细胞因子
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细胞因子范文第1篇
一、细胞因子与疾病
正常情况下，细胞因子表达和分泌受机体严格的调控，在病理状态下、细胞因子会出现异常性表达，表现为细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过高，以及可溶性细胞因受体的水平增加等。
（一）细胞因子及其受体的缺陷
包括先天性缺陷和继发性缺陷两种病理情况，例如先天性的性联重症联合免疫缺陷病人（XSCID），表现为体液免疫和细胞免疫的双重缺陷，出生后必须在无菌罩中生活，往往在幼儿期因感染而夭折。现已发现这种患者的IL-2受体γ链缺陷，由此导致IL-2、IL-4和IL-7的功能障碍，使免疫功能严重受损。细胞因子的继发性缺陷往往发生在感染、肿瘤等疾病以后，如人类免疫缺陷病毒（HIV）感染并破坏TH后，可导致TH细胞产生的各种细胞因子缺陷，免疫功能全面下降，从而表现出获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的一系列症状。
（二）细胞因子表达过高
在炎症、自身免疫病、变态反应、休克等疾病时，某些细胞因子的表达量可成百上千倍地增加，例如为风湿关节炎的滑膜液中可发现IL-1、IL-6、IL-8水平明显高于正常人，而这些细胞因子均可促进炎症过程，使病情加重。细胞因子的抑制剂有可能这为类症性细胞因子水平升高的疾病。
（三）可溶性细胞因子受体水平升高
细胞膜表面的细胞因子受体可脱落下来，成为可溶性细胞因子受体，存在于体液和血清中，在某些疾病条件下，可出现可溶性细胞因子受体的水平升高。这类分子可能结合细胞因子，使其不再与膜表面的细胞因子受体结合，因而封闭了细胞因子的功能。
二、细胞因子与治疗
，利用基因工程技术生产的重组细胞因子做为生物应答调节剂（BRM）治疗肿瘤、造血障碍、感染等已收到良好的疗效，成为新一代的药物。重组细胞因子做为药物具有很多优越之处。例如细胞因子为人体自身成分，可调节机体的生理过程和提高免疫功能，很低剂量即可发挥作用，因而疗效显著，副作用小，是一种全新的生物制剂，已成为某些疑难病症不可缺少的治疗手段。目前已批准生产的细胞因子药物包括干扰素α、β、γ，Epo，GM-CSF，G-CSF，IL-2，正在进行临床试验的包括IL-1、3、4、6、11，M-CSF，SCF，TGF-β等（表4-3、4-4。）这些细胞因子的主要适应症包括肿瘤、感染（如肝炎、AIDS）、造血功能障碍、创伤、炎症等。表4-3已批准生产的细胞因子多肽药物（略）表4-4已批准临床试验的细胞因子多肽药物（略）
细胞因子疗法（cytokinetherapy）基本上可分为两种，即细胞因子补充和添加疗法及细胞因子阻断和拮抗疗法。
（一）细胞因子补充和添加疗法
通过各种途径使患者体内细胞因子水平增加，充分发挥细胞因子的生物学作用，从而抗御和治疗疾病。目前已有多种细胞因子（多为基因重组产品）试用于临床治疗，经大量临床资料验证，以下几种细胞因子的临床适应症比较明确，临床疗效比较肯定。
1．IFN不同型别的IFN各有其独特的性质和生物学活性，其临床应用适应症和疗效有所不同。IFN-α主要用于治疗病毒性感染和肿瘤。IFN-α对于病毒性肝炎（主要是慢性活动性肝炎）、疱疹性角膜炎、带状疱疹、慢性宫颈炎等有较好疗效。IFN-α对于血液系统恶性疾病如毛细胞白血病（有效率达80%以上）等疗效较显著，但对实体肿瘤的疗效较差。虽然IFN-γ的免疫调节作用强于IFN-α，但其治疗肿瘤的效果弱于IFN-α，目前有人应用IFN-γ治疗类风湿关节炎、慢性肉芽肿取得了一定疗效。
2．IL-2目前多将IL-2与LAD/TIL合用治疗实体肿瘤，对肾细胞癌、黑色素瘤、非何杰金淋巴瘤、结肠直肠癌有较显著的疗效，应用IL-2（或与IFN合用）治疗感染疾病亦取得了一定疗效。
3．TNf由于其全身应用副作用严重且疗效差，目前多倾向将其局部应用如瘤灶内注射治疗某些肿瘤和直肠癌，其确切疗效尚待进一步评价。
4．CSF目前主要应用GM-CSF和G-CSF治疗各种粒细胞低下患者。例如与化疗药物合用治疗肿瘤可以降低化疗后粒细胞减少程度，使粒细胞的数量和功能能尽快回升并能提高机体对化疗药物的耐受剂量，从而提高治疗肿瘤的效果。对再生障碍性贫血和AIDS亦有肯定疗效。用于骨髓移植后可使中性粒细胞尽快恢复，降低感染率。此外，应用EPO治疗肾性贫血取得了非常显著的疗效。
（二）细胞因子阻断和拮抗疗法
其基本原理是抑制细胞因子的产生和阻断细胞因子与其相应受体的结合及受体后信号传导过程，使细胞因子的病理性作用难以发挥。该疗法适用于自身免疫性病、移植排序反应、感染性休克等的。例如抗TNF单克隆抗体可以减轻甚至阻断感染性休克的发生，IL-1受体拮抗剂对于炎症、自身免疫性疾病等具有较好的治疗效果。
三、细胞因子的检测
细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指标，因而具有重要的实验室价值，同时还可能在临床上有诸多实用价值、包括许多疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测等。但是，由于细胞因子在体内的含量甚微，给细胞因子的检测带来困维。细胞因子的主要检测包括：
（一）依赖性细胞株
一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDC-PL细胞株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用这些依赖细胞株检测相应的细胞因子。这种方法敏感性高，特异性也不错，但可异的是并非所有细胞因都能找到相应的细胞株，因而限制了它的。
（二）功能检测
利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的活性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应，肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。这样的方法敏感性高，但特异性不够，容易受一些扰因素的。
（三）免疫测定
利用抗原抗体反应的原理，制备出抗细胞因子的单克隆抗体或多克隆抗体，可进行细胞因子的免疫检测。这种方法的优点是特异性强、操作简便，缺点是灵敏度不够，且不能代表活性测定的结果。从目前的国际趋势来看，已研制出了高灵敏度、特异性高、高度配套的细胞检测试剂盒，其应用范围正在扩大，有良好的发展前景。
（四）功能测定与抗体抑制
