细胞培养
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细胞培养范文第1篇
【关键词】植物细胞 培养技术 研究发展
一、植物细胞培养发展简介
十九世纪九十年代，Haberlandt首先进行了植物细胞的培养；1939年， White， Nobecourt，Gau theret分别，提出非分化的植物细胞可以无限期地进行培养， 为植物细胞培养的发展奠定了基础。1942年，Gau theret发现植物细胞培养可产生次级代谢产物；1954年，Muir等第一次进行了植物细胞悬浮培养；自从1956年， Routine和Nickel首次提出用植物细胞培养技术生产有用次级代谢产物以来， 据不完全统计应用于植物细胞培养技术生产次生代谢产物的植物已达百种以上。
二、植物细胞培养技术
植物细胞的培养方法较复杂，根据培养对象可分为原生质体培养和单细胞培养；根据培养基的类型可分为固体培养和液体培养两大类；根据培养方式分为悬浮培养、平板培养、看护培养及固定化细胞培养等；根据培养规模大小可分为小规模培养和大批量培养。
（一）植物细胞培养的基本技术。
1.固体培养
固体培养是加入一定量凝固剂的液体培养基作为培养基的培养方式，其优点是简便，对实验设备要求简单，缺点是外植体或愈伤组织只有一部分表面能接触培养基，容易产生浓度差，影响其生长速度；同时固体培养基不利于气体交换和物质排泄，造成毒害；另外还有光线分布不均匀等缺点。
2.液体培养
液体培养是以配置的营养液作为培养基的培养方式，液体培养静止液体培养和震荡液体培养。液体培养弥补了固体培养的不足，但要求技术较高，成本较贵。
（二）单细胞培养技术。
1.看护培养技术
用一块愈伤组织来看护单细胞使之生长和增殖的方法称为看护培养。这种从单细胞起源的愈伤组织连同它衍生的培养物一起叫做一个单细胞无性系。此系统提供了一个单细胞系，它的生长因子是由愈伤组织和培养基提供的。
2.平板培养技术
平板培养是将一定密度的悬浮培养细胞接种到一薄层的固体培养基上进行培养的技术。由于平板培养具有筛选效率高、筛选量大、操作简单等优点，被广泛用于遗传变异、细胞分裂分化和细胞次生代谢物合成的种细胞筛选等各种需要获得单细胞克隆的研究。
3.微室培养技术
微室培养是将细胞培养在微量容器的少量培养基中，如凹穴载玻片上或多室培养盘内。优点是在培养过程中可连续进行显微观察以及多因子大量组合实验。但由于培养量少，水分难以保持，培养基的养分及P等也易于变动，细胞短期培养后往往不能再生长。
（三）植物细胞的大规模培养。
1.固定化培养技术
植物细胞固定化是将植物细胞包裹于一些多糖或多聚化合物上进行培养，并生产有用代谢物的技术。是由Brodelius等人于1979年首次生产植物次生代谢物应用成功的。与悬浮培养相比，它具有提高反应效率、延续反应时间及保持产物生产的稳定性等特点。
2.两相培养技术
在培养体系中加入水溶性或脂溶性有机物或者具有吸附作用的多聚物使培养体系分为上下两相，细胞或组织在水中生长和合成次生代谢物质， 次生代谢物质分泌出后再转移到有机相中， 然后再从有机相分离植物次生代谢物的技术， 称为两相培养技术。其优点是由于产物的不断释放与回收，有可能真正实现植物细胞的连续培养，从而降低生产成本。
3.反义技术
根据碱基互补原理，人工合成或生物体合成特定互补DNA或RN段，抑制或封闭某些基因表达的技术， 通过此技术，可以将反义DNA或RN段导入植物细胞，使催化某一分支代谢的关键酶活性受抑制或加强， 从而提高目的物的含量， 同时抑制其他化合物合成。
4.冠瘿培养技术
利用根癌农杆菌感染植物可以将Ti质粒的T - DN段（含有诱导冠瘿组织发生的tms基因和tmr基因）整合进入植物细胞的基因组，诱导细胞冠瘿组织的发生。冠瘿组织离体培养具有激素自主性、增殖速率较快等特点，另外，次生代谢产物合成稳定性和能力较强，用来生产有用的次生代谢产物有良好的开发前景。
5.毛状根培养技术
毛状根是双子叶植物各器官受发根土壤杆菌（A grobacterium rhizogenes） 感染后产生的病态组织。感染过程中，发根农杆菌Ti质粒T - DNA转移并整合到植物基因组中。具有激素自养，增殖速度快，次级代谢产物含量高且稳定等特点。
6.添加诱导子或引导物技术
诱导子是一种能引起植物过敏反应的物质， 当它在与植物的相互作用时， 能快速、高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达， 进而活化特定次生代谢途径， 积累特定地目的次生代谢物， 从而提高植物次生代谢产物的产量。
7.两步培养技术
植物细胞生物量增长与代谢产物积累之间是不同步的，用同一种培养基同时达到细胞的最佳生长和最佳次级代谢产物的积累是不现实的，因此采用两步培养技术，即在不同阶段使用不同的培养基。在细胞的生长阶段使用生长培养基，促进生物量的增长，生产培养阶段使用生产培养基，促进产物的生成，从而达到提高产物产率的目的。
