凝胶渗透色谱
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凝胶渗透色谱范文第1篇
【摘要】 目的建立凝胶渗透色谱（GPC）净化-毛细管气相色谱测定中成药中有机氯农药残留量的方法。方法凝胶渗透色谱采用的流动相为丙酮-环己烷 (1∶4)，最佳流速是5 ml/min，最佳馏分收集时间是15～26 min。结果低、中、高3个添加水平的回收率分别为85.5%～115.0%，84.3%～123.4%，86.7%～114.0%，相对标准偏差（RSD）为0.1%～9.3%，检出限0.008～0.05μg/kg。结论该方法简便，分离效果好，灵敏度高，重现性好。
【关键词】 气相色谱 凝胶渗透色谱 有机氯农药 中成药 残留量
有机氯类农药(OCPs)是一类高效广谱杀虫剂，广泛应用于杀灭农业害虫，曾是各国杀虫剂中使用最广泛的一大类。这类农药化学性质稳定，脂溶性强，残效期长，易在脂肪体内蓄积，造成慢性中毒，严重危及人体健康，中药材及中成药的农药残留问题近年来逐渐引起人们的重视。尽快建立中药中农药残留的检测方法及限量标准，对保证人们用药安全具有积极的意义。目前中药材中有机氯农药残留测定主要采用有机溶剂提取，浓硫酸净化，气相色谱分析。但因中药成分复杂，其中农药残留量属痕量范畴，这样使得农药的提取、分离、净化与富集的难度加大。凝胶渗透色谱作为一种自动化的分离技术在农药残留分析中得到了推广和应用［1～7］。本研究运用凝胶渗透色谱替代硫酸净化，有效地克服了硫酸净化回收率偏低的难题，建立的毛细管气相色谱分析方法，具有操作简便、分析速度快、分离效能高、检测灵敏度高等优点，适合于中成药中痕量有机氯农药的测定。
1 材料
Agilent 6890N 气相色谱仪，配备捕获检测器（μ-ECD），安捷伦GC工作站。GPC纯化系统：泵（Waters 515 HPLC Pump ），二极管阵列检测器（Waters 2996 PAD）， 自动馏分收集器（Waters Fraction Collector III），GPC纯化柱（Shodex CLNpak EV2000，20.0 mmID×300 mm），数据处理软件（Waters Empower），5 ml定量环。OV-1701毛细管色谱柱30 m×0.32 mmID×0.32 μm；R210旋转蒸发仪（瑞士BUCHI）；电子分析天平（R200D）。
丙酮、环己烷均为色谱纯（天津科密欧），二氯甲烷为分析纯（天津科密欧）。农药标准品：甲体-六六六（α- BHC）；乙体-六六六（β- BHC）；丙体-六六六（γ- BHC）；丁体-六六六（δ- BHC）；对对位滴滴依（PP`-DDE）；邻对位滴滴涕（OP-DDT）；对对位滴滴滴（PP`-DDD）；对对位滴滴涕（PP`-DDT）；五氯硝基苯（PCNB）。所用标准品由中国成都化学试剂生产，纯度大于99%。用甲醇分别配成0.1 mg/ml的单标储备液，再分别移取一定量的单标储备液于10 ml容量瓶中，用丙酮-环己烷（1∶4）混合液定容，配成混合标准液。
2 方法
2.1 样品的提取 准确称取仙灵骨葆胶囊样品（胶囊直接取其粉末即可，颗粒须经磨碎成粉末） 2.5 g于具塞锥形瓶中，加入10 ml水浸泡过夜或超声30 min，加丙酮30 ml超声30 min，加3 g氯化钠，振摇，再加30 ml二氯甲烷，超声30 min，静置1～2 h，取30 min上清液于100 ml浓缩瓶中，在50℃旋转蒸发浓缩近干，再加丙酮-环己烷（1∶4）混合液5 ml，重复2次，用丙酮－环己烷混合液定容至10 ml，4 000 r/min离心10 min待用。
2.2 GPC凝胶净化实验
2.2.1 GPC洗脱规律实验取5 ml一定浓度的农药混合标准液进样，用Waters 2996 PAD进行全波长扫描，以丙酮－环己烷（1∶4）混合液作流动相， 流量5 ml/ min，每毫升收集于一个试管中，收集30个，用氮吹近干，丙酮－环己烷定容至1 ml得到待测液1。同样在做成药洗脱曲线时，用带0.45 μl尼龙微孔滤膜的10 ml的注射器取样品提取液5 ml过GPC，其余同上，得到待测液2。
2.2.2 GPC净化取“2.1”项的提取液5.0 ml进样到GPC；保持流速为5 ml/ min，收集第15～26 min馏分。浓缩淋洗液，用丙酮－环己烷定容至5 ml待测，得到待测液3。