为解决功能定特异性不够，免疫测定灵敏度不够的，可将两种方法结合起来，利用各自的长处，有可能得到较为可靠的结果。在这一方法中，所用的抗细胞因子抗体必须是具有中和活性的抗体。
（五）分子杂交技术
利用分子生物学技术，制备出细胞因子的基因探针，可通过分子杂交技术检测细胞内细胞因子mRNA的表达，这是一种高度敏感和高度特异的检测技术，目前在实验室研究中使用较广，其缺点是操作较为繁琐，测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。
细胞因子范文第2篇
【关键词】 干细胞因子； 卵泡； 卵母细胞； 子宫内膜； 生殖医学
1 干细胞因子在卵泡发育中的作用
1.1 干细胞因子是酪氨酸激酶受体的配体，具有促进细胞增值和分化的作用
动物实验表明，干细胞因子能够促进卵泡发育，对优势卵泡生长有积极的影响。发育卵泡的颗粒细胞产生的干细胞因子对颗粒细胞-卵泡膜细胞相互作用很重要，并能促进卵母细胞发育。干细胞因子也能直接作用于卵泡膜细胞以促进细胞的生长和分化。干细胞因子促进卵泡膜细胞生长并刺激其分泌多种生长因子,使卵泡膜和颗粒细胞之间形成正反馈链。应用RT-PCR实验分析显示，牛的颗粒细胞表达干细胞因子，卵泡膜细胞表达受体酪氨酸蛋白激酶受体,酪氨酸蛋白激酶和干细胞因子对在体外维持卵母细胞存活与发育起重要作用,酪氨酸蛋白激酶/干细胞因子相互作用对于卵泡窦形成和类固醇激素生成很重要，调整卵母细胞的存活和细胞质成熟I代分离牛卵泡膜内层细胞，培养在游离血清中，当细胞在次融合状态下以剂量依赖的方式来研究干细胞因子刺激卵泡膜细胞生长的活动方式，发现干细胞因子能刺激卵泡膜细胞分泌雄甾烯二酮产生。表明在卵泡发育中干细胞因子能够直接刺激卵泡膜细胞生长和类固醇激素的产生。通过测定小、中、大卵泡的全部RNA，发现干细胞因子mRNA的稳定状态水平在大卵泡的颗粒细胞中最高，在小卵泡中最低，在中等卵泡中居中。而酪氨酸蛋白激酶mRNA稳定状态水平在大小不同卵泡中没有差别。干细胞因子在大卵泡中的高表达提示干细胞因子对提高大卵泡、优势卵泡的生长和类固醇激素产生可能很重要。在大的窦前卵泡中C-干细胞因子相互作用调节卵母细胞的细胞质成熟和卵泡膜细胞产生雄激素的量达到最大。干细胞因子还可能参与产生类固醇细胞之间的信息传递，干细胞因子作为颗粒细胞第一起源的生长因子，能够在促性腺激素的存在下直接刺激卵泡膜细胞生长和雄甾烯二酮的产生，然而，其对卵泡膜细胞孕酮(P)产生在任何密度下均无显著影响。干细胞因子显著改变卵泡膜细胞功能，并且支持局部颗粒―卵泡膜细胞相互作用，因而在卵巢局部调节中具有重要作用。干细胞因子不仅是卵泡膜细胞功能的重要调节因子，且还能调节局部间质―上皮细胞的相互作用。牛的卵巢颗粒细胞可表达干细胞因子基因，而且牛颗粒细胞主要表达可溶性干细胞因子，而不是膜性干细胞因子。牛的大、中、小卵泡膜细胞和间质―上皮细胞一样可表达酪氨酸蛋白激酶受体。已证明酪氨酸蛋白激酶mRNA在提纯的膜细胞上表达，小、中、大卵泡均表达干细胞因子和酪氨酸蛋白激酶mRNA，表明干细胞因子和酪氨酸蛋白激酶基因表达贯穿于卵泡的发育过程中。干细胞因子刺激卵泡膜细胞生长对于卵泡内/外层卵泡膜的形成很重要，来源于颗粒细胞的干细胞因子可能对未分化的间质干细胞转化为卵泡膜细胞募集在早期卵泡周围有作用，因为在组织培养中干细胞因子显著增加早期卵泡周围卵泡膜细胞层数目，有利于卵泡健康发育。如果卵泡膜细胞层分解将导致卵泡发育异常。干细胞因子可刺激融合培养状态下牛卵泡膜细胞产生雄甾烯二酮,干细胞因子直接刺激雄甾烯二酮产生而不是P产生，提示干细胞因子可能刺激卵泡期而非黄体期卵泡膜细胞的分化状态。在正常卵泡发育中，较大卵泡不断产生类固醇激素，发育为优势卵泡，并被选择排卵,干细胞因子mRNA在大卵泡的颗粒细胞中最高，提示干细胞因子对增加的卵泡膜细胞类固醇激素产量及优势卵泡的选择很重要。在卵泡发育过程中非正常的干细胞因子表达可以明显改变卵泡功能。干细胞因子过分表达可致发育卵泡数目增多和雄激素水平增高，最终导致多囊卵巢综合征。而低水平的干细胞因子可能影响优势卵泡选择或卵泡终末阶段发育。颗粒细胞产生的干细胞因子在卵泡膜细胞生长和雄甾烯二酮产生中的作用提供一种反馈机制，其可能调节卵巢内间质一上皮细胞的相互作用。这些细胞一细胞相互作用对正常卵巢卵泡发育和生殖功能必不可少。
1.2 干细胞因子对体外受精-胚胎移植的影响
干细胞因子是由颗粒细胞产生并且其水平受促卵泡成熟激素调节，提示干细胞因子在人卵泡发育过程中很重要。干细胞因子的表达与卵母细胞质量或人卵泡发育是否有关仍不清楚。衡量卵母细胞质量的标准是卵母细胞的受精能力，卵母细胞和受精后胚胎发育结果是决定受精卵是否能成功植人在宫内的因素。干细胞因子在胚胎移植后获得成功，妊娠患者的卵泡液中的浓度高于未妊娠者，提示干细胞因子可能是调节人类卵母细胞生长或卵泡发育过程中的一个重要因子，来源于子宫内膜细胞的干细胞因子，以自分泌/旁分泌方式，在胚胎移植过程中，通过受体酪氨酸蛋白激酶刺激胚胎滋养层细胞生长，在接受体外受精-胚胎移植的妊娠者的卵泡液中，干细胞因子浓度高于未妊娠者。干细胞因子对卵泡发育有着显著的诱导作用。干细胞因子是参与原始卵泡发育的启动因子。干细胞因子对优势原始卵泡发育和启动原始卵泡增值是必要的[3]。发育卵泡的颗粒细胞产生的干细胞因子对颗粒细胞-卵泡膜细胞相互作用很重要，并能促进卵母细胞发育[4，5，6]。干细胞因子也能直接作用于卵泡膜细胞以促进细胞的生长和分化[7]。卵泡液中较高浓度干细胞因子，表明干细胞因子与卵泡生长发育相关。总之，卵巢组织可产生干细胞因子，并通过自分泌和旁分泌等方式参与卵泡发育的过程，诱导、促进卵泡发育，刺激卵泡受体甾体激素产生，提高卵子的质量，从而提高体外受精-胚胎移植的妊娠率。表明干细胞因子是卵巢功能局部调节因子之一。对它的进一步深入研究，有助于不孕症的治疗。
1.3 干细胞因子水平对卵母细胞发育、受精和卵裂的影响
卵泡也是卵母细胞生长发育的微环境，其中含有许多对卵母细胞发育有重要影响的生物活性因子和激素，主要由血浆渗透液及卵巢局部产生的物质组成，其中含有许多对卵母细胞生长发育及受精卵发育潜能有重要影响的生物活性因子和激素[8，9，10]。发育成熟的卵母细胞是卵子受精的前提条件，而优质胚胎又是体外受精-胚胎移植成功的关键。动物实验表明，干细胞因子对诱导原始卵泡发育、促进卵泡膜细胞增殖、窦状卵泡类固醇激素生成及卵母细胞发育具有积极的促进作[11，12，13]。赵海波等通过卵泡液干细胞因子水平对卵母细胞发育、受精和卵裂影响的实验研究结果显示，成熟卵母细胞的卵泡液干细胞因子水平明显高于未成熟者，说明卵巢自身产生的干细胞因子通过旁分泌和/或自分泌的方式，促进卵母细胞的生长发育[14]。卵母细胞发育的好与坏，直接影响其今后的受精及分裂过程。SMIKLE[15]等研究发现，在体外受精―胚胎移植者中，妊娠组卵泡液干细胞因子水平显著高于未妊娠组。本实验结果也显示，受精卵子的卵泡液干细胞因子水平明显高于未受精卵子，优质胚胎的卵泡液干细胞因子水平明显高于劣质胚胎。所以，卵泡液中干细胞因子水平也间接影响着卵子的受精率和胚胎质量，较高水平的干细胞因子有利于卵子的受精和优质胚胎的形成。
