美丽的颜色

前言：想要写出一篇令人眼前一亮的文章吗？我们特意为您整理了5篇美丽的颜色范文，相信会为您的写作带来帮助，发现更多的写作思路和灵感。

美丽的颜色范文第1篇

当我踩在青草地上　 呼吸着来自森林的鲜美空气　 我感到大自然的芬芳　 充满了我的脆腔　 我的肺叶　 一定也像阔大的贝叶一样　 布满了美丽而健康的　 生命色素　 而我的双臂　 也像一双迎风扩展的　 向着大森林飞去的鸟的翅膀

绿色!绿色!绿色!　 它是我们这个世界最美丽的颜色　 绿色的大森林　 它是我们碧绿的生命之水　 是我们人类的摇篮　 是我们美丽星体的盛装

热爱我们的森林　 热爱我们绿色的大自然吧　 像热爱我们自己的生命一样　 保护我们的森林　 保护我们的每一株绿色植物吧　 像保护我们每个人的肺叶一样

给每一只小鸟一座绿色的楼房　 给每一头小鹿一片幽深的密林　 给每一棵小树一方纯净的天空　 给每一丛小花一块湿润的土壤　 让一切滥伐者都醒来　 放下爷头和锯子　 让一切制造污染和火灾者　 幡然悔语

那时候,请相信吧　 整个人类都将与大自然相亲相爱　 即使是高楼林立的城市　 也将紧紧地依偎在大森林的身旁　 美丽的绿荫　 将在世界的每一处轻轻摇荡

美丽的颜色范文第2篇

在睡梦的天边悠然生长

在人生的步伐里悄然逝去

在回望，在归期，在不能到达的永恒里

撑起翻好的记忆，在思绪里折下空隙

夜里的精灵在哭泣，拍打着我狂乱的心思

夜如黑夜，我如我忧伤的心灵

灯光也生了情，在我的怀抱里写了诗

在黑色里我寄给你我的心情

是怕打扰你的梦和梦中的人

美丽的颜色范文第3篇

滨崎步、张韶涵……细细数来，当红的偶像明星们个个都拥有一双电力十足的水灵大眼！怎样才能让自己的眼睛也变得又大又漂亮呢？无论你是单眼皮女生，还是肉肉眼美女，我们都拥有一个相同的目标，就是能让眼睛大一点，再大一点。美眉们，一起加入电“眼”女王速成班，让你的双眸电力四射，魅力无法阻挡！

流畅粗眼线

1、不要用眼线液来勾下眼线，这会让你看起来像埃及艳后般俗气。如果你是一个初学者，那么还是建议你使用眼线笔。眼线液虽然很好，但不容易控制，还是留给高级班的美眉吧。

2、除了黑色，蓝色、紫色和棕色都是很适合亚洲人使用的颜色。一切浅色和高光色都不能让你的眼睛变大，只会让你的眼睛变得比原来更小。所以一定要慎重。但是当你把白色眼线和黑色眼线搭配使用时，将会达到意想不到的效果呢。

3、通过眼线来改变眼型的方法还有很多：如果你是眼角下垂的下垂眼，那么建议你在画上眼线的时候稍稍挑起，并且将眼尾加粗；如果你是细长眼美眉，你可以通过加粗上眼线中部的方法，让眼睛变得又圆又亮；如果你想给自己增加一点性感女人味，那么试着从上眼皮1/2处向眼尾画一条上挑的眼线，就能拥有像李■那样性感的凤眼了。

浓睫芭比眼

1、任何买来的假睫毛都要经过剪裁，直到适合你的眼睛轮廓才可以用。因为假睫毛的尺寸是固定的，但是我们每个人的眼睛都不尽相同，所以啦，想要有好的效果就不要偷懒啦！

2、假睫毛贴在不同的部位会有不同的效果，比如贴在上眼皮中部，会让眼睛看起来像圆圆的天真眼，如果是贴一两簇在眼尾，又会变成高贵优雅的魅惑眼，贴一整帘再加上双重浓密睫毛膏，即使是萧亚轩的迷蒙眼也变得电力四射了！

