上皮细胞

前言：想要写出一篇令人眼前一亮的文章吗？我们特意为您整理了5篇上皮细胞范文，相信会为您的写作带来帮助，发现更多的写作思路和灵感。

上皮细胞范文第1篇

放射性口干症是头颈癌放疗的常见并发症，可导致唾液腺分泌功能的减弱或丧失，引起口干、继发龋、长期慢性黏膜炎症、吞咽困难以及营养不良等症状［1］。本课题采用双室共培养系统，将人羊膜上皮细胞(humanamnioticepithelialcells，hAECs)与SD大鼠下颌下腺腺泡细胞(submandibularglandacinarcells，SMGCs)进行体外共培养，研究hAECs的诱导分化，为唾液腺功能障碍性疾病的干细胞治疗寻找细胞来源。

1材料和方法

1．1材料无菌采集经产妇本人知情同意的健康足月剖宫产胎盘;8d龄SD大鼠;DMEM/F12培养基、LG-DMEM培养基、胎牛血清(FBS)(Gibco，美国)，表皮生长因子(EGF)，Transwell(CorningInc，catNO．3450)，小鼠抗大鼠角蛋白单克隆抗体(keratin19Ab-1)(NeoMark-ers)，小鼠抗人CK19单克隆抗体(GeneTech，China)，小鼠抗人淀粉酶单克隆抗体(Amylase-G10)(SantaCruz，USA)，两步法抗小鼠或兔通用型免疫组化试剂盒(DakoCytomation)，TotalRNA提取试剂盒、SYBRPrimesciptRT-PCRKit(宝生物工程有限公司)。

1．2SD大鼠下颌下腺细胞的分离、培养［2－4］、鉴定取8d龄SD大鼠原代培养SMGCs，常规传代、鉴定。取第2代生长状态良好的SMGCs用于下一步共培养实验。

1．3人羊膜上皮细胞的分离、培养［5－6］、鉴定机械法剥离胎盘上的羊膜组织，清除表面的血迹，0．05%的胰蛋白酶－0．02%EDTA-2Na37℃消化3次，每次30min。加血清终止胰酶反应，合并3次收集的细胞悬液筛网(200目)过滤后低速离心，弃上清，收获细胞沉淀即为hAECs。上述分离的hAECs加入培养基(LG-DMEM，10%FBS，2mmol/LL-谷氨酰胺，10ng/mlEGF，100U/ml青霉素，0．1mg/ml链霉素)，按5×105/cm2的细胞密度接种，置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，及时传代。免疫荧光法检测后取第2代状态良好的hAECs用于下一步共培养实验。

1．4人羊膜上皮细胞与大鼠下颌下腺细胞的共培养选用微孔膜孔径为0．4μm的6孔Transwell培养板(图1)，每板4孔为实验组，其余2孔为对照组。首先将第2代的hAECs以2×104/孔接种于Transwell下层，贴壁24h后，将SMGCs以8×104/孔接种于Tran-swell上层的生物膜上，共培养采用腺细胞专用培养基(DMEM/F12，10%FBS，2mmol/L-谷氨酰胺，10ng/mlEGF，100U/ml青霉素，0．1mg/ml链霉素)。对照组上下2层均为hAECs。上下2种细胞间不能接触，但共用培养基，分泌的细胞因子可相互影响。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，每隔3d换液1次。

1．5共培养系统的评价

1．5．1共培养前后的形态学观察共培养开始后，于倒置显微镜下观察细胞的形态变化。

1．5．2免疫细胞化学检测分别于共培养后1、2周，按照试剂盒说明书进行各组细胞的抗淀粉酶免疫细胞化学检测。

1．5．3实时荧光定量RT-PCR检测按试剂盒说明书提取共培养1、2周的人羊膜上皮细胞总RNA。按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。α-淀粉酶引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成，上游引物:5＇-CATAAGGATGAGCAAGCATAAATC-3＇，下游引物:5＇-TCGCAAGTGGAATGGAGAG-3＇，扩增产物大小203bp;内参GAPDH的引物序列由TaKaRa生物公司设计合成，上游引物:5＇-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3＇，下游引物:5＇-TGGTGAAGACGCCAGTGG-3＇，扩增产物大小138bp。反应体系如下:SYBRPremixExTaqTM(2×)10μl，上游引物F(10μmol/L)1μl，下游引物R(10μmol/L)1μl，cDNA2μl，ddH2O6μl。反应条件为:95℃10s预变性，然后95℃5s，60．2℃20s重复40个循环，55℃10s84个循环。反应结束仪器自动生成CT值及熔解曲线图。每个样本设4个重复管。将PCR产物作熔解曲线分析，并进行1%琼脂糖凝胶电泳，确定产物特异性。

1．6统计学处理使用SPSS13．0软件，采用单因素方差分析，数据用x珋±s表示，P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1SD大鼠下颌下腺细胞的鉴定

2．1．1SD大鼠下颌下腺细胞形态学特征原代培养第5天可见组织块周围有典型的上皮细胞游出，第8天细胞较多，显微镜下观察呈圆形或椭圆形，鹅卵石样排列(图2A)。

2．1．2SD大鼠下颌下腺细胞免疫学表型免疫细胞化学结果显示，第2代SD大鼠SMGCs表达CK19(图2B)、α-淀粉酶(图2C)，不表达波形蛋白。

2．2人羊膜上皮细胞的鉴定

2．2．1人羊膜上皮细胞形态学特征hAECs原代培养48h后，有少量细胞贴壁，第3天以后贴壁细胞数量迅速增多，形态多为卵圆形和三角形，传代培养的hAECs形态变化不大，呈铺路石样排列(图3A)。

2．2．2人羊膜上皮细胞免疫学表型免疫荧光染色结果显示，第2代的hAECs表达CK19(图3B)，不表达波形蛋白(图3C)，对照组结果阴性。

2．3共培养系统的评价

2．3．1共培养后的人羊膜上皮细胞形态学特征共培养后显微镜下观察显示hAECs胞质中分泌颗粒逐渐增多，而对照组未见明显变化(图4)。

2．3．2共培养前后人羊膜上皮细胞α-淀粉酶表达免疫细胞化学结果显示，共培养前后hAECs均表达α-淀粉酶，共培养后胞质中α-淀粉酶阳性信号表达增强(图5A、B)，对照组未见明显变化，用PBS替代一抗的对照组未见阳性信号(图5C)。2．3．3共培养前后hAECs中α-淀粉酶mRNA表达量共培养前后hAECs中α-淀粉酶基因和内参基因GAPDH的mRNA表达均以CT值表示，各组α-淀粉酶基因的mRNA相对表达量为2^-CT。单因素方差分析结果显示:共培养1、2周后hAECs中α-淀粉酶mRNA相对表达量均高于共培养前，其表达量分别增加至共培养前的3．38倍、6．60倍(P＜0．05)(图6)。

上皮细胞范文第2篇

近年来研究发现，晶状体上皮细胞（LEC）凋亡在白内障的发生中具有重要的作用，并发现多种基因参与调控LEC凋亡。本文总结了该方面的研究进展，希望为研究白内障形成机制和防治方法提供新的依据和参考。

