠抗体, 4℃标记15 min后洗涤, 用500 μl的pbs充分混匀后加入到磁柱中, 在macs细胞分选仪中分离, 推注器将分选的阳性细胞推入无菌试管, 为nk细胞。cd3fitc、 cd16pecd56pe mab标记nk细胞检测nk细胞的纯度。
1.2.3 idc、 mdc表面nkg2d配体的fcm检测 分别收集鉴定后的idc与mdc洗涤计数, 分6管, 每管109/100 ml细胞悬液, 按1 μg/106个细胞密度分别加入mica、 micb、 ulbp1、 ulbp2、 ulbp3 mab, 4度标记30 min后洗涤, 加入fitc标记的山羊抗鼠igg1二抗4度标记30 min, 第6管加等量同型igg1作为阴性对照, 洗涤后以fcm检测mica、 micb、 ulbp1、 ulbp2、 ulbp3的表达量。为避免实验误差, 不同时间点重复3次。
1.2.4 nk细胞对idc与mdc杀伤活性的检测 采用ldh释放法［4］, 收集idc, mdc作为靶细胞, nk细胞为效应细胞, 按照cytotox96 non-radioactive cytotoxocity assay杀伤试剂盒说明书操作, 倍比稀释法按效靶比20∶1、 10∶1、 5∶1铺板, 阻断组先加抗nkg2d mab 10 μg/100 μl常温下孵育15 min, 封闭nk细胞表面nkg2d受体, 再加靶细胞。显色后elx-800酶标仪上测a值。nk细胞杀伤率=(实验孔a值－靶细胞自发释放孔a值－效应细胞自发释放孔a值)/(靶细胞最大释放孔a值－靶细胞自发释放孔a值)×100%
1.2.5 统计学处理 应用spss13.0统计软件进行数据处理, 数据以x±s表示, 采用独立样本t检验, p<0.05者表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 idc和mdc的形态和表型 倒置显微镜下观察第6天细胞大部分半悬浮聚集成簇生长, 胞体增大, 表面可见短小毛刺状突起。第9天细胞大部分悬浮生长, 表面树突结构明显。扫面电镜下观察第6天细胞大小10 μm左右, 表面突起短小, 多见薄沙或云雾状皱褶, 符合idc的形态特征（图1a）; 第9天细胞表面突起更多更长, 呈典型树突状结构, 云雾状皱褶稀疏, 符合mdc的形态特征（图1b）。fcm结果显示第6天dc表面共刺激分子cd80和cd86分别为（40.8±7.9）%和（45.1±3.7）%, hla-dr表达为（59.9±5.2）%, 特异性分子标志物cd1a高表达为（71.9±5.2）%, 成熟分子标志物cd83低表达为（14.9±1.9）%, 为不成熟阶段表型。第9天测得cd80、 cd86和hla-dr表达升高为（71.5±7.3）%、 （79.9±6.7）%和（88.6±6.6）%, cd1a仍高表达, cd83表达升高为(65.5±3.8)%, 为成熟阶段表型。
图1 扫描电镜下观察dc形态（略）
fig 1 the morphologies of dc observed by scanning electron microscope
a: day 6; b: day 9.
2.2 nk细胞的纯度 fcm结果显示外周血单个核细胞经免疫磁珠分选后nk细胞（cd3-cd16+cd56+）的纯度为（91.66±4.04）%, 能满足实验要求（图2）。
图2 免疫磁珠法分选后nk细胞的纯度（略）
fig 2 purification of nk cells after immunomagnetic isolation
2.3 idc和mdc表面nkg2d配体的表达 idc表面表达mica、 micb、 ulbp1和ulbp34个配体; mdc表面只表达mica、 ulbp22个配体, 且比idc表面相应配体表达率低, 差异均有统计学意义（p<0.01）。其他配体表达率均低于5%, 视为阴性结果(表1, 图3)。
表1 nkg2d配体在idc和mdc表面的表达率（略）
tab 1 expression of nkg2d ligands on the surface of idc and mdc
bp<0.01 vs idc.