8.植物细胞悬浮培养生物反应器技术
植物细胞悬浮培养生物反应器技术是发酵技术在植物细胞大规模培养的应用。植物细胞培养对反应器的要求简单、坚固、价廉、多用途、操作稳定、维修更换附件方便之外，要求反应器在满足供氧的前提下，能为细胞的生长、次生代谢产物的合成提供一最佳的外部条件，即均一的反应体系、温和的流场、合适的细胞团太小以及分布。生物反应器技术具有很多优点： 工作体积大、单位体积生产能力高、物理和化学条件控制方便等。
9.三维细胞培养技术
三维细胞培养技术是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间中迁移、生长、构成三维的细胞一载体复合物。目前该技术主要应用在哺乳动物细胞培养研究中，涉及到植物细胞培养中的研究报道甚少，但这种多学科的交叉融合和互相渗透无疑将成为今后研究植物细胞培养技术发展趋势。
三、植物细胞培养存在的问题
（一）适用范围较窄。
许多的植物类型或基因型还不能按照人们的目的用现有的技术培养成功。甚至一些重要农作物的基本技术如棉花花药培养研究， 至今尚未取得突破。
（二）所建的技术体系稳定性差。
同一技术在不同实验室、不同的人操作， 甚至不同的批次之间都有差异， 难以推广应用。
（三）随机性太强。
由于组织细胞培养过程中一些作用机制还不太清楚， 当无性繁殖扩增保存材料时， 对无性系变异现象无法控制， 长期培养的材料往往会失去分化能力。而进行无性变异筛选时希望的变异个体又因变异率低而选不出。
参考文献：
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细胞培养范文第2篇
关键词：心肌细胞；细胞培养；三维培养
Abstract：Cell culture is one of the most commonly used and the most important techniques in the biomedical research. In this paper， the classical cardiomyocyte culture methods and the latest progress in this field are reviewed.
Key words：Cardiomyocyte；Cell culture；Three-dimensional cultivation
细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是疾病发生和转归的基础。因此，细胞是生物医学研究中最重要的环节。在体细胞研究存在诸多局限性，如成本高、影响因素复杂、可重复性差等，为解决这些困难，离体细胞培养技术应运而生。细胞培养（cell culture）是细胞在离体条件下的克隆性增殖过程，具有成本低、周期短、数量多、单克隆性、条件可控等诸多优势。可以说，细胞培养技术是生物医学研究中最基础最重要的技术之一。本文仅就心肌细胞培养技术及其进展作一浅述。
1经典心肌细胞培养模型
鼠心肌细胞是心肌细胞培养最常用的材料，包括未成熟心肌细胞（immature cardiomyocyte，ICM）和成熟心肌细胞（adult cardiomyocyte，ACM）两种。ICM培养技术是由Harary等在1960年建立的[1]，经过后人改进形成了经典的Simpson培养法[2]。ICM主要来源于胚胎鼠和乳鼠，以出生3 d内的乳鼠心室肌细胞最常用。ACM相互间有大量闰盘和外基质紧密相连，又没有分裂增殖能力，其分离和培养比ICM要困难得多，直到上世纪60年代才通过逆行主动脉生物酶灌注法分离出单个ACM[3]，但是当时ACM因置于生理浓度钙溶液中而迅速死亡，这个现象被称为"钙反常（calcium paradox）"[4]。1976年， Powell首次报道了分离活性的钙耐受成熟心室肌细胞的技术[5]。Jacobson则在1977年首次成功培养出ACM。
经典的心肌细胞培养技术包括细胞分离、纯化、接种、培养和传代培养等步骤。
1.1心肌细胞的分离 ICM的分离一般采用组织块消化法，即将心肌组织剪成小碎块，然后加入消化分离液将心肌细胞和非心肌细胞分开。消化分离液的主要成分是生物酶，常用的有胰蛋白酶、胶原酶和透明质酸酶[6]，其中胰蛋白酶作用最强，但也最容易损伤心肌细胞；胶原酶作用温和；透明质酸酶作用弱，不宜单用。目前多采用两种或三种消化酶联合，以胰蛋白酶和胶原酶Ⅰ联合最常用。消化分离液中可加入牛血清白蛋白以保护心肌细胞，提高细胞质量[7]；也可加入脱氧核糖核酸酶，防止DNA聚积在心肌组织表面而影响分离效率[6，8]；乙二胺四乙酸（EDTA）是一种常用的螯合剂，能吸附溶液中的Ca2+、Mg2+等金属离子而促进细胞分离（细胞间粘附因子发挥作用需有上述金属离子存在），而且对细胞功能影响极小[9]，故加入EDTA可进一步提高分离效率，但是EDTA不能被血清中和，后续必须洗净，以免影响细胞贴壁。心肌细胞分离后加入含胎牛血清的培养液以终止消化，即得到初步的心肌细胞悬液[10]。在实际操作中，消化分离液的酶类、酶浓度、温度、搅拌转速及时间长短等因素相互影响、相互制约，需要反复摸索才能得到最佳方案。