1 LEC凋亡的形态学特点

细胞凋亡（apotosis）或称程序性细胞死亡（pragrammed cell death，PCD），是受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，是生物体中一种普遍存在的现象。Li[1，2]等用透射电镜观察正常及白内障患者晶状体上皮细胞超微结构时发现：正常晶状体上皮细胞形态规则，细胞膜结构清晰，相邻细胞及晶状体囊皮细胞结合紧密，细胞质及染色质均匀无凝缩。白内障患者晶状体上皮细胞可见凋亡细胞。这些凋亡细胞与相邻细胞及晶状体囊膜疏松结合，细胞外形不规则、扭曲，进而微绒毛消失，以出芽的方式形成有膜包被的凋亡小体。从而提出了LEC凋亡是除先天性白内障以外的所有类型白内障形成的细胞学基础。Michael等[3]用紫外线照射活体鼠24 h后用透射电镜观察鼠LEC，发现部分上皮细胞形成特征性膜胞质小体即凋亡小体。说明LEC的凋亡参与了辐射性白内障的形成。

2 LEC凋亡的生物化学特征

1980年，Wyllie首次报道小鼠胸腺细胞发生凋亡时其DNA琼脂糖凝胶电泳呈现特征性“梯状”条带(ladder)，这一现象成为PCD的典型特征。Takamura等[4]用DN段分析的方法对白内障LEC凋亡进行研究中亦发现了“梯状”条带。Marian等[5]通过实验证实晶状体上皮细胞的凋亡在白内障的形成之中是通过Ca2+途径激活的。Malina等[6]用黄尿酸诱导体外培养的人LEC发生凋亡时，发现凋亡细胞离Ca2+浓度升高，并随着黄尿酸浓度的升高，细胞内游离Ca2+的浓度也升高。Ghafourifar等[7]研究表明，线粒体内部存在依赖Ca2+的NO合酶(NOS)，线粒体吸收Ca2+后激活NOS，线粒体膜发生脂质过氧化(LOP)，细胞色素C释放，诱导细胞凋亡。

3 LEC凋亡的基因调控

研究发现目前有20余种基因与PCD有关，按基因表达产物对凋亡过程的作用分为2类：（1）促进凋亡的基因，如c-myc、p53、c-Jun、c-fos和Bcl-xs等；（2）抑制细胞凋亡的基因，如bcl-2、bc1-xl、Mc1和MyD16等。但关于PCD的确切机制尚不十分清楚。

3.1 bcl-2：bcl-2是一个家族基因，bcl-2、bcl-xl和bax是该家族的重要成员，它们主要通过线粒体途径参与凋亡调控，当细胞受到死亡信号刺激，与Bcl-2或Bcl-xl蛋白相结合的Bax蛋白就会被置换出来，线粒体膜通透性增加，释放出一系列物质，最终导致细胞死亡。Bcl-2在正常晶状体上皮细胞和老年白内障晶状体上皮细胞均不表达。Tsujimoto等[8]研究发现转染bcl-2基因可抑制化疗药物、加热、放射性c-myc或p53基因等多种因素诱导的多种细胞的凋亡延长细胞生存的时间。Schwartz 等[9]认为bcl-2是一种抗氧化剂，能抑制过氧化物诱导的凋亡。Mao YW[10]等实验结果显示：bcl-2能调节兔晶状体上皮细胞表达，通过下调β晶状体蛋白基因bcl-2，减弱由H2O2诱导的兔晶状体上皮细胞对凋亡的抵抗力。

3.2 Bax：为编码bcl-2相关蛋白x的基因，其与bcl-2功能刚好相反，促进细胞凋亡。bax与bcl-2在同一细胞共同表达时，bax可拮抗bcl-2的凋亡作用。Li等[11]在研究多聚醚脂肪酸诱导兔LEC凋亡时，发现多聚醚脂肪酸通过抑制蛋白磷酸酶-1使兔LEC快速凋亡，同时bax的mRNA和蛋白水平升高，表明bax表达水平的升高在凋亡过程中发挥了重要的作用。

3.3 P53：P53是一种典型的抑癌基因，是目前发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，编码的蛋白位于细胞核内，对细胞生长起负调节作用，能促进PCD。p53分为野生型和突变型2种，野生型p53对PCD具有激发作用，而突变型p53则有抑制PCD的作用。李桂荣等[12]发现在老年白内障组LEC中p53基因和蛋白表达均高于正常组，说明p53基因促进了LEC的凋亡，导致了晶状体混浊。

3.4 c-myc基因：c-myc基因是一种癌基因，具有潜在的抑制PCD的作用。它主要参与转录，而在转录过程中可以是激活启动而诱导细胞周期进程和分化，也可以是抑制启动而导致阻止细胞分化或程序死亡，因此它既是激活子又是抑制子。这种取决于在有足够的促进增殖因子存在时，c-myc促进癌细胞增殖，当某些生长因子缺乏和有抑癌因子存在时，则可诱导细胞凋亡[13]。Hann SR等[14]发现半乳糖白内障早期有c-myc基因的高表达，说明在白内障发生过程中也存在有“快速早期反应”核因子的变化，白内障后期c-myc基因的蛋白表达水平可恢复正常。林宏华等[15]的研究发现，LEC中c-myc水平在半乳糖诱导第七天和十四天均高于对照组，尽管第二十四天接近正常水平，但LEC凋亡率却很高。可见c-myc基因参与了LEC的凋亡过程，导致晶状体混浊的发生。

3.5 Fas/FasL：属于TNF受体，神经生长因子受体及其配体超家族中的成员，Fas是I型膜蛋白，胞浆区一段约80个氨基酸序列与TNF-R1同源，介导细胞死亡，称为死亡区。FasL为Ⅱ型膜蛋白，它是Fas的天然配体。Fas通过和FasL结合而介导表达Fas的细胞发生凋亡，Fas/FasL系统所诱导的细胞凋亡机制在机体与肿瘤细胞对抗中具有重要的生物学意义[16]。Okamura等[17]比较了年龄相关性白内障和糖尿病性白内障LEC的免疫组化及RT-PCR表明有增殖性视网膜病变的白内障组Fas及其mRNA的表达明显增高。认为PCD在合并有增殖性视网膜病变的白内障组可能是通过Fas途径介导的。

3.6 c-fos及c-jun基因：c-fos在人类染色体上定位于14q。c-fos和jun蛋白系列形成一聚体构成转录因子复合物AP-1。c-fos作为AP-1的成分，是参与细胞分裂、分化以及转化的一种重要分子。Wenzel A等[18]研究认为，在细胞内外环境的改变或某些诱导剂的作用下，某些细胞发生凋亡的同时存在c-fos表达的增加或过度表达。即c-fos基因可启动PCD。目前认为c-jun基因主要通过蛋白激酶C传导通路对PCD进行调控与白内障的发生有密切的关系。Li等发现在H2O2诱导的大鼠白内障中，c-fos及c-jun都有mRNA水平的表达增强。Tempestini A等[19]发现由于氧化损伤、紫外线照射、钙离子等作用，触发了c-fos及c-jun细胞凋亡机制，使LECs的结构和功能通过凋亡受损。引起成纤维细胞中钙离子聚集，并随之发生一系列生化改变。如激活蛋白水解酶Calpainl和CalpainII，细胞骨架和晶状体蛋白变性，大分子聚集，形成白内障。国内亦有报道[20]c-fos、c-jun与LECs凋亡之间呈一定相关性，尤以c-fos表达与凋亡细胞的相关性最强。

白内障发病机制十分复杂，目前临床上尚无切实有效的预防药物。从PCD角度进一步研究白内障的发病机制，进而通过药物抑制LECs凋亡以防治白内障是眼科工作者面临的新课题。随着细胞生物学和分子生物学的发展，凋亡的基因调控机制将会得到进一步揭示，有望通过促进凋亡抑制基因的表达、抑制激活基因的表达，或通过抑制凋亡诱导物和阻抑其活性物的形式而达到治疗目的，同时对于后发白内障的研究方面亦具有重要的参考价值。

参考文献：

[1] Li WC，Kuszak JR，Dunn K，et al. Lens epithelial cell apoptosis ap-pears to be a common cellular basis for non-congenital cataract de-velopment in humans and animals[J].J Cell Biol，1995，130(1):169.