图3 idc和mdc膜表面nkg2d配体的表达（略）
fig 3 expression of nkg2d ligands on the surface of idc and mdc
2.3 nk细胞对idc与mdc的杀伤活性 各效靶比nk细胞对idc的杀伤活性分别高于对mdc的杀伤活性, 差异均有统计学意义（p<0.01）。nkg2d mab阻断nk细胞后, 各效靶比nk细胞对idc的杀伤活性降低（p<0.05）; 对mdc的杀伤活性与阻断前相比均无统计学意义（p>0.05）; 阻断后的nk细胞对idc的杀伤活性比阻断前nk细胞对mdc的杀伤活性高, 差异有统计学意义（p<0.05, 图4）。
图4抗nkg2d mab阻断前后nk细胞对idc和mdc的杀伤活性（略）
fig 4 cytotoxicity of nk cells and the nk cells blocked with anti-nkg2d mab against idc and mdc
3 讨论
nk细胞和dc是机体天然免疫和获得性免疫系统中重要的组成部分, 近年来研究［1, 5］表明二者在天然免疫早期阶段存在相互作用, dc能增强nk细胞的杀伤活性, 同时nk细胞能选择性杀伤idc, 到目前为止其杀伤机制仍在探索中。dc根据发育阶段的不同可分为idc和mdc, 其在形态, 表型和功能上有所不同［6］。nk细胞的杀伤活性同时受活化性和抑制性受配体结合产生的信号平衡调节起作用［7］, 其活化性受体主要包括ii型跨膜蛋白受体nkg2d和nk细胞自然细胞毒受体ncr, 与配体结合向nk细胞传递活化性信号。nkg2d配体［8］主要包括多态性的mhc-i类链相关的肽a、 b（mica/b）和人巨细胞病毒ul16结合蛋白(ulbps), 它们在不同发育阶段dc的表达情况尚未见研究报道。我们通过fcm分别检测idc和mdc表面nkg2d配体的表达, 结果显示idc表面表达mica、 micb、 ulbp1和ulbp3, 而mdc表面只表达mica和ulbp3, 且表达率很低。因此idc可以通过表面nkg2d配体与nkg2d结合激活nk细胞的杀伤活性, mdc通过nkg2d配体很难激活nk细胞。本研究杀伤试验显示nk细胞对idc的杀伤活性比对mdc的杀伤活性高很多, 与其他研究结果一致［9］。nkg2d mab阻断nk细胞后降低了nk细胞对idc的杀伤活性, 但对mdc的杀伤没有影响。因此可认为nkg2d受配体识别信号途径介导了nk细胞对idc的杀伤, 没有介导对mdc的杀伤, 是nk细胞选择性高杀伤idc的机制之一。
nk细胞的杀伤作用除了受活化性信号作用之外, 同时受抑制性信号的共同调节作用。nk细胞抑制性信号受体主要包括杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir和cd94/nkg2a等, 分别与靶细胞表面的hla-ⅰ类分子和不典型的i类分子结合, 向nk细胞传递抑制性信号［10］。本研究结果显示抗nkg2d mab阻断后对idc的杀伤活性仍比未阻断前nk对mdc的杀伤活性高, 说明抗nkg2d mab不能完全阻断nk细胞对idc的杀伤, 同时其他受配体识别途径介导。除了其他活化性信号途径外, 更主要的就是抑制性信号在二者强弱不等。ferlazzo等［11］发现mdc高表达抑制性配体mhc-i类分子, 而idc低表达, 这可能也是idc被nk细胞选择性杀伤的原因之一。
在异基因造血干细胞移植中利用nk细胞对idc 的杀伤清除能力, 输入kir/hla错配的nk细胞可能做为一种安全有效的过继细胞免疫治疗方法用于白血病的治疗, 降低gvhd的发生。本研究发现nkg2d配体在idc表面表达, 并首次证实它直接影响nk细胞对idc的选择性杀伤, 为临床造血干细胞移植合理选择供者提供了一定的理论依据。
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nk细胞范文第5篇