ACM的分离方法相对更复杂，主要有组织浸泡法、贴块培养法和离体心脏生物酶灌注法。效果最好和最常用的是离体心脏生物酶灌注法，又称为Langendorff离体心脏灌注法，是Oscar Langendorff在1895年发明的[11]，经过预热、消毒、洗涤、经升主动脉逆灌消化酶溶液循环灌流、震荡释放心肌细胞和梯度复钙等步骤，最终得到活性的单个ACM[12，13]。
1.2心肌细胞的纯化 心肌组织由多种细胞构成，以心肌细胞和成纤维细胞样细胞数量最多。在体外培养的特殊环境中，非心肌细胞对心肌细胞的影响是巨大的，主要表现在：①非心肌细胞贴壁和生长增殖能力更强，容易成为优势细胞，通过空间竞争、分泌抑制因子等机制影响心肌细胞的生长增殖和功能[14，15]；②非心肌细胞对干预因素的反应与心肌细胞不同，影响实验结果。因此，细胞分离后的纯化是必要的。常用的纯化方法有差速贴壁法和化学试剂法，主要是除去成纤维细胞样细胞：①差速贴壁法利用不同细胞贴壁速度的不同（心肌细胞贴壁较慢）进行分离和纯化。通过差速贴壁法纯化的心肌细胞纯度可达到90%以上[16，17]，且操作简单、成本低、对心肌细胞影响小，但缺点是作用时间短，不能单独用于长时间培养的实验；②化学试剂法利用某些化学试剂对不同细胞的抑制强度不同来达到纯化目的。5-溴脱氧尿嘧啶核苷可明显抑制成纤维细胞样细胞增殖，而对心肌细胞影响小，是心肌细胞纯化常用的试剂[18，19]。化学试剂能够持续起作用，但缺点是对心肌细胞可能具有潜在影响。在实际操作中，差速贴壁法和化学试剂法常联用。
1.3心肌细胞接种和培养 细胞培养基分天然培养基和合成培养基两种，后者更常用。心肌细胞常用的培养基有DMEM、M199、MEM、EMEM等。为了促进细胞贴壁，培养基中可加入促吸附因子（Ⅰ型胶原、Ⅵ型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白等）；为了预防细菌污染，有时加入抗生素[20]。细胞密度是影响细胞生长、增殖、分化表型、生存时间等的重要因素，接种密度需根据实验目的而定，如果是为了观察单个细胞的行为，密度宜较低，一般为1～2×105/mL；如果是为了获取细胞产物，密度则宜较高，一般为5～6×105/mL[21]。接种在多孔培养板时，应放弃周边孔并加入空白培养基以避免"边缘效应"。
ACM的培养比较复杂，分为去分化法和快速吸附法两种[22]。去分化法使用含血清培养基培养，研究表明[23]，通过该法培养的ACM在超微结构、分子水平和电生理水平表型上都发生了"去分化（dedifferentiation）（向胎儿表型的逆转）"，因此被称为"去分化法"。去分化法的优点是细胞存活时间较长，达数周到数月，缺点是发生了表型逆转而且逆转程度尚不明确[24]，也正因为如此，现在多采用快速吸附法。快速吸附法是将ACM接种在经促吸附因子预处理过的基质上，使用无血清培养基培养。ACM可在接种3 h内吸附到培养基质上，并且始终保持急性分离时的柱形、纹状形态，也不会自发性收缩，尤其适用于分子生物学和电生理试验[25]。快速吸附法的缺点是细胞存活时间较短，只有1～2 w。
1.4 ICM的传代培养 ICM具有分裂能力，为了调节细胞密度，有时需要传代培养。传代培养实质上是将原代细胞收集起来稀释后重新接种和培养的过程。由于心肌细胞是贴壁生长的，传代培养的关键是使细胞脱壁、分离成细胞悬液，分离方法主要有两种：①生物酶法：加入低浓度（0.01%～0.05%）胰蛋白酶溶液使细胞分离；②机械法：通过吸管的刮吹使细胞分离。
2心肌细胞三维培养技术
经典的心肌细胞培养模型，细胞接种在二维基质中，与在体的三维环境完全不同，势必导致细胞在结构和功能上发生一系列适应性改变，影响科学研究的效果。所以，人们迫切需要一种既能尽量保留在体细胞的结构和功能特点、又具有体外培养优势的技术。随着生物、材料、纳米、组织工程等学科的快速发展，细胞三维培养技术应运而生了[26]。
刘霞等用三维的PLGA泡沫支架材料培养乳鼠心肌细胞，观察到心肌细胞形成了心肌组织样结构，超微结构保持良好，代谢活性也较二维培养更高[27]。刘兴茂等将乳鼠心肌细胞接种于鼠尾胶原膜三维支架中培养，并与二维培养作横向比较，发现三维培养的心肌细胞保持了良好的形态和功能[28]。Eschenhagen等将鸡胚心肌细胞接种到胶原凝胶上，观察到心肌细胞形成了可收缩的网络结构[29]。Hussain等将乳鼠心肌细胞与成纤维细胞共同接种于经层粘连蛋白处理过的生物活性壳聚糖纳米纤维三维支架中，发现心肌细胞能长期维持在体的形态和功能，形成同步化收缩[30]。
