真核细胞

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真核细胞范文第1篇

例1 关于同一个体中细胞有丝分裂和减数第一次分裂的叙述，正确的是（ ）

A.两者前期染色体数目相同，染色体行为和DNA分子数目不同

B.两者中期染色体数目不同，染色体行为和DNA分子数目相同

C.两者后期染色体行为和数目不同，DNA分子数目相同

D.两者后期染色体行为和数目相同，DNA分子数目不同

解析 有丝分裂和减数分裂分裂期过程的最大区别是染色体的行为不同。有丝分裂前期有同源染色体但不联会，中期染色体的着丝点被纺锤丝拉到赤道板位置排列整齐，后期着丝点分裂，姐妹染色单体分离并分别移向细胞的两极，此时染色体数目暂时性加倍，DNA分子数不变，分裂的结果是分裂前后染色体数与DNA分子数与分裂前一样。减数第一次分裂前期同源染色体联会，中期是联会的同源染色体被拉到赤道板的两侧并列分布，后期同源染色体分离及非同源染色体的自由组合，分裂的结果是染色体数目和DNA 数目均减少一半。由于DNA是在间期复制的，在分裂期总数未增加。有丝分裂的前期无同源染色体联会的行为，所以A、B、D错。本题通过有丝分裂和减数第一次分裂中有关染色体行为和DNA数目变化规律的内容，考查两种分裂方式的相同点和不同点，考查大家对两种分裂方式的识记和分析解决问题的能力。

答案 C

例2 判断下列细胞正在进行什么分裂，处在什么时期？

解析 该题要求根据细胞分裂图能判断其所处的时期，实际上需要区分有丝分裂、减Ⅰ和减Ⅱ的前、中、后期的特点。前期特点：有丝分裂是核膜核仁消失，出现了纺锤体和染色体，染色体散乱排列；减Ⅰ是同源染色体配对联会，出现四分体，交叉互换；减Ⅱ是非同源染色体散乱排列在细胞内。中期特点：有丝分裂是染色体排列在赤道板上，染色体形态数目清晰；减Ⅰ是同源染色体排列在赤道板上；减Ⅱ是非同源染色体排列在赤道板上。后期特点：有丝分裂是着丝点分裂，姐妹染色单体分离变成染色体，染色体数目加倍；减Ⅰ是同源染色体分离，非同源染色体自由组合；减Ⅱ是着丝点分裂，姐妹染色单体分离变成染色体，染色体数目加倍。

答案 1. 减Ⅱ前期 2. 减Ⅰ前期 3. 减Ⅱ前期 4. 减Ⅱ末期 5. 有丝分裂后期 6. 减Ⅱ后期 7. 减Ⅱ后期 8. 减Ⅰ后期 9. 有丝分裂前期 10. 减Ⅱ中期 11. 减Ⅰ后期 12. 减Ⅱ中期 13. 减Ⅰ前期 14. 减Ⅱ后期 15. 减Ⅰ中期 16. 有丝分裂中期

点拨 可按下列步骤判断：一看染色体数目，奇数为减Ⅱ（姐妹染色单体分家只看一极），偶数进行二看；二看有无同源染色体，没有为减Ⅱ（姐妹染色单体分家只看一极），有同源染色体进行三看；三看同源染色体行为，根据同源染色体行为确定有丝分裂或减Ⅰ。

例3 下图表示某种生物细胞核内染色体及DNA相对量变化的曲线图。根据此曲线图回答下列问题：（注：横坐标各个区域代表细胞分裂的各个时期，区域的大小和各个时期所需的时间不成比例）

（1）图中代表染色体相对数量变化的曲线是 。

（2）形成配子时，成对的遗传因子分离发生在图中的 过程。

（3）细胞内含有四分体的区间是 。

（4）若该生物体细胞中染色体数为20条，则一个细胞核中的DNA分子数在9—12时期为 条。

（5）着丝点分裂发生在横坐标数字的 处进行。

解析 根据DNA和染色体在有丝分裂和减数分裂中的变化特点可知，曲线A为DNA的变化曲线，B为染色体的变化曲线。这个图把减数分裂、受精作用和有丝分裂很好的联系在一起。0～8表示的是减数分裂；8位点发生受精作用；8～13表示的是有丝分裂。具体的时间段1～2、2～3、3～4、4～5、5～6、6～7、7～8依次为减Ⅰ的前期、中期、后期、减Ⅱ的前期、中期后期和末期；9～10、10～11、11～12、12～13依次为有丝的前期、中期、后期和末期。成对的遗传因子分离发生在减Ⅰ后期，即3～4；四分体形成于减Ⅰ前期，消失于减Ⅰ后期，存在区间即1～3；着丝点分裂是瞬间完成的，在两个地方发生：减Ⅱ后期和有丝后期刚开始时，这里很多考生往往不是漏掉一个就是填成区间。

答案 （1）B （2）3～4 （3）1～3 （4）40 （5）6、11

点拨 主要是减数分裂染色体、DNA的变化和有丝分裂染色体、DNA的变化四种曲线的比较（如下图）。

[减数分裂染色体的变化][减数分裂DNA的变化][① ②]

[③ ④] [有丝分裂DNA的变化][有丝分裂染色体的变化]

区别有丝分裂曲线与减数分裂曲线：看起点和终点，起点和终点在同一直线上的为有丝分裂；不在同一直线上的为减数分裂。（如图①与图②或图③与图④）

区别染色体曲线与DNA曲线：看染色体或DNA暂时加倍的时间，加倍的时间在间期，且线条是倾斜（DNA的复制需一定时间）的为DNA；加倍的时间在后期（有丝分裂后期或减数第二次分裂后期），且是突然加倍（着丝点的分裂是瞬间的）的为染色体。（如图①与图③或图②与图④）