3、假睫毛虽然精美，同时也很脆弱，在每次使用时都要小心。不要用力拉扯它的边缘，要顺着睫毛的方向，用两只手轻轻地取出来；从眼皮取下时，要捏住假睫毛的一头，“刷”的一下子拉下，动作干脆利索，不要拉着二三根睫毛往下揪。用过的假睫毛要彻底清除上面的粘合胶，整整齐齐地收进盒里晾干后才能继续使用。

渐层式小烟熏

1、烟熏妆开始于2006年的秋冬，从此便一发不可收拾，今年秋冬的彩妆趋势中依然“烟雾缭绕”！在生活中过于夸张的烟熏妆不但不美，还会让你看起来像个脏兮兮的熊猫宝宝。

2、在晕染眼影的时候一定要有耐心，眼头的色彩较轻柔，眼影范围也不必晕染太大，但一定要有层次感。如果你是一个清秀的单眼皮美眉或者是个眼袋美眉，你也可以尝试比较生活化的烟熏妆，眼影的范围要小，可以省去下眼睑的眼影晕染。用软质的眼线笔描绘眼线后，将眼线上下范围晕染开来，再与相近色的眼影融合即可。

3、建议你在眼头和眉弓，还有鼻梁的部位用白色珠光眼影提亮，可以改善亚洲人平板的面孔，加强面部立体感！

睫毛篇 ■

爱美的美眉们谁不想拥有一对浓密而卷翘的纤长睫毛，顾盼流转之间风情万种，或纯真可爱，或迷离诱惑，将女人的娇媚体现得淋漓尽致？许多图省事的MM就想到了去美容院做“睫毛嫁接”。这项美容服务如今已经风靡大江南北，只需用些许特殊胶水粘上漂亮的假睫毛，几十分钟后眼睛上就生出了两排浓密的小扇子，忽闪忽闪的眼睛神采飞扬。可最近曝光的“劣等假睫毛”导致的美容风波又让好多人为之却步。其实只需正确使用睫毛膏，不用“嫁接”你也可以拥有奥黛丽・赫本那般如梦如幻的双眼。

步骤一：弯弯上翘的睫毛让人看起来明媚可爱，我们首先要做的就是夹睫毛。夹睫毛时眼睛往下看，睫毛夹要放到接近睫毛根部的位置，手由眼尾往眼头方向分三段把睫毛夹翘，夹的时候要轻轻用力往上提拉，可以让睫毛自然上翘，不过注意不要用力过大，睫毛是很娇贵的，不小心爱护就会掉下来。夹下睫毛时眼睛往上看，反手用睫毛夹轻轻夹住，下睫毛比较稀疏，动作更要小心哦。

步骤二：许多美眉都抱怨自己的睫毛稀疏，用纤长型睫毛膏拉长了也不好看，感觉睫毛就跟营养不良似的。其实只需在上睫毛膏之前，先用蜜粉轻轻刷在睫毛上，就可以增加睫毛的浓密感。也可以先刷一层睫毛底膏，再刷普通的睫毛膏，也会使睫毛的浓密超过一般程度，滨崎步的眼妆就是这样化的哦。没有睫毛底膏的美眉可以等刷的第一层睫毛膏干了之后，再刷一层，同样可以达到增加睫毛浓密度的效果。

步骤三：用睫毛膏的时候，先从上睫毛刷起，用Z字形的刷牙方式刷，这样可以防止睫毛打结，将睫毛膏刷在睫毛的根处稍微用力压一下，这样可以增加睫毛根部的支撑力，上翘的效果会比较好看，再由上往下将睫毛刷翘。然后用螺旋状的睫毛刷将睫毛轻轻梳开，就可以拥有丝丝分明、浓密卷翘的迷人俏睫毛了。刷下睫毛要用睫毛刷的尖端，可以让眼睛变得更大，显得明亮有神，不过经常熬夜有黑眼圈或眼袋比较大的MM就不要刷下睫毛了，否则会让缺点更加暴露，反而显得眼睛没有神采。