[2] Li WC， Spector A. Lens epithelial cell apoptosis is an early event in the development of UVB-induced cataract[J].Free Radic Biol Med，1996，20(3)：301.

[3] Michael R，Vrensen GF，van Marle J，et al. Repair in the rat lens af-ter threshold ultraviolet radiation injury[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41(1):204.

[4] Takamura Y，Kubo E，Tsuzuki S，et al.Apoptotic cell death in the lens epithelium of rat sugar cataract[J].Exp Eye Res，2003，77(1):51.

[5] Marian MJ，Li H，Borchman D，et al. Plasma membrane Ca2+-ATPase expression in the human lens[J].Exp Eye Res， 2005，81(1):57.

[6] Malina H，Richter C，Frueh B，et al. Lensepithelialcellapoptosis and intracellular Ca2+ increase in the presence of xanthurenic acid[J].BMC Ophthalmol，2002，5(2):1.

[7] Ghafourifar P，Schenk U，Klein SD，et al. Mitochondrial nitric-oxide synthase stimulation causes cytochrome c release from isolated mito-chondria. Evidence for intramitochondrial peroxynitrite formation[J].J Biol Chem，1999，274(44):31185.

[8] Tsujimoto Y，Shimizu S，Eguchi Y，et al.Bcl-2 and Bcl-xL block apoptosis as well as necrosis possible involvement of common media-tors in apoptotic and necrotic signal transduction pathways[J].Leukemia，1997，11(3):380.

[9] Schwartz PS，Hockenbery DM.Bcl-2-related survival proteins[J]. Cell Death Differ，2006，13(8):1250.

[10] Mao YW，Xiang H，Wang J，et al.Human bcl-2 gene attenuates the ability of rabbit lens epithelial cells against H2O2-induced apoptosisthrough down-regulation of the alpha B-crystallin gene[J]. JBiol Chem，2001，276(46):43435.

[11] Li DW，Fass U，Huizar I，Spector. Okadaic acid-induced lens ep-ithelial cell apoptosis requires inhibition of phosphatase-1 and is associated with induction of gene expression including P53 and bax[J].Eur J Biochem，1998，275(2):351.

[12] 李桂荣，苏冠方，周鸿雁.老年白内障晶状体上皮细胞凋亡及凋亡基囚的表达[J].中国老年学杂志，2007，27(12):1186.

[13] Ifandi V，Al-Rubeai M.Regulation of cell proliferation and apopto-sis in CHO-K1 cells by the coexpression of c-myc and Bcl-2[J].Biotechnol Prog，2005，21(3):671.

[14] Hann SR. Role of post-translational modifications in regulating c-Myc proteolysis，transcriptional activity and biological function[J].Semin Cancer Biol，2006，16(4):288.

[15] 林宏华，范 芳，陈佳瑜，等.半乳糖诱导大鼠晶状体上皮细胞凋亡与白内障形成的关系[J].基础医学与临床，2006，26(8):818.

[16] Chang JS，Hsu YL，Kuo PL，et al.Upregulation of Fas/Fas ligand-mediated apoptosis by gossypol in an immortalized human alveolar lung cancer cell line[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2004，31(10):716.

[17] Okamura N，Ito Y，Shibata MA，et al. Fas-mediated apoptosis in hu-man lens epithelial cells of cataracts associated with diabetic retino-pathy[J]. Med Electron Microsc，2002，35(4):234.

[18] Wenzel A，Grimm C，Samardzija M，et al.The genetic modifier Rpe65Leu(450):effect on light damage susceptibility in c-Fos-deficient mice[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44(6):2798.

[19] Tempestini A，Schiavone N，Papucci L，et al. The mechanisms of apoptosis in biology and medicine: a new focus for ophthalmology[J].Eur J Ophthalmol，2003，13(3):S11.

上皮细胞范文第3篇

食管疾病的发生已成为危害人类健康的重要因素，每年有大量的患者需进行手术治疗。而手术治疗的主要方式多是切除食管或用自身的其他组织器官进行重建。其缺点是手术创伤大，操作复杂，术后并发症多。因此组织工程食管日益显现出其存在的必要性。组织工程食管的基本原理是将体外培养和扩增所得的自体细胞，种植在组织相容性好的可降解支架上，进行共同培养，再植入体内相应位置，逐步形成在结构功能上与自体组织相似的人工食管，但干细胞必须分化为上皮细胞才有价值。细胞的分化方向与微环境“壁龛”密切相关［1］。微环境包括细胞因子、细胞外基质、生理激素、离子浓度、O2浓度等。本文就微环境对组织工程中食管上皮细胞增殖分化的影响作一简要综述。

1 细胞因子的影响

1.1 血管内皮细胞生长因子 血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）是一种分子量为40～45 kD的分泌性糖蛋白，编码人类VEGF的基因位于染色体6p21.3上，该基因全长24 kb。体外实验发现其对血管内皮的增殖，血管构建的作用较强，且特异性高，VEGF还可以增加血管内皮细胞的通透性［2］。VEGF发挥作用主要依赖其受体的存在。其中VEGFR1和VEGFR2是血管内皮细胞的特异性酪氨酸激酶蛋白受体，而VEGFR3主要在淋巴管内皮细胞中表达［3］。由此可见，VEGF在干细胞向食管上皮诱导分化过程中有一定的意义。首先，VEGF可以促进组织工程食管中微血管的生成，并增加其通透性；其次，促进淋巴管的形成。以上两者的作用，创造出更接近于人体食管的微环境，有利于食管上皮细胞的增殖分化。

1.2 表皮生长因子 表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）是一种广泛存在于各种组织体液中的53个氨基酸组成的促有丝分裂的多肽，可促进多种细胞增殖，包括上皮细胞、间质细胞及神经干细胞等［4］。EGF在体外可刺激角化细胞分裂，在体内可促进上皮的再生［5］。许多文献报道，干细胞向食管上皮分化中出现分化消失现象，原因可能与培养基血清中的转移生长因子β（TGF-β）等因子抑制上皮细胞生长，但刺激成纤维细胞生长有关［6］。成纤维细胞的大量产生有有利的一面，也可以消耗培养基中大量营养物质，从而抑制上皮细胞生长。刘洪清等［7］采用添加EGF等细胞因子的方法，有效地促进食管上皮细胞增殖和传代，有效抑制成纤维细胞生长。EGF与靶细胞表面的EGF受体结合后，能刺激受体自身磷酸化及细胞内其它蛋白质的酪氨酸磷酸化，进而激活蛋白激酶C和磷脂酶C，通过第二信使CAMP、Ca2+激活CAMP依赖的蛋白酶，使细胞核内组蛋白对DNA的阻遏作用解除，促使有丝分裂信号向细胞内传递，从而引起DNA合成细胞增殖［8］。但不同浓度的EGF对BMSC促分化和促增殖的影响作用不同，其机理有待进一步研究。