1.a和b属于同一动物体内的两个细胞，通过对其核内DNA分子含量的测定，发现a细胞中DNA含量是b细胞的两倍，最可能的解释是（ ）

A.a是正常体细胞，b是处于减数第一次分裂结束时的细胞

B.a是处于有丝分裂后期的细胞，b是处于有丝分裂前期的细胞

C.a是处于有丝分裂前期的细胞，b是处于减数第一次分裂后期的细胞

D.a处于有丝分裂中心体相互分离时，b处于次级性母细胞中染色体移向两极时

2.图示某雄性二倍体动物体内一个正在分裂的精原细胞。这个细胞所处的时期为（ ）

A.有丝分裂中期

B.减数第一次分裂中期

C.减数第二次分裂中期

D.减数第一次分裂间期

3.下图表示某种植物生殖与发育过程中，细胞内染色体和DNA相对含量的变化曲线，据图回答下列问题。

（1）图中“——”（实线）表示 含量的变化，“- - -”（虚线）表示 含量的变化。

（2）图中表示有丝分裂的阶段是 ，表示减数分裂的阶段是 ，表示受精作用的点是 。

真核细胞范文第2篇

【摘要】

目的: 观察CRLF3蛋白在293T细胞中的表达及亚细胞定位， 并在大肠杆菌中表达和纯化了重组CRLF3蛋白。方法: 将真核表达载体pCMVmycCRLF3瞬时转染293T细胞， 转染24 h和48 h后免疫荧光染色， 共聚焦显微镜观察蛋白表达及定位; 构建原核表达质粒pGEX4T1CRLF3， 实现插入基因的融合表达， 经GST亲合层析纯化蛋白。结果: CRLF3蛋白在293T细胞中高效表达， 主要分布在细胞质和细胞膜; 成功构建了表达CRLF3融合蛋白的原核表达载体， 并在大肠杆菌内高效表达， 纯化后得到Mr 约为74000的融合蛋白。结论: 在真核细胞中过表达的CRLF3蛋白主要定位在细胞质和细胞膜; 获得了重组GSTCRLF3融合蛋白，为进一步探讨CRLF3的功能奠定基础。

【关键词】 人细胞因子受体样因子3 真核表达 原核表达 蛋白纯化

[Abstract]AIM: Cytokine receptorlike factor 3 (CRLF3) is a novel gene cloned from K562 cell line. The aim of the current study is to observe CRLF3 expression and subcellular localization in 293T cells and to express and purify the CRLF3 fusion protein in E.coli. METHODS: The plasmid pCMVmycCRLF3 was transiently transfected into 293T cell. The expression and localization of CRLF3 protein was observed by immunostaining approach. CRLF3 was also cloned into pGEX4T1 vector. The GSTCRLF3 fusion protein was expressed in E.coli and purified by GST affinity chromatography． RESULTS: CRLF3 protein was highly expressed in transfected 293T cells. CRLF3 protein was distributed in both cytoplasm and cell membrane. The GSTCRLF3 fusion protein was expressed as a Mr 74 000 protein and then successfully purified from E.coli cells. CONCLUSION: Overexpressed CRLF3 is a cytoplasmic protein that distributes in both cytoplasm and cell membrane in mammalian cells. The recombinant GSTCRLF3 fusion protein had been isolated and could be used for further antibody production and functional characterization.

[Keywords]CRLF3; eukaryotic expression; prokaryotic expression; protein purification

人细胞因子受体样因子3（cytokine receptorlike factor 3， CRLF3）是一个具有I类细胞因子受体保守功能域的新基因。本实验室从K562细胞中克隆出CRLF3[1]， 并提交NCBI GenBank（DQ298450）。CRLF3基因编码区全长1317 bp， 编码一个438个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析CRLF3定位在17q11.2， 具有一个重要的结构域——FN3功能域， 这一结构域的C末端， 有一个RGD基序和I类细胞因子受体特有的WSXWS基序， CRLF3基因保守存在于多种生物中。对CRLF3的功能研究表明CRLF3 的过表达可以抑制细胞周期， 使细胞停滞在G0/G1期， 减少了进入S期的细胞， 其作用机制尚不明确。CRLF3可能是一种交通信号分子。本研究中， 我们将CRLF3基因在真核细胞中表达， 观察了CRLF3在真核细胞中的定位， 并在原核细胞中表达和纯化了其融合蛋白， 为进一步研究CRLF3的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 真核表达质粒pCMVmycCRLF3、 人胚肾293T细胞、 融合表达载体pGEX4T1、 E.coli DH5α、 E.coli BL21(DE3)均由本室保存; MEM、 胎牛血清购自Gibco公司; T4连接酶、 BamH I、 Xho I限制性内切酶、 λEcoT14I digest DNA marker、 蛋白maker均购自TaKaRa公司; 磷酸钙转染试剂购自碧云天生物技术公司; cMyc抗体购自Santa Cruz公司; FITC标记山羊抗小鼠IgG购自中杉金桥公司; GSTTag抗体购自Proteintech公司; Glutathione Sepharose 4B购自GE Healthcare公司; PCR引物由上海英俊生物技术公司合成; 其他均为国产分析纯生化试剂。

1.2 方法

1.2.1 293T细胞的培养和pCMVmycCRLF3的转染 将生长状态良好的293T细胞按1×105 cells/孔的密度转移到放玻片的6孔板中， 在含100 mL/L胎牛血清的MEM培养基中培养24 h。转染前30 min， 换新鲜的培养液2 mL， 分别取5 μg空载体质粒和pCMVmycCRLF3与磷酸钙转染试剂混匀， 室温孵育20 min， 均匀滴加到6孔板内， 在50 mL/LCO2， 37℃培养箱内培养24 h和48 h。

1.2.2 免疫荧光染色 转染24 h和48 h后， 弃去培养液， 多聚甲醛固定20 min， 5 mL/L TritonX100去膜10 min。含100 mL/L胎牛血清的PBS封闭1 h， 加入抗cmyc抗体（1∶100）室温孵育1 h， PBST充分洗涤。加入FITC标记山羊抗小鼠IgG（1∶100）室温孵育1～2 h， PBST充分洗涤。最后加入0.5 g/L DAPI(联眯基苯吲哚酸盐)标记细胞核15min， 洗涤后500mL/L甘油封片， 共聚焦显微镜观察结果。

1.2.3 pGEX4T1CRLF3融合表达载体的构建 以本室构建的pCMVmycCRLF3质粒为模板， 根据已测得的CRLF3的全长序列设计引物， 进行PCR扩增。上游引物序列为5′TATA GGATCC ATG GAG CTG GAG CCT GAG CT3′， 其中导人BamH I酶切位点; 下游引物序列为5′TATA CTCGAG CTA AAA CAC TAA CAC TTT CC3′， 其中导人Xho I酶切位点。PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳回收， BamH I和Xho I酶切pGEX4T1载体和PCR产物， T4连接酶连接， 转化DH5α感受态细胞。挑取单个克隆于5 mL LB(Amp+)培养液中培养过夜， 提取重组质粒， BamH I/Xho I酶切鉴定， 阳性克隆提交上海英俊生物技术公司进行测序分析。