神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，其发病率占全部脑部肿瘤的50%以上。因其生长活跃，沿神经纤维呈浸润性生长，与脑组织无明显的界限，外科手术难以完全切除。加上脑组织对射线的耐受性差及血－脑脊液屏障对药物渗透的限制作用，恶性神经胶质瘤对化疗和放疗仅为中度敏感，大部分肿瘤会在原肿瘤周边0.5～3.0cm范围内复发[1]。所以需要其他辅助治疗方法来控制肿瘤的复发，以延长生存期，改善远期疗效。nk细胞是肿瘤免疫治疗的新的研究热点。随着临床和基础研究进展，人们发现部分神经胶质瘤细胞有逃避nk细胞免疫杀伤的生物学行为[2]。本研究以k562细胞为对照，探讨人神经胶质瘤细胞u251逃逸nk细胞杀伤的机制，为提高nk细胞免疫治疗效果，寻找新的免疫治疗方案提供新的思路。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和细胞株 nk细胞分离缓冲液和抗cd56免疫磁珠(miltenyi biotec公司)，amo1(antimica, igg1)、bmo1 (antimicb, igg1)、m295(antiulbp1, igg1)、m310(antiulbp2, igg1)、m551(antiulbp3, igg1)(德国alexander. steinle教授惠赠)，fitc标记的鼠抗人hlaⅰ类分子单抗（w6/32, igg2a）和山羊抗小鼠igg (ebioscience公司)，rpmi1640(gibco公司)，ldh杀伤活性检测试剂盒(promega公司)，trizol (invitrogen公司)，takara rna kit(amv)ver.3.0（takara公司），胎牛血清(杭州四季青公司)。人神经胶质瘤细胞株u251由中南大学湘雅医学院遗传研究所惠赠，人红白血病细胞株k562由本室冻存。用含10%胎牛血清的rpmi1640培养基，在37℃、5%co2、充分湿度的孵箱中培养，实验用细胞均处于对数生长期。
1.2 nk细胞的分离纯化 用梯度密度沉淀法常规分离5例健康个体外周血单个核细胞，pbs洗涤2次，计数细胞，按每107细胞加入80μl nk细胞分离缓冲液和20μl抗cd56免疫磁珠，4℃孵育15min，加入1ml的缓冲液，离心，弃上清。然后按108细胞/500μl缓冲液悬浮细胞，加入minimacs磁场中的分选柱，进行分离。用500μl缓冲液冲洗分选的阳性细胞，共3次。取下分选柱，置于无菌试管上，加入rpmi1640培养基1ml，用推注器推出分选的阳性细胞，获得cd3-cd56+细胞即为nk细胞。
1.3 nk细胞的细胞毒实验 用5%胎牛血清rpmi1640悬浮u251和k562细胞，作为靶细胞，加于96孔板中，每孔1×104细胞/50μl。以nk细胞为效应细胞，按不同效靶比(5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)分别加入相应数量的效应细胞50μl。另设培养基对照孔，效、靶细胞自然释放孔，靶细胞最大释放孔，各组均设3个复孔。于孵箱中培养4h，靶细胞最大释放孔提前45min加10μl裂解液，离心，每孔吸取上清50μl转入另一96孔板中，加入50μl ldh底物反应液，室温避光放置30min，每孔加50μl反应终止液，酶标仪490nm处测od值。抗体封闭试验以效靶比20∶1时，amo1、bmo1、m295、m310和m551分别与k562和u251细胞室温孵育15min，再加入nk细胞检测杀伤率。nk细胞杀伤率(%)=(实验组od平均值-靶细胞自然释放组od平均值-效应细胞自然释放组od平均值)/(靶细胞最大释放组od平均值-靶细胞自然释放组od平均值)×100%。