1.3 转移生长因子β 转移生长因子β（ transforming growth factor-β，TGF-β）是一类多功能的细胞因子，参与多种细胞功能的调节，包括细胞增殖、分化、迁移，细胞外基质生成等。在干细胞向食管上皮分的过程中，TGF-β1的突出作用是促使各种细胞外基质（extra cellular matrixc，ECM），如胶原蛋白、连接蛋白（fibronectin，FN）、层黏蛋白（laminin，LN）和蛋白多糖的合成，抑制这些蛋白的降解，从而增加ECM的沉积［9］。TGF-β通过与细胞跨膜蛋白受体结合发挥其生物作用，其跨膜蛋白受体有三种亚型TGF-β RAⅠ、RⅡ、RⅢ。RI、RII有丝氨酸-苏氨酸激酶活性，RⅢ可促进TGF-β与RI、RII结合［10］。TGF-β1另一重要作用是刺激成纤维上皮细胞的生长，但其机制说法尚不统一。被TGF-β1刺激增生的成纤维细胞能促进食管上皮细胞增殖分化，有报道证实食管上皮细胞分层程度与加入成纤维细胞密度成正比［11］。

1.4 胰岛素样生长因子-1 胰岛素样生长因子-1 （Insulin-like growth factor1，IGF-1）是一个重要的细胞增殖因子。在细胞周期中，一旦细胞进入G1期，在其他生长因子缺乏的情况下，IGF-1可促进C增殖周期的完成［12］。IGF-1的活性主要是由胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）介导的，即IGF-1R很大程度上与细胞增殖状况有关［13］。它的这种作用，在组织工程食管上皮细胞分化增殖中十分重要。组织工程食管上皮在体外培养时，必然存在与体内微环境的不同之处，缺乏某些细胞因子，IGF-1上述特点正好弥补了此种不足，值得关注的是IGF-1刺激细胞增生抑制凋亡，又是致食管癌的发生的重要因素。IGF-1活性主要由胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）来调控，故对IGFBPs的研究也值得进一步深入研究。

1.5 碱性成纤维细胞生长因子 碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，BFGF）,有研究表明,体积大于1 mm3的组织就需要血液供应。组织工程中食管上皮细胞体积巨大，需要充足的血供，BFGF表达与食管中微血管密度有关。BFGF是一种碱性多肽，在体内广泛分布，是血管内皮细胞的有丝分裂素，它在体内可趋化血管内膜的各类细胞，并诱导这些细胞表达组织重建所需的血浆酶原激活剂等，通过刺激内膜各类细胞的增殖和迁移，诱导血管内皮细胞长入胶原基质中形成管腔，并促进神经元与新生血管的生长［14］。BFGF在促进神经元生成的作用，为研究组织工程食管神经的重建提供了新的思路与着手点。

2 细胞外基质的影响

在组织工程食管中，高分了聚合材料结构和成分单一，不能同时提供食管上皮细胞生长的ECM。而种子细胞与ECM的黏附及相互作用是细胞分化增殖的基础。故对ECM的研究，对组织工程食管上皮细胞分化增殖有重要意义。

2.1 胶原蛋白 研究发现Ⅰ型胶原主要存在于食管的黏膜下层及肌层内，Ⅲ型胶原主要存在于食管的外膜弹力纤维层和黏膜下［15］。具有良好的生物相容性，极低的免疫原性，极强的促组织再生性［16］。鲍春荣等［10］用Ⅳ型胶原预涂材料表面，可有效地促进食管上皮细胞与支架的吸附和均匀分布。但在食管中各型胶原蛋白的比例关系及各型胶原如何特异性作用于食管的特定部位，还有待研究。

2.2 纤维连接蛋白 纤维连接蛋白（FN）是一组结构上类似、免疫源性相同的高分子糖蛋白，是体内重要的细胞外基质成份。它具有维持细胞正常形态参与细胞与细胞，细胞与基质间的粘连，促细胞生长，分化和增殖，调节细胞运动等功能，在正常食管上皮有表达［17］。在组织上工程食管上皮细胞诱导过程中，利用其具有细胞间或细胞与其他细胞外基质间的桥蛋白作用，促进食管上皮细胞的粘附，构成其它增殖，分化的基础。梁志刚等成功应用转染Ad.FnCBD64的食管上皮细胞体外构建组织工程食管。证明了FN具有增强种子细胞黏附力的效果。但FN分子量大，在实际的使用中存在转染种子细胞的困难，有待于寻找促进FN表达的实用性方法。

2.3 缝隙连接蛋白（Cx43） 缝隙连接蛋白（Connexins，Cx）的缝隙连接普遍存在于上皮细胞间，缝隙连接蛋白CX43表达与胚胎发育，细胞诱导，分化，生长调控有关［18］。刘学红等［19］通过实验证实，2～4个月CX43蛋白呈阳性或强阳性表达，4个月后呈弱阳性表达，推测在食管神经系统及微循环系统未完善时期，Cx43通过参与细胞间缝隙连接调控信息转导及细胞的分化、增殖。在组织工程食管上皮细胞的培养中，诱导种子细胞向食管上皮细胞分化，利用Cx43特性促进分化增殖国内外尚无报道。笔者认为有待从实验中得到求证。

3 性激素

从食管癌发生的性别差异，不难发现性激素可能参与了上皮细胞的增殖分化，但不论雌雄激素，发挥生理作用均与其受体密切相关，雌激素（ER）在胎儿食管正常食管上皮两者间出现到消失的规律。有学者认为最好的解释是ER参与了食管上皮细胞的增殖分化。ER的作用机制为雌激素弥漫入细胞后，先与靶细胞浆异性受体结合，形成激素受体复合物，复合物进入细胞核内，加上共激活因子的作用与核内受体形成单二聚体，影响DNA转录生成新的mRNA，从而生成新的蛋白质，影响细胞生理功能，雄激素（AR）作用机制与ER相似。但在性激素影响下产生了何种蛋白质影响了生物学功能尚不清楚，且人体内雌雄激素间存在复杂的相互影响，不同性别个体间雌、雄激素迥然不同，所以性激素对组织工程食管上细胞的分化影响还有待进一步研究。

4 Ca2+浓度及O2浓度的影响

4.1 Ca2+浓度与食管上皮细胞的增殖、分化密切相关 Ca2+浓度低于0.05 mmol/L时食管上皮细胞缺少桥粒，当Ca2+浓度大于等于0.05 mmol/L时角蛋白丝增加，桥粒出现。其机制可能为Ca2+充当第二信使激活CAMP依赖的蛋白激酶使细胞核内组蛋白对DNA的组合解除，促使有丝分裂信号向细胞内传递引起DNA合成，细胞增殖，并且整合素等粘附分子发挥作用也需要Ca2+的存在。

4.2 O2浓度的影响 O2浓度为微环境对组织工程食管上皮细胞分化的影响报道不一，有学者用CoCl2诱导缺氧条件，发现随缺氧时间延长，处于G0/G1期的细胞明显增加，S期减少，由此认为，缺氧对细胞周期进行负调控［20］。另一部分学者认为供氧不足，缺氧信号迅速传至细胞核内启动相关基因表达，以维持细胞和机体氧平衡，在这一过程中引起细胞的增殖分化，其中缺氧诱导因子-1（HIF-1）是影响调控的最主要因子。组织工程食管种子细胞在体外诱导分化过程中，O2浓度必然高于正常处于体内的细胞，高O2浓度的影响是有利于细胞增殖分化，还是不利于细胞增殖分化，有待于进一步研究。

今后，组织工程食管的研究，应深入研究微环境如何影响种子细胞向食管上皮细胞增生、分化，如何在体外模拟体内的微环境。在不久的未来，组织工程食管必将应用于临床，给更多的患者减少病痛。

参 考 文 献

［1］ Fuchs E, Tumbar T, Guasch G. Socializing with the neighbors: stem cells and their niche. Cell,2004,116（6）:769-778.