1.2.4 GSTCRLF3融合蛋白的诱导表达和纯化 将序列正确的重组表达质粒pGEX4T1CRLF3转化宿主菌BL21（DE3）， 挑选5个单个菌落分别接种到5 mL LB（Amp＋）管中， 与37℃剧烈摇动培养过夜。每个菌落的培养物按1/100的比例接种到2个新鲜LB（Amp＋）管中， 37℃剧烈摇动培养4 h， A550达到0.6～0.8后， 向其中一管中加入终浓度为1 mmol/L IPTG， 另一管为未诱导的对照菌， 30℃继续培养3～4 h。离心收集培养液各1 mL， 菌体沉淀以100 μL PBS重悬， 取10 μL样品进行120 g/L SDSPAGE电泳， 考马斯亮蓝染色。以空载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)作为阴性对照， 检测蛋白表达情况， 选出蛋白表达量高的菌落做种子。

1.2.5 融合蛋白的大量表达和纯化 选取融合蛋白表达量高的种子菌， 以终浓度为1 mmol/L IPTG大量诱导菌液500 mL， 离心收集菌体， 1×PBS(pH7.4)悬浮菌体， 冰浴条件下超声破裂菌体， 4℃、 120000 r/min离心30 min， 取少量上清和沉淀， 进行SDSPAGE检测， 分析蛋白质在胞内表达形式。确定目的蛋白以可溶性形式存在后， 取超声上清过装有500 μL Glutathione Sepharose 4B凝胶的纯化柱， 以1 L的PBS淋洗， 去除杂蛋白， 最后用1倍柱体积的GST洗脱缓冲液 (50 mmol/L TrisHC1 pH8.0， 10 mmol/L还原型谷胱甘肽)洗脱目的蛋白。

1.2.6 Western blot鉴定融合蛋白 取纯化的蛋白进行120 g/L丙烯酰胺凝胶电泳， 电转移至硝酸纤维素膜上， 50 g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜。加入GST抗体（1∶2500）室温孵育2 h， TBST充分洗涤， 加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1∶5000）， 室温孵育1 h， TBST充分洗涤， ECL显影。

2 结果

2.1 共聚焦显微镜观察结果 采用共聚焦显微镜观察CRLF3蛋白在293T细胞中的表达及分布。以转染pCMVmyc空载体的293T细胞为本底对照， 40倍物镜下观察可见CRLF3在真核细胞中高效表达。油镜下观察可见瞬时转染24h后的CRLF3均匀分布在胞质中; 瞬时转染48 h后的CRLF3分布在细胞质和细胞膜上（图1）。

图1 转染24 h和48 h后免疫荧光染色（略）

Fig 1 Immunostaining of CRLF3 on 293T cell transfecting pCMVmycCRLF3 after 24 h and 48 h(×1000)

A: Antimyc after 24 h; B: DAPI; C: Merged; D: Antimyc after 48 h; E: DAPI; F: Merged.

2.2 重组质粒的构建和鉴定 以pCMVmycCRLF3质粒为模板扩增的产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳， 得到一条特异条带， 与目的片段1318 bp的大小位置相符（图2）。重组质粒pGEX4T1CRLF3采用BamH I/Xho I酶切鉴定（图3）， DNA测序分析， 证明插入序列是目的序列， 且与融合表达载体的读码框相符。

图2 CRLF3 PCR扩增产物（略）

Fig 2 CRLF3 product of PCR

1: CRLF3 PCR product; 2: λEcoT14I digest DNA marker.

图3 重组质粒pGEX4T1CRLF3的酶切鉴定（略）

Fig 3 Restriction analysis of recombinant plasmid pGEX4T1CRLF3

1: λEcoT14I digest DNA marker; 2: pGEX4T1CRLF3 digested by BamH I and Xho I.

2.3 重组蛋白在大肠杆菌BL21中的表达和纯化 SDSPAGE结果显示， 转化空载体的对照组BL21 IPTG诱导后， 在Mr 26000的位置上出现1条浓集带; 转化pGEX4T1CRLF3重组质粒的BL21 IPTG诱导后， 在Mr约为74000的位置上出现1条较浓集而且表达量受IPTG诱导的蛋白条带， 说明插人的融合基因已经在大肠杆菌中表达， 但在这一位点上也有内源性基因的表达。超声破碎菌体并离心后， 分别取上清和沉淀进行SDSPAGE电泳检测， 显示目的蛋白主要在上清液中， 它在菌体内主要以可溶性形式存在; 利用Glutathione Sepharose 4B亲和纯化目的蛋白， SDSPAGE分析得到1条Mr为74000的单一条带。灰度扫描分析， 纯度达到85%（图4）。

图4 SDSPAGE分析融合蛋白的表达及纯化（略）

Fig 4 SDSPAGE analysis of expression and purification of fusion protein

1: Protein maker; 2: pGEX4T1 transformed BL21（IPTG-）; 3: pGEX4T1 transformed BL21（IPTG＋）; 4: pGEX4T1CRLF3 transformed BL21（IPTG-）; 5: pGEX4T1CRLF3 transformed BL21（IPTG＋）; 6: Supernatant; 7: Sediment; 8: Purified fusion protein.

2.4 Western blot检测 用抗GSTtag多克隆抗体对纯化的GSTCRLF3融合蛋白进行Western blot检测。抗GST的抗体可以检测到Mr为74000的CRLF3融合蛋白条带， 提示纯化后的蛋白为所需要的GST融合蛋白。

3 讨论

CRLF3基因定位在17q11.2， 邻近NF1 (neurofibromatosis type 1)基因， 在神经纤维瘤患者中， CRLF3基因常与NF1一起缺失。神经纤维瘤的遗传学致病机制是由于NF1基因的微缺失， 其缺失的范围至少包括11个基因， CRLF3为其中之一[2， 3]。NF1基因是一种抑癌基因[4]， 而缺失基因簇中的其他基因功能尚不清楚。对CRLF3的生物信息学预测， 它不具有跨膜结构域， 没有核定位信号与细胞器定位信号， 是一种胞质蛋白质。本研究中通过在真核细胞中表达CRLF3， 可见CRLF3转染24 h后主要定位在细胞质， 转染48 h后， 则在细胞质和细胞膜上均有分布， 提示在真核细胞中过表达的CRLF3是一种胞质蛋白质， 充分表达后向细胞膜迁移。CRLF3含有FN3功能域和RGD基序， 含有这样结构域的分子大部分具有介导细胞间黏附和相互作用的功能， 而且主要以受体和分泌形式存在[5]。具有RGD基序的胞质蛋白CRLF3是否也具有介导细胞间黏附和相互作用的功能， 或在细胞质中发挥通讯分子的作用，有待进一步探讨。

本研究中， 我们利用可诱导表达的大肠杆菌表达系统， 以原核表达质粒pGEX4T1为载体表达出GSTCRLF3的融合蛋白， 进一步应用GST亲和层析法有效分离得到纯化的目的基因CRLF3的融合蛋白[6]， 为下一步制备抗CRLF3的多克隆抗体， 更好的研究CRLF3的功能创造条件。

参考文献

[1] Yang F， Zhang Y， Cao YL， et al. Establishment and utilization of a tetracyclinecontrolled inducible RNA interfering system to repress gene expression in chronic myelogenous leukemia cells[J]. Acta Biochim Biophys Sin， 2005， 37(12): 851-856.