2.3 GC分析条件Agilent 6890N 气相色谱仪，配备捕获检测器（μ-ECD），ov-1701弹性石英毛细管色谱柱30 m×0.32 mmID×0.32 μm；进样口280℃，柱温220℃，检测器370℃，载气为高纯N2（纯度99.99%），柱前压105 KPa，柱流量1.5 ml/min，进样量1 μl，不分流进样。
3 结果
3.1 净化条件的确定馏分收集时间点的确定要充分考虑被渗透排除的机体组分与混合标准组分的分离情况和回收率。成药样品和农药混合标准经GPC净化后GC-ECD检测结果表明，收集第15～26 min的馏分，成药（仙灵骨葆胶囊，贵州同济堂制药有限责任公司生产）样品净化率可达70%，加标回收率为85%～115%，回收率满足痕量分析的要求，成药样品色谱图见图1。
3.506 min为α- BHC，3.77 min为PCNB，5.94 min为β- BHC
图1 成药样品GC-ECD色谱图
3.2 成药及9种有机氯农药的GPC流出规律GPC是根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应进行分离，大分子的油脂、色素(叶绿素、叶黄素)、生物碱、聚合物等先淋洗出来，农药及工业污染物等分子量较小，后淋洗出。GPC凝胶柱对成药以及9种有机氯农药的分离、净化效果进行如下试验。将待测液1分别用Agilent 6890N 气相色谱仪，电子捕获检测器（μ-ECD）检测出各段流出农药的含量，结果见图2。9种有机氯农药在凝胶渗透色谱柱上都是在第15～26 min时流出，但在第15 min仅有δ- BHC和第26 min有PCNB流出少量，所以，在样品基质较复杂的体系中，只需收集16～25 min，这可最大限度去除油脂等杂质的干扰，回收率达到85%～115%。将待测液2分别用Agilent 6890N 气相色谱仪，电子捕获检测器（μ-ECD）检测出各段流出液杂质的含量，结果见图3。成药流出液杂质（油脂、色素、生物碱等）在凝胶渗透色谱柱上是在第10～35 min流出，其中10～15 min时流出 50%的杂质，第15分钟收集的馏分在ECD上响应值最高，第900分收集的馏分在ECD上有响应。
图2 9种有机氯农药的GPC流出规律
图3 仙灵骨葆胶囊的GPC流出规律
3.3 标准工作曲线和方法学评价配制5个不同浓度的混合标准溶液，每个浓度重复3次，取峰面积平均值，得线性回归方程，见表1。有机氯农药标准品色谱图见图4。从表1得出，在一定的浓度范围内，9种有机氯农药的线性关系良好，线性关系系数r（0.998 9～0.999 7）。加标样品按3倍基线-噪声比计算9种有机氯农药的检出限。
3.4 回收率及精密度实验在2.5 g成药样品中加入3种不同浓度（添加水平见表2）有机氯混合标准液，按上述方法进行，同时做空白对照，回收率及相对标准偏差结果见表2，成药加标GC-ECD色谱图见图5。 表2 回收率与精密度测定结果
3.5 样品测定按照本文建立的方法，测定了贵州省出口潜力较大的3种中成药，农药残留测定结果见表3。结果表明，贵州中药有机氯农药的残留自实行中药药材规范化种植以来，中药中有机氯农药污染已得到了控制。表3 3种成药中有机氯农药的残留量mg·kg-1 H1-仙灵骨葆胶囊（批号：060428），贵州同济堂制药有限责任公司生产；H2-抗妇炎胶囊，贵州远程制药有限责任有限公司生产（批号：Z20025698）；H3-妇科再造丸（批号：Z20025056），贵州德昌祥药业有限公司生产。“-”表示未检出
4 讨论
本文以贵州出口中成药仙灵骨葆胶囊为样品，系统地研究了其提取液和有机氯农药的GPC流出规律，建立了仙灵骨葆胶囊中有机氯农药残留的测定方法，并成功地运用于其他中药的测定。建立的GPC净化，气相色谱测定中成药中有机氯农药残留量的方法具有自动化程度高，回收率和净化效率好等优点，适合于大部分中成药中9种有机氯农药的测定。但对于含糖组分较高的中成药，如糖浆类成药，本文建立的样品提取方法不适用，有待进一步研究。
参考文献
［1］ 刘咏梅，王志华，储晓刚. 凝胶渗透色谱技术在农药残留分析中的应用［J］.分析测试学报， 2005， 24(2)：123.
［2］ 刘咏梅， 王志华， 储晓刚. 凝胶渗透色谱净化-气相色谱分离同时测定糙米中50种有机磷农药残留［J］.分析化学，2005，33(6)：808.
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［4］ 曾凡刚.凝胶渗透色谱净化：气相色谱法测定牛奶中10种有机氯农药残留［J］.中国乳品工业，2006，34（5）：52.