2 干细胞因子在促超排卵中的关系
保证良好的促超排卵效果，是体外受精-胚胎移植工作成功的首要一步，如果卵巢反应差可能因得不到足够数目的成熟卵子，影响临床妊娠率。足够发育的大卵泡是得到成熟卵子的前提，对如何提高促超排卵周期中卵泡发育的质量至关重要。 促超排卵中干细胞因子 与促卵泡激素 之间的相互作用，17位作者通过实验表明，患者在用药前的个人情况大多相似，血清中干细胞因子、促卵泡激素和黄体生成素水平在各反应组之间没有差异，而卵泡液中干细胞因子、促卵泡激素和黄体生成素水平在高、中反应组中显著高于低反应组，说明卵巢对促排卵药物的反应差异并不在于血清干细胞因子浓度的高低，而主要在于卵泡自身。通过测定小、中、大卵泡的全部RNA，发现干细胞因子mRNA 的稳定状态水平在大卵泡颗粒细胞内最高，在小卵泡中最低，在中等卵泡中居中［16］；高、中反应组中大卵泡数目多，产生的颗粒细胞和卵泡膜细胞数也多，人卵巢内颗粒细胞、卵泡膜细胞及间质细胞都能够产生干细胞因子［17，18，19］；这种在大卵泡中的高表达提示干细胞因子对提高大卵泡、优势卵泡的生长很重要。低反应组中大卵泡数目少，产生干细胞因子也少，以及需要促卵泡激素的水平刺激作用不及高、中反应组。促卵泡激素促使卵泡进一步发育，提供了产生干细胞因子的物质基础，反过来，干细胞因子又能够维持和调整卵泡发育，促进卵母细胞成熟。促卵泡激素促进卵巢多个卵泡生长发育的活动，受到卵巢内微环境的内分泌和旁分泌因子的调整，使卵巢内各种类型细胞之间相互作用，这些协同作用可以影响卵泡的发育、卵子成熟与排卵。近年来动物实验研究认为［19，20］，干细胞因子和促卵泡激素之间的作用对动物卵泡生长发育有重要影响；干细胞因子和促卵泡激素之间相互调节、相互影响，彼此有促进作用。
3 干细胞因子与子宫内膜的关系
饲养层细胞在分离培养人胚胎干细胞过程中起着非常重要的作用，它能够分泌一些生长因子，如干细胞因子、白血病抑制因子，这些因子可以有效的抑制胚胎干细胞的分化并促进使其增值。曲文玉等用人子宫内膜成纤维细胞作为饲养层，使人胚胎干细胞连续培养14代仍保持胚胎干细胞的所有特性，且子宫内膜传至20代仍增值旺盛。在人子宫内膜基质细胞饲养层上生长的胚胎干细胞持续培养后，仍具有胚胎干细胞的特性，不影响他们显著的发育潜能，维持正常的核型。子宫内膜细胞可作为体外培养胚胎干细胞的饲养层细胞，为将来临床应用提供安全保障。
总之，干细胞因子与生殖医学密不可分，它的进一步研究和发展，为临床治疗不孕症和提高体外受精-胚胎移植成功率奠定基础。
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细胞因子范文第3篇
1转化生长因子-β(transforming growth factorβ,TGF-β)
TGF-β是一组多功能蛋白多肽,广泛存在于动物正常组织细胞及转化细胞中,以骨组织和血小板中含量最为丰富,其在骨形成和骨重建中起着极其重要的作用。TGF-βs能促进成骨细胞、软骨细胞、间质细胞及前成骨细胞的增殖,同时能有效促进胶原合成及非胶原细胞外基质蛋白的表达;此外,TGF-βs能通过抑制基质金属蛋白酶的合成和促进金属蛋白酶组织抑制因子TIMP-1的合成抑制细胞外基质分子的降解[2]。
目前,对DO过程中TGF-β1的表达研究较为深入,多数学者认为TGF-β1在DO的整个过程中均有表达,只是表达水平不同;并且在不同时期表达部位也不同。Mehrara等[3]在鼠下颌DO实验中发现,在潜伏期末TGF-β1表达较未手术组增加2.5倍,牵张初期增加到正常水平的3倍,并且在整个牵张期都保持高水平,直至固定期第4周末才恢复到正常水平;潜伏期及牵张早期TGF-β1主要在截骨线周围的炎症细胞、成骨细胞、间充质细胞、细胞外基质中表达增高;当继续牵引,则高表达于活性成骨细胞、新生成的血管及细胞外基质中的胶原纤维;固定期TGF-β1表达仅局限于牵张间隙中的成骨细胞。Steinbrech等[4]发现TGF-β1随牵张的进行而持续表达,并伴有骨基质的轻度矿化和胶原的活跃合成,而且TGF-β1及其受体的表达广泛存在于皮质切开的骨边缘、骨膜、周围软组织和炎细胞,以及中央纤维形成区的成纤维细胞和各区域的成骨细胞。陈勇等[5]也证实TGF-β1的表达贯穿下颌骨DO的全过程,且TGF-β1mRNA及其蛋白表达在牵引早期达到高峰,此后逐渐减弱,其不同时期表达部位与上述相似。表明牵张机械力刺激可促进TGF-β1的合成和分泌,推测其在牵引成骨中是成骨细胞迁移、分化、胞外基质合成、血管形成的重要调节因子。
然而,外源性TGF-β1对DO中新骨形成作用的研究结果不完全相同。Ozkan等[6]发现外源性TGF-β1增加牵张区新生骨组织的密度和强度;而Rauch等[7]在兔DO实验中局部应用TGF-β1,结果对成骨量及成骨密度均无影响,仅增加了骨痂区的纤维组织。Seiadini等[8]在对胫骨节段性DO研究中,给予外源性重组人TGF-β,结果发现空白对照组和生理盐水组骨明显、连续、稳定、矿化均匀,而注入TGF-β组结果则相反,且随剂量的增加软骨和软骨细胞数量减少,表现出对成骨起抑制作用。表明TGF-βs促进成骨作用在体内可能存在一精确的调节机制,如何利用外源性TGF-βs来促进DO中的骨组织的再生有待进一步研究。
2骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)