[2] KehrerSawatzki H， Kluwe L， Sandig C， et al. High frequency of mosaicism among patients with neurofibromatosis type 1 (NF1) with microdeletions caused by somatic recombination of the JJAZ1 gene[J]. Am J Hum Genet， 2004， 75(3): 410-423.

[3] Jenne DE， Tinschert S， Reimann H， et al. Molecular characterization and gene content of breakpoint boundaries in patients with neurofibromatosis Type 1 with 17q11.2 microdeletions[J]. Am J Hum Genet， 2001， 69(3): 516-527.

[4] Bollag G， Clapp DW， Shih S， et al. Loss of NF1 results in activation of the Ras signaling pathway and leads to aberrant growth in haematopoietic cells[J]. Nat Genet， 1996， 12(2): 144-148.

真核细胞范文第3篇

【关键词】  α突触核蛋白;质粒;帕金森病

【摘要】  目的 构建携带人alpha突触核蛋白真核重组质粒，检测其在人神经母细胞瘤sknsh细胞中的表达及对细胞存活率的影响。方法 pcr扩增alpha突触核蛋白基因，产物纯化后与pcdna3.1(+)载体进行连接反应, 构建pcdna3.1(+)/alpha突触核蛋白真核重组质粒。lipofectamine法转染人神经母细胞瘤sknsh细胞，rtpcr方法检测sknsh细胞中alpha突触核蛋白mrna的表达，四甲基偶氮唑盐(mtt)法检测其对细胞存活率的影响。结果 酶切鉴定及基因测序证明人alpha突触核蛋白基因已被完整、正确地插入到pcdna3.1(+)载体中。rtpcr 结果显示该表达载体转染sknsh细胞后，细胞内alpha突触核蛋白mrna的表达水平明显增高，mtt方法检测结果显示该表达载体转染并未引起细胞存活率的改变。结论 alpha突触核蛋白真核重组质粒构建成功, 并可在sknsh细胞内表达，且对细胞的存活率不产生任何影响，从而为进一步研究alpha突触核蛋白在帕金森病发病机制中的作用奠定了基础。

【关键词】  α突触核蛋白;质粒;帕金森病

construction of the eukaryotic expression plasmid of human alphasynuclein gene and its expression in sknsh cells he qing, du tingting, song ning, et al (department of physiology, shandong provincial key laboratory of pathogenesis and prevention of neurological disorders and state key disciplines: physiology, qingdao university medical college, qingdao 266071, china); [abstract] objective to construct the eukaryotic expression plasmid of human alphasynuclein gene and detect its expression in human sknsh neuroblastoma cells and its effect on cell viability. methods pcr was performed to amplify the entire fragment of human alphasynuclein gene, and the amplified gene was inserted into the eukaryotic expression vector pcdna3.1 (+) to form the new construct donated pcdna3.1(+)/alphasynuclein after purification. liposomemediated gene transfection method was used to transfect the human sknsh cells. rtpcr was used to detect the transient expression of alphasynuclein gene. mtt assay was used to detect the changes in cell viability. results recombinant contained the correct and entire nucleotide sequence of human alphasynuclein gene was found to be successfully constructed via restriction enzyme digestion and sequencing methods. levels of alphasynuclein mrna were obviously increased in sknsh cells with reconstructive plasmid transfection. however, no significant changes in cell viability were observed in these transfected cells. conclusion the eukaryotic expression plasmid of human alphasynuclein gene is successfully constructed and expressed in sknsh cells. the cell viability is not affected. all these results establish a foundation for a further study of the role of alphasynuclein in the pathogenesy of parkinson disease.

[key words] alphasynuclein; plasmids; parkinson disease

帕金森病(pd)是最常见的神经退行性疾病，发病率仅次于老年痴呆。其主要的病理改变是黑质致密带多巴胺能神经元脱失及伴发的纹状体轴突末梢多巴胺的耗竭[1]。pd的发病机制目前还不清楚，可能与老龄、环境毒素、遗传因素、氧化应激、兴奋性毒素、神经营养因子缺失等因素有关[23]。近年来，蛋白质的异常修饰和错误折叠在神经系统退行性疾病发病中的作用越来越受到关注，被认为可能是神经细胞变性死亡的关键环节。alpha突触核蛋白为一种在健康人的脑组织中广泛分布的可溶性蛋白，被认为是pd发病机制中最重要的蛋白。alpha突触核蛋白是路易小体的主要结构成分，其聚集与路易小体的形成及多巴胺能神经元的死亡密切相关[4]。但是目前alpha突触核蛋白为何发生聚集形成路易小体以及聚集过程中对多巴胺能神经细胞的毒性作用还不十分清楚。因此，本实验拟构建一种携带人alpha突触核蛋白的真核重组质粒，并转染人神经母细胞瘤sknsh细胞，为探讨影响alpha突触核蛋白聚集的因素以及alpha突触核蛋白聚集的毒性作用机制提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料

实验所需大肠杆菌菌株jm109和pcdna3.1(+)载体均为本实验室保存。dmem培养基购自gibco公司，各种限制性内切酶、dna连接酶购自中国宝生物工程(大连)有限公司。质粒小提试剂盒购自贝基生化科技有限公司，胶回收试剂盒、pcr产物纯化试剂盒和rt试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。琼脂糖购自bioasia生物技术公司，lipofectamine 2000购自invitrogen公司。四甲基偶氮唑盐(mtt)购自sigma公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。sknsh细胞购自上海中国科学院细胞库。其他化学试剂为国产分析纯。

1.2 alpha突触核蛋白基因的pcr扩增

根据genbank中已收录的alpha突触核蛋白cdna序列设计特异引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物:5′ctcgagcggccgccagtgtgatg3′(xhoⅰ酶切位点)，下游引物:5′tctagaatctcaagaaactgggagcaaag3′(xbaⅰ酶切位点)。以sknsh细胞全长cdna为模版，pcr扩增alpha突触核蛋白基因获得所需片段。扩增片段大小为545 bp。pcr循环条件:94 ℃变性1 min，56 ℃复性1 min，72 ℃延伸2 min，共循环30次，最后72 ℃再延伸10 min。取2 μl扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳。