［5］ 高梦南，王燕萍，唐红卫，等.凝胶渗透色谱净化在土样有机氯测定中的应用［J］.环境科学与技术，2006，29（3）：38.
凝胶渗透色谱范文第2篇
【关键词】天然药物；强极性化学成分；亲水作用色谱；反相色谱；高速逆流色谱
长期以来，由于条件的限制和方法的不成熟，对天然产物化学成分的研究多局限于脂溶性成分，关于天然药物中非极性、低极性化合物的分离纯化均有相关专著，然而根据传统用药习惯，天然药物大多用水煎服，许多有效成分如生物碱、有机酸、多糖类等都较亲水，极性强。强极性化合物的分离一直是天然产物分离工作中的难点之一，本文综述了天然药物中各类亲水性、强极性化学成分的分离纯化技术，归纳各类强极性化学成分分离纯化方案，以期系统、快速、有效的提取、分离纯化以及制备高纯度的天然化合物，为全面研究天然药物化学成分提供一定的参考。
一、层析分离
层析分离是一种经典的传统分离手段，具有分离效能高，快速简便等特点，被广泛用于黄酮类、生物碱、挥发油、蒽醌类等天然产物中化合物的分离和纯化。根据分离机理，大致可以将强极性化学成分分离层析方法归纳为以下几种。
1．亲水作用色谱。亲水作用色谱（Hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）是采用极性固定相、高含量极性有机溶剂－水相缓冲液为流动相的一种分离技术，它能有效地保留反相色谱中保留弱或者不保留的强极性化合物。HILIC作为一种分离极性化合物的液相色谱模式，其概念最早是由Alpert于1990 年提出。其主要特征是使用类似于正相色谱的极性固定相和水/有机溶剂流动相与正相色谱类似，在HILIC模式下化合物的保留时间随化合物极性的增强而增加。但是，由于HILIC使用含水流动相，这就可以解决正相色谱中水溶性物质不溶于流动相的问题。近年来随着强极性化合物的分离问题引起了各个研究领域的重视及HILIC自身的优势，使得HILIC逐渐引起人们的关注。Min Liu等以Atlantis HILIC 硅胶住为固定相，乙腈/50mM甲酸铵为流动相，调pH3，梯度洗脱，成功的分离强极性化合物2-氨基咪唑（2-AMP）及其类似物3-AMP、4-AMP。
2．反相色谱。反相色谱是以表面非极性载体为固定相，而以比固定相极性强的溶剂为流动相的色谱分离模式。天然产物化合物的分离常用的反相层析柱固定相为十八烷基（ODS）。ODS反相柱可减少死吸附，有效的实现中到大极性化合物的分离。日本学者Shiji Yahara采用反复硅胶柱层析和ODS层析对新疆一枝蒿Astragalus shikokianus 40%甲醇洗脱物进行化学成分分析，得到黄酮苷astrasikokioside I。ODS柱对于极性较大的糖苷类化合物具有很好的吸附与解吸能力。多用于正丁醇部位、水部位化学经大孔树脂、硅胶等粗分后所得组分细分时所用材料。
3．正相色谱。正相色谱是采用极性固定相和相对非极性流动相，由于极性化合物更容易被极性固定相所保留，所以正相液－液色谱系统一般可用于分离极性化合物，化合物保留时间随着极性的增强的加长。主要用于分离甾醇类、类脂化合物、磷脂类化合物、脂肪酸以及其他有机物。A.E. Borgund采用正己烷、二氯甲烷、甲醇混合溶剂为流动相，正相液相色谱模式分离、富集油中的有机酸，建立的方法既可以用于分离，也可以用于制备。正相色谱虽然多用来分离弱极性或非极性的烃类化合物，但条件适当，可用于分析分离苷类化合。
4．凝胶过滤色谱。凝胶色谱也叫凝胶渗透或分子筛过滤。固定相是具有一定大小孔径的多孔凝胶制成。各组分在柱内的保留时间和从柱中流出的次序决定于分子的大小，分子量大、体积大的，不能进入凝胶颗粒内部而被排阻在凝胶粒子外部，只能在颗粒间移动，较早地被溶剂冲出来，因此大分子首先从柱底流出，分子量小、体积小的化合物可自由渗入微孔扩散到凝胶颗粒内部，故通过色谱柱时阻力增大，流速变慢，最后从柱底流出，因此，各组分在凝胶柱色谱被洗脱出柱的先后顺序基本是按分子大小排列的，不受化合物极性大小的限制，故可用于强极性化合物的分离纯化。天然产物化合物分离中，用的较多的是Sephadex LH-20。在国外，很多学者采用凝胶进行分段，国内很多实验室Sephadex LH-20 用于除去色素和最后的细分。
二、高速逆流色谱
高速逆流色谱（High-speed counter current chromatography，HSCCC）是利用溶质在两相无不相容的溶剂系统中分配系数的不同，从而进行分离的色谱法。由于其无不可逆吸附，回收率两大特点，逆流色谱从逆流分配、液滴逆流色谱到现在的HSCCC历程十年，技术和设备日臻成熟，受到不同学者的关注，广泛用于中药及天然产物的研发。HSCCC在天然产物分离中成功应用在于两相溶剂系统的选择和优化。当前，HSCCC广泛的被用于分离生物碱类、黄酮类、蒽醌类等化合物。
三、膜分离技术