总之，心肌细胞三维培养技术还方兴未艾，是未来的发展方向之一。
3结论
心肌细胞培养技术已走过半个多世纪的历史，广泛应用于电生理、信号通路、细胞凋亡以及药物安全性评价和新药筛选等领域，为生物医学的发展作出了巨大贡献。同时，随着三维培养、反义寡核苷酸和基因转染等新技术手段的涌现，心肌细胞培养技术又是历久弥新、蒸蒸日上，必将为人类的健康事业更立新功。
参考文献：
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细胞培养范文第3篇
【关键词】 植物细胞培养 条件优化 模型
植物细胞培养始于本世纪初，并不可争议地具有工业化潜力。目前植物细胞培养生产的化合物很多，包括糖类、酚类、脂类、蛋白质、核酸以及帖类和生物碱等初生和次生代谢产物，植物细胞培养的应用主要包括以下3个方面：有用物质（次生代谢产物）的生产；植物无性系的快速繁殖和遗传突变体的筛选；植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的深入研究。但是由于植物细胞大规模培养技术的局限性使得植物细胞仍难以实现大规模工业化生产，迫切需要进一步研究和发展细胞培养条件的优化控制及其工艺。目前，世界上众多研究工作集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高目标产物的产率并保证其生产稳定性上。
1 植物细胞悬浮培养条件的优化
1.1 植物细胞培养过程中物理因素的优化控制对于植物细胞培养来说，环境中的许多物理因素对细胞的生长以及目标次生代谢产物的合成具有很大的影响。如通过温度、光照、电场、磁场电磁辐射、机械力以及超声波等对于植物细胞培养过程都有着十分重要的作用。植物细胞的生长、繁殖和次生代谢物的生产需要一定的温度条件，在一定的温度范围内细胞才能正常生长、繁殖和维持正常的新陈代谢，植物细胞培养的最适温度一般为25℃，但不同的植物种类略有差异，而且植物细胞生长和次生代谢产物的合成所需的温度并不一致，因此选择合理的培养温度并进行相应的调控对于细胞生长以及产物合成十分关键，H.J.G.ten Hoopen等［1］曾对Catharanthus roseus细胞的培养过程、Toshiya Takeda等［2］对Strawberry细胞的培养过程分别进行温度的阶段性调控，结果都在很大程度上提高了产物的产率；培养基的pH值与细胞生长繁殖以及次生代谢产物的生产关系密切，与培养温度相似，细胞的生长繁殖与次生代谢产物合成时所需的pH值通常并不一致，需要在不同的阶段控制不同的pH值；目前关于电场的作用机理膜周电泳学说，该学说认为对细胞施加稳定的电场能够导致膜中带电物质的重新分配，最终导致原生质体生长和分化效应。石贵玉等［3］曾对银杏细胞培养细胞施加一定的高压电场进行刺激，结果发现对细胞的相关指标产生了较大的影响；而磁场的作用机理使它加速了细胞内的氧化磷酸化过程，从而促进ATP的合成，最终使得有丝分裂指数增高。王曼丝等［4］和洪丽萍等［5］分别研究过磁场对滇紫草细胞培养过程的影响；有研究表明［6］宇宙中的电磁波对生物体都会产生巨大的影响；超声波的运用主要是有利于细胞次生代谢物向细胞外释放。目前在这些方面的一些研究主要还是停留在机理的探讨上，而如何在细胞大量培养时综合利用并对这些因素进行调控还有待进一步的研究。
1.2 植物细胞培养过程中化学因素的优化控制植物细胞培养过程中的一些化学因素如培养基组成、溶氧、其它添加物等对于细胞的生长也具有十分重要的意义。合理的培养基组分、适当的溶氧以及其它诱导子及其前体等物质的有效调控能够在很大程度上促进细胞的生长以及次生代谢物的合成。培养基中的碳源、氮源及其一些微量的金属离子以及一些有机物质不仅是细胞生长以及合成的物质基础，而且很多都能够促进细胞生长或者是有利于产物的形成。植物细胞培养通常使用蔗糖作为碳源，研究表明，一定浓度的蔗糖不仅能够促进植物细胞的生长，还能够刺激次生物质的合成，Fujita等采用4%（W/V）的蔗糖浓度培养紫草细胞，结果仍能提高花色素的产量，Venkatesh等通过交替流加碳、氮源紫草宁的实验发现，在一定范围内，碳源浓度的提高有利于色素的产生，但当蔗糖浓度大于5%时，对紫草宁的合成开始产生抑制作用；氮源的主要作用是促进细胞分裂，合成蛋白质与核酸等细胞物质，培养基中的氮源可分别以［NH4+］和［NO3-］的形式存在，氮源浓度有最佳范围，而［NH4+］/［NO3-］的浓度比对细胞的生长代谢也非常重要；其它一些金属离子以及一些有机诱导子的添加也会对培养细胞的生长以及次生代谢产物的合成产生影响；在植物细胞悬浮培养中，溶氧对细胞的生长和代谢有很大的影响［7，8］，同时，在培养条件中溶氧也是最复杂的因素之一，溶氧有一定的极限，过高或过低都会影响到细胞生长和产物合成，特别是在高密度培养时，供氧不足往往可能是限制产量的主要因素之一，因此溶氧参数的调控对于植物细胞培养十分关键，Jin-Han等研究了氧分压对Panax notoginseng培养细胞生长以及人参皂苷和多糖合成的影响，发现高的氧分压抑制细胞生长，同时也不利于产物的合成。
