细胞分化
前言：想要写出一篇令人眼前一亮的文章吗？我们特意为您整理了5篇细胞分化范文，相信会为您的写作带来帮助，发现更多的写作思路和灵感。
细胞分化范文第1篇
1.在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态、结构和生理功能上会发生稳定性差异。细胞的这种特化不仅是正常发育所必需的,而且还能提高细胞各种生理功能的效率。
2.一般说来,体内各种细胞均含有物种的全部基因,但基因的表达具有时空性。细胞之所以在形态、结构和功能上发生稳定性差异,是因为组织特异性基因选择表达成了组织特异性蛋白的缘故。从理论上讲,已分化的细胞仍然具有发育成一个完整个体的潜能。
3.细胞分化是渐进性的,其方向的限定早于形态差异的出现,且分化细胞的表型保持相对稳定,一般不可逆转。
之所以采用完整的陈述句的形式来表述概念,是因为这种表述方式更易于确认需要学生理解和掌握概念的内容及意义,也更易于建立概念之间的联系。
二、“细胞分化”概念教学的组织
在分析“细胞分化”的概念内涵及层级之后,教学设计应该紧紧围绕着相应的概念条款展开,通过列举事实、分析讨论,或者基于资料的探究等活动,帮助学生深层理解这些概念内涵,并基于概念理解而构建合理的知识结构(见图1)。
1.列举事实,尝试定义。呈现人的受精卵发育至胎儿的图片:列举学生熟知的根尖分生区细胞分化成伸长区、成熟区的事实,然后,引导学生抽象概括出:“细胞分化是指在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态、结构和生理功能上会发生稳定性差异的过程。”这是广大教师一贯坚持的做法,值得肯定。因为事实是用来帮助学生建立和理解概念的,事实当然要围绕着概念的结构来排布。但是,定义常常不等同于概念。“定义”通常用“是……”来表述,说得十分肯定。“概念”描述一类事物的本质,有时并不用“是”来描述。在引导学生下定义之后,教师还应该设置下列问题,吸引学生深入思考细胞分化的结果和生物学意义。①在人的个体发育过程中,假若没有细胞分化,受精卵能发育成胎儿吗?为什么?②细胞在形态、结构上出现特化,对于细胞完成其生理功能有何意义?③从遗传的角度分析,受精卵为什么能够发育成一个完整个体?问题3的设置实际上是指向“细胞全能性”这一核心概念的丰富内涵,之所以在此设置问题3,一方面是因为不仅已分化的细胞具有发育成完整个体的潜能,未分化的受精卵在自然条件下更容易发育成一个完整的个体。也就是说,“细胞全能性”这一概念是随着教学进程不断建构起来的;另一方面,其用意还在于探讨细胞分化的原因,起到承上启下的教学功效。
2.探究发现,明晰原因。美国地平线研究组(Horizon Research Team)主席维斯(Weiss)及高级研究助理帕斯利(Pasley)经过了18个月的观察,对364节课详细分析,发现优质课堂主要有几个特征,其中包括:①在课堂教学过程中,教师善用多种策略,为某个科学概念提供清晰的阐释;②吸引学生从事动脑筋的活动;③帮助学生理解学科的核心概念等。因此,可以引入相关科学史对细胞分化原因进行探讨。
资料1:最早试图对细胞分化机制作出解释的学者是Weismann(1883),他根据当时对马蛔虫的研究结果,提出了“体细胞分化是由于遗传物质丢失造成的,每一种组织只保留了其特有的遗传物质”的见解。在马蛔虫这一特例中,在卵裂过程中体细胞的染色体确实发生丢失现象。因此,Weismann这一观点在当时看来既符合逻辑,又有实际例证,因而被学术界所普遍接受。你同意上述观点吗?根据是什么?