膜分离技术是现代分离技术领域先进的技术之一，使用膜技术(包括半透膜、超滤膜、微孔滤膜、反渗透膜等)可以在原生物体系环境下实现物质分离，可以高效浓缩富集产物，有效去除杂质。超滤法是上世纪六、七十年展起来的一种膜分离技术，是以超滤膜作为分离介质的一种膜分离技术，具有分离不同分子量分子的功能。超滤法的工作原理是含有两种或两种以上溶质的溶液，通过滤膜分离流动时，其中分子体积小的溶质，经滤膜流出，而分子体积较大的溶质，不能通过滤膜而被截留；含有一种溶质的溶液，通过滤膜可将溶质全部截留，经滤膜流出的是纯净的溶剂。超滤法的特点是有效膜面积大，分离效率高，滤速快，不易形成表面浓度极化现象，无相态变化，能耗小，可在常温下进行操作，对分离热敏性、保味性的药物更为适用。这种分离方法应用于中药有效成分的分离纯化中已显示出极大的优越性，以超滤为代表的膜分离技术曾被列为医药领域国家“八五”重点科技项目，目前，国家中医药管理局又将膜分离技术列为“十五”新药研究研发中的支持项目，相信此技术将有良好的应用前景。
四、小结与展望
天然产物开发及新药的发现经常要面对化学成分的分离问题，天然产物的化学成分极其复杂，要获得大量高纯度的单一有效成分，常要综合性地利用各种溶剂提取法及层析方法。所有的层析方法包括亲水作用色谱、反相色谱、正相色谱、凝胶色谱（Sephadex LH-20）、高速逆流色谱、膜分离，均具有选择性高、载量大、有机溶剂用量少等特点。利用这些层析纯化概念，希望能够更系统、快速、有效的提前、制备天然产物中亲水性、强极性化合物。
综上所述，纵然各种方法在天然产物开发中取得了很好的效果，但由于天然产物种类繁多，性质各异，必须针对各类甚至各个化合物的性质综合考虑提取、分离、纯化中的各个环节。针对不同的化合物性质制定特异性的分离方案，结合现代化的分析手段与药效学评价，阐明化合物结构与药效之间关系，才能更好的开发更多的具有价值的先导化合物。
参考文献
凝胶渗透色谱范文第3篇
【关键词】 高效凝胶色谱法； 多花黄精多糖； 分子量及其分布
多花黄精多糖是从传统中药百合科植物多花黄精中发现并分离出一种低分子量活性多糖，为新药(中药)原二类,全国第一个治疗病毒性角膜炎的中药。多花黄精多糖抗单纯疱疹病毒i型的体外细胞培养试验结果结果表明,多花黄精多糖有明显的抗单纯疱疹病毒i型的作用。多糖为单糖的天然聚合物，多糖的性质和药理作用与其分子量大小，分子量分布及其结构密切相关。多糖的分子量不是均一的，具多分散性，需要用统计方法表征其平均分子量及其分子量分布。高效凝胶色谱法测定多糖的分子量及其分布，具有快速，重现性好等优点，在国内外得到了广泛的应用[1]。多花黄精多糖为水溶性多糖，针对其单糖组成和空间结构与葡聚糖相似，在色谱柱的选择上倾向于更适合于水溶性多糖分离测定用的shodex ohpak sb803hq系列（对葡聚糖的排阻极限为1×105）。有关多花黄精多糖的平均分子量及其分子量分布尚未见相关报道，本文应用凝胶渗透色谱（gpc）法测定多花黄精多糖的平均分子量及其分子量分布[2]，为考察生产工艺的稳定一致性及控制产品质量提供了科学依据，为多花黄精多糖分子大小和药理作用的相关性研究打下了一定基础。
1实验部分
1.1仪器与试药
agilent 1100型高效液相色谱仪（自动进样器），示差折光检测器。shodex ohpak sb803hq凝胶色谱柱。北京龙智达公司提供gpc专用软件。
供分子量测定用右旋糖酐分子量标准对照品（中国药品生物制品检定所提供，d0、d1、d2、d3、d5、d6、d8、d2000分子量依次为180、2500、4600、7100、21400、41100、133800、2000000）；其余试剂均为分析纯；高纯水用milliporeq超纯水系统制得。
试验用样品多花黄精多糖由四川泰华堂制药有限公司提供。
1.2方法与结果
1.2.1色谱条件色谱柱为shodex ohpak sb803hq，流动相为0.71%硫酸钠溶液（内含0.02%叠氮钠），柱温：35 ℃，示差折光检测器（检测器温度35 ℃），流速0.5 ml·min－1，取供试品溶液及对照品溶液各20μl注入液相色谱仪。
1.2.2溶液的制备取多花黄精多糖适量，加流动相制成每1 ml中约含10 mg的溶液，振摇，室温放置过夜，作为供试品溶液。另取d0，d2000及4～6个已知分子量的葡聚糖对照品，同法制成每1ml中各含10 mg的溶液作为对照品溶液。
1.2.2.5系统适应性试验取葡萄糖对照品溶液（d0），按1.2.1的色谱条件进样，纪录色谱图，按葡萄糖峰计算理论塔板数n=5.54×trw1/2=16083；另取d2000对照品溶液，1.2.1的色谱条件进样，纪录色谱图，计算分配系数，kd=trt0ttt0=0.52，kd在0～1之间，符合中国药典2005年版的要求。式中tr为供试品峰保留时间，t0为蓝色葡聚糖（d2000）峰保留时间，tt为葡萄糖（d0）峰保留时间。
1.2.3标准曲线的制备及样品测定