2 植物细胞培养相关模型的研究进展
利用植物细胞培养生产药物，已发展成植物细胞培养在生产运用中的主流之一。目前全世界约有四分之三的人以植物作为预防疾病的药物来源。因葡萄球菌、大肠杆菌、结核杆菌等都表现出对由微生物来源的各种抗生素的耐药性，人们对抗生素类药的局限性已有了深刻的认识。植物产生的药物在微生物中很少发现，而且植物产生的药能克服微生物来源药物的诸多不足，而化学合成药物的难度又远远超过了从植物中获得天然产物。然而由于药用植物的过度采伐，其资源日趋贫乏，同时对环境也造成了极大的破坏，因此为了解决植物资源短缺、环境保护等问题，药用植物细胞的大量培养显得十分重要。目前国内外在药用植物细胞培养方面的研究取得了很大进展，特别是运用生物反应器进行药用植物细胞大量培养的技术正日趋成熟。在植物细胞放大培养的过程中最关键的问题是建立对培养过程中各种现象进行合理描述的模型， 为细胞的大量培养奠定基础。目前国内外在植物细胞培养过程动力学模型的研究方面取得了很大的进展。植物细胞培养始于20世纪初， 运用生物反应器对植物细胞进行大量培养的报道最初始于1960年，Tuleche和Nickel运用134L的生物反应器成功培养了不同种类的植物。但由于植物细胞固有的性质代谢途径和代谢产物与细胞生长关系的复杂性，细胞与培养环境相互作用，使得对植物细胞的放大培养变得难以实现，只有针对不同的植物细胞，采用相应的简化策略建立细胞培养模型，逐级模拟和优化培养过程才能够最终实现细胞的大量培养。现分别就近几年关于植物细胞培养过程的动力学模型的研究进展进行归纳。
2.1 植物细胞培养非结构化动力学模型最初植物细胞培养的数学模型的建立是在细菌等微生物培养过程动力学模型的基础上发展起来的。在传统的微生物发酵过程中通常都是以一个简单的生物量组分来进行模型化，因此都是非结构化的，如Monod模型、Nyholm模型及其Leudeking-piret模型等，这些类型的模型通常都只能够考虑一些单组分的变化情况，而不能够考虑到植物细胞组分的多样性和细胞在培养过程及其代谢过程中变化的复杂性，如次生代谢产物的生成和细胞生长以及细胞在代谢过程中其它中间物质之间的相互转化的复杂关系等。因此这类模型不能够预测植物细胞培养过程中的很多行为，对于植物细胞的放大培养的指导性也十分有限。
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2.2 植物细胞培养结构化动力学模型随着对植物细胞培养过程的研究深入进行以及对植物细胞代谢过程的明朗，植物细胞培养的多样性也有了较多的认识，从而开始运用复杂的数学模型——结构化数学模型——来描述植物细胞的培养过程。由于结构化数学模型考虑了培养细胞组分的多样性及其之间以及细胞与环境之间的生理生长关系，因此能够较精确地描述植物细胞的培养过程。这类模型对于分析细胞内的代谢调控很有价值，能够为培养过程提供更加清晰、更加定量的依据，其分析结果对于进行细胞培养过程的优化具有较强的指导性。到目前已经有4种结构化数学模型运用于植物细胞培养的研究之中：
第一类模型是由Frazier等在1987年提出了一个基于两种代谢中间物的动力学模型，用于解释细胞生长及与生长相关的产物合成之间的相互作用，1989年他又提出植物细胞处于细胞团的小环境中，其生长受中间代谢物控制的模型，该模型预测在细胞生长过程中存在一个延迟期。这类模型关键在以细胞培养中间代谢产物的生成和释放行为为建模依据建立模型来解释细胞生长及与生长相关代谢产物之间的关系。
第二类模型把细胞的存活率引入了建模中，分析了细胞活性与细胞生长、底物消耗以及代谢产物的形成之间的相互关系。在1989年Bailey和Nicholson提出了一个新的模型，在这个模型中考虑了细胞鲜重和存活率两个新的变量，这种模型能够预知细胞的膨胀和溶解过程。1990年Mathisca 等［9］又提出了一个能够区分分裂细胞和非分裂细胞的生长模型。到1998年，在Bailey和Nicholson提出的模型的基础上，Glicklis［10，11］在假设只有存活细胞生成产物多糖，底物消耗不用于维持细胞生长的前体下提出了一个植物细胞悬浮培养生成多糖的动力学模型，并通过Symphytum officinal L.的悬浮培养确定其多糖的合成属于生长相关型。