资料2:1958年Steward等利用胡萝卜根的韧皮部组织培养出了完整的新植株;1970年Steward用悬浮培养的胡萝卜单个细胞培养成了可育的植株。
资料3:1969年Nitch将烟草的单个单倍体孢子培养成了完整的单倍体植株。
分析资料2和资料3,你得出的结论是什么?基于对上述3则资料的分析探究,学生就容易得出以下结论:①高度分化的植物体细胞,遗传物质并没有丢失,仍含有发育成一个完整个体所需的全套基因,具有发育的全能性;②在二倍体染色体组中,只要有一套单倍体的基因组,就含有该物种的全部遗传信息,因此,植物的生殖细胞也具有发育的全能性。至此,细胞全能性的概念内涵已昭然若揭,师生共同归纳(见图2)。学生仍然会有2个疑问:①既然已分化细胞中含有相同的遗传信息,为什么细胞的形态、结构和生理功能会出现稳定性差异?②已分化的动物细胞是否也像植物细胞那样具有发育的全能性?针对疑问1,教师可以列举事实,循循善诱,问题指向要明确,最终让学生领悟“细胞分化是组织特异性基因表达的结果”。例如:通过分子杂交实验表明,在任何时间一种细胞的基因组只有一少部分基因在活动。在幼红细胞中,糖酵解酶系的编码基因、核糖体蛋白基因是否均能表达?血红蛋白基因、胰岛素基因是否都能表达?细胞的形态、结构与生理功能主要由哪种化学物质直接体现?幼红细胞最终分化成红细胞的主要原因是什么?针对疑问2,教师要向学生说明:到目前为止,人们还没有成功地将单个已分化的动物体细胞培养成新个体,这是因为动物细胞的发育潜能随着分化程度的提高而逐渐变窄。但这种分化潜能的变化是对细胞整体而言的,对细胞核来说是否还保持着全能性呢?进而引导学生分析细胞核移植实验。
3.因果分析,把握特征。学生一旦理解了细胞分化的因果关系,就容易从中把握细胞分化的特征:①渐变性——细胞在发生形态差异之前的一定时间,细胞分化命运即已确定,基因活动模式已发生改变,从基因到蛋白质再到细胞形态、结构、功能特化是一个渐变过程。②不可逆性——分化细胞的表型保持相对稳定,以执行特
定的功能。然而,在某些条件下,分化细胞的基因活动模式可发生可逆的变化,又回到未分化状态。
细胞分化范文第2篇
【关键词】 间充质干细胞 免疫调控
endothelial cells derived from mesenchymal stem cells harbor immunoregulatory effects
jiang xiaoxia*, chen jinsong*1, su yongfeng, liao can1, liu bing, mao ning
institute of basic medical sciences, academy of military medical sciences, beijing 100850, china; 1guangzhou cord blood bank, guangzhou maternal neenatal hospital, guangzhou 510180, china
abstract this study was purposed to investigate the immunoregulatory effect of endothelial cells derived from mesenchymal stem cells (msc). the human msc was induced to differentiate into endothelial cells for one week. the phenotypes were evaluated by flow cytometry, the cell morphologic feature was observed by invert phasecontrast microsoope and analysis of capillary formation was performed by using the in vitro angiogenesis kit. the immunoregulatory effect was detected by lymphocyte transformation test. the result indicated that during the differentiation cells grew fast and there was no significant change in the phenotypes, i.e. cd73，cd105，hlaabc were positive and cd34, cd80, cd86, hladr, cd31 were negative. immunofluorescence analysis showed typical expression of the von willebrand factor. differentiated mscs formed capillarylike structure. endothelial cells derived from msc also revealed immunosuppressive effect on t cell proliferation in a dosedependent manner. it is concluded that endothelial cells derived from msc also harbor immunoregulatory effect on t lymphocytes.
key words mesenchymal stem cell; endothelial cell; immunoregulatory effect
j exp hematol 2007; 15(1):175-178
间充质干细胞(msc)起源于中胚层，免疫原性低, 移植后无免疫排斥反应，对多种免疫细胞具有调控功能［1］，且在体外可大量增殖培养。若将msc定向诱导，分化为血管内皮细胞，在体外构建成理想的血管移植物，在血管组织工程和再生医学领域必将有广阔的应用前景。
为了研究成体msc向血管内皮细胞分化的能力，摸索msc体外诱导分化为内皮细胞的实验条件，以及探讨msc分化为内皮细胞后应用于血管损伤修复方面的可行性，我们分离纯化骨髓msc后，选取合适的条件，将msc诱导分化为内皮细胞，并观察其对t淋巴细胞的免疫调控能力。