BMPs是一种疏水酸性糖蛋白,为TGF-β超家族成员之一,目前已发现的有BMPl-12,其作用具有浓度依赖性,低浓度时能促进细胞趋化和增殖,高浓度时能促进细胞分化和骨形成。Sato等[9]在鼠长骨DO实验中发现,在截骨后4天,BMP-2、-4mRNA可在骨膜下未成熟骨痂中的软骨前体细胞中检测到;截骨后7天,BMP-2、-4mRNA恢复到术前水平;当牵引开始后,BMP-2、-4mRNA在纤维区的软骨细胞,骨细胞和它们的前体细胞中明显表达,约是骨切开时表达量的20倍,在整个牵引期维持较高水平;至固定期BMP-2、-4表达消失;而BMP-6、-7在DO中的表达情况与BMP-2、-4的表达不同,牵张初期,BMP-6仅在成软骨细胞内可以检测得到,随着牵张的进行,BMP-6 mRNA表达渐降低,至固定期不表达;BMP-7在整个实验过程中均未被检测到。推测BMP-6在软骨成骨阶段可能发挥着一定的作用,BMP-7对其成骨无明显影响。Rauch等[10]在对兔胫骨施行牵引成骨术时也证实,在潜伏期,BMP-2、-4表达增加,尤其在骨膜的间充质细胞和成骨细胞十分明显;在牵引期,BMP-2、-4在成纤维细胞和软骨细胞中表达持续升高;当牵引停止后,表达逐渐下降;但Rauch等发现BMP-7的表达与BMP-2、-4的表达同步,且表达的部位也基本类似。这可能与动物模型的建立、检测手段和检测试剂等因素有关。Khanal[11]进行牵引区新生骨组织免疫组化检查发现,潜伏期BMP-2、-4, Smads 1、5、 8的表达仅轻微增加,牵引期表达显著增加而进入固定期则逐渐减弱,认为BMP信号通路在将机械应力转录为生物学效果中起重要作用。
目前,已证实BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-12均有促进新骨形成的作用,其中,以BMP-2促进新骨形成作用最强[12-18]。这些骨形态发生蛋白之间也可能存在协同作用,有文献报道[19-20]重组BMP-2与BMP-7的联合基因治疗较单一应用其中一个更能促进成骨细胞分化成骨。但目前仍然不知道在牵引过程中产生的机械应力是如何激活机体产生相应生物学信号,尚需进一步研究。
3血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)
血管内皮生长因子也称血管渗透因子(vascular permeability factor,VPF),最初是在肿瘤细胞分泌物中发现的,是一种糖基化分泌性多肽因子,具有维持血管正常状态和完整性,增加血管通透性,诱导血管发生,并促进血管生成的作用。Warren等[21]在鼠下颌骨DO实验中发现,在截骨后5～7天 VEGFmRNA的表达增加,在牵引1周左右达高峰,其表达贯穿整个牵引期及固定期,在牵引带成骨细胞和内皮细胞上有高浓度的VEGF表达及强烈的血管生成反应。Byun[22]在狗单侧下颌骨DO过程中检测牵引区VEGF和其两种受体Flt-1、Flk-1,发现牵引7天后牵引区成骨细胞、骨细胞和成纤维细胞中VEGF和其受体表达明显增加,并在成骨细胞和成纤维细胞中维持14天。牵引28天后VEGF和VEGFR-1在成骨细胞中表达减弱,牵引区细胞中无VEGFR-2表达。在整个观察期VEGFR-1明显强于VEGFR-2的表达。Sojo[23]研究发现VEGF在牵引区新生成骨的前部靠近新生成骨的周边的成骨细胞表达,而BMP-2、-4在肥大的软骨细胞中表达。在同一标本中VEGF表达区域比BMP-2、-4表达区域离骨干远,因此认为在成骨之前先有血管生成。Casap[24]在兔下颌骨牵引一侧牵引区应用VEGF后发现应用VEGF部位的新骨生成明显增加,因此,认为VEGF对新骨形成具有积极的作用。但Eckardt等[25]在对兔牵引动物模型中局部导入VEGF或VEGF拮抗剂,结果未发现对新骨形成有明显影响。推测可能是因为机械牵张已刺激VEGF等生长因子的大量产生,导入的外源性VEGF或VEGF拮抗剂不足以发挥作用。另外,导入VEGF的时机、剂量及处理方式等都可能影响新骨形成。
4碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor,bFGF)
bFGF是一种25kD的多肽,包括至少19个密切相关的单肽,能促进细胞增殖,调节细胞分化,诱导软骨和骨基质合成,与血管内皮生长因子协同作用,可促进血管再生,从而促进骨生成。Yeung等[26]研究bFGF在牵引过程中的表达中发现,在延迟期、牵引期、固定期bFGF均有不同程度的表达。在潜伏期,骨膜和骨髓质区的类纤维原细胞bFGF表达较明显,新形成的成骨细胞也有bFGF的表达;牵引期,正在形成中的骨小梁成骨细胞bFGF有非常强的表达。在新形成骨小梁和纤维组织中,成骨细胞密度比相邻区域明显增高,bFGF的表达也更明显。在固定期bFGF的表达比牵引期明显减弱。刘人恺等[27]在山羊颅骨缝DO实验中发现山羊颅骨缝在受到牵张力作用后bFGF有高水平表达,以牵张结束当天与第2周最为显著,主要定位于成纤维样细胞与成骨细胞,随着固定时间的延长其表达逐渐减弱。
应用外源性bFGF可刺激骨痂形成,促进骨折修复和再生、移植骨愈合及骨缺损修复。Okazaki等[28]对兔胫骨行牵引成骨,牵引结束后,局部注入200μg bFGF,发现能促进牵引区骨形成。在牵引结束后2～5周,发现骨矿化量明显增加,提示在骨牵引的固定期,外源性bFGF的应用可以缩短骨延长时间。将bFGF注入兔胫骨近端骺板后,血管由邻近干骺端长入,加速骨前体细胞的侵入及软骨骨化。朱永云等[29]将外源性bFGF注射到兔下颌骨牵引区,显示牵引区新骨生成速度和数量高于对照组,认为局部导入外源性bFGF可能有促进下颌骨牵引成骨的作用,从而为缩短DO疗程和减少牵引后复发回弹提供了一种可能的途径。
5胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)
胰岛素样生长因子是一类对机体生长发育起重要调节作用并具有胰岛素样代谢效应的因子,目前已发现有IGF-1和IGF-2两种异构体,分别为含有70个和67个氨基酸的单链多肽。IGF-1可由成骨细胞产生并以自分泌方式刺激成骨细胞增殖和基质合成,IGF-2的生理作用与IGF-1相似但作用较弱。Eingartner等[30]研究发现,在DO过程中IGF-l的表达呈现明显的时间性。在牵引早期,血浆中IGF-1水平最先升高,其后牵引带和周围骨组织中IGF-1水平开始升高,这可能是由于受牵引力影响,周围软组织最先释放IGF-1,导致血液中浓度升高的结果。而Meyer等[31]检测牵引成骨时兔血清IGF-1含量发现,在骨切开后IGF-1血清浓度下降,但牵引期其浓度并无明显升高。Yates等[32]研究IGF-1在猪下颌DO早期的作用,发现牵引早期骨膜中IGF-1升高明显,牵引带仅有少量矿化骨质形成;牵引结束后,IGF-1恢复到正常水平,牵引带有大量矿化骨形成。说明IGF-1可能在牵引早期发挥重要作用。王志国等[33]在研究局部应用IGF-1对兔下颌骨DO的影响时发现,实验组和对照组动物在X线片上无明显差异;在组织学观察上,两组在牵张间隙内均见到有大量新生骨小梁生成,骨小梁排列方向与牵引方向一致;组织学分级评价结果显示,实验组新骨生成数量仅比对照组多2.4%,但统计学检验结果表明两组未见显著差异。Schrnid[34]研究发现只有在机体缺乏IGF时,外源性IGF对成骨细胞的分化与增殖才有促进作用。在骨切开术和随后的牵引过程中,局部组织会产生较高浓度的IGF-1,这时候导入外源性IGF-1显得多余。另外,联合应用生长因子可能比单独应用某一种生长因子更有效。