第三类模型属于考虑底物吸收及其活化机制的结构化模型。1992年Brian S. Hooker 和James M. Lee以细胞吸收培养基中的物质蔗糖等以及其在细胞内的代谢为基础， 通过一定的假设和简化，建立了考虑细胞生长、产物生成以及细胞呼吸作用的结构化数学模型，通过对细胞结构化的组成物、次生代谢产物的形成和细胞呼吸作用的检测来研究细胞在培养过程中内部的相互作用，并且将生长竞争型和非生长竞争型次生代谢产物区分开来。这个模型第一次说明了底物吸收和活化机制，模型的预测与实验有一定的相符合性。在2000年薛莲等［12］以培养基中碳源在培养过程中所经历的途径为依据，建立了紫草细胞悬浮培养的结构化动力学模型来描述细胞的培养过程，参数优化的结果使模型能够较好的反映培养体系的变化情况。这种结构化模型较之Hooker等建立的模型更加简单，而且参数较少容易检测，有较强的实用性，在2003年李踳等［13］也以同样的方法对红豆杉细胞培养建立了相应的模型，其实验结果也证明了该模型能很好的描述培养过程，通过对两种细胞培养建模的成功实现证明了该模型对于植物细胞培养存在一定的通用性。
第四类模型主要考察了在细胞培养过程中其它重要盐类物质如磷酸盐和钙盐等对细胞培养生长或产物形成的影响。1993年Guliklis等［14］提出了一个关于长春花细胞在不同磷酸盐水平下进行分批培养的结构化模型，模型不仅成功的描述了批式培养时细胞在不同磷酸盐浓度下的生长情况，而且对细胞在恒化器中的培养情况也有较好的预见性。Bramble等也提出了一个考虑钙盐和磷酸盐对咖啡细胞悬浮培养的影响的结构化模型，能够预见生物碱的形成速率，与实验结果具有很好的一致性。1999年，许建峰等［15］以磷酸盐与细胞生长和代谢产物的生产的关系建立了高山红景天致密愈伤组织颗粒悬浮培养的结构化动力学模型， 该模型能够计算并预测接种量、接种无“年龄”及培养基中初始磷酸盐浓度对高山红景天致密愈伤组织生长与红景天甙的影响，模型能够基本上反映高山红景天致密愈伤组织悬浮培养的动力学规律。
2.3 植物细胞培养人工智能仿真模型最近由于计算机技术的突飞猛进，特别是其在生物学中的运用，使得计算机技术在细胞培养中的运用也有了很大的进步。因为植物细胞在培养过程中因素众多，各种因素对细胞培养的影响也是交错复杂，很难精确地运用纯粹的数学方法进行描述和优化，而运用计算机技术进行人工智能仿真模拟能够弥补数学方法的不足。作者在对怀槐细胞培养过程中，为了考察氮源和激素对培养细胞生长和产物异黄酮合成的影响，运用神经网络和实数编码的加速遗传算法对过程进行建模并进行模型参数优化［16］，模拟结果与实验结果具有很好的一致性，而且优化的氮源和激素组合使得培养细胞的异黄酮产率较对照有很大的提高。
3 植物细胞生物反应器培养
自从1960年Tuleche和Nickle首次报道在134L生物反应器中成功培养不同植物种类以来，利用植物细胞大规模培养技术为植物有用代谢产物的生产提供了有效途径和生产方法。由于植物细胞固有的性质，如细胞容易聚集、细胞分化、细胞十分脆弱以及代谢途径和代谢产物形成与细胞生长关系复杂，因此在植物细胞培养时选择合适的反应器类型及操作方法极大地关系到植物细胞代谢产物的合成。
利用生物反应器来培养植物细胞相对与利用摇瓶来讲有两大优势，首先可以更好的控制反应系统(比如pH值和溶氧浓度可以在线监控等)；第二点优势在于许多生物反应器可以放大，可以更好的运用于大规模的工业化生产。运用于植物细胞培养的生物反应器主要有：搅拌式反应器、气升式反应器、鼓泡式反应器、膜反应器、光照培养反应器和转鼓式反应器等。各种反应器都有自身的特点和优点，在选用反应器时要根据不同的植物细胞特点选取相应的反应器类型。在运用反应器培养植物细胞时反应器的操作策略也是多样的，如间歇培养、流加操作、连续培养和两段培养等。但在反应器培养时主要考察的参数是系统的溶氧速率以及其调控方式的优化。
4 展望
虽然通过植物细胞培养生产药用成分取得了很大的进展，目前已经研究过的植物有400多种，能够生产超过600多种的成分，其中有相当大部分具有药用价值，而且也有不少成功实现工业化生产的实例，如日本实现的紫草细胞培养生产紫草宁、人参细胞培养生产人参皂苷以及黄连细胞培养生产黄连素等。但药用植物细胞大量培养的研究还有很多关键性的问题没有得到根本性的解决，始终制约着药用植物细胞培养实现工业化生产的进程，这其中最主要的问题还是如何建立出适合不同植物细胞培养体系优化和放大的模型。因此对于植物细胞培养过程进行建模以及细胞培养规模放大的研究仍然是一项十分有意义而又艰巨的研究任务。
【参考文献】
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［3］石贵玉，周巧劲，张振球，等.电场对银杏愈伤组织生长的影响［J］.生物物理学报，1999， 15(3): 547.
［4］王曼丝，李洪摘，曹日强.滇紫草愈伤组织辐射和磁场效应研究初报［J］.南京大学学报，1994， 30(1): 80.
［5］洪丽萍，黄维南，王曼丝.激光和磁场对滇紫草愈伤组织色素含量的影响［J］.亚热带植物通讯，2000， 29(2): 11.