材料和方法
msc分离培养及鉴定
msc分离培养 取正常人骨髓以肝素抗凝，用pbs稀释后，密度梯度离心(percoll 比重 1.077 g/ml)分离单个核细胞，按2×105/cm2加入含10%胎牛血清(hyclone公司产品) 的dmemlg培养液的75 cm2培养瓶中，于37℃、5% co2、饱和湿度的培养箱中培养48小时后去除非贴壁细胞，并更换新鲜培养体系，继续培养，待细胞90%融合时，用0.05%胰酶消化，按5 000 cells/cm2的密度传代培养，取第3代至第7代的细胞进行实验。
间充质干细胞分化而来的内皮细胞具有免疫调控能力msc表面标志测定 用0.05%胰酶消化收获细胞，用流式细胞术按常规测定以下指标：cd34、cd45、cd31、cd80、cd86、cd73、cd105、hlaabc、hladr(pharmingen 公司产品)。间接免疫荧光染色法测定vwf(一抗是鼠抗人vwf抗体，novocastra laboratories 公司产品；二抗是fitc标记的羊抗鼠igg，southern biotech公司产品)。vwf标记前细胞首先用4%多聚甲醛固定10分钟，再用0.5%triton100透膜处理10分钟，然后与一抗(1∶100)孵育60分钟，离心洗涤后二抗孵育30分钟，再次洗涤后在荧光显微镜下观察细胞，并设立阴性对照样品(细胞只加二抗孵育)。
msc多向分化潜能鉴定 msc以0.5×104/well接种于24孔板，用含10% fbs的dmemhg培养液，加入地塞米松0.1 μmol/l、β磷酸甘油10 mmol/l、抗坏血酸磷酸盐50 μmol/l，以诱导分化成成骨细胞，每3天半量换液体，7天后碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞形成； 与此同时，msc以1.7×104/well接种于24孔板,加入地塞米松1 μmol/l、胰岛素10 μg/ml、ibmx 0.5 mmol/l、消炎痛200 μmol/l，以诱导分化成脂肪细胞，油红染色鉴定脂滴形成。
msc向内皮细胞诱导分化及鉴定
诱导培养 诱导培养体系是含5% fbs的dmemhg加细胞因子vegf(20 ng/ml， r&d公司vegf121), msc接种于75 cm2的培养瓶，其密度为3 000 cells/cm2，于37℃、5% co2、饱和湿度的培养箱中培养7天，每2天半量换液，收获的细胞一部分用于检测鉴定，另一部分加入淋巴细胞转化实验的反应体系中，观察其对淋巴细胞的免疫调控作用。
流式细胞术检测 对向内皮细胞诱导7天后细胞的免疫表型： cd34、cd45、cd31、cd80、cd86、cd73、cd105、hlaabc、hladr，用间接免疫荧光技术标记vwf，方法同前。
体外血管生成实验 用体外血管生成模型试剂盒(chemicon公司产品)，观察在半固体matrigel上诱导后的细胞形成毛细血管样网状结构的能力。将matrigel置于4 ℃冰水浴中融化，按30 μl/well铺于96孔板，在37℃培养箱放置1小时后，加入诱导分化内皮细胞7天的细胞，5×103/well，2小时后开始在倒置显微镜下观察细胞形成管状结构的形态。
诱导后细胞的免疫调控能力
细胞接种 诱导后的msc细胞分别按0.2×104/well、0.4×104/well、2×104/well接种于96孔板，即内皮细胞与t淋巴细胞（2×105/well）比例分别为1∶100， 1∶50和1∶10。每组细胞设5个复孔。待细胞贴壁后再加入t淋巴细胞。
淋巴细胞转化 淋巴细胞采自健康成人的外周血，用ficoll(比重1.077 g/ml)离心分离单个核细胞，用磁珠(miltenyi公司产品)分离纯化cd3+t细胞。t淋巴细胞重悬于含20% fbs的rpmi 1640 培养液，以2×105/well加入已经铺有贴壁细胞的96孔板，并加入终浓度为10 μg/ml植物血凝素(pha)，刺激t淋巴细胞增殖。以单纯t细胞加pha作为对照组。细胞于37℃、5% co2、饱和湿度孵育84小时后,加3h标记的脱氧胸腺嘧啶苷(3htdr， 中国科学院原子能研究所提供)1 μci/well，标记12小时后，收集细胞，用液体闪烁计数仪(wallac公司产品)检测cpm值，观察msc诱导对淋巴细胞转化的作用。
结 果
msc诱导分化为内皮细胞
本实验所采用的骨髓msc经过鉴定，具有分化为成骨细胞和脂肪细胞的能力。流式细胞术检测msc表面抗原： cd34、cd45、cd31、cd80、cd86、hladr、vwf为阴性，cd73、cd105、hlaabc为阳性，3代以后的细胞纯度超过95%，将第3到第7代间的msc用于内皮细胞诱导。
向内皮细胞诱导分化7天的msc在显微镜下呈现形态无明显改变。在诱导体系中，msc的生长速度比普通培养条件下稍快，3天可形成致密的贴壁细胞层。
免疫荧光标记诱导7天后的细胞显示，vwf为阳性(图 1)，对照组msc细胞为阴性。细胞其它表面标记无明显改变，即cd73、cd105、hlaabc仍为阳性；cd34、cd45、cd80、cd86、hladr、cd31仍为阴性。
向内皮诱导7天后的msc具有在半固体matrigel胶上形成毛细血管样网状结构能力。相差显微镜下观察发现，用胰酶消化下来的细胞接种在matrigel上，2小时后开始伸出丝状触突(图 2)，4小时后相邻的细胞通过触突互相连通，并逐渐通过管状结构联成网状。随后细胞缓慢聚集，形成粗管状结构。而对照组未诱导的msc不能形成这种管状结构。
msc诱导分化的内皮细胞对淋巴细胞转化的影响
经过pha刺激后t淋巴细胞增殖迅速， cpm值为(16.13±1.83)×103(图 3)，表明加入msc诱导分化的内皮细胞对t淋巴细胞的增殖有抑制作用。当加入细胞量分别为200、400、2 000，即与t淋巴细胞的比例从 1∶100增加到1∶50 和1∶10，其抑制效应逐渐增强， cpm值分别是(14.22±1.67)×103、(12.36±1.08)×103和(0.83±0.09)×103（图3）。由此可见，msc向内皮细胞诱导分化以后，仍然具有免疫调控能力，其抑制效应与加入的内皮细胞浓度有关。
讨 论