综上所述,在牵引成骨术中牵张机械力能促进多种细胞因子的表达,其参与了牵引区新骨形成及矿化的调节,这为阐明牵引成骨的分子机制奠定了基础;但这些细胞因子表达的时间顺序及之间的相互作用还尚不清楚,此外,对于外源性细胞因子应用的时间、途径及剂量还需深入研究。相信随着对牵引成骨分子机制的研究深入,必将对临床应用和研究产生重要的指导意义,推动牵引成骨的广泛应用。
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细胞因子范文第4篇
健康网讯: 王红英 闫华 刘卫红
【摘要】 输卵管的微环境中含有细胞因子、粘附因子、蛋白质等多种物质，参与输卵管生理功能、病理过程的调节，作用机制极其复杂。认识输卵管微环境物质的变化，有助于防治输卵管炎、输卵管性不孕、输卵管妊娠等疾病，提高体外受精成功率。
输卵管是卵子摄取、和卵子最后成熟、受精、植入前胚胎发育的场所，在人类生殖过程中发挥着重要的作用。而输卵管的微环境是其物质基础，输卵管病变导致输卵管微环境中物质变化及功能异常，引起输卵管性不孕、输卵管妊娠发生，严重危害妇女的身心健康;现对输卵管微环境中细胞因子、粘附因子、蛋白质的表达及作用做一综述。 输卵管连于子宫角两侧，细长而弯曲，由浆膜层、肌层、粘膜层构成，其中粘膜层由单层柱状上皮和固有层组成，单层柱状上皮包括分泌细胞、纤毛细胞和少数栓细胞;在近排卵时，上皮高度和分泌活动达到最高峰;排卵期雌激素水平升高，输卵管蠕动推动由子宫角向输卵管壶腹部移动，同时，峡部粘膜分泌增加，有利于的运行，并为提供足够的能量;排卵后，输卵管漏斗部拾卵，使之漂浮于输卵管液中，、卵子在输卵管壶腹部相遇、受精，受精卵在输卵管的蠕动性收缩、纤毛的摆动及输卵管液的作用下向宫腔运行;输卵管的功能与微环境的周期调节是分不开的，输卵管液是输卵管微环境中最重要的部分，分别来自血浆渗液、输卵管分泌物、子宫液、卵泡液，含有细胞因子、生长因子、粘附因子、特异性蛋白质、电解质、糖、氨基酸、多种酶等多种物质。输卵管上皮细胞表达:雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR），其功能是在雌孕激素调节下进行的，它们对、卵子在输卵管内的迁移、停留和经历受精前的生理、生化改变及受精卵和胚胎的早期发育起着至关重要的作用 ［1］ 。 1 输卵管微环境中细胞因子表达 1.1 白血病抑制因子（LIF） LIF是一种具有广泛生物学功能的细胞因子，能调节胚胎干细胞、原始生长细胞、内皮细胞等细胞的生长和分化，LIF及其受体（ILFR）在女性生殖系统的表达，随月经周期而变化，故认为与生殖密切相关。对于人体输卵管组织进行研究表明:输卵管上皮细胞和间质细胞表达LIF/ILFR，上皮细胞表达的强度大于间质细胞，输卵管伞部表达较高，分泌期表达大于增殖晚期，LIF与LIFR在输卵管组织中动态表达与子宫内膜的表达一致;在分泌期，输卵管LIF表达增加，为受精卵、早期胚胎发育、转运和成功种植创造了适宜的生理环境，对胚胎有营养和增强生存能力的作用。正常输卵管LIF表达维持较低水平，培养的输卵管片段在经过生长因子:表皮生长因子（EGF）、转化生长因子（TGF）及炎症因子:肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1）等处理后，LIF在基质细胞表达明显增强，推测LIF、LIFR表达增强可能与输卵管炎、输卵管妊娠有关。进一步研究发现:妊娠的输卵管LIF表达明显增高，推测输卵管合成和分泌LIF在促进早期囊胚发育的同时，也有接受孕卵着床的作用 ［2，3］ 。 1.2 表皮生长因子（EGF） EGF具有多方面的生理功能，不仅与机体的物质转运、糖代谢、细胞增殖、成纤维细胞的游走等有关，并且在生殖过程中起重要作用。输卵管上皮细胞表达EGF、表皮生长因子受体（EGFR），随月经周期变化，在增殖晚期、分泌期明显高于增殖早期，这种周期性变化与雌激素水平相关，EGFR与配体EGF结合，通过旁分泌、自分泌机制刺激上皮细胞生长，参与卵子、在输卵管的成熟及受精卵的早期发育;HB-EGF为EGF家族成员之一，与EGFR及硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）结合发挥生物作用，其作用EGF强，胚泡种植前期输卵管峡部、壶腹部有HB-EGF的表达，可能也参与卵子、在输卵管的成熟及受精卵的早期发育 ［4～6］ 。 1.3 肿瘤坏死因子α（TNF-α） TNF-α是一种单核细胞因子，主要由单核细胞、巨噬细胞产生，具有杀伤肿瘤、抗感染、促进细胞增殖的作用，TNF-α可激活局部单核细胞、巨噬细胞，并产生更多的TNF-α，在抗感染同时造成组织损伤;TNF-α及受体（TNF-αR）在输卵管组织表达，随月经周期变化，在卵泡期及排卵后高表达，黄体期未见表达，TNF-α可刺激输卵管分泌前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、前列腺素F2αprostaglandin F2alpha，PGF2α），内皮素（endothelin-1，ET-1）和血管紧张素ⅡangiotensinⅡ，AngⅡ）等，这些物质可刺激平滑肌细胞收缩，与输卵管内配子及早期囊胚的运输有关。输卵管感染沙眼衣原体（CT）、淋球菌等后，输卵管液中TNF-α及TNF-αR升高，其中TNF-α与输卵管损伤程度呈正相关，TNF-α分泌越多，则输卵管纤毛损伤越严重，影响胚胎的运输;输卵管液中TNF-α浓度增高，影响配子及胚胎质量，故输卵管炎易导致异位妊娠;异位妊娠患者血清中TNF-α显著升高，TNF-α在异位妊娠中的作用机制有待进一步研究 ［7～10］ 。 1.4 白细胞介素8（IL-8） IL-8是白细胞趋化因子之一，参与炎症反应的调节。在基础状态下，人体输卵管上皮细胞和基质细胞表达IL-8不同，输卵管上皮细胞表达IL-8mRNA高，基质细胞表达IL-8mRNA低，在IL-1α、TNF-α等前炎症因子刺激下，输卵管基质细胞IL-8的分泌增加，而上皮细胞IL-8的分泌无增加;此结果提示IL-8与输卵管炎的病理损伤有关。宫外孕患者血清中IL-8水平较流产、正常妊娠者血清中IL-8水平高;提示IL-8与异位妊娠有关，其作用机制待进一步研究 ［9，10］ 。