步骤四：东方人的肤色较黑，直接使用彩色睫毛膏并不好看，用黑色睫毛膏刷出的两把小黑扇子反而更加动人，每一次眨眼时睫毛微微的颤动都会勾起人心底的一份怜爱。

喜欢新潮炫色的美眉可以先刷一层深色的睫毛膏，睫毛变得分明、浓黑之后，在睫毛尖端再刷上一层浅色的睫毛膏，就可以拥有多层次感的绚丽睫毛，同样前卫，效果却好得多。也可在上下睫毛刷上不同色系的睫毛膏，展现绚丽迷人的眼妆效果。

睫毛修护锦囊 ■

虽然睫毛膏可以让你的睫毛迅速变得弯翘迷人，但是晚上卸妆的时候一定要清除干净，让睫毛美美地睡上一觉，第二天才能继续让你神采飞扬。卸妆的时候用力一定要恰当，用力过大很容易弄掉睫毛。

美丽的颜色范文第4篇

关键词：农村小学；美术教育；现状；对策

一、农村小学美术教育的价值空间

当前农村基础教育阶段中的美术教育，是提高整个国民文化素养的重要组成部分。因此，加强地方特色在农村小学美术教育中的应用显得非常必要。

上美术课是学生深感快乐的事，小学生学习美术，有利于开发智力，提高其审美能力和想象力，促进其综合素质的全面发展。当然，美术教育的育人是潜移默化的，不可能有立竿见影的功效。这就说明小学美术教育提升空间很大。

二、农村小学美术教育现状分析

1.美术教育地位低微

目前，很多农村学校的学生家长认识不到美术教育是对创造性思维和创造力培养最具成效的学科之一。家长不重视，学生应付，有学生说：“只要语、数、英觉得好就可以，因为爸妈觉得美术工具浪费钱，不给买美术工具。”然而，面对内容丰富的美术教材，基本的绘画工具还有手工材料，却由于工具不齐全而大大影响了美术课的教学质量。其他学科的教师觉得美术教师很轻松，没有语文课的之乎者也；没有数学课的数字游戏；更没有英语课的ABCD，无非是画画，学生吵闹也是正常，若有需要思想教育，学习辅导的，更被视为剥夺学生的美术课。其实不然，美术学科是在夹缝里求生存、难度极大。

2.对学生安全的局限

学生的安全是第一，这是毋庸置疑的，但如今安全变得让教师在某些学习活动上畏手畏脚，要带出校园写生，几乎没有教师敢去承担这份风险，而在农村小小的校园发挥的余地甚少。因为安全问题，教师又不敢放开手脚大胆地把学生带到农村特色的周边环境进行写生教育、观察教育，如此一来，直观感受受到极大的限制，必然大大打击教师的热情，降低学生的学习积极性。

3.师资力量匮乏

很多农村学校的专业美术教师非常缺乏，都是由其他科目的教师兼职上课。本人的经历是，我所在的学校11个班级，就我一个专职的美术教师，本校的课程都承担不完，却要配合教育局的“三校绑定资源共享”奔走于另一个更偏僻的农村学校，花一个上午去上两节课，下午再回本学校上三节课，而结果就是，本来可以从一年级抓起的本校学生让兼职教师教，所教的班级在美术素养上是有所提高，但这不是多此一举吗？缺的还是缺，拆东墙补西墙，累的是靠两条腿奔走的教师。

三、农村小学美术教育融入地方特色的途径

虽然农村教学设施落后于城市，但是农村本身就是一个蕴含美术创作美的地方。教师应当积极引导学生从质朴可爱的土地上发掘出灵感，让他们时刻注意身边的人和事，去尽情地描绘生活，丰富他们的内心世界。

1.以地方资源，展示农村印象

农村是一本五彩斑斓的教材，它展示着不同风景的四季，拥有着辽阔的田野，秀气的山峰，清澈的溪流，独特的古建筑等。买不起彩色橡皮泥，可用田里的泥巴代替，校园外面各种各样的树叶也是入手的材料，叶子贴画，叶子拓印画，还有山上的松果也可以是手工课的材料，还有瓦片，更不用说光滑的鹅卵石，花丛里多彩的蝴蝶等，这无疑是大自然对农村学生的恩赐，教师应当鼓励学生从家乡挖掘美，在美术作品中展现美。通过对生活的观察，描绘自然，学生对家乡的热爱会更加浓烈。