1.3 alpha突触核蛋白真核表达载体pcdna3.1(+)/alpha突触核蛋白的构建及鉴定

alpha突触核蛋白的pcr产物经20 g/l琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化。将pcdna3.1(+)空载体采用xbaⅰ和xhoⅰ酶切、回收纯化后将目的基因(alpha突触核蛋白)和载体(pcdna3.1(+))按3∶1的摩尔比混合，用t4 dna ligase 进行连接反应，16 ℃下16 h以上，连接后24 h内将连接产物转化入感受态大肠杆菌jm109中，挑取阳性单克隆，在含氨苄青霉素的l培养液中摇菌培养过夜，裂解大肠杆菌，提取、纯化质粒，用xbaⅰ和xhoⅰ双酶切连接产物，并用10 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。将酶切鉴定正确的结果送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将构建好的鉴定无误的重组质粒命名为pcdna3.1(+)/alpha突触核蛋白。

1.4 细胞培养

sknsh细胞培养于含体积分数0.10胎牛血清、105 u/l青霉素和100 g/l链霉素的dmem培养液中，置于体积分数0.05的co2培养箱中传代培养，每2～3 d传代一次。

1.5 细胞转染

在转染前1 d，将处于对数生长期的sknsh细胞按每孔106个细胞接种于6孔板中，使其在转染之日达到80%的融合度，使用lipofectaminetm 2000 将pcdna3.1(+)/alpha突触核蛋白真核重组转染入细胞中(参照脂质体转染说明书)，每孔按照dna(μg)∶lipofectaminetm 2000=1∶5转染5 h后，更换为含体积分数0.10胎牛血清的完全新鲜培养基继续在培养箱中培养至48 h。同时，设立转染pcdna3.1(+)的空载体对照组和不转染的空白对照组。

1.6 rtpcr 检测外源alpha突触核蛋白基因在sknsh细胞中的表达

瞬时转染48 h后，将alpha突触核蛋白真核重组质粒转染组、pcdna3.1(+)的空载体对照组与不转染的空白对照组细胞用trizol法提取总rna，进行rtpcr 反应，以检测alpha突触核蛋白在转录水平的表达情况。alpha突触核蛋白检测引物的上游序列为：5′caagtgacaaatgttggaggag3′，下游序列为：5′tttcttaggcttcaggttcgtag3′，扩增片段长度为244 bp;内参照gapdh引物的上游序列为：5′ttcaccaccatggagaaggc3′，下游序列为5′ggcatggactgtggtcatga3′，扩增片段长度为236 bp。pcr 反应参数：94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，循环36次。

1.7 mtt法检测细胞存活率

参照脂质体转染说明书，将处于对数生长期的sknsh细胞按每孔104个接种于96孔板中并同时转染，置于37 ℃、体积分数0.05 co2培养箱中培养48 h后，每孔加入5 g/l的mtt 20 μl，于37 ℃培养箱中培养4 h，弃上清后每孔加入二甲基亚砜100 μl，用酶标仪测定570 nm处吸光度(a)值。

1.8 统计学处理

采用spss 12.0软件进行统计学处理，结果以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以p<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 重组质粒的酶切鉴定

重组质粒pcdna3.1(+)/alpha突触核蛋白经xbaⅰ和xhoⅰ双酶切后，分别获得长度为545 bp和5 422 bp的dna片段。见图1。

2.2 alpha突触核蛋白真核表达载体测序

alpha突触核蛋白真核重组质粒中alpha突触核蛋白基因的测序结果进一步证实alpha突触核蛋白克隆片段的插入方向正确，插入序列符合要求。测序发现克隆的alpha突触核蛋白基因片段的编码区序列和genbank中报道的序列完全一致。

2.3 外源alpha突触核蛋白基因在sknsh细胞中的表达

pcdna3.1(+)/alpha突触核蛋白转染sknsh细胞48 h后，转染组alpha突触核蛋白mrna表达水平明显增高。见图2。

①dna标准参照物dl2000;②pcdna3.1(+)/alpha突触核蛋白重组质粒经xbaⅰ和xhoⅰ双酶切的片段;③dna标准参照物dl15000。

图1 pcdna3.1(+)/alpha突触核蛋白质粒的双酶切鉴定

①～③分别为正常细胞组、空载体转染组、pcdna3.1(+)/alpha突触核蛋白转染组内参照gapdh; ④为dna标准参照物dl2000;⑤～⑦分别为正常细胞组、空载体转染组、pcdna3.1(+)/alpha突触核蛋白转染组alpha突触核蛋白。

图2 pcdna3.1(+)/alpha突触核蛋白转染sknsh细胞中alpha突触核蛋白基因的表达

2.4 重组质粒pcdna3.1(+)/alpha突触核蛋白在sknsh细胞中表达后对细胞存活率的影响

正常细胞组、pcdna3.1(+)载体转染组以及pcdna3.1(+)/alpha突触核蛋白转染组细胞存活率比较，差异无显著性(f=0.005，p>0.05)。

3 讨 论

在生理状态下，alpha突触核蛋白是一种天然未折叠的可溶性蛋白，但其构象极易受外界环境的影响。低ph值、高温、有机溶剂、金属离子、盐溶液及杀虫剂等条件下可形成前熔球、α螺旋、β折叠、二聚体、寡聚体以及不溶性的聚集体等状态[5]。近年来研究发现，家族性与散发性pd中均伴有alpha突触核蛋白含量的增高，并出现alpha突触核蛋白聚集形成的路易小体，说明了alpha突触核蛋白与pd的发病密切相关[67]。目前已有一些对alpha突触核蛋白高表达的细胞模型的研究，有研究者认为，很多细胞高表达alpha突触核蛋白后会产生明显的细胞毒性[8];但也有研究者认为，细胞内高表达alpha突触核蛋白后只有在一些诱导其聚集的因素如氧化应激条件下才会产生毒性[9]。这些研究结果差异反映了人们对alpha突触核蛋白的致病机制仍不十分清楚。pd病人脑内存在的氧化应激、炎症反应、高铁等状态被认为是其发病重要原因[10]，这些因素是否与alpha突触核蛋白聚集有关呢? 泛素蛋白酶体系统(ups)是细胞内重要的非溶酶体蛋白降解途径，它可以清除真核细胞中异常蛋白质，维持细胞内环境稳定。异常折叠的alpha突触核蛋白也可通过此途径被降解。但研究表明，与其他部位相比，黑质中泛素酶活性降低33%～42%以及选择性的蛋白酶体亚单位活性丧失[11]。在散发型pd的黑质神经元中的26/20s蛋白酶体的α亚单位和20s蛋白酶体酶的活性都有损失[12]。过表达突变的alpha突触核蛋白亦可降低蛋白酶体的活性，降低细胞对蛋白酶体抑制剂的耐受性, 引起线粒体损害和细胞凋亡[13]。alpha突触核蛋白在脑中由可溶性的单体变为不可溶的聚集体很可能是pd的始发因素。