取上述右旋糖酐系列对照品溶液分别进样，记录洗脱峰的保留时间，由gpc专用软件绘制标准曲线，以标准分子量的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性回归，得回归方程。该方法的标准校正曲线线性良好，相关系数达0.9997。根据gpc专用软件绘制的标准曲线及供试品的保留时间采用gpc专用软件计算样品各组分的重均分子量及其分子量分布。 表1 右旋糖酐分子量标准对照品保留时间及其相应的对数值
1.2.4 精密度试验取供试品溶液20 μl，按“1.2.1”项下色谱条件，连续测定5次，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5018，5009，5009，5028，5017，rsd为0.16%，表明该系统测定样品分子量的精密度良好。
1.2.5重复性试验取批号为060701的样品，按“1.2.2”项下方法分别制备供试品溶液5份，按“1.2.1”项下色谱条件测定分子量及其分子量分布，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5020，5028，5044，5054，5053，rsd为0.30%。表明该分析方法测定样品分子量精密度良好。
1.2.6稳定性试验取同一供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件，在0h、2h、4h、8h、12h和24h分别进样，测定分子量及分子量分布，根据gpc曲线计算重均分子量（mw）分别为5055，5090，5100，5126，5160、5046，rsd为0.84%。表明供试品溶液在24小时内稳定。
1.2.7样品的测定取不同批号的多花黄精多糖样品，按“1.2.2”项下的方法制备供试品溶液，然后按“1.2.1”项下的色谱条件测定分子量及分子量分布，结果见表2。表2 3 批样品重均分子量及其分布情况表
2讨论
根据以上测定结果可见，测定的三批多花黄精多糖的重均分子量分布在2500～7500之间，分布宽度小于2.0。用本方法测定多花黄精多糖的分子量与分子量分布，准确可行，简便快捷，精密度好。
分布宽度的引入，使多花黄精多糖的分子量分布更具可控性，能够通过检测该指标反映生产该样品的工艺的变化以及样品质量的变化，使得样品的质量更具有可控性。
凝胶渗透色谱范文第4篇
关键词：高效液相色谱法 发展 优势 劣势 发展 应用
高效液相色谱法使用的流动相是液体，应用高压输液装置，将具有不同极性的单一溶剂或者不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相压进装有固定相的色谱柱中，各种成分在柱内分离以后，然后进入检测器被检验，最后对试样进行分析。
一、高效液相色谱法的发展
1.高效液相色谱法的历史
色谱分析法的一个分支就是高效液相色谱法，在20世纪60年代末期，以气相色谱法和经典液相色谱发为基础，形成的一种新的分离和分析技术。到了1960年，随着气相色谱法理论和实践的不断发展，同时光学、机械、电子等技术也在不断发展，液相色谱法逐渐被相关学者使用。到了20世纪60年代末，高效液相色谱发就应用高压泵和化学键合固定相。
2.高效液相色谱法和其他色谱法的比较
2.1高效液相色谱法和经典液相色谱的比较
经典液相色谱法使用的是粗粒多孔固定相，将固定相装在口径大、较长的玻璃柱管内，流动相只能通过重力流过色谱柱，溶质在固定相的传质和扩散的速度都很慢，因为柱的入口压力很小，导致柱子的效果很差，在很大程度上增加了分析时间。而高效液相色谱法使用的固定相是全多孔微粒，将固定相装在口径小、短的不锈钢的柱子内，流动相通过高压输液泵进入了柱压很大的色谱柱中，在固定相中，溶质的传质和扩散速度都很快，所以在很多的时间内，柱子的效率和分离能力都很好。
2.2和气象色谱法的比较
高效液相色谱法和气象色谱法相比有很多的类似之处。气象色谱法的选择性很高、分析效率也不低，同时还具有很高的灵敏度和分析速度，可是这种分析方法只能对那些蒸气压低和沸点低的样品进行分析，对于那些高沸点的有机物、具有不高稳定性的化合物、高分子物质和生物活性物质来说，这种方法就行不通了。经过分析，只有20%的有机化合物可以使用气象色谱法进行分析。可是对高效液相色谱法来说，就能分离和分析剩余的80%的有机化合物。
二、高效液相色谱法的综合分析
1.高效液相色谱法的有适合劣势
高效液相色谱法和其它分析方法相比具有很高的分辨率，为了达到最佳的分离效果可以选择流动相和固定相；同时它的分析速度很快，一般只需要几分钟或者即使分钟；它还具有很高的重复性，使用的样品还可以回收；它使用的色谱柱还可以重复使用，非常环保；具有较高的自动化程度，在进行分析时，分析的精确度也很高。所以高效液相色谱法被广泛应用，尤其是对大部分的有机化合物进行分离和分析，在分离和分析高沸点、极性强、大分子、热稳定差的化合物时有很大的优势。
可是高效液相色谱法需要很高的压力，一般要达到150～350×102 KPa。同时如果流动相的配比在进样器、柱接头、连接管和检测池等发生任何变化，或者被分离的物质发生扩散或者滞留的现象都会加宽色谱峰，降低柱效率。
2.对高效液相色谱法的分类