2.从农村乡俗入手，彰显淳朴民风

农村具备着城市所没有的农家文化。这些民俗风情都是经历了千百年才逐渐形成的，形成了独特的风格。尤其是我国的传统节日，在农村的地位更加明显，节日氛围也更加浓厚。比如，端午节、中秋节、春节、元宵节等，都被农村的风土人情阐释得非常完美。粽子、月饼、年糕、元宵、灯笼，年画、剪纸这些都是代表传统节日的重要意象。所以，小学美术教师应当督促学生将这些美好的民俗风情融入美术作品里，让他们懂得农村的美，农村的热闹，使他们的美术作品不再空洞，变得更加富有色彩。

3.关注家乡变化，充分展示新农村面貌

随着社会的不断进步，如今的农村已经发生了翻天覆地的变化。很多小洋楼拔地而起，村里也铺上了公路，这些都是社会主义新农村的变化。这是一道亮丽的风景线，老师可让学生在将过去与现在进行对比后，感受家乡的变迁，通过手中的笔渗透出欢喜的心情，激发起他们热爱家乡的良好品质，让学生更加珍惜来之不易的生活，从而更加刻苦地学习，在学成之后努力回报家乡，这也是美术做为人文学科的一项重要作用。

4.认真体验农村人的朴实，描绘出劳动的苦甜

农村小学生的父母多数都是通过辛勤的劳动为子女提供学习条件，他们身上普遍散发着朴实的农村气息。这种刻骨铭心的体验将使学生的绘画更加到位丰满。例如，以“父亲或母亲”为题完成绘画，学生可以将父母干农活时的场景描绘出来，增强感染力，引起大家的共鸣。

5.改善小学美术教学条件，加强师资素质建设

首先，应当对现有的美术教师进行专科的培训，教师应不断提高自己的能力；不断提高自己的业务水平。其次，应当强化学校设施，增添教具，配备专职美术教师强化校园文化建设，培养特长生。让一部分学生“富”起来，让学校的美术教学向更高水平迈进，为农村地方特色的融入提供更多的契机。

农村小学教育应当受到社会各界更多的重视和关爱。当然，农村小学美术教育更得益于农村固有的地方特色，只有合理利用地方特色，农村小学美术教育水平才会拥有显著的提升，从而改变农村小学美术教育的落后面貌。民族的才是世界的，农村学校独特的美术教育资源是广大农村美术教师特有的舞台，让我们一起为农村艺术教育事业贡献出应有的一份力，让农村学生的这片天空更加绚丽多姿！

参考文献：

[1]乔丽珍.农村小学美术教学中存在的问题及对策[J].教育实践与研究：小学版，2008（1）.

[2]杨文春.浅谈农村小学美术教育教学现状分析及策略[J].现代教育教研，2011（6）.

美丽的颜色范文第5篇

inhibition of green fluorescent protein expression by short hairpin rna expression vector in human breast cancer cells（mcf7/adrr）

gan huizhu, zhang guizhen, zhang fengchun, bu lisha, yang shaojuan, gao shen, zheng deming. 

department of hematology, chinajapan union hospital, jilin university, changchun 130031, china

［abstract］  objective:to investigate whether short hairpin rna expression vector targeting enhanced green fluo in multidrug resistance human breast cancer cells(mcf7/adrr).methods:the shrna expression vector targeting egfp gene was constructed, and cotransfected into mcf7 cells and mcf7/adrr cells with pcdna3.0 egfp. the rnai effects were assessed by laser confocal scanning microscope and flow cytometry.results:in mcf7/adrr cells transient cotransfected with psilencertm 3.1h1 neo shrna and pcdna3.0 egfp expression vectors,lcsm showed that positive percentage of egfp expression was reduced,and fluorescence intensity was depressed significantly.fcm assay showed that positive percentage was significantly reduced to 35.6%(p<0.05).conclusion:shrna expression vector targeting egfp gene could inhibit enhanced green fluorescent protein expression in mcf7/adrr cells effectively and specifically, rna interference exists in mcf7/adrr cell line, which will provide a new strategy for researching the reversal of multidrug resistance by rnai in breast cancer cells.