究竟是什么因素引起alpha突触核蛋白的升高并出现聚集呢?alpha突触核蛋白是通过何种途径抑制ups的活性而引起自身的聚集呢?基于上述问题，本研究通过pcr法扩增真核细胞alpha突触核蛋白序列，将pcr产物进行电泳分离，回收，纯化，将该片段克隆入pcdna3.1(+)载体中，转化，提取，纯化质粒，经酶切鉴定、基因测序正确后，命名为pcdna3.1(+)/alpha突触核蛋白，将其转染入sknsh细胞内观察到alpha突触核蛋白的表达水平明显升高，且对细胞存活率并无明显的影响。

综上所述，本研究成功地构建了alpha突触核蛋白真核表达载体，并转染至sknsh细胞， 通过rtpcr方法检测其在sknsh细胞中的表达。本文结果为探讨影响alpha突触核蛋白聚集的因素以及alpha突触核蛋白聚集的毒性作用机制提供了研究基础。

【参考文献】

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真核细胞范文第4篇

病历资料

例1：患儿，女，8岁，以主因双眼睑水肿2天入院。体温正常，无寒战及抽搐。不流涕，无咳嗽、咳痰、气喘。食纳差，未见呕吐、腹痛、腹胀、腹泻。入院查体：乏力状，双眼睑肿胀，颜面轻微浮肿，无皮疹，浅表淋巴结无肿大，无口唇皲裂、指趾末端硬性红肿、脱屑。咽部充血明显，扁桃体无肿大，无脓膜。心、肺、腹、脊柱、四肢、神经系统无异常。辅助检查：血常规：WBC 7.0×109/L、N 0.78、L 0.15、PLT 156×109/L。尿常规：未提示异常。入院诊断：①急性上呼吸道感染。②急性肾小球肾炎。给与利巴韦林抗病毒，营养支持治疗，利尿，低盐饮食。治疗5天，双眼睑肿胀无明显消退，出现发热，咳嗽，频繁剧烈，无痰，不喘。食纳差，未见呕吐、腹痛、腹胀、腹泻。未述胸闷、心悸、头痛、头晕。查体：热病容，乏力状态，无皮疹，颈部浅表淋巴结约绿豆大小、可触及3枚，质软，活动度好，无压痛，无口唇皲裂，指趾末端硬性红肿，脱屑。咽部充血明显，扁桃体无肿大，未见散在脓膜。心、肺、腹、脊柱、四肢、神经系统无异常。辅助检查：血常规：WBC 2.8×109/L、N 0.18、L 0.85、PLT 256×109/L。异常白细胞检查：异常淋巴细胞0.26。胸部正位片：双肺纹理粗乱、模糊。心脏：未提示异常。腹部B超：巨脾，肝脏明显增大。转院检查：EB病毒抗体：阳性。嗜异凝集反应：阳性。确诊：传单，临床治疗20余天，长期随诊3个月。预后良好。

例2：患儿，女，13岁，以主因间断低热、乏力6个月入院。热程不规则，自述乏力时，测体温37.3～37.5℃。查体：浅表淋巴结无明显肿大，咽部轻微充血，扁桃体不大，呼吸音略粗，未闻及啰音，心腹、脊柱、四肢、神经系统无异常。辅助检查：血、尿、便常规无异常。ASO＼ESR＼CRP＼风湿＼类风湿因子＼支原体＼衣原体抗体＼PPD皮试，胸部正侧位平片，心脏，腹部B超均正常。初步诊断：青春期综合征。给予多种维生素，谷维素等调节治疗1个月，无明显缓解。转院辅助检查：EB病毒抗体：阳性。嗜异凝集反应：阳性。确诊：传单。临床治疗半月，随诊半年，预后良好。临床误诊原因：⑴热待查：儿童或青年多见于：①感染因素：细菌感染，支原体、衣原体感染，病毒感染，结核感染。②非感染因素：幼年性类风湿，川崎病，传单，系统性红斑狼疮，癌症等。⑵传染性单核细胞增多症诊断依据不清楚。多数临床医生认为，发热，皮疹，淋巴结肿大，肝脾肿大为必须具备条件。以至于每天查房，有无皮疹，肝脾是否肿大为查体及诊断重点。其实不然。

讨 论

传染性单核细胞增多症简称传单，是EB病毒感染所致的一种急性或亚急性淋巴细胞良性增生性传染病，多见于儿童或青年。在集体机构中可造成流行。潜伏期30～50天。儿童潜伏期较短。前驱期症状隐匿，类似上呼吸道感染症状，持续1～2周。腺肿期主要表现淋巴结肿大，发热，咽炎，肝脾肿大。所有患者均有淋巴结肿大，以颈部淋巴结肿大最为常见，不对称，无粘连，无压痛，大小不等。肿大的淋巴结在热退后数周消退，偶见可持续数月甚至数年。85%有发热，热型不规则，一般持续1～4周。80%～85%有咽痛，扁桃体肿大，充血和厚霜样渗出物。50%病例有脾肿大，少数可有巨脾。30%有肝肿大。少数病例有红色斑丘疹、眼睑水肿、肺炎、神经系统损害，血小板减少、自身免疫性溶血性贫血。确诊依据：①嗜异凝集反应：阳性。②EB病毒抗体：阳性。③骨髓涂片：原始淋巴细胞不增多。④外周淋巴细胞：增多。异常淋巴细胞≥10%。本文案例提示不明原因眼睑肿胀，乏力，初期尿常规正常，虽然传单眼睑水肿发病率属少数，但不排除传单诊断。长期发热：儿科患者发热>1周围即属于热待查，热程>1个月，甚至半年，辅助检查无明显提示异常，患儿无进行性消瘦，衰竭症状，传单诊断不排除。