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细胞培养范文第4篇
【关键词】 羊水细胞培养；产前诊断；染色体核型分析
产前诊断方法中最为广泛且可靠的方式是羊水脱落细胞培养和分析染色体核型分析[1]。本文旨在研究羊水细胞培养在产前诊断中的应用价值， 现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 选择2012年4月～2013年4月在本院产科就诊的具有产前诊断指征的178例孕妇， 年龄20～47岁， 孕周16～25周， 有70例孕妇唐氏综合征筛查为阳性， 23例孕妇有异常生育史， 60例孕妇年龄≥35岁， 14例妇女于早孕服药， 6例孕妇神经管急性筛查为阳性， 5例孕妇丈夫染色体异常。
1. 2 方法
1. 2. 1 羊膜穿刺 经B超定位后， 在无菌条件下， 用一次性羊水穿刺针行羊膜穿刺术。舍弃最开始的2 ml羊水， 再抽取20～30 ml的羊水放入2支无菌离心试管中。
1. 2. 2 羊水细胞培养 以1000 r/min的离心速度将2支无菌试管中的羊水进行离心处理达10 min， 舍弃上层清液， 保留管内沉淀细胞和0.5 ml羊水， 加入20%胎牛血清及含张氏成分的5 ml F10培养基， 用细管使之混匀， 将其接种于T-25的无菌试管中， 在37℃有5%二氧化碳培养环境中进行培育， 5 d后观察细胞生长情况， 若发现纤维状或者梭状细胞生长是， 则可更换5 ml新鲜培养液进行传代培养[2]。
1. 2. 3 收获细胞并进行制片 在对羊水细胞进行培养6～7 d后， 在倒置的显微镜下对正在培养的羊水细胞进行观察， 观察其生长情况， 发现有不同大小的梭长形细胞正在进行克隆并生长， 每个克隆过的细胞其生长状态良好并且已经形成细胞岛。对培养皿中的培养液进行定时的更换， 每天对细胞进行观察， 在观察2～3 d后， 发现每个形成的细胞岛已经逐渐长成为透亮细胞， 这些细胞较大， 细胞融合度达到70%～80%， 并且数目不等， 形状多呈圆形或类圆形， 这时即可对细胞进行收获。在对细胞进行收获的前1 d， 更换新鲜培养液， 在培养液中加入秋水仙素， 使其浓度达到0.1 mg/ml， 在4～5 h后， 使用显微镜观察， 发现培养液中出现大量的呈鱼眼状的细胞时， 即可对细胞终止培养并进行收获。加入0.25%的2 ml胰酶消化液， 在37℃的环境下放置5 min， 使得瓶壁上细胞脱落， 再以1500r的转速离心处理8 min， 弃上清液。加入1.5 ml的0.4%枸缘酸钠和0.4%的氯化钾混合液低渗7 min， 滴片， 常规G显带。每张玻片有20～30个细胞分裂相， 进行染色体核型分析， 每例分析核型5个。
1. 3 核型统计分析 使用显微镜对细胞核型进行观察， 常规技术分散良好的细胞核型有30个中期分裂相， 细胞核型计数发生异常的则有50个分裂相， 如出现≥2个细胞核型计数异常， 则对所有分裂相进行计数， 使用染色体核型分析软件对核型图像进行采集， 对3～5个核型进行分析， 并完成报告， 为遗传咨询提供意见。
2 结果
进行羊水穿刺培养一次性成功的患者有178例， 成功率高达100%， 其中有11例患者进行血性羊水培养并且取得成功。178例患者的培养时间为9～14 d。
本研究中178例孕妇有10例胎儿染色体异常者， 其中唐氏综合征阳性组占有1例结构异常和1例数目异常， 占20%；高龄产妇组有3例数目异常， 占30%；异常生育史组有1例结构异常， 占10%；夫妇一方染色体异常组有2例染色体结构异常， 占20%；超声检查异常组有2例数目异常， 占20%。10例染色体异常者中， 有6例数目异常， 4例结构异常。178例孕妇中10例胎儿染色体异常， 检出率为5.62%。
3 讨论
导致新生儿出生缺陷的重要原因之一就是染色体病， 然而， 这可以通过产前诊断进行预防。在孕中期进行羊水检查， 操作安全便捷， 细胞培养成功率相对较高， 及早发现异常情况能够及时终止妊娠。
有研究表明， 胎儿染色体异常在对具有产前诊断指征孕妇中的异常检出率在3.8%～7.7%[3]。本研究结果显示该组胎儿异常检出率为5.62%。据相关报道显示， 35岁以上的孕妇胎儿出现唐氏综合征的几率15%～31%， 大部分均出现在>35岁的孕妇群体中。这说明唐氏综合征血清学筛查尤为重要。对于年龄≥35岁的孕妇出现非整倍体的几率显著高于年龄
为了预防和减少染色体异常胎儿出生， 作者认为产前诊断中进行羊水细胞培养意义重大。首先， 产前诊断中进行羊水细胞培养能有效提高我国人口素质。本研究结果显示， 胎儿染色体异常检出率为5.62%， 对于这类胎儿， 可以提前建议孕妇进行引产；其次， 通过对孕妇年龄、游离β人绒毛膜促性腺激素和血清甲种胎儿球蛋白（AFP）进行筛查后， 有产前诊断指征的高风险孕妇在医师的指导下对产前诊断知识有了更深入的认识， 更好地配合检查， 提高检出率；在羊水细胞培养过程中， 对细胞进行转瓶培养， 大大增加了羊水细胞培养的成功率， 为临床上其他项目提供了便利。
综上所述， 羊水细胞培养应用于产前诊断中， 操作便捷、创伤小、效果安全可靠， 还可分瓶进行传代培养， 提高了细胞培养成功率， 值得临床上广泛推广使用。
参考文献
[1] 鲁莉萍， 陈意振， 张莉超.羊水细胞培养在产前诊断中的应用――619例染色体核型分析.中国优生与遗传杂志， 2005， 13（5）：32-32， 56.
[2] 王丽娟， 段程颖， 傅文宇， 等. 902例产前诊断染色体核型分析. 苏州大学学报（医学版）， 2008， 28（5）：862-863.
[3] 刘晓翌， 肖晓素， 樊尚荣， 等.羊水细胞培养用于染色体病产前诊断64例分析.中国实用妇科与产科杂志， 2005， 21（7）：420-421.