   

［key words］  rnai；green fluorescent protein；breast neoplasm；shrna expression vector

   

rna干扰（rna interference，rnai）是近年来兴起的分子生物学技术，是在研究反义rna作用过程中发现的，首先在华丽新小杆线虫（c.elegans）中证实［1］；是由dsrna（doublestranded rna）介导的基因阻抑现象，由于这是一种在rna水平的基因表达抑制，故称为rna干扰，简称rnai。rnai技术的发展已经成为人类研究基因功能、抗病毒、治疗恶性肿瘤的一种新方法［26］。绿色荧光蛋白（gfp）可作为报告基因、定位标志，并可用于基因转染效率的测定［7］。增强型绿色荧光蛋白（egfp）是绿色荧光蛋白的突变型，所发荧光强度高，通过显微镜可直接观测、快速、简便。本研究构建了针对egfp基因的shrna表达载体，观察其在耐阿霉素的人乳腺癌细胞中对egfp表达的抑制作用。

1  材料与方法

1.1  质粒和细胞株  pcdna3.0 egfp质粒由中日联谊医院基本外科曹宏惠赠；psilencertm 3.1h1 neo sirna表达载体购自美国ambion公司。敏感的和耐阿霉素的人乳腺癌细胞株mcf7/s、mcf7/adrr由上海第二医科大学附属仁济医院张凤春教授惠赠。

1.2  试剂  t4dna连接酶购自美国promega公司；bamh ⅰ和hind ⅲ内切酶购于日本takara公司；质粒抽提试剂盒dna purification system wizardplus sv minipreps购自美国promega公司；siporttm xp1转染试剂购自美国ambion公司；rpmi1640培养基、胎牛血清购自美国gibco brl公司；阿霉素（adm）购自法玛西亚普强公司；g418购自美国sigma公司。

1.3  方法

1.3.1  egfp shrna表达质粒的构建  根据shrna 的设计原则和genebank egfp编码基因的已知序列(genebank nm_001970)，选择特异性shrna靶位点序列，设计egfp基因shrna插入模板寡核苷酸。合成egfp基因shrna插入模板寡核苷酸，退火后形成双链的shrna插入模板寡核苷酸，克隆到psilencertm 3.1h1 neo sirna表达载体，转化大肠杆菌jm109，提取质粒，酶切和测序鉴定，纯化。

1.3.2  细胞培养和转染  mcf7/s、mcf7/adrr细胞用含有10%胎牛血清的rpmi1640培养基，置于37℃、5%co2条件下常规培养。mcf7/adrr细胞培养基中加入1.0 μg/ml的阿霉素维持耐药亚型，试验前2周换用无阿霉素的培养基。取对数生长期的mcf7/adrr细胞，以2×105/孔接种至6孔板中，培养24小时后达到30%～60%充满，将6 μl siporttm xp1转染试剂加入94 μl无血清rpmi1640培养基，终体积为100 μl，混匀，室温孵化5～20分钟；分别将2 μg共转染质粒dna(pcdna3.0 egfp质粒1 μg，干扰质粒1 μg)加入上述稀释物，室温孵化5～20分钟；换用2 ml无血清培养基，加入质粒dna/siporttm xp1复合物；5小时后换用含10%胎牛血清的rpmi1640培养基。实验同时只加入pcdna3.0 egfp质粒对照组和只加入siporttm xp1转染试剂对照组以及阴性对照质粒组。阴性对照质粒是一个编码shrna的环形质粒，其序列与小鼠、人、大鼠基因组序列无同源性。瞬时转染24～48小时后，检测rna干扰效果。

1.3.3  激光共聚焦荧光显微镜检测  将无菌处理的盖玻片放到12孔培养板中，加入转染质粒后的mcf7/adrr细胞，37℃、5%co2孵箱中过夜培养，细胞自然贴附于盖玻片上。然后，将上述制备好的玻片浸入0.01 mmol/l(ph 7.4)pbs中洗3×5分钟，488 nm激发波长的激光共聚焦扫描显微镜下观察转染后绿色荧光的表达变化。

1.3.4  转染效率的判定  在激光扫描共聚焦显微镜下沿垂直与水平经过连续视野计数egfp阳性的细胞数，如果转染效率极低，如低于1%，则计数各孔所有egfp表达阳性的细胞数量，共观察约20个视野，按如下公式计算转染效率。