研究表明，出生后人体内一直存在有内皮干细胞，参与新生血管形成。有研究人员从骨髓、外周血、脐血等组织分离出内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, epcs)［2-4］，其特征为cd133+、cd34+、kdr+或cd14+。也有研究人员从骨髓msc诱导分化出内皮细胞［5］，msc在小鼠体内也被发现能分化为内皮细胞［6］，甚至有报道指出，msc与肿瘤血管形成有关［7］。msc本身具有部分内皮细胞的表型：表达cd105(内皮糖蛋白endoglin)，endoglin主要分布在内皮细胞，与血管的发育有关； 表达黏附分子vcam1、icam1、integrin β3以及内皮细胞特异性的血管内皮生长因子受体vegfr2(kdr/flk1)等。
无论是用cd34+细胞，还是用cd34-的msc体外诱导的内皮细胞，vegf都是主要的诱导因子 ［ 8,9 ］。本实验采用人骨髓msc，在含vegf(20 ng/ml)的分化诱导体系中培养7天，获得了内皮样细胞，特异性表达抗原vwf，在半固体matrigel上能形成毛细血管样管状结构。但是，直至将细胞诱导培养14天仍然未检测到cd31表达，诱导的细胞不能吞噬dilacldl，其原因可能与内皮细胞分化阶段有关。
引人注意的是，msc诱导分化成为内皮样细胞后，仍然具有免疫调控功能，正如msc分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞后仍保持原来的免疫调节功能［10］。从实验结果来看，其抑制作用依赖于细胞的剂量，当其与t淋巴细胞比例为1∶10的时候，抑制率可达56%。由msc诱导来的内皮细胞的这种特性使其在血管组织修复的应用中呈现良好的前景，低免疫原性及免疫抑制功能有利于血管移植物的植入和生长，能维持血管腔长期通畅。同时作为干细胞来源的msc又具有取材方便、适合体外大量培养扩增的优点，能很好地解决临床应用中如何大量获取干细胞来源问题，因而可以广泛地应用于心血管疾病的治疗及组织器官移植。
【参考文献】
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8asahara t, murohara t, sullivan a, et al. isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. science,1997; 275（5302）:964-967
细胞分化范文第3篇
放射性口干症是头颈癌放疗的常见并发症，可导致唾液腺分泌功能的减弱或丧失，引起口干、继发龋、长期慢性黏膜炎症、吞咽困难以及营养不良等症状［1］。本课题采用双室共培养系统，将人羊膜上皮细胞(humanamnioticepithelialcells，hAECs)与SD大鼠下颌下腺腺泡细胞(submandibularglandacinarcells，SMGCs)进行体外共培养，研究hAECs的诱导分化，为唾液腺功能障碍性疾病的干细胞治疗寻找细胞来源。
1材料和方法
1．1材料无菌采集经产妇本人知情同意的健康足月剖宫产胎盘;8d龄SD大鼠;DMEM/F12培养基、LG-DMEM培养基、胎牛血清(FBS)(Gibco，美国)，表皮生长因子(EGF)，Transwell(CorningInc，catNO．3450)，小鼠抗大鼠角蛋白单克隆抗体(keratin19Ab-1)(NeoMark-ers)，小鼠抗人CK19单克隆抗体(GeneTech，China)，小鼠抗人淀粉酶单克隆抗体(Amylase-G10)(SantaCruz，USA)，两步法抗小鼠或兔通用型免疫组化试剂盒(DakoCytomation)，TotalRNA提取试剂盒、SYBRPrimesciptRT-PCRKit(宝生物工程有限公司)。
1．2SD大鼠下颌下腺细胞的分离、培养［2－4］、鉴定取8d龄SD大鼠原代培养SMGCs，常规传代、鉴定。取第2代生长状态良好的SMGCs用于下一步共培养实验。
1．3人羊膜上皮细胞的分离、培养［5－6］、鉴定机械法剥离胎盘上的羊膜组织，清除表面的血迹，0．05%的胰蛋白酶－0．02%EDTA-2Na37℃消化3次，每次30min。加血清终止胰酶反应，合并3次收集的细胞悬液筛网(200目)过滤后低速离心，弃上清，收获细胞沉淀即为hAECs。上述分离的hAECs加入培养基(LG-DMEM，10%FBS，2mmol/LL-谷氨酰胺，10ng/mlEGF，100U/ml青霉素，0．1mg/ml链霉素)，按5×105/cm2的细胞密度接种，置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，及时传代。免疫荧光法检测后取第2代状态良好的hAECs用于下一步共培养实验。
1．4人羊膜上皮细胞与大鼠下颌下腺细胞的共培养选用微孔膜孔径为0．4μm的6孔Transwell培养板(图1)，每板4孔为实验组，其余2孔为对照组。首先将第2代的hAECs以2×104/孔接种于Transwell下层，贴壁24h后，将SMGCs以8×104/孔接种于Tran-swell上层的生物膜上，共培养采用腺细胞专用培养基(DMEM/F12，10%FBS，2mmol/L-谷氨酰胺，10ng/mlEGF，100U/ml青霉素，0．1mg/ml链霉素)。对照组上下2层均为hAECs。上下2种细胞间不能接触，但共用培养基，分泌的细胞因子可相互影响。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，每隔3d换液1次。
1．5共培养系统的评价
1．5．1共培养前后的形态学观察共培养开始后，于倒置显微镜下观察细胞的形态变化。
1．5．2免疫细胞化学检测分别于共培养后1、2周，按照试剂盒说明书进行各组细胞的抗淀粉酶免疫细胞化学检测。