真核细胞范文第5篇

【关键词】 肺癌; 基因治疗; 生存素; 启动子; 单纯疱疹病毒1型胸苷激酶

[Abstract] Objective: To construct a lung cancer specific the herpes simplex virus 1 thymidine kinase (HSV1TK) expression vector regulated by survivin promoter (SURV) and detect its activation and potential to inhibit the grow of lung cancer in vivo. Methods: Plasmid pGL3TK was obtained by substituting the luciferase cassette with a PCR product corresponding to TK with flanking Nco Ⅰ and Xho Ⅰ sites. To obtain the pSURVTK and pCMVTK two versions， the SURV and CMV cassettes were excised with Bgl Ⅱ and Hand Ⅲ and cloned into the respective sites of the vector. Recombinant plasmid pSURVTK and pCMVTK were transfected into survivin positive or negative cell lines by the means of lipofectamine. The expression of HSV1TK was tested by Western Blotting， Ganciclovir cytotoxicity assay to evaluate the activation of SURV and in vivo tumorigenesis experiments to explore the potential using this vector to treat lung cancer. Results: The vector pSURVTK has been successfully constructed which can not only express the TK protein indentified by Western Blotting， but also show its enzyme activation related to the concentration of ganciclovir and suppression of tumor growth in vivo. Conclusion: Survivin promoter can effectively drive the HSV1TK to express. The expression of TK gene will be confined just within the site of tumor. This presented a new way of employment sucide genes for treatment of lung cancer.

[Key words] lung cancer; gene therapy; survivin; promoter; herpes simplex virus 1 thymidine kinase

肺癌已成为恶性肿瘤死亡的首要病因，传统的治疗方法包括化疗、放疗和手术，总的生存率不到15 %[1]。随着免疫学和分子生物学的飞速发展，肺癌的基因治疗越来越受到研究人员的重视。采用非病毒载体携带治疗基因，如自杀基因单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1TK)基因是目前肺癌基因治疗的研究热点之一。这些非病毒载体一般使用真核细胞启动子如巨细胞病毒启动子(CMV promoter)，该启动子无组织特异性，在正常细胞中也能高表达TK基因，通过使无毒的前药如更昔洛韦(GCV)转化成有毒的磷酸化产物，对正常组织也会造成损伤[2，3]。所以，研究在肺癌细胞高表达，而在正常组织低表达，甚至不表达的特异性启动子是肺癌自杀基因治疗成功的关键。

生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins， IAP)家族的新成员，其组织分布特征具有明显的细胞选择性，在胚胎及多种肿瘤细胞系中高表达，但是不表达于终末分化的正常组织[4-6]。Survivin主要通过转录水平调控mRNA或蛋白的表达[7-8]。

本研究构建了生存素基因启动子(survivin promoter)调控的HSV1TK基因表达载体，通过体内外对肺癌细胞的杀伤效应研究，证实生存素启动子在肺癌细胞异性活化，可以驱动其调控的下游TK基因的表达，在更昔洛韦(Ganciclovir，GCV)的作用下，可有效抑制肺癌细胞的生长，为应用自杀基因治疗肺癌提供了新思路。

1 材料和方法

1.1 试剂和工具酶

异丙基β半乳糖苷(IPTG)、低分子质量蛋白标准品、核酸标准参照物、限制性内切酶Bgl Ⅱ、Hind Ⅲ、Nco Ⅰ、Xho Ⅰ和Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、质粒DNA纯化试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、DNA标准参照物(上海华美生物工程公司);蛋白胨、酵母粉、丙烯酰胺等(上海生工生物工程公司);PCR引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。脂质体Lipofectamine2000 购于Invitrogen 公司，更昔洛韦购自罗氏公司，兔抗HSV1TK血清由耶鲁大学William C Summers教授馈赠。

1.2 质粒和细胞株、菌株

Survivin基因启动子SURV由美国MD Anderson Cancer Center的MienChie Hung教授馈赠，含有HSV1TK cDNA的质粒rpAs16Dr由德国MartinLuther大学Ariane Sling教授馈赠， pGL3Basic载体购自美国Promega公司，质粒pcDNA3.1(+)、人肺癌细胞株A549、E.coli菌株XL1Blue由本室保存。

1.3 仪 器

凝胶扫描仪、蛋白电泳仪、电转化仪、凝胶扫描仪、AKTA Prime 高压液相色谱仪(以上均为伯乐公司产品)，恒流泵(兰格公司)。

1.4 重组载体pSURVTK、pCMVTK，pSURVLuc、pCMVLuc的构建

根据HSV1TK的DNA序列设计一对引物，在P1和P2的5′ 端引Nco Ⅰ和Xho Ⅰ两个酶切位点，TKP1：5′ATCCATGGATGGCTTCGTACCCCT3′和TKP2：5′ATCTCGAGTCAGTTAGCCTCCCCC3′，将PCR产物亚克隆至用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ消化的真核表达质粒pGL3Luc，PCR鉴定阳性重组质粒pGL3TK;Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切pcDNA3.1(+)并回收CMV启动子，与SURV启动子一起克隆至pGL3Luc和pGL3TK的Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切位点间，Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切鉴定重组载体pSURVTK、pCMVTK，并经DNA测序证实。

1.5 蛋白质印迹法检测转染细胞外源HSV1TK基因表达蛋白

人肺癌细胞系A549及正常人肝细胞LO2均用DMEM培养液于37 ℃、5%CO2条件下培养。转染前1天，取生长良好的细胞，胰酶消化，记数，将细胞浓度调至5×104个/ml，在6孔细胞培养板的每孔加入2 ml含上述细胞的DMEM培养液，每孔细胞数为1×105个。在Lipofectamine 2000的介导下分别转染pSURVTK质粒和pCMVTK质粒。每种质粒转染3个孔，具体按Lipofectamine 2000操作手册进行，待转染的细胞用无血清、无双抗的DMEM培养基洗2次，在每孔中加入混匀的DNA脂质体复合物溶液，细胞在37 ℃继续温育5 h后，吸去转染液，加入2 ml含10%小牛血清的DMEM，继续培养48 h。PBS充分洗涤细胞，100 ℃、10 min将细胞裂解，取15 μl细胞裂解液加15 μl 2×加载缓冲液，100 ℃、10 min，12 000×g离心10 min。取20 μl上清12% SDSPAGE电泳，阴性对照为未转染的A549、LO2细胞裂解物，电转移至硝酸纤维膜，加1∶200稀释的兔抗HSV1TK血清37 ℃轻摇孵育2 h，1×PBST(含0.05% Tween20)洗膜3次，加1∶200稀释的羊抗兔IgGHRP， 37 ℃轻摇孵育2 h，加邻苯二胺显色10 min，水洗终止反应。