1.5 干扰素γ（IFN-γ） IFN-γ具有诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等细胞MHC-Ⅱ类抗原表达，参与抗原提呈和特异性免疫识别过程。IFN-γ参与抵抗输卵管CT感染，在抗感染的同时促进输卵管炎症损伤和纤维化，IFN-γ介导的组织损伤机制可能为:IFN-γ使CT的57kD在局部组织堆积引起超敏反应，诱导输卵管上皮细胞膜异常表达MHC-Ⅱ类抗原，呈递给自身反应性T细胞，启动自身免疫及刺激其它细胞因子（如:IL-1、TNF-α等）分泌，造成组织增生、纤维化 ［12］ 。 2 输卵管微环境中粘附分子的表达 粘附分子广泛分布于全身各组织，在胚胎发育、分化、正常组织结构维持、炎症免疫应答，伤口愈合、凝血及肿瘤的发生、发展等诸多生理、病理过程中具有重要作用。输卵管峡部、壶腹部和伞部粘膜上皮纤毛细胞表达整合素β 3 ，随月经周期而变化:排卵后输卵管峡部纤毛细胞整合素β 3 的含量显著增加，为发挥“储器”的功能，提供一个分子机制，壶腹部粘膜上皮纤毛细胞整合素β 3 含量排卵后显著下降，此时输卵管对胚胎的容受性下降，可降低或避免早期胚胎在输卵管壶腹部植入，伞部粘膜纤毛分泌整合素β 3 排卵期升高，可能与伞部拾卵有关;正常输卵管粘膜上皮基底膜、粘膜基质表达纤维粘连蛋白（FN），且增殖期大于分泌期，排卵前达到高峰，排卵后显著下降，FN具有调节细胞生长、分化、促进细胞迁移、增殖和信息传递的功能，受雌、孕激素影响，雌激素促进其表达，孕激素抑制其表达，为防止输卵管妊娠机制之一。在炎症存在时输卵管粘膜上皮基底膜、粘膜基质、血管内皮基底膜表达:FN、表皮细胞间粘附分子ECAM）、细胞间粘附分子（ICAM）、血管细胞间粘附分子（VCAM）等增加，提示:输卵管炎时输卵管粘膜高表达粘附分子可能为输卵管妊娠的机制之一。Qin等研究发现:输卵管妊娠3～9周的母胎界面有整合素和细胞外基质蛋白的表达，输卵管妊娠5～7周达高峰，参与滋养细胞粘附与侵入 ［13～15］ 。 3 输卵管微环境中的蛋白质及其作用 3.1 输卵管特异性糖蛋白（OGP） OGP是输卵管上皮细胞合成和分泌的糖蛋白，该糖蛋白在排卵期、受精期及早期囊胚发育阶段的输卵管内含量较高，与血清中雌、孕激素和黄体生成素水平有关，其对、卵子受精前的准备和早期囊胚的发育起重要作用。纯化的人输卵管蛋白与卵子共同培养时，可以看到其首先与卵透明带结合，进而促进与卵透明带结合，并且形成了输卵管上皮与早期囊胚间的排斥力，保证早期囊胚在输卵管内自如活动，再联合输卵管纤毛摆动、平滑肌收缩，防止异位妊娠的发生。狒狒的OGP与人的OGP具有高度同源性，但狒狒的OGP可以抑制人和卵子的结合，提示OGP在防止异种精卵结合，维持种属特异性方面发挥作用。通过体内、外实验对比发现:相同条件下，在体内OGP与卵透明带（zona pellucida，ZP）结合明显高于体外，在体内可能有其它物质参与OGP作用的调节，故体外研究OGP机能是受限的。Woo等研究发现:OGP作为输卵管上皮细胞分化的标志物，在卵巢组织也有表达，且表达强度不同:在正常卵巢组织呈阴性表达，在卵巢良性、交界性浆液瘤及早期卵巢癌呈阳性表达，而在十二指肠、回肠、胰腺表达极微弱，在46种非妇科肿瘤呈阴性表达;提示:OGP可作为卵巢囊肿及早期卵巢癌的标志 物 ［16～18］ 。 3.2 输卵管素（oviductin） 输卵管素也是人输卵管上皮细胞合成和分泌的蛋白质，可与结合，增加获能效应和穿透能力，从而有利于与卵透明带结合及顶体反应发生;并且与选择性结合，对起到了筛选作用。输卵管素与ZP和/或卵黄周隙（perivitelline space，PV）结合，卵裂开始后位于2-细胞、4-细胞、8-细胞和早期囊胚的质膜，增强早期囊胚发育能力，随后逐渐降解。其中发育促进因子-1（DPF-1）容易迁移过卵透明带，进入内层，呈点状分布，与早期囊胚细胞膜牢固地结合，可克服早期囊胚体外发育过程中的发育停滞，支持体外卵裂的发生。持续腹腔注射DPF-1抗体，胚胎的植入率下降，提示DPF-1有克服早期囊胚发育停滞的作用 ［19～22］ 。 总之，输卵管微环境中细胞因子、粘附因子、特异性蛋白质等对输卵管功能起重要作用，并且受激素的影响，相互作用机制极其复杂;输卵管病理变化、组织损伤可能导致输卵管微环境中物质变化，引起输卵管功能失常，导致输卵管性不孕、输卵管妊娠发生;对输卵管微环境有待进一步了解，揭示输卵管性不孕、输卵管妊娠机制，为防治疾病、寻找更有效的避孕措施及提高IVF的成功率提供理论依据。
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细胞因子范文第5篇
【摘要】
目的: 观察CRLF3蛋白在293T细胞中的表达及亚细胞定位， 并在大肠杆菌中表达和纯化了重组CRLF3蛋白。方法: 将真核表达载体pCMVmycCRLF3瞬时转染293T细胞， 转染24 h和48 h后免疫荧光染色， 共聚焦显微镜观察蛋白表达及定位; 构建原核表达质粒pGEX4T1CRLF3， 实现插入基因的融合表达， 经GST亲合层析纯化蛋白。结果: CRLF3蛋白在293T细胞中高效表达， 主要分布在细胞质和细胞膜; 成功构建了表达CRLF3融合蛋白的原核表达载体， 并在大肠杆菌内高效表达， 纯化后得到Mr 约为74000的融合蛋白。结论: 在真核细胞中过表达的CRLF3蛋白主要定位在细胞质和细胞膜; 获得了重组GSTCRLF3融合蛋白，为进一步探讨CRLF3的功能奠定基础。
【关键词】 人细胞因子受体样因子3 真核表达 原核表达 蛋白纯化
[Abstract]AIM: Cytokine receptorlike factor 3 (CRLF3) is a novel gene cloned from K562 cell line. The aim of the current study is to observe CRLF3 expression and subcellular localization in 293T cells and to express and purify the CRLF3 fusion protein in E.coli. METHODS: The plasmid pCMVmycCRLF3 was transiently transfected into 293T cell. The expression and localization of CRLF3 protein was observed by immunostaining approach. CRLF3 was also cloned into pGEX4T1 vector. The GSTCRLF3 fusion protein was expressed in E.coli and