1．5．3实时荧光定量RT-PCR检测按试剂盒说明书提取共培养1、2周的人羊膜上皮细胞总RNA。按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。α-淀粉酶引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成，上游引物:5＇-CATAAGGATGAGCAAGCATAAATC-3＇，下游引物:5＇-TCGCAAGTGGAATGGAGAG-3＇，扩增产物大小203bp;内参GAPDH的引物序列由TaKaRa生物公司设计合成，上游引物:5＇-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3＇，下游引物:5＇-TGGTGAAGACGCCAGTGG-3＇，扩增产物大小138bp。反应体系如下:SYBRPremixExTaqTM(2×)10μl，上游引物F(10μmol/L)1μl，下游引物R(10μmol/L)1μl，cDNA2μl，ddH2O6μl。反应条件为:95℃10s预变性，然后95℃5s，60．2℃20s重复40个循环，55℃10s84个循环。反应结束仪器自动生成CT值及熔解曲线图。每个样本设4个重复管。将PCR产物作熔解曲线分析，并进行1%琼脂糖凝胶电泳，确定产物特异性。
1．6统计学处理使用SPSS13．0软件，采用单因素方差分析，数据用x珋±s表示，P＜0．05为差异有统计学意义。
2结果
2．1SD大鼠下颌下腺细胞的鉴定
2．1．1SD大鼠下颌下腺细胞形态学特征原代培养第5天可见组织块周围有典型的上皮细胞游出，第8天细胞较多，显微镜下观察呈圆形或椭圆形，鹅卵石样排列(图2A)。
2．1．2SD大鼠下颌下腺细胞免疫学表型免疫细胞化学结果显示，第2代SD大鼠SMGCs表达CK19(图2B)、α-淀粉酶(图2C)，不表达波形蛋白。
2．2人羊膜上皮细胞的鉴定
2．2．1人羊膜上皮细胞形态学特征hAECs原代培养48h后，有少量细胞贴壁，第3天以后贴壁细胞数量迅速增多，形态多为卵圆形和三角形，传代培养的hAECs形态变化不大，呈铺路石样排列(图3A)。
2．2．2人羊膜上皮细胞免疫学表型免疫荧光染色结果显示，第2代的hAECs表达CK19(图3B)，不表达波形蛋白(图3C)，对照组结果阴性。
2．3共培养系统的评价
2．3．1共培养后的人羊膜上皮细胞形态学特征共培养后显微镜下观察显示hAECs胞质中分泌颗粒逐渐增多，而对照组未见明显变化(图4)。
2．3．2共培养前后人羊膜上皮细胞α-淀粉酶表达免疫细胞化学结果显示，共培养前后hAECs均表达α-淀粉酶，共培养后胞质中α-淀粉酶阳性信号表达增强(图5A、B)，对照组未见明显变化，用PBS替代一抗的对照组未见阳性信号(图5C)。2．3．3共培养前后hAECs中α-淀粉酶mRNA表达量共培养前后hAECs中α-淀粉酶基因和内参基因GAPDH的mRNA表达均以CT值表示，各组α-淀粉酶基因的mRNA相对表达量为2^-CT。单因素方差分析结果显示:共培养1、2周后hAECs中α-淀粉酶mRNA相对表达量均高于共培养前，其表达量分别增加至共培养前的3．38倍、6．60倍(P＜0．05)(图6)。
细胞分化范文第4篇
关键词：组织工程骨；脂肪干细胞；成骨诱导；成骨分化
中图分类号：R446.6文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2680-02
Inducing Human Adipose-derived Stem Cells Into Osteoblasts Directionally And
Identification of Their Osteogenesis Characteristics
LIU Bo, ZHU Jintu, CAO Yi, GAO Shousong, YU Tu-gen
(Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Zhejiang Traditional Chinese Medicine Hospital,Hangzhou 310006,Zhejiang,China)
Abstract:Objective:To study the method of inducing human adipose-derived stem cells (ADSCs) into osteoblasts directionally and to identify osteogenesis characteristics. Methods: ADSC was isolated from liposuction aspirates using digestion method by I type collagenase and passage 2 cells were cultured in conditioned medium containing 0.01μM dexamethasone, 10 mMβ-glycerophosphate, 50μM ascorbate-2-phosphate and 10mM 1,25-dihydroxyvitamin D3.The induced cells were chosen to check osteogenesis characteristics, including alkaline phosphatase quantitative assay, osteocalcin, osteopontin and collagen_I assay by immunoflurorescence,and calcium nodes assay with Alizarn Red staining. RT-PCR was used to assay alkaline phosphatase and osteopontin. Results: The expression of AKP is positive at several detecting times, and the osteopontin,collagen_I, and osteocalcin were positive by immunoflurorescence method in experimental group after induced 14 days, and calcium nodes were seen by Alizarn Red staining in induced cells. AKP and OPN expression or experimental group were detected by RT-PCR method. Conclusion: The induced human ADSCs had typical osteogenesis characteristics.