1.6 MTT法测定细胞增殖抑制率

在96孔细胞培养板的每孔中加入0.1 ml含上述细胞的DMEM培养液，每孔细胞数为5×104个，用pSURVTK，pSURVLuc质粒DNA 在Lipofectamine 2000的介导下转染细胞，质粒的用量为0.1 μg/孔;脂质体Lipofectamine 2000的用量为0.2 μl/孔。每种质粒转染40个孔。转染48 h后，分别加入终浓度为0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50，100，150 μmol/L的GCV，其中不加GCV的3孔作为对照组，以上每份样品均设3个复孔。37 ℃继续培养3 d。采用MTT法测定细胞增殖情况。1000 r/min离心5 min，去上清，每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，继续培养4 h，每孔加入100 μl二甲亚砜(DMSO)混匀，570 nm测D值，根据下列公式计算细胞增殖抑制率(GIR)：GIR(%)=(1-实验组光密度值/对照组光密度值)×100%。

1.7 pSURVTK抗肿瘤实验

将A549细胞悬浮于PBS中，浓度调至1×107个/ml。BALB/c 裸鼠，雌雄不限，4～6周龄，体质量30～60 g，随机分为3组，每组10只。分别于背部皮下注射100 μl细胞。当肿瘤体积达到30 mm3时，瘤内注射pSURVTK、pCMVTK、pCMVLuc 质粒DNA-脂质体复合物(50 μg/次)，每隔1天依次转染，连续7次，转染的第2次各组动物同时尾静脉注射GCV，100 mg /kg，共6次。每隔1天测量1次肿瘤体积，肿瘤体积(V)=A(mm)×B(mm)2/2。A为肿瘤最长直径，B为最短直径。

1.8 数据处理

数据均采用x±s形式表示，利用SAS 8.1软件对各实验组的细胞增殖抑制率与其对照组的差异显著性进行t检验分析。

2 结 果

2.1 真核表达载体pSURVTK、pCMVTK，pSURVLuc、pCMVLuc的构建

将制备好的TK基因PCR片段亚克隆至真核表达载体pGL3Luc中，筛得的阳性菌落经PCR扩增鉴定，经1%琼脂糖凝胶电泳，可见到与TK基因相对分子质量一致的目的基因片段(HSVTK相对分子质量为1144 bp左右)(图1A)，核苷酸序列测定结果表明，克隆基因的核苷酸序列与HSVTK的DNA序列完全一致，说明pGL3TK构建成功;将制备好的SURV、CMV启动子片段分别亚克隆至pGL3-Luc或pGL3TK真核表达载体Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ的酶切位点间，筛得的阳性菌落经Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切，获得900 bp大小CMV启动子基因(图1B，泳道1)和977 bp大小SURV启动子基因(图1B，泳道2)，经核苷酸序列测定证实，pSURVTK、pCMVTK，pSURVLuc、pCMVLuc构建成功。图1 PCR扩增HSV1TK基因及pSURVTK、pCMVTK重组真核表达载体酶切鉴定

2.2 HSV1TK基因的表达

转染pSURVTK质粒或pCMVTK的质粒A549细胞裂解蛋白能被兔抗HSV1TK阳性血清特异性识别，且识别条带的浓度相近，而转染pSURVLuc质粒或pCMVLuc质粒的A549细胞以及转染pSURVTK transfected LO2细胞裂解蛋白则不能被识别(图2)，说明HSV1TK基因在SURV启动子调控下于肺癌细胞异性高效表达。

2.3 TK蛋白的酶活性

对转染pSURVTK质粒的A549细胞进行不同浓度(0.01～500 μmol/L)GCV的细胞毒实验，采用MTT法检测72 h时的细胞杀伤活性。A549细胞的生长呈明显的浓度依赖性，低浓度(0.1 μmol/L)GCV对其的抑制率在第3天达到了41%，且抑制率与GCV浓度及作用时间(数据未列出)呈正相关，而转染pSURVLuc质粒的A549细胞在同样浓度的GCV作用下生长几乎未受影响(图3)。t检验分析表明差异具统计学意义，由此表明SURV启动子调控下的HSV1TK基因仍具有很好的酶活性。

M：蛋白标准参照物;1：转染pSURVTK的A549 细胞;2：转染pCMVTK的A549细胞;3：转染pSURVLuc的 A549 细胞;4：转染pCMVLuc的 A549细胞;5：转染pSURVTK的LO2细胞图2 SURV启动子调控HSV1TK基因表达的蛋白印迹分析　图3 HSV1TK基因表达对肺癌细胞和正常细胞增殖的影响

2.4 HSV1TK基因对体内肿瘤生长的抑制作用

第6天肺癌瘤体长至38 mm3大小，这时3组大鼠分别瘤内注射pSURVTK、pCMVTK、pCMVLuc 质粒DNA脂质体复合物，接着尾静脉应用GCV，20 d后pSURVTK组和pCMVTK组肿瘤大小仅分别为85、83 mm3，而pCMVLuc组(对照载体)大小为180 mm3，P

3 讨 论

自杀基因疗法的最大特征就是具有“旁观者效应”，即只要正常组织有少量目的基因获得表达，就有可能产生严重的副作用[9]。因此，使自杀基因仅在肺癌组织中获得特异性表达，从而准确地杀伤肿箭头处为给药时间点， *：P

图4 体内转染pSURVTK对肿瘤生长的抑制作用瘤细胞，保护正常组织，减少毒副作用，是肺癌采用自杀基因疗法的关键。其中，用肿瘤特异性启动子启动目的基因特异性的表达是目前多数学者关注的方法之一[3]。

研究显示，SURV启动子在肿瘤细胞中具有高活性，正常细胞株和组织中被抑制，尤其是肺组织。SURV启动子在心、肺、脑、肝、肾活性很低，表明当体内应用SURV调控的TK基因载体时，毒副作用可以大大降低[10]。

常用的肿瘤特异性启动子如AFP、hTERT等启动子的活性往往弱于CMV启动子和SV40启动子，SURV启动子也不例外。我们的研究结果显示，虽然SURV在各种肿瘤细胞的活性仅为CMV启动子的10%～40%，已足够抑制肿瘤细胞的生长，一方面表明SVRV启动子在肺癌细胞中也具有很强的启动下游基因转录的活性，另外，特异性表达于肺癌细胞中的TK也产生显著的旁观者效应，极大地弥补了启动子活性低的不足。

我们构建了SURV启动子调控下的HSV1TK基因的真核表达载体pSURVTK，采用蛋白质印迹法证实pSURVTK在肺癌细胞系A549中可表达出TK蛋白，GCV细胞毒实验表明表达的TK蛋白具有酶活性，可有效抑制体内肺癌的生长。

综上所述，SURV启动子可以驱动TK基因在肺癌细胞中的特异性转录，在GCV作用下，体内外能有效杀伤肺癌的生长，为自杀基因治疗肺癌提供了新的途径。

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