细胞培养范文第5篇
【摘要】本文建立了反相色谱法同时测定细胞培养基M199中维生素A、维生素E醋酸酯、维生素D2的含量的方法。采用Lichrospher C18，5μm，225×4mmid柱，可变波长UV检测器，甲醇为流动相，样品在10分钟内达到了基线分离。该方法简便、快速，结果可靠，可用于细胞培养基的质量控制。
【关键词】细胞培养基 维生素 高效液相色谱法
细胞培养基作为细胞工程重要的原材料，其品质的优劣直接影响到生物制品的质量，是生物制品企业非常重视的基础原料。而细胞培养基中含有氨基酸、维生素等必需的营养物质，它们是维持和促进细胞生长、增殖的主要因素。这些物质含量的多少、是否符合规定已成为衡量细胞培养基质量的重要指标。其中的某些维生素成分如维生素A、维生素E、维生素D2等对空气、光照和热极不稳定，且在培养基中的含量极少，是细胞培养基质量稳定性的重要影响因素。在细胞培养基M199中这三种维生素组分的含量在0.01μg/ml～0.14μg/ml之间，参考已报道的文献，脂溶性维生素的测定大都是含量较高的复合制品，而从含有61种成分的M199细胞培养基中提取这三种维生素并进行测定还未见报道［1～4］。由于这三种维生素的含量极低，在同一波长下难以同时测定三种组分，因此，我们采用可变波长UV检测器，利用多波长切换来分别测定VA、VD2和VE，以提高检测灵敏度，获得了良好的结果。
1实验部分
1.1 仪器和试剂：HP1050型高效液相色谱仪包括：HP 四元梯度泵、HP自动进样器、HP 可变波长紫外检测器、HP Pheonix Dos化学工作站；分析天平BS210S，赛多利斯；旋转蒸发器RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂；维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素E醋酸酯均为sigma试剂；甲醇为色谱纯；氯仿、异丙醇为分析纯。细胞培养基M199，无锡市美迪生物制品有限公司。
1.2 色谱条件：色谱柱：Lichrospher C18，5μm，225×4mmid；流动相：甲醇；流速： 1.0ml/min，柱温控制：40℃；进样量：30μl；波长切换程序：时间0.0～6.0min 检测波长320nm，时间6.0～8.5min 检测波长265nm，时间8.5～10.0min 检测波长295nm。
1.3 标准品溶液：精密称取维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素E醋酸酯适量，用异丙醇溶解并稀释至下列浓度：维生素A醋酸酯1.4μg/ml、维生素D2 1.0μg/ml、维生素E醋酸酯0.1μg/ml，作为标准品溶液。
1.4 样品制备：取M199细胞培养基5g，精密称定，置250ml分液漏斗中，加入50ml纯化水完全溶解；加入氯仿振摇萃取，萃取5次，每次加入氯仿20ml；合并氯仿层放入250ml旋转烧瓶中，置旋转蒸发器上旋转蒸发至干（35℃），精密量取5.00ml异丙醇至烧瓶中溶解残渣，溶液即为供试品溶液。
2结果与讨论
2.1 色谱分离：根据1.2色谱条件进行色谱分离试验。结果表明，该条件下10分钟内可以有效的使维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素E醋酸酯三种组分达到基线分离，色谱图见图1。
图1维生素色谱分离图
2.2 线性关系：分别取维生素A醋酸酯、维生素E醋酸酯和维生素D2标准品溶液0、1、2、2.5、3ml，置10ml容量瓶中，用异丙醇稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件，分别进样30μl，计算浓度C（μg/ml）与峰面积（A）之间的线性回归方程：维生素A醋酸酯 A=96.95C-1.76，R=0.9998；维生素D2 A=62.83C-0.45，R=0.9998；维生素E醋酸酯 A= 13.09C+0.20，R=0.999；结果表明，维生素A醋酸酯在0.14～0.42μg/ml、维生素E醋酸酯在0.01～0.03μg/ml、维生素D2 0.1～0.3μg/ml内，与峰面积有良好的线性关系。
2.3 精密度试验：分别取标准品溶液的1ml稀释液，重复进样6次，计算峰面积的相对标准偏差，RSD（n=6）分别为：维生素A醋酸酯1.45%、维生素D2 1.31%、维生素E醋酸酯3.17%，精密度良好。
2.4 回收率试验：在样品中加入三种组分，按上述色谱条件测定维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素E醋酸酯的回收率，平均回收率为95.9%～100.8%，见表1
2.5 样品测定：取三批样品适量，精密称定，按1.4样品溶液制备方法制备供试品溶液，进样量30μl测定峰面积，按外标法计算样品含量，结果见表2
2.6 讨论
维生素A醋酸酯、维生素D2、维生素E醋酸酯的紫外最大吸收波长分别为320nm、265nm和295nm；由于三种组分在细胞培养基中含量都极小，浓度分别为0.14μg/ml、0.10μg/ml和0.01μg/ml，故本法采用多波长切换来进行测定，以提高检测灵敏度；另外细胞培养基成分非常复杂，给脂溶性维生素分离带来相当大的困难，我们在样品前处理时采用了溶媒萃取法；上述两个原因给分析测定带来一定的偏差。由于这三种脂溶性维生素对光、热、空气极不稳定，故我们可以通过测定这三个组分的含量来反映细胞培养基的质量稳定性。本法较好的测定了细胞培养基M199中脂溶性维生素的含量，为细胞培养基的质量控制提供了检测手段。
参考文献
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