1.4 mhcⅰ类链相关分子a和b(mica/b)和人巨细胞病毒糖蛋白ul16结合蛋白(ulbp1～3) mrna的检测 引物参考文献[3]设计，由上海生工公司合成。收集k562和u251细胞，用trizol一步法直接提取总rna，紫外分光光度计测rna含量。取2μg总rna，加入20μl逆转录体系(25mm mgcl2 2μl、10mm dntp mixture 2μl、10×rt buffer 1μl、20μmol/l特异性下游引物0.5μl、rnase free ddh2o 3.75μl、rnase inhibitor 10u、amv reverse transcriptase 2.5u)混匀，50℃ 20min，99℃ 5min，5℃ 5min终止反应。直接在逆转录反应产物中加入40μl pcr反应体系(5×pcr buffer 10μl、takara ex taq 1.25u、20μmol/l上游特异性引物0.5μl、ddh2o 29.75μl)混匀。95℃预变性5min，95℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min，35个循环，72℃ 10min终止反应。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析仪观察结果。
1.5 mica/b和ulbp1～3和hlaⅰ分子测定 收集肿瘤细胞，pbs洗涤2次，计数细胞，分管，用直接标记法检测hlaⅰ类分子，按1μg/106细胞浓度加入w6/32，4℃孵育30min，pbs洗涤3次。用间接标记法检测mica/b和ulbp1～3分子的表达，加入amo1、bmo1、m295、m310和m551一抗，4℃作用30min，pbs洗涤后再加fitc标记的山羊抗鼠igg1二抗，4℃孵育30min，pbs洗涤后上机，以同型igg1抗体( pharmingen公司)为阴性对照。用流式细胞仪分析1×104细胞中阳性细胞数，计算百分率。为减少误差，重复实验3次。
1.6 统计学方法 所有实验数据以均数±标准差(±s)表示， 应用spss13.0软件处理数据，采用独立样本t检验以及单向方差分析。
2 结果
2.1 nk细胞的纯度 流式细胞仪检测nk细胞(cd3-cd16+cd56+)的纯度为（89.4±3.26）%。
2.2 nk细胞杀伤活性
2.2.1 不同效靶比时nk细胞杀伤k562和u251细胞的活性见表1。同一效靶比时nk细胞对两种细胞的杀伤率之间的差异有统计学意义(p＜0.05)。不同效靶比之间nk细胞对k562细胞杀伤率的差异有统计学意义(p＜0.05)，对u251细胞杀伤率的差异无统计学意义(p＞0.05)。表1 不同效靶比时nk细胞杀伤k562
和u251细胞的情况（％，±s）
5∶110∶120∶140∶1k562细胞29.32±1.1745.33±1.7858.37±2.3572.37±3.06 u251细胞4.69±0.323.47±0.845.36±1.135.81±0.82
2.2.2 效靶比20∶1时用抗体分别封闭靶细胞表面相应分子后nk细胞的杀伤情况见表2。阻断靶细胞nkg2d的各配体，nk细胞对k562细胞杀伤率有明显下降，对u251细胞的杀伤率无明显变化；阻断hlaⅰ分子，nk细胞对k562细胞杀伤率无明显变化，对u251细胞的杀伤率明显上升。
2.3 k562、u251细胞mica/b和ulbp1～3基因的表达情况 两种细胞在mrna水平均表达5种基因，见图1。
2.4 k562和u251细胞表面mica、ulbp1～3和hlaⅰ分子的表达情况，见表3、图2。
3 讨论
nk细胞是天然免疫的主要承担者，是机体抗肿瘤免疫的第一道天然防线。nk细胞功能的发挥由其细胞表面活化性和抑制性受体传递的信号共同决定[4]。nk细胞表面主要抑制性受体为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)，其共同特征是胞质区末端含有免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)，其配体为mhcⅰ分子。当抑制性kir与mhc分子结合后，引起kir分子在胞膜中聚集，使itim的酪氨酸磷酸化，向nk细胞传递抑制性信号，使其不杀伤靶细胞[5]。nk细胞表面活化性受体大致分为两大类，一类是mhcⅰ类分子特异性受体；另一类是非mhcⅰ类分子特异性受体，包括c型凝集素受体