purified by GST affinity chromatography． RESULTS: CRLF3 protein was highly expressed in transfected 293T cells. CRLF3 protein was distributed in both cytoplasm and cell membrane. The GSTCRLF3 fusion protein was expressed as a Mr 74 000 protein and then successfully purified from E.coli cells. CONCLUSION: Overexpressed CRLF3 is a cytoplasmic protein that distributes in both cytoplasm and cell membrane in mammalian cells. The recombinant GSTCRLF3 fusion protein had been isolated and could be used for further antibody production and functional characterization.
[Keywords]CRLF3; eukaryotic expression; prokaryotic expression; protein purification
人细胞因子受体样因子3（cytokine receptorlike factor 3， CRLF3）是一个具有I类细胞因子受体保守功能域的新基因。本实验室从K562细胞中克隆出CRLF3[1]， 并提交NCBI GenBank（DQ298450）。CRLF3基因编码区全长1317 bp， 编码一个438个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析CRLF3定位在17q11.2， 具有一个重要的结构域——FN3功能域， 这一结构域的C末端， 有一个RGD基序和I类细胞因子受体特有的WSXWS基序， CRLF3基因保守存在于多种生物中。对CRLF3的功能研究表明CRLF3 的过表达可以抑制细胞周期， 使细胞停滞在G0/G1期， 减少了进入S期的细胞， 其作用机制尚不明确。CRLF3可能是一种交通信号分子。本研究中， 我们将CRLF3基因在真核细胞中表达， 观察了CRLF3在真核细胞中的定位， 并在原核细胞中表达和纯化了其融合蛋白， 为进一步研究CRLF3的功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 真核表达质粒pCMVmycCRLF3、 人胚肾293T细胞、 融合表达载体pGEX4T1、 E.coli DH5α、 E.coli BL21(DE3)均由本室保存; MEM、 胎牛血清购自Gibco公司; T4连接酶、 BamH I、 Xho I限制性内切酶、 λEcoT14I digest DNA marker、 蛋白maker均购自TaKaRa公司; 磷酸钙转染试剂购自碧云天生物技术公司; cMyc抗体购自Santa Cruz公司; FITC标记山羊抗小鼠IgG购自中杉金桥公司; GSTTag抗体购自Proteintech公司; Glutathione Sepharose 4B购自GE Healthcare公司; PCR引物由上海英俊生物技术公司合成; 其他均为国产分析纯生化试剂。
1.2 方法
1.2.1 293T细胞的培养和pCMVmycCRLF3的转染 将生长状态良好的293T细胞按1×105 cells/孔的密度转移到放玻片的6孔板中， 在含100 mL/L胎牛血清的MEM培养基中培养24 h。转染前30 min， 换新鲜的培养液2 mL， 分别取5 μg空载体质粒和pCMVmycCRLF3与磷酸钙转染试剂混匀， 室温孵育20 min， 均匀滴加到6孔板内， 在50 mL/LCO2， 37℃培养箱内培养24 h和48 h。
1.2.2 免疫荧光染色 转染24 h和48 h后， 弃去培养液， 多聚甲醛固定20 min， 5 mL/L TritonX100去膜10 min。含100 mL/L胎牛血清的PBS封闭1 h， 加入抗cmyc抗体（1∶100）室温孵育1 h， PBST充分洗涤。加入FITC标记山羊抗小鼠IgG（1∶100）室温孵育1～2 h， PBST充分洗涤。最后加入0.5 g/L DAPI(联眯基苯吲哚酸盐)标记细胞核15min， 洗涤后500mL/L甘油封片， 共聚焦显微镜观察结果。
1.2.3 pGEX4T1CRLF3融合表达载体的构建 以本室构建的pCMVmycCRLF3质粒为模板， 根据已测得的CRLF3的全长序列设计引物， 进行PCR扩增。上游引物序列为5′TATA GGATCC ATG GAG CTG GAG CCT GAG CT3′， 其中导人BamH I酶切位点; 下游引物序列为5′TATA CTCGAG CTA AAA CAC TAA CAC TTT CC3′， 其中导人Xho I酶切位点。PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳回收， BamH I和Xho I酶切pGEX4T1载体和PCR产物， T4连接酶连接， 转化DH5α感受态细胞。挑取单个克隆于5 mL LB(Amp+)培养液中培养过夜， 提取重组质粒， BamH I/Xho I酶切鉴定， 阳性克隆提交上海英俊生物技术公司进行测序分析。
1.2.4 GSTCRLF3融合蛋白的诱导表达和纯化 将序列正确的重组表达质粒pGEX4T1CRLF3转化宿主菌BL21（DE3）， 挑选5个单个菌落分别接种到5 mL LB（Amp＋）管中， 与37℃剧烈摇动培养过夜。每个菌落的培养物按1/100的比例接种到2个新鲜LB（Amp＋）管中， 37℃剧烈摇动培养4 h， A550达到0.6～0.8后， 向其中一管中加入终浓度为1 mmol/L IPTG， 另一管为未诱导的对照菌， 30℃继续培养3～4 h。离心收集培养液各1 mL， 菌体沉淀以100 μL PBS重悬， 取10 μL样品进行120 g/L SDSPAGE电泳， 考马斯亮蓝染色。以空载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)作为阴性对照， 检测蛋白表达情况， 选出蛋白表达量高的菌落做种子。