［2］ Kim K J, Li B, Winer J, et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumour growth in vivo. Nature,1993,362（6423）:841-844.

［3］ Veikkola T, Alitalo K. VEGFs, receptors and angiogenesis. Semin Cancer Biol,1999,9（3）:211-220.

［4］ Direnzo J, Signoretti S, Nakamura N, et al. Growth factor requirements and basal phenotype of an immortalized mammary epithelial cell line. Cancer Res,2002,62（1）:89-98.

［5］ Vicario-abejon C, Yusta-boyo M J, Fernandez-moreno C, et al. Locally born olfactory bulb stem cells proliferate in response to insulin-related factors and require endogenous insulin-like growth factor-I for differentiation into neurons and glia. J Neurosci,2003,23（3）:895-906.

［6］ Masui T, Wakefield LM, Lechner JF, et al. Type beta transforming growth factor is the primary differentiation-inducing serum factor for normal human bronchial epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA,1986,83（8）:2438-2442.

［7］ 刘洪涛，黄盛东，张宝仁，等. 成人食管上皮细胞的体外培养及生物学特性. 解剖学报,2008,39（1）:60-63.

［8］ Wolfgang CL, Lin C, Meng Q, et al. Epidermal growth factor activation of intestinal glutamine transport is mediated by mitogen-activated protein kinases. J Gastrointest Surg,2003,7（1）:149-156.

［9］ O'kane S, Ferguson MW. Transforming growth factor beta s and wound healing. Int J Biochem Cell Biol,1997,29（1）:63-78.

［10］ 马军，郭敏，李印，等. 食管鳞癌中TGF-β及其受体调节成分Endoglin/CD 105的表达. 第四军医大学学报,2006,27（14）:1308-1311.

［11］ 鲍春荣，丁芳宝，梅举，等. 人工生物可降解支架构建组织工程食管的实验研究. 中国修复重建外科杂志,2006,20（12）:1235-1239.

［12］ Russell WE, Vanwyk JJ, Pledger WJ. Inhibition of the mitogenic effects of plasma by a monoclonal antibody to somatomedin C. Proc Natl Acad Sci U S A,1984,81（8）:2389-2392.

［13］ Iihara K, Shiozaki H, Oku K, et al. Growth-regulatory mechanism of two human esophageal-cancer cell lines in protein-free conditions. Int J Cancer,1993,55（3）:364-370.

［14］ 徐泱，陈治平.碱性成纤维细胞生长因子在门静脉高压症大鼠断流术后食管中的表达和意义. 肝胆胰外科杂志,2001,13（3）:135-138.

［15］ Schulze K, Ellerbroek S, Martin J. Matrix composition in opossum esophagus. Dig Dis Sci,2001,46（5）:968-975.

［16］ 刘平.胶原蛋白的实验方法. 上海:上海中医学院出版社,1992:30-48.

［17］ Kaur P, Li A. Adhesive properties of human basal epidermal cells: an analysis of keratinocyte stem cells, transit amplifying cells, and postmitotic differentiating cells. J Invest Dermatol,2000,114（3）:413-420.

［18］ Holland MS, Stasko JA, Holland RE. Influence of extracellular matrix on bovine mammary gland progenitor cell growth and differentiation. Am J Vet Res,2007,68（5）:476-482.

［19］ 刘学红，张金萍. Cx43在人胚胎早期食管上皮组织中的表达. 现代生物医学进展,2008,8（5）:862-863.

上皮细胞范文第4篇

【摘要】 目的 模拟缺血/再灌注诱导人离体的胃黏膜上皮细胞损伤模型，观察再灌注不同时间点胃黏膜上皮细胞凋亡情况并分析其规律。方法 采用人胃黏膜上皮细胞株进行体外培养并传代，细胞以缺氧(5% CO2、1% O2、94% N2)+无糖KR液模拟缺血、缺氧，复氧、复糖模拟再灌注诱导胃黏膜上皮细胞凋亡，用流式细胞仪、Hoechst33258染色法观察正常对照组及模拟损伤组于模拟缺血1 h，再灌注3、6、12 h细胞凋亡的情况及变化规律。结果 ①胃黏膜上皮细胞12～24 h贴壁，24 h后有少量上皮样细胞从周边爬出，48 h后细胞呈指数样生长，72 h后细胞已基本能达到融合。②模拟胃缺血/再灌注后细胞凋亡率于缺血1 h、再灌注6 h时出现高峰，且与正常对照组相比差异有统计学意义(P

【关键词】 胃缺血/再灌注;胃黏膜上皮细胞;细胞凋亡;细胞培养

Abstract: Objective To simulate the ischemia/reperfusion-induced injury to the epithelial cells of gastric mucosa and to investigate the cellular apoptosis at different time points in order to explore its regularity.Methods Human gastric epithelial cell line was cultured and subculture in vitro. The cells were subjected to hypoxia (5% CO2， 1% O2 and 94% N2) + glucose-free KR bicarbonate buffer and succedent reperfusion (5%CO2 and 95% air) in DMEM/F12 to simulate conditions of ischemia and hypoxia， reoxygenation and glucose reintroduction. The morphological changes and the percentage of apoptotic cells were evaluated by Hoechast33258 staining， flow cytometry (FCM) at reperfusive 3， 6 and 12 h secondary to 1 h simulated ischemia culture.Results ①Observation under the inverted microscope revealed the gastric mucosa epithelial cell adherence after 12 to 24 h; and at 24th h， there was outgrowth of epithelial cells; at 48th h the cells were in exponential growth; and at 72nd h the cultured cells reached nearly confluence， displaying the typical cobblestone appearance. ②FCM analysis revealed that the percentage of cell apoptosis peaked at simulated ischemic 1 h and reperfusive 6 h， with significant difference (P

Key words：gastric ischemia-reperfusion; gastric mucosa epithelial cell; cell apoptosis; cell culture

胃缺血/再灌注(gastric ischemia-reperfusion， GI/R)损伤是一种常见的临床病理生理过程，临床发生多器官障碍综合征时，由于血液的重分布造成的胃肠黏膜缺血出现的最早最明显，远比其他脏器更易发生缺血-再灌注损伤，因此，胃被认为是机体内最早受累的器官[1-2]。胃黏膜虽易损伤，但其修复快，它是机体内自身代谢最快的组织之一，这表明胃黏膜细胞可能具有较强的抗凋亡调控机制和增殖修复能力。深入研究GI-R的胃黏膜上皮细胞凋亡、增殖及其分子机制不仅有利于GI-R的防治，而且对于器官缺血/再灌注损伤理论的深入具有重要意义。