由于分离机制不同，高效液相色谱法可分为以下几类。（1）吸附色谱。这种方法的固定相是固体吸附剂，流动相是不同极性溶剂，根据各个组分在吸附剂上的吸附能力不同对其进行分离。（2）分配色谱。这种方法的固定相是液体。因为每一个组分在固定相中的溶解能力不同，对试样中的组分进行分离。（3）亲和色谱。这种方法主要是对固定相的结合特性进行利用，然后将分子分离。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接和有待分离的物质有一定结合能力的分子，同时这种结合是可逆的，在对流动条件进行改变时，也能对其进行分离。（4）离子交换色谱。这种色谱的固定相是离子交换剂，将离子交换树脂上可电离的离子和流动相中的具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，因为这些离子和交换剂的亲和能力不同，就会分离开来。（5）体积排阻色谱。这种色谱的固定相是具有化学惰性的多孔性凝胶，固定相对各组分的体积阻滞作用不同，这样各组分就会发生分离。因为流动相的不同又可分为凝胶过滤色谱和凝胶渗透色谱。
三、高效液相色谱法的应用
1.高效液相色谱法的应用范围
对于那些高沸点不易挥发、热稳定性差的、高分子的、具有不同极性饿有机化合物，生物活性物质和各种天然的物质，高效液相色谱法都能对其进行分离和分析。这些物质在食品、合成药物、石油化工产品、生物化工产品等方面都有应用，其中在这些方面应用的无机物中占20%，在这些方面应用的有机物中占80%，特别是那些永久性气体、易挥发的、具有中等分子量的化合物都能进行分析。
2.高效液相色谱法应用的限制
首先高效液相色谱法使用的流动相是多种溶剂，同时使用这种方法进行分析需要的成本比气象色谱法高，对环境也会产生污染。特别是在进行不同浓度的操作时，还要对其进行洗脱，操作起来比气象色谱法复杂。同时，这种方法使用的检测器不是通用的，和气象色谱相比就处于劣势了。可是这几年蒸发激光散射检测器逐渐被应用，很有可能成为高效液相色谱法分析时一种通用的检测器。还有就是，高效液相色谱法是不可能取代气象色谱法的，因为对于组成复杂、具有多种沸程的石油产品来说，它需要柱效达到10万块塔板和毛细管气相分析发分析。最后，这种方法也无法取代中、低压柱色谱法。在柱压从200千帕升到到1兆帕时，具有生化活性的生化样品收到压力容易分解、变性。
四、结束语
高效液相色谱法是在气象色谱和液相色谱的基础上发展的，同时发展也很快，因为这种方法操作简单，结果准确、效率高，当前，在各个方面的应用也非常广泛。可是这种方法也有缺陷，所以要不断的对其进行完善，使其变得更加快捷精准。
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凝胶渗透色谱范文第5篇
[关键词] 复方南星止痛膏；凝胶膏剂；透皮吸收；水杨酸甲酯；透皮促进剂；丁香酚
[收稿日期] 2012-10-11
[基金项目] 中药制药过程新技术国家重点实验室开放基金项目（SKL2010M0302）；北京中医药大学复方中药制药研究创新团队项目（2011-CXTD-13）；北京中医药大学自主选题项目（2011JYB22XS-063）
[通信作者] *杜守颖，教授，博士生导师，主要从事中药新剂型与新技术研究，Tel：（010）84738615，E-mail：
[作者简介] 黎迎，硕士研究生，E-mail： 复方南星止痛膏的处方由丁香、肉桂、白芷、川芎等中药组成，具有散寒除湿、活血止痛的作用。临床上用于寒湿瘀阻所致的关节疼痛，肿胀，活动不利，遇寒加重，舌质暗淡或瘀斑[1]。凝胶膏剂属于中药经皮给药制剂，具有载药量大，透皮效果好，对皮肤无刺激等优点。国际上常用的促渗剂有亚砜类、吡咯酮类、月桂氮酮类、表面活性剂类等10多种，其中有些促渗剂的毒副作用较大，该制剂处方含有樟脑、冰片、水杨酸甲酯等挥发性成分，文献报道冰片[2-4]、樟脑[4]不仅本身具有的杀菌、消炎、止痛、镇痛的作用，而且对药物的透皮吸收具有促进作用，起到了药辅合一的效果。本研究通过考察复方南星止痛凝胶膏剂的体外透皮情况，并与不含水杨酸甲酯的凝胶膏剂进行比较，探讨水杨酸甲酯在处方中的促渗作用，为临床使用和优化复方南星止痛膏处方提供实验依据。
1 材料
高效液相色谱仪（日本岛津公司，包括LC-20AT泵，VWD检测器，LC Solution色谱工作站）；Sartorius BS 110S型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；TP-5智能透皮试验仪（南京红蓝电子科技有限公司）；SHB-III型循环水式多用真空泵（上海振捷实验设备有限公司）。丁香酚（中国食品药品检定研究院，批号10719-200613）；复方南星止痛凝胶膏剂（自制）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团）；甲醇（色谱纯，Promptar公司）；冰醋酸（色谱纯，美国FISHER公司）；PEG-400（天津市光复精细化工研究所）；氯化钠（西陇化工股份有限公司）；其他试剂均为分析纯。CD-1裸鼠，体重15～18 g，由维通利华实验动物中心提供[SCXK（京）2012-0001]。