   

转染效率＝egfp表达阳性的细胞数计数细胞总数×100%。

1.3.5  流式细胞仪检测  将转染质粒后的mcf7/adrr细胞用pbs洗涤2次，加入600 μl pbs，以未转染细胞作对照，488 nm激发波长用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达。

1.3.6  统计学方法  应用统计学软件spss 10.0进行统计学分析。数据以x±s表示，组间比较采用t检验，p<0.05有统计学意义。

2  结果

2.1  egfp基因shrna表达质粒的鉴定  重组质粒分别用bamh ⅰ和hind ⅲ双酶切，1.5%琼脂糖凝胶电泳结果出现66 bp和4.3 kb条带，与实验设计的egfp基因模板寡核苷酸长度相符，结果见图1。将阳性重组质粒进行dna序列测定，测序结果与实验设计的模板寡核苷酸序列相符，进一步证实egfp基因shrna表达质粒构建成功。

2.2  lcsm检测pcdna3.0 egfp和egfp shrna表达质粒共转染在耐药细胞中的表达情况  mcf7/adrr细胞转染pcdna3.0 egfp质粒后，激光扫描共聚焦荧光显微镜观察发现转染后4小时即可见到部分细胞表达egfp，在4～48小时内表达egfp的细胞数量逐渐增多，在48小时达到高峰，其转染细胞内出现大量明亮的绿色荧光。共转染空载体与pcdna3.0 egfp质粒细胞中egfp的表达不受影响，同时共转染阴性对照质粒细胞内egfp的表达不受影响。而pcdna3.0 egfp和egfp shrna表达质粒共转染后发出绿色荧光的细胞数量明显减少，荧光强度也明显降低，亮度减弱。mcf7/adrr细胞荧光强度为38.34±6.35，阳性细胞百分率为58.53%±0.55%；而同时转染pcdna3.0 egfp质粒和egfp shrna表达质粒的肿瘤细胞绿色荧光产生明显减少，细胞荧光强度为15.85±4.93，阳性细胞百分率为30.13%±0.26%，结果见表1。转染mcf7/adrr细胞预实验发现当质粒dna与转染试剂siporttm xp1 比例为12时egfp表达最强，故采用该优化条件进行egfp干扰质粒转染，对照组egfp表达最强时，测定的转染效率大致为70%～80%。

图1  egfp shrna表达质粒的酶切鉴定（略）

fig.1  identification of psilencertm 3.1h1 neo egfp shrna expression plasmid by restriction enzyme digestion

note:m.dl2000 dna marker;1.egfp shrna expression plasmid;2.egfp shrna expression plasmid digested by bamh ⅰ and hind ⅲ.

表1  激光共聚焦荧光显微镜检测egfp的表达（略）

tab.1  results of egfp expression assayed by lcsm

note:compare with cells transfected with pcdna3.0 egfp plasmid,1) p<0.05. results represent the mean of two or x±s of three separate experiments.

表2  流式细胞术检测egfp的表达（略）

tab.2  results of egfp expression assayed by flow cytometry

图2  流式细胞术检测egfp的表达（略）

fig.2  results of egfp expression assayed by flow cytometry

note:a.mcf7/adrr;b.mcf7/adrr+pcdna3.0 egfp+negative plasmid;c.mcf7/adrr+pcdna3.0;d.mcf7/adrr+pcdna3.0 egfp+shegfp.compared with cells transfected with pcdna3.0 egfp plasmid,*.p<0.05. results represent the mean of two or x±s of three separate experiments.