以往研究多是采用夹闭腹腔动脉导致胃缺血/再灌注损伤的在体模型[3-4]，但由于体内环境的复杂性，在体研究受到诸多因素的干扰，也难以特异性地针对胃黏膜某一细胞进行研究。故对于离体胃黏膜上皮细胞缺血-再灌注后损伤的研究具有十分重要的意义。本研究采用人胃黏膜上皮细胞株经体外培养及传代后建立模拟缺血/再灌注细胞损伤模型，观察在缺血-再灌注不同时间点胃黏膜上皮细胞凋亡的情况及其规律。

1 材料和方法

1.1 实验试剂及细胞株 DMEM/F12(1∶1)培养基购自美国Hyclone公司;Hoechst33258、碘化吡啶(PI)染液购自美国Sigma公司;人胃黏膜上皮细胞株由北京肿瘤研究所提供。

1.2 实验分组

1.2.1 正常对照(control)组 正常环境下培养人胃黏膜上皮细胞。

1.2.2 模拟缺血/再灌注损伤(I-R)组 更换模拟缺血液，于缺氧箱中缺氧、缺糖孵育1 h，更换模拟再灌注液，正常环境下分别进行再灌注孵育3、6、12 h。

1.3 模拟缺血-再灌注诱导胃黏膜上皮细胞凋亡模型的建立 采用缺氧、缺糖、复氧、复糖的方法模拟在体的缺血/再灌注过程。参照文献的方法[5-6]，取胃黏膜上皮细胞接种在培养瓶中，待细胞生长至2～3天接近融合状态时，将上述培养基置换为无糖的模拟缺血液，在模拟缺血条件下(5% CO2、1% O2、94% N2、37℃的缺氧箱中缺氧、缺糖)培养1 h，之后将模拟缺血液吸尽并加入正常DMEM/F12(含10%的胎牛血清)培养基，放至普通培养箱中(5% CO2、37℃)继续培养不同时间。

1.4 流式细胞仪分析细胞凋亡率 分别收集各组培养的胃黏膜上皮细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，用0.25%胰酶消化液制备单细胞悬液，以75%冷乙醇固定，置4℃ 保存。向固定的细胞悬液中加入PBS，轻轻混匀，1 000 r/min离心5 min，去除固定液。再以PBS洗一次。加入RNase A和PI染色液4℃避光染色30 min后，用流式细胞仪检测分析细胞DNA含量，计算凋亡细胞百分率和凋亡峰，此峰的大小即代表凋亡细胞的多少。

1.5 胃黏膜上皮细胞形态学观察 Hoechst33258染色法：吸尽培养液，加入0.5 ml 4%多聚甲醛固定细胞10 min;去除固定液，用MPBS洗2次;加入0.5 ml Hoechst33258染色液(10 mg/L) 37℃染色15 min;去染色液，用MPBS洗2次，去除过多的染色背景;荧光显微镜下观察(激发波长为350 nm，发射波长为460 nm)，细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染为凋亡阳性细胞。

1.6 统计学处理 数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P

2 结 果

2.1 胃黏膜上皮细胞的培养及传代 倒置显微镜下观察，胃黏膜上皮细胞12～24 h贴壁，24 h后可见少量上皮样细胞从周边爬出，48 h后见细胞呈指数样生长，72 h后细胞已基本融合，镜下观察可见细胞体积较大，细胞间紧密相连融合成片，核椭圆形，呈多边鹅卵石铺路样(图1)。传代后的细胞生长迅速，48～72 h后可传代。表明本研究中胃黏膜上皮细胞的体外培养及传代成功可行。图1 倒置显微镜下观察正常对照组细胞

A.Bar=40 μm; B.Bar=20 μm2.2 模拟缺血-再灌注损伤对胃黏膜上皮细胞凋亡的影响

2.2.1 流式细胞仪检测模拟缺血/再灌注后不同时间点细胞凋亡率变化 经流式细胞仪分析细胞的DNA含量。正常对照组胃黏膜上皮细胞凋亡百分率为(1.65±0.37)%，缺血/再灌注损伤组的胃黏膜上皮细胞经模拟缺血1 h，再灌注3、6、12 h均可诱导出凋亡峰(图2)，细胞凋亡百分率分别为 (2.34±0.27)%、(6.68±0.56)%、(2.84±0.68)%，其中再灌注6 h时细胞凋亡出现高峰，且凋亡率与正常对照组相比差异有统计学意义(P

A.正常对照组;B、C、D.缺血1 h再灌注3、6、12 h组

图3 模拟缺血/再灌注不同时间点细胞凋亡率的比较

与正常对照组比较：# # P

A、B.正常对照组(A：Bar=40 μm;B： Bar=20 μm);C、D.模拟缺血1 h、再灌注6 h组(C：Bar=40 μm; D：Bar=20 μm)图5 荧光显微镜下胃黏膜上皮细胞的形态学变化(Hoechst33258染色)

A.正常对照组;B.模拟缺血1 h、再灌注6 h组(Bar=20 μm)

3 讨 论

本实验从形态学方面观察到了模拟缺血/再灌注损伤后胃黏膜上皮细胞凋亡的变化：出现典型凋亡特征。同时，采用流式细胞仪检测细胞内DNA含量，观察模拟缺血/再灌注后不同时间点细胞凋亡率的变化。细胞发生凋亡时，由于核酸内切酶的激活，细胞内的DNA发生了断裂， DNA含量减少，与荧光染料PI的结合减少，细胞的DNA荧光强度会降低，分析图上在G0/G1峰前出现DNA含量减少的亚G0/G1峰，即典型的凋亡峰[7]。实验结果表明：在缺血1 h、再灌注6 h后细胞凋亡出现明显的高峰，细胞损伤加重。我们推测胃黏膜上皮细胞于缺血1 h、再灌注6 h后明显凋亡可能与其具有较强的凋亡调控机制和增殖修复能力有关。

缺血/再灌注损伤导致的胃黏膜上皮细胞损伤实际上是一种氧化应激反应，在缺血-缺氧、氧自由基(OFR)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等胞外刺激信号的作用下，可激活核因子-κB(NF-κB)信号蛋白通路。然而NF-κB 在各类细胞中所导致的生物学反应是不同的，在一些细胞内它可以引起细胞的增殖， 相反则促进了细胞的凋亡[8]。我们前期的研究表明：氧自由基和 NF-B的活化均参与 GI-R损伤过程[9-10]，因此，进一步研究缺血-再灌注损伤导致的胃黏膜上皮细胞凋亡机制，NF-κB在离体胃黏膜上皮细胞的缺血-再灌注损伤中将起什么作用是我们今后研究的重点，这对于防治器官缺血/再灌注损伤也有着重要的意义。

参考文献

[1] Kwiecień S， Brzozowski T， Konturek SJ. Effects of reactive oxygen species action on gastric mucosa in various models of mucosal injury [J]. J Physiol Pharmacol，2002，53(1):39-50.

[2] Synnerstad I， Johansson M， Nylander O， et al. Intraluminal acid and gastric mucosal integrity: the importance of blood-borne bicarbonate [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2001，280(1):G121-129.

[3] Zhang JF， Zhang YM， Yan CD， et al. Neuroregulative mechanism of hypothalamic paraventricular nucleus on gastric ischemia-reperfusion injury in rats [J]. Life Sci，2002，71(13):1501-1510.