Key words:tissue engineering bone; adipose-derived stem cells; osteogenic induction; osteogenic differentiation
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收稿日期：2011-07-30
基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（Y2080180）
作者简介：刘波（1978-），男，山东诸城人，主治医师，硕士，研究方向：脂肪移植治疗的基础与临床研究。种子细胞的来源是组织工程的基本问题。众多学者一直在寻找具有强大的体外增殖力和多向分化潜能的干细胞，现已成功获得骨髓间充质干细胞（BMSCs），并证明其能向多种中胚层组织细胞分化，极大推动了组织工程学的发展。近年有学者注意到，在某些病理情况下脂肪中有异位骨形成，这表明脂肪组织中可能存在某些细胞可分化为其他组织细胞。2002年，Zuk\[1\]从脂肪抽吸物中分离到具有多向分化潜能的干细胞，以后的学者将其命名为ADSCs(Adipose -derived stem cells)。脂肪干细胞因其来源广泛，经脂肪抽吸术即可大量获取，成为现今组织工程领域研究热点之一。本文旨在探讨人脂肪干细胞体外成骨的特性。
1 材料与方法
1.1 材料与主要试剂 脂肪抽吸物均来自浙江省中医院整形外科门诊行脂肪抽吸术的患者；DMEM低糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均为Gibco公司产品；β-甘油磷酸钠、地塞米松、抗坏血酸及1,25-(OH)2VitD3均为Sigma公司产品；OPN、OCN、I型胶原一抗为CHEMICON公司产品，二抗为Santa Cruz公司产品。
1.2 脂肪干细胞培养与传代 无菌条件下将脂肪抽吸物用PBS反复冲洗，尔后移入离心管，加入等体积的0.075%的I型胶原酶消化，37℃、1h,加带血清培养液终止消化，离心1380r/min，10min，弃去上清，用100目细胞滤器过滤，再离心1380r/min，5min，弃去上清，加入含10％胎牛血清DMEM低糖培养液混匀细胞，以2×104/cm2接种于100mm培养皿中培养。24h后，可见梭型细胞贴壁，每3天更换培养液一次，待细胞融合至80％～90％时进行传代，传代密度为1×104/cm2。扩增到第2代后，换成骨诱导液。
1.3 AKP定量检测 将底物 40mg(1粒)溶解于10mL去离子水中备用；取5支15mL离心管分别标记空白等，各放入0.5mL缓冲液和0.5mL底物水溶液，37℃水浴10min；每盘细胞PBS冲洗后，加入3mL Tris (ph7.4)，将细胞刮下，吸入离心管，超声震荡粉碎（90s,间隔9s, 4℃）；取01mL混合震荡液加入已标记的离心管中，空白组加入0.1 mL去离子水，继续37℃水浴15min；加入10mL 0.05N NAOH终止，405nm分光光度计测光密度值（吸光度），以空白对照组进行调零。（0.0815OD值=1 Sigma U，1 Sigma U=1μmol p-nitrophenol/h）。
1.4 细胞免疫荧光分析OPN 、OCN 及I型胶原表达 细胞爬片经PBS冲洗两遍，每次5min，加入95％丙酮固定10min，PBS适当冲洗，10％羊血清封闭30min，加一抗（OPN、I型胶原为兔抗人多克隆抗体，OCN为鼠抗人单克隆抗体）4°C过夜，PBS适当冲洗，二抗（OPN、I型胶原FITC标羊抗兔多克隆抗体，OCN为FITC标羊抗鼠多克隆抗体）37°C孵育30min，PBS适当冲洗，1∶ 1000稀释PI(Sigma公司)37°C孵育10min，PBS漂洗后封片，荧光显微镜观察。
1.5 Alizarn Red 染色-检测钙结节形成 以未诱导组作为阴性对照。诱导28天，4％多聚甲醛固定30min，PBS适当冲洗，加入0.1％Alizarn Red-Tris-Hcl 溶液（pH83），室温，10min。PBS适当冲洗，干燥封片。
1.6 RT-PCR检测AKP、OPN表达 分别收集对照组和实验组在培养和诱导14天后细胞，加入Trizol抽取mRNA，进行逆转录反应，得到的cDNA进行PCR扩增,反应条件94°C变性，55°C退火，35个循环。引物序列。
1.7 统计学方法 结果数据以均数士标准差(±s)表示，组间采用Student-Newman-kewls方法进行比较。P＜005认为有显著性差别，统计软件包为SAS Ver.6.12。