1.2.5 融合蛋白的大量表达和纯化 选取融合蛋白表达量高的种子菌， 以终浓度为1 mmol/L IPTG大量诱导菌液500 mL， 离心收集菌体， 1×PBS(pH7.4)悬浮菌体， 冰浴条件下超声破裂菌体， 4℃、 120000 r/min离心30 min， 取少量上清和沉淀， 进行SDSPAGE检测， 分析蛋白质在胞内表达形式。确定目的蛋白以可溶性形式存在后， 取超声上清过装有500 μL Glutathione Sepharose 4B凝胶的纯化柱， 以1 L的PBS淋洗， 去除杂蛋白， 最后用1倍柱体积的GST洗脱缓冲液 (50 mmol/L TrisHC1 pH8.0， 10 mmol/L还原型谷胱甘肽)洗脱目的蛋白。
1.2.6 Western blot鉴定融合蛋白 取纯化的蛋白进行120 g/L丙烯酰胺凝胶电泳， 电转移至硝酸纤维素膜上， 50 g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜。加入GST抗体（1∶2500）室温孵育2 h， TBST充分洗涤， 加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1∶5000）， 室温孵育1 h， TBST充分洗涤， ECL显影。
2 结果
2.1 共聚焦显微镜观察结果 采用共聚焦显微镜观察CRLF3蛋白在293T细胞中的表达及分布。以转染pCMVmyc空载体的293T细胞为本底对照， 40倍物镜下观察可见CRLF3在真核细胞中高效表达。油镜下观察可见瞬时转染24h后的CRLF3均匀分布在胞质中; 瞬时转染48 h后的CRLF3分布在细胞质和细胞膜上（图1）。
图1 转染24 h和48 h后免疫荧光染色（略）
Fig 1 Immunostaining of CRLF3 on 293T cell transfecting pCMVmycCRLF3 after 24 h and 48 h(×1000)
A: Antimyc after 24 h; B: DAPI; C: Merged; D: Antimyc after 48 h; E: DAPI; F: Merged.
2.2 重组质粒的构建和鉴定 以pCMVmycCRLF3质粒为模板扩增的产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳， 得到一条特异条带， 与目的片段1318 bp的大小位置相符（图2）。重组质粒pGEX4T1CRLF3采用BamH I/Xho I酶切鉴定（图3）， DNA测序分析， 证明插入序列是目的序列， 且与融合表达载体的读码框相符。
图2 CRLF3 PCR扩增产物（略）
Fig 2 CRLF3 product of PCR
1: CRLF3 PCR product; 2: λEcoT14I digest DNA marker.
图3 重组质粒pGEX4T1CRLF3的酶切鉴定（略）
Fig 3 Restriction analysis of recombinant plasmid pGEX4T1CRLF3
1: λEcoT14I digest DNA marker; 2: pGEX4T1CRLF3 digested by BamH I and Xho I.
2.3 重组蛋白在大肠杆菌BL21中的表达和纯化 SDSPAGE结果显示， 转化空载体的对照组BL21 IPTG诱导后， 在Mr 26000的位置上出现1条浓集带; 转化pGEX4T1CRLF3重组质粒的BL21 IPTG诱导后， 在Mr约为74000的位置上出现1条较浓集而且表达量受IPTG诱导的蛋白条带， 说明插人的融合基因已经在大肠杆菌中表达， 但在这一位点上也有内源性基因的表达。超声破碎菌体并离心后， 分别取上清和沉淀进行SDSPAGE电泳检测， 显示目的蛋白主要在上清液中， 它在菌体内主要以可溶性形式存在; 利用Glutathione Sepharose 4B亲和纯化目的蛋白， SDSPAGE分析得到1条Mr为74000的单一条带。灰度扫描分析， 纯度达到85%（图4）。
图4 SDSPAGE分析融合蛋白的表达及纯化（略）
Fig 4 SDSPAGE analysis of expression and purification of fusion protein
1: Protein maker; 2: pGEX4T1 transformed BL21（IPTG-）; 3: pGEX4T1 transformed BL21（IPTG＋）; 4: pGEX4T1CRLF3 transformed BL21（IPTG-）; 5: pGEX4T1CRLF3 transformed BL21（IPTG＋）; 6: Supernatant; 7: Sediment; 8: Purified fusion protein.
2.4 Western blot检测 用抗GSTtag多克隆抗体对纯化的GSTCRLF3融合蛋白进行Western blot检测。抗GST的抗体可以检测到Mr为74000的CRLF3融合蛋白条带， 提示纯化后的蛋白为所需要的GST融合蛋白。
3 讨论
CRLF3基因定位在17q11.2， 邻近NF1 (neurofibromatosis type 1)基因， 在神经纤维瘤患者中， CRLF3基因常与NF1一起缺失。神经纤维瘤的遗传学致病机制是由于NF1基因的微缺失， 其缺失的范围至少包括11个基因， CRLF3为其中之一[2， 3]。NF1基因是一种抑癌基因[4]， 而缺失基因簇中的其他基因功能尚不清楚。对CRLF3的生物信息学预测， 它不具有跨膜结构域， 没有核定位信号与细胞器定位信号， 是一种胞质蛋白质。本研究中通过在真核细胞中表达CRLF3， 可见CRLF3转染24 h后主要定位在细胞质， 转染48 h后， 则在细胞质和细胞膜上均有分布， 提示在真核细胞中过表达的CRLF3是一种胞质蛋白质， 充分表达后向细胞膜迁移。CRLF3含有FN3功能域和RGD基序， 含有这样结构域的分子大部分具有介导细胞间黏附和相互作用的功能， 而且主要以受体和分泌形式存在[5]。具有RGD基序的胞质蛋白CRLF3是否也具有介导细胞间黏附和相互作用的功能， 或在细胞质中发挥通讯分子的作用，有待进一步探讨。
本研究中， 我们利用可诱导表达的大肠杆菌表达系统， 以原核表达质粒pGEX4T1为载体表达出GSTCRLF3的融合蛋白， 进一步应用GST亲和层析法有效分离得到纯化的目的基因CRLF3的融合蛋白[6]， 为下一步制备抗CRLF3的多克隆抗体， 更好的研究CRLF3的功能创造条件。
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