[4] Zhang JF， Zheng F. The role of paraventricular nucleus of hypothalamus in stress-ulcer formation in rats [J]. Brain Res，1997，761(2):203-209.

[5] Zhang X， Shan P， Alam J， et al. Carbon monoxide modulates Fas/Fas ligand， caspases， and Bcl-2 family proteins via the p38alpha mitogen-activated protein kinase pathway during ischemia-reperfusion lung injury [J]. J Biol Chem，2003，278(24):22061-22070.

[6] Song JJ， Lee YJ. Daxx deletion mutant (amino acids 501-625)-induced apoptosis occurs through the JNK/p38-Bax-dependent mitochondrial pathway [J]. J Cell Biochem，2004，92(6):1257-1270.

[7] Bortuzzo C， Hanif R， Kashfi K， et al. The effect of leukotrienes B and selected HETEs on the proliferation of colon cancer cells [J]. Biochim Biophys Acta，1996，1300(3):240-246.

[8] Monaco C， Paleolog E. Nuclear factor kappaB: a potential therapeutic target in atherosclerosis and thrombosis [J].Cardiovasc Res，2004，61(4):671-682.

[9] 徐明，张建福，张咏梅.核因子κ B在大鼠胃缺血再灌注损伤中的表达及意义 [J]. 徐州医学院学报，2006，26(6):471-473.

上皮细胞范文第5篇

[摘要] 目的:研究血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞损伤的机制。 方法:血管紧张素Ⅱ（10-7 μmol/l）加入肾小管上皮细胞为对照组；体外培养的肾小管上皮细胞作为空白对照；不同浓度缬沙坦（10-6 μmol/l、10-7 μmol/l、10-8 μmol/l、10-9 μmol/l）先与肾小管上皮细胞共同培养半小时后再加入血管紧张素Ⅱ（10-7 μmol/l）为干预组；EMSA、RT-PCR分别检测不同时限NF-κB活性、骨桥蛋白mRNA表达。 结果:血管紧张素Ⅱ可诱导肾小管上皮细胞内NF-κB活性增加，骨桥蛋白mRNA表达上调；而不同浓度缬沙坦干预组检测结果显示NF-κB活性、骨桥蛋白mRNA表达明显下调。 结论:血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞损伤与导致肾小管上皮细胞内NF-κB活性增加、骨桥蛋白mRNA转录上调有关。这一过程可能依赖血管紧张素ⅡⅠ型受体。

[关键词] 血管紧张素Ⅱ;肾小管上皮细胞;核转录因子-κB;骨桥蛋白

Abstract： Objective To explore the mechanism of angiotensinⅡinducing the injury of proximal tubular cells. Methods Cultured cells were incubated with AngiotensinⅡ（10-7 μmol/l）as the control; cultured cells were incubated with different concentration Xiesartan for half an hour and then with angiotensinⅡ（10-7μmol/l） as the intervention group; proximal tubular cells without stimulation as blank control; EMSA， RT-PCR were used to observe NF-κB activity and OPN mRNA expression in different periods，respectively. Results AngiotensinⅡcould increase NF-κB activity and upregulate OPN mRNA expression in proximal tubular cells.While Xiesartan could decrease NF-κB activity and downregulate OPN mRNA expression in angiotensinⅡ stimulated proximal tubular cells. Conclusion The mechanism of angiotensinⅡ inducing the injury of proximal tubular cells is related to increase NF-κB activity and upregulate OPN mRNA expression，and this process is angiotensinⅡ receptorⅠ dependent.

Key words: AngiotensinⅡ; Proximal tubular cell; NF-κB; OPN

近年来，肾脏局部肾素―血管紧张素―醛固酮系统（RAS）在慢性肾脏病的发生、发展中的重要作用越来越受到人们的关注。RAS的主要效应因子血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ）已发现与许多肾脏疾病的发生、发展过程密切相关。但血管紧张素Ⅱ能否诱导小管上皮细胞损伤及其具体机制不明。本课题通过体外实验用一定浓度血管紧张素Ⅱ刺激肾小管上皮细胞，观察核转录因子、细胞因子的变化，探讨血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器测定NF-κB活性的EMSA试剂盒（promega公司）；血管紧张素 Ⅱ（sigma公司）；RT-PCR试剂盒（BD Bioscience公司）；TRIZOL（GiBco公司）；RNaseA抑制剂（Novagen 公司）；引物（上海生工生物工程技术公司）；大鼠的肾小管上皮细胞株(NRK细胞)购至中科院上海细胞库；冷冻离心机（Biofuge公司），二氧化碳温箱（Forma scientific公司）。缬沙坦由北京诺华公司提供。

1.2 细胞培养无菌条件下大鼠肾小管上皮细胞株，0.25%胰酶消化2 min，观察细胞分散成拉网状，终止消化，加入RPMI 1640培养液（含20%胎牛血清，300 mg/l谷氨酰胺、青霉素、链霉素）反复吹打，并分装至培养皿，置于37 ℃二氧化碳温箱中孵育；反复传代，取第七代细胞实验用。

1.3 实验分组当传代细胞长至90%融合时换无血清培养液继续培养12 h。试验分组如下：①空白对照:未加刺激物的培养细胞。②对照组:血管紧张素Ⅱ（10-7 μmol/l）加入培养细胞，分别于12、24 h检测NF-κB活性； 12、24 h检测骨桥蛋白 mRNA表达水平；每个检测指标均设五个重复组。③干预组:不同浓度缬沙坦（10-6 μmol/l、10-7 μmol/l、10-8 μmol/l、10-9 μmol/l）加入培养细胞，半小时后再加入血管紧张素Ⅱ（10-7 μmol/l），分别于12 h检测NF-κB活性；12 h检测骨桥蛋白 mRNA表达水平；每个检测指标均设五个重复组。

1.4 EMSA的操作步骤①核蛋白的提取Bradford法定量。②EMSA 的操作依试剂盒说明书（Cat#3050）进行NF-κB寡核苷酸探针[r-32p]ATP标记及EMSA法测定NF-κB活性。NF-κB同序寡核苷酸探针序列为3′-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G5′；5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′。反应结束后，在4%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳2 h（电压150 V，电泳缓冲液为0.5×TBE）。电泳完毕后干胶， -70 ℃放射自显影。电泳结果经密度扫描仪进行半定量分析。

1.5 骨桥蛋白的RT-PCR操作步骤培养细胞接种至12孔培养板，当细胞长至80%～90%融合时换无血清培养液，12 h后按试验分组加药物干预，每组细胞均设五个复孔。①TRIZOL提取总RNA，并测定浓度及260/280 nm的吸光度（A）值。②按T1TANIUMTM one-step RT-PCR试剂盒说明进行操作。反应条件：50 ℃ 1 h，90 ℃ 5 min； 94 ℃ 30′，65 ℃ 30′， 68 ℃ 1 min 30个循环；68 ℃延伸2 min，4 ℃保存。骨桥蛋白上游引物序列：5′AAGCCTGACCCATCTCAGAA 3′； 骨桥蛋白下游引物序列为： 5′GCAACTGGGATGACCTTGAT 3′，产物长度446 bp；设β-actin为内参照，其上流引物序列为5′-TCGTACCACTGGCATTGTGA-3′，下游引物序列为5′-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′，产物长度545 bp。Mark片段选用2 000 bp。③电泳分析:取8 μl PCR扩增产物于质量浓度为1.5 g/l的琼脂糖凝胶上电泳，采用kodak scieuce凝胶图像分析系统扫描，并分析电泳条带，以OPN与β-actin的电泳条带光密度比值来作为OPN mRNA的相对表达量。