2 结 果
2.1 AKP定量检测 AKP在第3天开始出现，14天达高峰，随后下降。自第3天起各个检测点（诱导3、7、14、21、28天）诱导组与对照组差异具有统计学意义（P
2.2 细胞免疫荧光分析OCN、OPN 及I型胶原表达 诱导14天,实验组细胞OCN表达阳性，胞浆内出现黄绿色荧光见插页Ⅲ图2A，OPN表达阳性见插页Ⅲ图2B，I型胶原表达阳性见插页Ⅲ图2C。
2.3 钙结节Alizarn Red 染色 诱导14天，实验组细胞外散在出现钙盐沉积，28天达高峰，细胞外有大量钙结节出现。Alizarn Red 染色为红色结节见插页Ⅲ图3。
2.4 RT-PCR检测AKP、OPN AKP（14天） RT-PCR检测结果：显示大约400bp与500bp之间诱导组出现阳性表达，未诱导组未见阳性表达。OPN（14天）检测，大约300bp与400bp之间诱导组出现阳性表达，未诱导组也有表达，但明显弱于诱导组，见插页Ⅲ图4。
3 讨 论
骨组织工程研究的重要内容之一是寻找具有取材容易、体外扩增能力强、易定向诱导分化等优点的种子细胞。2002年国外学者Zuk从脂肪抽吸物中分离到脂肪干细胞，体外证明具有多向分化潜能以来。脂肪干细胞因其来源广泛，经脂肪抽吸术即可大量获取，成为现今组织工程领域研究热点之一。
研究发现，ADSCs在含地塞米松、β－磷酸甘油、维生素C、1,25(OH）2VitD3的诱导下，能够向成骨细胞分化。其中地塞米松在成骨分化早期以促进基质合成为主，调控分化细胞中基因表达，提高AKP活性，促进向成骨细胞转化，后期以促进钙化为主，是体外人间充质干细胞（hMSCs）成骨分化的必需成分。β-甘油磷酸钠可以提供骨组织在体外培养体系中发生沉淀所需的磷离子，从而加速结节的钙化细胞\[2-3\]。维生素C的作用主要是促进体外培养细胞合成胶原、形成钙化，同时可调节AKP活性，而AKP在成骨细胞体外钙化中起决定性作用\[3\]。成骨细胞有1,25-(OH)2VitD3的受体，1,25-(OH)2VitD3的主要作用是直接作用于细胞膜的受体，调节细胞对钙离子的转运，促进钙磷代谢，在诱导培养液中加入1,25-(OH)2VitD3能促进间充质干细胞向成骨细胞表型转化，同时抑制软骨细胞的分化，并维持成骨细胞的分泌与代谢活动，这是重要的诱导条件之一\[4\]。
检测细胞是否分化为成骨细胞，碱性磷酸酶(AKP)活性增强和细胞外基质钙化是两个重要标志。AKP是成熟成骨细胞标志酶之一，目前普遍认为，AKP在体外钙化中起着关键的作用。如果没有AKP活性，钙化就不会发生，其主要机制在于AKP能够水解有机磷酸酶，使局部PO-43浓度升高，结合钙，并可破坏钙化抑制剂，从而启动钙化\[5\]。AKP定量检测表明在我们以上诱导条件下，AKP在第4天开始出现，14天达高峰，随后下降。RT-PCR也证实了诱导后AKP基因水平的表达。AKP活性增强与钙沉积是不同步的，AKP活性增强是钙化出现的前提。诱导14天，细胞外散在出现钙盐沉积，28天达高峰，细胞外有大量钙结节出现。Alizarn Red 染色为红色结节。
成骨细胞分泌的蛋白以I型胶原为主，是骨组织的支架，实验表明成骨诱导前后，免疫荧光都检测到其表达。OPN和OCN都是成骨过程中的重要蛋白质，能够促进成骨过程钙磷沉积。然而OPN并不特异，其他细胞也有表达，但RT-PCR显示诱导组较非诱导组表达增强。OCN是成骨细胞特异的蛋白质，诱导14天后，免疫荧光显示其表达。以上实验表明我们应用以上诱导培养液能够将第二代的脂肪干细胞诱导为成骨细胞。
对脂肪干细胞的研究才刚刚开始，各实验室的结果也不尽相同，进一步的研究还有待于深入进行。但现有的研究资料已经预示了ADSCs广泛的应用前景。
参考文献
［1］ Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells\[J\]. Mol Bio Cell,2002,13:4279 4295.
\[2\] Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues \[J\]. Science,1997,276(5309): 71-74.
\[3\] Conget PA, Minguell JJ. Phentotypical and functional properies of human bone marrow mesenchymal progenitor cells \[J\]. J Cell Physiol,1999,181(1): 67-73.