2 方法与结果
2.1 含量测定方法的建立
本试验以丁香酚作为复方南星止痛贴膏剂的指标成分，建立了测定体外透皮后接收液，皮中及剩余膏中丁香酚的HPLC检验方法。
2.1.1 色谱条件 Merck RP-18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以1%冰醋酸溶液-甲醇（54∶46）为流动相，流速1 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长280 nm。色谱图见图1。
2.1.2 对照品溶液的制备及线性试验 精密称取丁香酚对照品适量，加甲醇制成每1 mL含丁香酚
A. 对照品；B. 接受液样品；C. 膏处理样品；D. 皮肤处理样品；E. 空白接收液；F. 空白皮；1. 丁香酚。
图1 复方南星止痛贴膏剂有效成分HPLC图
Fig.1 HPLC chromatograms of index compositions of compound Nanxing pain paste cataplasm
0.091 6 mg的对照品溶液，分别进样0.2，0.5，1，5，10，20，30，40 μL，进行色谱分析；以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，计算回归方程。 Y =1.00×106 X-10 866， r = 0.999 9。结果表明，丁香酚在0.018～3.66 μg线性关系良好。
2.1.3 精密度试验 取上述对照品溶液，精密吸取对照品溶液20 μL重复进样6次，计算RSD。丁香酚峰面积的RSD为0.69%，表明仪器精密度良好。
2.2 体外透皮吸收实验[5-7]
2.2.1 离体鼠皮的制备 裸鼠脱颈椎处死，取下腹皮，用干棉花将脂肪及黏液组织擦试干净，置于-20 ℃冰箱中保存，实验时取出，室温下自然解冻。
2.2.2 实验方法 采用TP-5智能透皮试验仪，Franz扩散池，上室为扩散室，下室为接收室，扩散池容积为7 mL，有效扩散面积为2.80 cm恒温水浴加热，温度（37±0.2） ℃。实验时，接收室加满释放介质（含有30%PEG-400的生理盐水），将裸鼠皮附在接收室上，再将贴膏贴于裸鼠皮上，使其背衬层朝向扩散室，将其固定在两室之间，排除气泡。磁搅拌转速设定为300 r·min-1，在设定的时间点1，2，4，6，8，10，12，24 h精密移取接收液0.4 mL，同时补加同样体积的新鲜接收液。过滤进行含量测定。
2.2.3 体外透皮吸收实验结果 根据以下公式计算体外累积透皮率（ Q %）及单位面积累积透过量（ m/A ），以6组数据平均累积体外透皮率对时间作图，结果见图2；以单位面积累积渗透量 m/A 对时间 t 进行线性回归得方程 m/A = Js× t +B，所得斜率 Js即为稳态渗透速率（μg·cm-2·h-1），2种复方南星止痛凝胶膏剂中丁香酚透皮吸收相关参数见表1。公式中， V 为接收室中接收液的体积（mL）； V S为取出接收液的体积（mL）； C n为第 n 个取样点测得的接收液中药物浓度（g·L-1）； W 为贴膏剂中所含药物的量（mg）； A 为药物有效扩散面积（cm2）。
Q %=（ VCn + n-1 i =1 V sCi ）/ W ×100
m/A =（ VCn + n-1 i =1 V sCi ）/ A
图2 2种凝胶膏剂中丁香酚累积透过率-时间曲线图
Fig.2 The curve of cumulative permeation percentage-time of eugenol in two kinds of cataplasm
采用统计软件分别对含水杨酸甲酯和不含水杨酸甲酯凝胶膏剂中丁香酚24 h累积透过率和稳态渗透速率进行统计学处理， t 检验分析结果表明，两者的丁香酚24 h累积透过率和稳态渗透率之间差异均具有显著性（ P
表1 2种凝胶膏剂中丁香酚透皮吸收相关参数（ n= 6）
Table 1 Parameters relevant to TDD absorption of eugenol in two kinds of cataplasms （ n= 6）
2.4 膏中残留量的测定
2.4.1 膏中残留量的测定方法 体外经皮渗透试验结束后，揭去制剂，将膏从衬布上刮下，加入3倍量硅藻土将膏研磨均匀后，放入锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，超声处理40 min，冷却到室温，再称定质量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，得供试品溶液，进行含量测定。