1.6 统计学处理全部实验数据采用均数±标准差（x±s）表示，差异的显著性采用单因素方差分析及q检验，以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 EMSA法测定结果(见图1)图1中1~7泳道的密度扫描值依次为：36.30±8.73，194.50±10.45，186.30±12.30，76.34±4.57，90.34±5.86，114.60±7.67，138.41±6.53；n=5（每组细胞均设五个重复组）。未加刺激的肾小管上皮细胞内NF-κB表达较弱；血管紧张素Ⅱ（10-7 μmol/l）刺激肾小管上皮细胞后NF-κB活性明显增高，以12 h最明显，为空白对照的5.47倍（P10-8 μmol/l>10-9 μmol/l（P

图1 各组NF-κB活性的变化（略）

注: 1.空白对照；2.血管紧张素Ⅱ10-7 μmol/l 12 h；3.血管紧张素Ⅱ10-7 μmol/l 24 h；4、5、6、7泳道分别为10-6 μmol/l 12 h、10-7 μmol/l 12 h、10-8 μmol/l 12 h、10-9 μmol/l 12 h；

2.2 骨桥蛋白RT-PCR检测结果(见图2)1~7泳道OPN与β-actin的电泳条带的光密度比值依次为：1~7泳道依次为0.20±0.05，0.97±0.049，0.85±0.014，0.17±0.032，0.37±0.017，0.60±0.031，0.28±0.012；n=5；经过统计学分析，各组及组间相比均有显著差异，P＜0.05。从结果分析：未加刺激的肾小管上皮细胞内骨桥蛋白转录较弱，而血管紧张素Ⅱ（10-7 μmol/l）诱导肾小管上皮细胞内骨桥蛋白转录增加，12 h达高峰，并持续至24 h；不同浓度缬沙坦可抑制血管紧张素Ⅱ刺激的肾小管上皮细胞骨桥蛋白的转录水平，抑制作用依次为10-6 μmol/l>10-7 μmol/l>10-9 μmol/l>10-8 μmol/l（P

图2 各组OPN mRNA水平的变化（略）

注：M:DNA Mark； 1、空白对照; 2、血管紧张素Ⅱ10-7 μmol/l 12 h； 3、血管紧张素Ⅱ10-7 μmol/l 24 h； 4、 5、6、7泳道分别为缬沙坦10-6 μmol/l 12 h、10-7 μmol/l 12 h、10-8 μmol/l 12 h、10-9 μmol/l 12 h。

3 讨论

肾脏局部肾素―血管紧张素―醛固酮系统（RAS）在慢性肾脏病进展中的作用已倍受重视， 血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂应用临床及动物实验研究证实，血管紧张素Ⅱ在小管间质病变中发挥重要作用[1]。近年来，大量研究结果表明[2]，肾小管间质病变较肾小球病变更密切相关于肾功能的损伤和预后。小管间质病变在进行性肾小球损伤中的重要性已经被越来越多的国内外学者所重视。在小管间质损害过程中肾小管上皮细胞扮演着重要的角色。但血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞损伤的具体机制不明。NF-κB作为一种重要的核转录因子，能与多种基因启动子或增强子上的κB位点发生特异性结合，并促进基因转录，参与许多基因，尤其是炎症与免疫相关基因的表达与调控。许多刺激，如：肿瘤坏死因子α（TNF-α）、高糖、血小板活化因子、细胞因子等可激活NF-κB[3]。NF-κB游离并移入核内，调控炎症与免疫相关的基因的表达。在胞浆中还存在另一种蛋白质家族-IκB，它的主要作用是与NF-κB/Rel蛋白在胞浆中结合并使后者保持静息状态。NF-κB在核内与新合成的IκB结合后出核，进入胞浆，从而失活。本课题通过体外实验用血管紧张素Ⅱ（10-7 μmol/l）刺激肾小管上皮细胞， EMSA检测结果显示NF-κB活性升高，12 h达高峰，并持续至24 h，说明一定浓度血管紧张素Ⅱ可诱导肾小管上皮细胞NF-κB活性升高，与随后的炎症、纤维化基因的过度表达密切相关。骨桥蛋白是一种可以在肾小管上皮表达的高度酸化的磷蛋白，现认为它是巨噬细胞趋化因子。而在许多病肾实验模型上（包括缺血再灌注损伤）发现其表达上调。目前针对临床肾脏疾病的研究发现骨桥蛋白在伴有蛋白尿的肾小球疾病如微小病变性肾病、膜性肾病、IgA肾病的肾小管上皮细胞处高表达，均与小管间质纤维化密切相关[4-5]。本研究通过体外实验用血管紧张素Ⅱ（10-7 μmol/l）刺激肾小管上皮细胞，RT-PCR结果显示共同培养后骨桥蛋白的转录增加，在12 h达高峰并持续至24 h，与血管紧张素Ⅱ（10-7 μmol/l）诱导肾小管上皮细胞内NF-κB活性改变相一致，证实血管紧张素Ⅱ（10-7 μmol/l）可诱导肾小管上皮细胞内骨桥蛋白的转录增加，这可能与肾小管间质巨噬细胞浸润有关。通过对不同浓度缬沙坦共同培养的肾小管上皮细胞的测定，在相同刺激下其NF-κB活性及骨桥蛋白的转录水平明显降低，从实验角度说明缬沙坦用于慢性肾脏病的治疗机制与抑制血管紧张素Ⅱ诱导的肾小管上皮细胞内NF-κB活性及骨桥蛋白的转录水平有关，因缬沙坦属血管紧张素Ⅱ Ⅰ型受体拮抗剂，我们推测血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞NF-κB及OPN mRNA活性上调依赖于血管紧张素Ⅱ Ⅰ型受体。通过本研究证实血管紧张素Ⅱ可诱导小管上皮细胞内NF-κB活性明显增加，骨桥蛋白转录增加，与炎性细胞小管间质浸润密切相关，并且这一过程依赖AGNⅡ Ⅰ型受体。但具体的信号转导途径仍需深入研究。

[参考文献]

[1]

Lai KN，Chan LY，Tang SC，et al.Mesangial expression of angiotensin Ⅱ receptor in IgA nephropathy and its regulation by polymeric IgA1[J].Kidney Int，2004，66(4):1 403-1 416.

[2]

Drumm K，Bauer B，Freudinger R，et al. Albumin induces NF-kappaB expression in human proximal tubule-derived cells (IHKE-1)[J].Cell Physiol Biochem，2002，12(4):187-196.

[3]

Tomita N，Morishita R，Tomita S，et al. Inhibition of TNF-alpha， induced cytokine and adhesion molecule: expression in glomerular cells in vitro and in vivo by transcription factor decoy for NFkappaB[J].Exp Nephrol，2001，9(3):181-190.

[4]

Kaimori JY，Takenaka M，Nagasawa Y，et al. Quantitative analyses of osteopontin mRNA expression in human proximal tubules isolated from renal biopsy tissue sections of minimal change nephrotic syndrome and IgA glomerulonephropathy patients[J]. Am J Kidney Dis，2002，39(5):948-957.