细胞分化范文第5篇
【摘要】 骨髓基质干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的非造血干细胞。在一定的诱导条件下可以转化为神经细胞，随着中药提纯技术的不断改进，祖国医学在以中药制剂为诱导剂来治疗疾病的研究方面有了一定的进展。随着研究的不断深入，骨髓基质干细胞会有非常广阔的应用前景。
【关键词】 骨髓基质干细胞；神经细胞；中药制剂；龟板；党参；黄芪
干细胞是一种具有高度自我更新能力和分化潜能的细胞群体，因而成为细胞治疗的理想靶细胞。骨髓造血干细胞的研究成为早期干细胞研究的焦点，并且取得了巨大的成就。近些年的研究发现，骨髓中还存在一类骨髓基质干细胞，这种细胞不仅可以分化为造血组织的细胞，还可以分化为中胚层和神经外胚层组织来源的细胞。这类细胞的发现及各项相关研究为缺血性脑损伤、帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等神经系统疾病的治疗带来了希望。本文就祖国医学以中药制剂对骨髓基质干细胞向神经细胞分化影响的研究进展作一概述。
1 骨髓基质干细胞的发现和分离方法
Friedenstein等［1］于1968年证实了骨髓基质干细胞的存在。在对全骨髓标本的培养过程中发现了一些克隆性、成纤维样生长的贴壁细胞，这些细胞就是骨髓基质干细胞。1987年Friedenstein等［2］在塑料培养皿中培养骨髓单个核细胞时发现这些细胞在一定条件下可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等，这些细胞经过20～30个培养周期后仍能保持其多向分化的潜能。由于骨髓中的这种多能细胞能够分化为多种中胚层来源的间质细胞，因而又被称为间充质干细胞。
骨髓基质干细胞的分离方法：(1)密度梯度离心法：根据骨髓基质干细胞与其它细胞的密度不同而采用percoll分层液将其分离出来。(2)贴壁筛选法：根据骨髓基质干细胞具有在塑料培养瓶中贴壁生长的特性对其进行分离。(3)流式细胞仪分选法：根据骨髓基质干细胞体积小，相对缺少颗粒的特征对它进行分选。(4)免疫磁珠分离法。
2 骨髓基质干细胞的生物学特征与鉴定
骨髓基质干细胞具有很强的自我更新能力。生理状态下，体内骨髓基质干细胞增殖不明显，但是在体外补充适量血清的培养液中，它们能贴壁生长，表现出旺盛的有丝分裂能力和增殖能力。到目前为止，还没有特异性的骨髓基质干细胞表面标记物被发现。一般认为细胞表面蛋白如SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120、CD124等呈阳性，CD14、CD34、CD45造血谱系标记阴性。由于骨髓基质干细胞特有的标记分子尚未筛选出来，所以现在只能通过培养过程中出现CD14、CD34和CD45的阴性反应作为一定的参考依据。
3 中药制剂对骨髓基质干细胞体外诱导分化的研究
大量实验研究已经证实骨髓基质干细胞具有旺盛的分裂增生能力和多向分化潜能。体外培养的骨髓基质干细胞在不同诱导因素下可以向不同的谱系分化。尤其是随着中药提纯技术的不断改进，祖国医学在以中药制剂作为诱导剂来治疗疾病的研究方面有了一定的进展。张进等［3］用龟板水煎液诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化，结果发现骨髓基质干细胞可转化为神经干细胞。董晓先等［4］用天麻注射液诱导骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞。姚晓黎等［5］将含不同浓度党参和黄芪血清DMEM用来诱导人的骨髓基质干细胞，经免疫组化检测和神经分化的定量分析，证明用含党参和黄芪的培养液体外可以诱导人的骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞。
陆长青等［6］用含丹参注射液的LDMEM培养基进行诱导，以不含血清的LDMEM培养基进行培养作为对照。经观察细胞的形态学变化和诱导后相关的指标检测，结果显示丹参体外可以将骨髓基质干细胞诱导分化为神经元样细胞。杨新文等［7］在体外用黄芪注射液成功将骨髓基质干细胞诱导分化为神经元样细胞。人参注射液、刺五加注射液等均可作为诱导剂在体外诱导骨髓基质干细胞定向分化成神经元样细胞。
4 中药制剂对骨髓基质干细胞体外诱导分化的作用机制
尽管中药制剂作为诱导剂在骨髓基质干细胞分化为神经元细胞的研究中取得了显著的成绩，但是仍然存在着很多问题。其作用机制尚不完全清楚，目前认为中药制剂作为诱导剂的可能机制主要是抗氧化作用，实验研究表明，骨髓基质干细胞经中药制剂诱导后，单一的向神经细胞方向分化，细胞不仅在形态，而且在基因水平均发生了明显的变化。
5 小结
中药是祖国传统医学的瑰宝，素有强身健体，滋阴壮阳等作用，中国传统中药的应用历史源远流长。中药诱导具有鲜明的特色，近年来国内学者在以中药制剂诱导骨髓基质干细胞向神经细胞分化方面取得了显著的成绩。但是仍然存在一些需要解决的问题：(1)实验中的选药依据；(2)有效成分的筛选；(3)确切的诱导机制等问题有待进一步的解决。目前的研究大多数停留在实验阶段，怎样才能更好的服务于临床，相信随着研究的不断深入，中药制剂诱导骨髓基质干细胞分化为神经元的方法会越来越成熟。
【参考文献】
［1］Transplantation：Friedenstein AJ， Petrakova KV， Kurolesova AI， et al. Heterotopic of bone marrow［J］.Analysis of precursor cells，1968，6(2):230247.
［2］ Cell tissue kinet:Friedenstein AJ，Chailakhyan RK，Gerasimov UV.Bone marrow osteogenic stem cells:in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers［J］.1987，20(3):263272.
［3］张 进，徐志伟，补肾法诱导间充质干细胞向神经方向分化研究［J］.现代医院，2004，4(9):1517.
［4］董晓先，，董燕湘，等.天麻诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究［J］.中国中西医结合杂志，2004，24(1):5154.
［5］姚晓黎，刘卫彬，柳太云，等.参芪液对成人骨髓间质干细胞的诱导分化作用［J］.中国神经精神疾病杂志，2004，30(3):211212.
［6］陆长青，王 勇，陈登榜，等.丹参诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化及相关基因的表达［J］.四川解剖学杂志，2006，14(1):14.