2.3  流式细胞术检测pcdna3.0 egfp和egfp发夹shrna表达质粒共转染在耐药细胞中的表达情况  流式细胞仪检测绿色荧光的表达，结果显示单独转染pcdna3.0 egfp质粒mcf7/adrr细胞有egfp表达，共转染阴性对照质粒细胞内egfp的表达不受影响；但共转染pcdna3.0 egfp质粒和egfp shrna表达质粒的肿瘤细胞绿色荧光产生明显减少，阳性细胞百分率显著降低，差异有显著意义(p<0.05)，结果见表2、图2。

3  讨论

   

当21～23 nt短链rna(sirna)导入哺乳动物细胞，引起序列特异性内源性目的基因mrnas的降解和基因表达的有效抑制。rna干扰引发的基因沉默作用是特异的和有效的，sirna对与其同源的基因表达产生作用，而对与其不同源的基因表达不产生作用。对哺乳动物的研究显示，sirna浓度比传统的反义核酸浓度低几个数量级时仍然有效，rnai技术沉默目的基因具有高效、方便而且适用范围广的优点。

   

rnai作用机制可能为病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些双链dsrna。宿主细胞胞质中的dicer rnasel将dsrna切割成多个具有特定长度和结构的小片段rna，即sirna。这些sirna可能与解旋酶和一些相关因子形成rna诱导的沉默复合体（rnainduced silencing complex，risc）。新形成的复合体与外源性基因表达的mrna进行特异性结合，并诱发宿主细胞针对这些mrna的降解反应，使外源性基因的蛋白表达消失。rnai具有放大效应。被降解的mrna片段及未被降解的完整mrna均可作为引物，在rna依赖的rna聚合酶（rnadependent rna polymerase，rdrp）作用下，合成更多的dsrna。新合成的dsrna进入下一轮rnai循环。

  

以前报道的许多rnai载体系统都不含有筛选标志，故阳性rnai克隆的筛选非常困难［8］。本研究采用的psilencer3.1 h1 neo载体具有筛选标志，带有新霉素抗性基因，所以可以用g418进行筛选；而在加入800 μg/ml g418稳定筛选时，只有含有mdr1发夹模板序列的克隆生长，并且阳性克隆转染前后生长状态、细胞形态及生长速度均无明显差别。

   

利用lsfm和流式细胞仪检测pcdna3.0 egfp和egfp shrna表达质粒共转染在耐药细胞中的表达情况。mcf7/adrr细胞转染pcdna3.0 egfp质粒后，激光扫描共聚焦荧光显微镜观察发现在4小时后即可见到部分细胞表达egfp，在4～48小时内表达egfp的细胞数量逐渐增多，在48小时达到高峰，其转染细胞内出现大量明亮的绿色荧光，主要位于细胞核内；而pcdna3.0 egfp和egfp shrna表达质粒共转染后细胞内绿色荧光明显减少、亮度减弱，荧光强度降低，阳性细胞百分率减低，差异有显著性。流式细胞仪结果显示转染阳性细胞比例与激光共聚焦荧光显微镜计算结果大致相符，mcf7/adrr细胞的转染效率达到55%以上。阳性对照egfp shrna表达质粒的转染验证siporttm xp1转染试剂的转染效率符合实验要求，可以用siporttm xp1转染试剂进行发夹shrna表达质粒的转染。同时pcdna3.0 egfp和egfp shrna表达质粒共转染结果表明，egfp shrna表达质粒转染后有效而特异地抑制egfp的表达，故可以作为rna干扰实验的阳性对照，进一步证实基因沉默可引起序列特异性的目的基因表达的抑制。

【参考文献】

 

1 elbashir s m, martinez j, patkaniowska a et al. functional anatomy of sirnas for mediating efficient rnai in drosophila melanogaster embryo lysare ［j］. embo j, 2001; 20:68776888.

2 yu j y, deruiter s l, turner d l et al. rna interference by expression of shortinterfering rnas and hairpin rnas in mammalian cells ［j］. proc natl acad sci usa, 2002; 99:60476052.

3 kisielow m, kieiner s, nagasawa m et al. isoformspecific knockdown and expression of adaptor protein shca using small interfering rna ［j］. biochem j, 2002; 363:15.

4 brummelkamp t r, bernards r, agami r. a system for stable expression of short interfering rnas in mammalian cells ［j］. science, 2002; 296:550553.

5 paddison p j，caudy a a, bernstein e et al. short hairpin rnas(shrnas) induce sequencespecific silencing in mammalian cells ［j］. genes dev, 2002; 16:948958.

6 paul c p, good p d, winer i et al. effective expression of small interfering rna in human cells ［j］. nat biotechnol, 2002; 20:505508.