2.4.2 膏中残留量和残留率的测定结果 分别将2种复方南星止痛凝胶膏剂的6组试验结果取平均值，结果见表3。
表3 膏中残留量和残留率结果（ ±s，n= 6）
Table 3 Results of retention amount and retention rate in cataplasms（ ±s，n= 6）
3 讨论
实验结果表明，复方南星止痛凝胶膏剂体外渗透作用时间较长，可减少用药次数，提高患者顺应性。在透皮过程中，有效成分一部分透过皮肤进入血液循环，一部分残留于凝胶膏剂中，另一部分滞留于皮肤上，但皮中滞留量很低，当揭掉制剂后，不会对身体产生影响。
由于测定累积透过率、皮中滞留率、膏中残留率的样品需要分别制备、测定，且测定皮肤滞留率和膏中残留率的样品需要经过比较复杂的处理过程，因此产生的测定误差使三者之和不等于100%。但是2种凝胶膏剂中有效成分总体回收率均在90%～110%，符合了一般样品测定的要求。
药物的透皮吸收过程分为3个阶段：药物从基质中释放，药物穿透角质层屏障，药物通过表皮和真皮被血管吸收。皮肤是主要的限速因素，增加药物透皮吸收是提高血药浓度的关键。实验结果表明，水杨酸甲酯能促进药物透皮吸收，水杨酸甲酯属芳香酯类化合物，是外用制剂中常用的药物，具有强烈的嗅味，其促渗机制可能在于能增加皮肤的类脂流动性来促进丁香酚的经皮渗透；也可能使脂质分子层产生扭转效应，形成微孔，增加药物通过角质层的渗透性。水杨酸甲酯既为处方中的药物，具有消炎、抗菌、止痛等多种药理作用[10]，同时可作为促渗剂，具有促渗的作用，对提高药物使用率，节约药物资源，提高用药经济性都有重要意义。本研究为复方南星止痛膏处方及剂型研究提供了参考。
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Study on transdermal characteristics of compound Nanxing pain-relieving
cataplasm and effects of gaultherolin in prescriptions
LI Ying， DU Shou-ying LU Yang， BAI Jie， WANG Ying-zi， WANG Yue， XING Yu-shu， XIAO Wei2， 3
（1.Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；
2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；
3. State Key Laboratory of New Pharmaceutical Technology of Traditional Chinese Medicines， Lianyungang 222001， China）
[Abstract] Objective： To study transdermal absorption characteristics of eugenol in compound Nanxing pain-relieving cataplasm， and discuss the effect of gaultherolin on the transdermal absorption of the cataplasm. Method： The improved franz diffusing cell was adopted with hairless mice skins as transdermal carriers. The content of eugenol in receptor liquid， skins and cataplasm were analyzed by HPLC and compared with the cataplasm without gaultherolin. Result： The penetration rates of eugenol of cataplasms with and without gaultherolin were 13.18 and 9.58 μg·cm-2·h-1， with the retention amount in skins of （185.02±19.23） and （160.23±16.54） μg·g-1 and the retention amount in cataplasms was （1.96±0.12） and （1.71±0.15） mg， respectively. Conclusion： Eugenol in compound Nanxing pain-relieving cataplasm has good pereutaoeous permeation. Gaultherolin in the cataplasm prescription can promote the absorption of eugenol.