1：dna marker；2：mica（635bp）；3：micb（690bp）；4：ulbp1（319bp）；5：ulbp2（327bp）； 6: ulbp3（321bp）；7：βactin (510bp)
图1 u251、k562细胞mica/b和
ulbp1～3 mrna的表达情况
和自然细胞毒受体(ncr)。nkg2d是c型凝集素受体超家族中的成员[6]，是nk细胞表面重要的活化受体，其配体为mica/b和ulbp1～3。nkg2d与肿瘤细胞表面的配体分子相互交联后，可以直接活化nk细胞，触发nk细胞的细胞毒活性，在肿瘤免疫监视中起着非常重要的作用。
本研究结果显示，同一效靶比时nk细胞杀伤u251细胞的活性明显低于杀伤k562细胞的活性，两者之间差异有统计学意义(p＜0.05)。表明以nk细胞杀伤敏感的细胞k562为对照，u251细胞抵抗nk细胞的杀伤。用rtpcr方法检测发现，k562和u251细胞在mrna水平均表达mica/b和ulbps基因，但流式细胞仪并未在u251细胞表面检测到mica/b和ulbps分子。另外，流式细胞仪检测发现u251细胞高表达hlaⅰ类分子，而k562细胞却不表达。因此可以推测，u251细胞通过hlakir信号途径向nk细胞传递抑制性信号，抑制性信号的参与会提高nk细胞的活化阈值。而u251细胞又不表达所有5个nkg2d的配体，不能向nk细胞传递活化性信号。因此与活化性信号相比，抑制性信号明显占优势，所以u251细胞抵抗同种异体nk细胞的杀伤。而k562细胞的情况则恰恰相反，其表面缺乏hlaⅰ分子，不会通过hlakir系统向nk细胞传递抑制性信号，没有抑制性信号对活化性信号的对冲，nk细胞活化的阈值就低。同时k562细胞又高表达活化性受体 表2 效靶比20∶1时阻断靶细胞表面相应分子后nk细胞的杀伤情况表3 u251和k562细胞表面mica/b和ulbp1～3的表达情况 图2 k562细胞和u251细胞表面nkg2d的配体和hlai类分子的表达情况
nkg2d的5种配体，因此任何同种异体nk细胞都表现出对k562细胞有很强的杀伤力。在效靶比为20∶1时我们用w6/32抗体阻断肿瘤细胞表面的hlaⅰ分子后，nk细胞对u251细胞的杀伤能力明显上升，而对k562细胞的杀伤活性没有明显变化。用amo1、bmo1、m295、m310和m551抗体分别封闭靶细胞表面的相应配体，结果显示，nk细胞对k562细胞的杀伤能力明显降低，而对u251细胞的杀伤活性没有明显变化。说明nkg2d配受体和hlakir信号系统确实参与调节nk细胞对u251细胞的杀伤作用，也证实了我们上述的推理。但抗体阻断试验并没有完全阻断nk细胞杀伤k562细胞的活性，说明除了nkg2d介导的杀伤活性外，尚有其他信号通路参与nk细胞对其的杀伤作用。
本实验结果和friese等[3]的研究一致。friese等发现人神经胶质瘤细胞ln229虽然表达mica，但由于该类肿瘤细胞高表达hlaⅰ类分子，因而对nk细胞抵抗。将转染mica基因的ln229细胞(ln229/mica)和未处理的ln229细胞接种于裸鼠皮下，发现ln229/mica肿瘤生长明显延迟，体积明显缩小。该研究表明增强nk细胞活化性信号，可以对抗抑制性信号，提高nk细胞的细胞毒活性。另外本研究发现u251细胞在mrna水平表达mica/b和ulbp基因，但细胞表面mica/b和ulbp蛋白的表达率极低。因此，研究如何使这些基因转录成蛋白表达在胶质瘤细胞表面，或者降低胶质瘤细胞的hlaⅰ分子，增强nk细胞的杀伤活性，将会为寻找新的免疫治疗方案提供新的思路。
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