蛋白酶抑制剂

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蛋白酶抑制剂范文第1篇

【关键词】 Eppin； ； 男性； 不育症； 避孕； 无症

进入21世纪，人们逐渐发现人类的繁衍生育能力正在逐渐下降，不孕不育已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后威胁全人类生存的三大疾病之一。WHO指出，排除女方的因素，婚后有规律性生活、未采取任何避孕措施的夫妻生活达到一年以上者，女方仍未能怀孕，可诊断为男性不育症。据WHO最新的统计结果显示，全球的不孕不育患者占世界人口的15%，并且这个数字还在飞速增加。我国的发病率约在12.5%左右，这些患者中约40%是由于男性因素导致的[1]。

质量是决定男性生育力最主要的方面，男性质量的下降是导致男性不育症的最重要原因，主要有少症、弱症以及畸形症[2]；另一方面，现代社会女性意外怀孕后的流产比例越来越高，目前针对男性的避孕措施仅仅局限于、体外、输精管结扎等[3]，并没有针对男性的可逆性药物，所以针对男性的避孕措施相对较少。大量研究表明Eppin（epididymal peptidase inhibitor）与生殖和免疫性避孕关系密切。本文对Eppin基因及蛋白的发现、特征及其在男性生殖等方面的作用做一综述。

1Eppin的发现及特征

研究发现部分人的精浆中存在一种蛋白质抗体，这种抗体会阻碍的液化和的运动，进而导致男性不育，后来人们将其命名为Eppin蛋白，由Eppin基因编码[4-6]。

人类Eppin表达的三种mRNA实际上只编码两种蛋白亚型（1、3的蛋白质序列一样），分别为Eppin 1和Eppin 2，它们的区别在于N端的氨基酸序列不同。Eppin 1是最主要的，它的mRNA编码133个氨基酸残基，1～21是信号肽，22～133是成熟蛋白，所以是一种分泌蛋白；Eppin蛋白理论上的等电点是8.52，相对分子质量（Mr）为15283[7]。这类蛋白质在和附睾中被检测到，可能在灵长类动物的繁衍中发挥重要的作用。

2Eppin对活动力的影响

O′Rand等[8，9]研究证实，重组Eppin免疫的雄猴无法使雌猴自然受孕，经过检测这些雄猴的血清发现其Eppin抗体阳性率非常高。王增军等[10]采用严谨的实验方法证明了存在于精浆中和表面的Eppin蛋白能够与精囊的凝固蛋白酶（Semenogelin）结合，同时让重组Eppin和重组Semenogelin的不同氨基酸片段自由结合，发现C端Eppin75-133氨基酸片段能够与Sg164-283氨基酸片段相结合，而且人类Semenogelin中唯一的胱氨酸残基（Cys239）就存在于Semenogelin片段中，这项研究证实了Eppin能够通过影响Semenogelin而发挥其作用，因此推测Eppin可能干扰了Eppin-Semenogelin结合，使形成团块影响了活动力。

ELISA法检测25例抗抗体阳性的不育患者中有7例Eppin（28%）阳性。然后使用Western blot方法进一步检测7例阳性患者的标本，发现有5例Eppin阳性表达。另外对25例可以正常生育的男性患者的进行检测，发现抗Eppin抗体均为阴性表达。这说明抗抗体阳性的不育患者的中含有抗Eppin抗体。抗Eppin抗体能够通过干扰正常Eppin和Semenogelin的相互作用，影响的成熟过程和液化情况，致使运动能力下降，进而导致患者不育。

丁新良等[11]通过对Eppin基因SNPS（单核苷酸多态性）的研究发现，位点rs2231829与数量之间以及位点rs6124715、rs11594与运动能力之间均存在显著相关性。在SNPS与发病风险的分析中，发现多态性位点rs2231829和rs11594的存在显著改变男性原发性不育症的发病风险，并且这种风险在质量异常的病例中非常明显。然而，这些SNPS各基因型对应的血清睾酮水平没有显著性差异。生物信息学分析表明，位点rs2231829影响转录因子的结合，而位点rs11594影响mRNA结构。因此可以推测Eppin基因多态性可能通过影响转录因子的结合以及mRNA的结构而影响该基因的生物学功能，进而干扰成熟过程，影响生育结局，但是这一假设还有待进一步研究证实。此外，以小鼠为研究对象，采用整体动物RNA干扰结合显微注射与膜片钳技术，发现Eppin基因低表达会引起小鼠运动能力明显下降，主要表现为平均路径速度、活力、直线速度和曲线速度的显著下降。进一步研究表明与运动能力变化相一致的是，小鼠生精细胞的T型钙电流也随之显著下降，T型钙通道的mRNA水平亦显著降低。因此可以得出以下结论：Eppin基因低表达导致生精细胞T型钙通道mRNA水平的降低和T型钙电流的下降，进而引起运动能力的下降。

3Eppin在OA和NOA诊断中的应用

基于Eppin基因在附睾和异性表达，Liu B等[18]采用Western blot的方法检测40例正常人和46例无症患者中Eppin蛋白的表达，将精浆中Eppin蛋白有表达的无症患者诊断为非梗阻性无症（NOA，Non obstructive azoospermia），而精浆中Eppin蛋白无表达的无症患者诊断为梗阻性无症（OA，Obstructive azoospermia），并且进一步通过经皮附睾穿刺术/经皮穿刺术（PESA/TESA）确诊无症的类别。对比发现，通过Western blot检测Eppin蛋白的表达得到的诊断结果与PESA/TESA的诊断结果非常类似。因此，Eppin蛋白检测或许是一种新的、有效的、无创的诊断OA和NOA的方法，将来有望在临床中得到广泛的应用。

4Eppin在男性避孕方面的应用

目前在避孕领域，男性避孕疫苗是研究的热点之一。Eppin蛋白是由和附睾特异性分泌，广泛存在于后的人类头部和尾部表面，进入附睾输出管后，表面与附睾头部和尾部所分泌的Eppin蛋白会发生特异性结合；另一方面，膜蛋白在发生和成熟过程中、受精过程中和胚胎早期发育过程中有着至关重要的作用，可能涉及到获能、顶体反应、穿透卵子透明带、精卵结合和受精卵的分裂等方面，机体可能对一些膜蛋白发生免疫反应，导致免疫性不孕症。顶体赤道区及顶体内膜含有顶体膜蛋白17（Sp17），Sp17会在顶体反应后大量表达，有促进受精的作用，其机制可能是Sp17能够与透明带上的糖基结合引起。因此Sp17和Eppin都可作为潜在的避孕疫苗靶点。

房磊臣等[19]采用基因重组及抗原抗体反应等方法，将人Sp17和Eppin作为靶抗原，成功构建了酵母Sp17-Eppin融合蛋白表达系统，获得了高纯度Sp17-Eppin融合蛋白，并且进一步在大量动物实验中发现这种融合蛋白疫苗组的避孕效应显著强于单一重组的Sp17蛋白疫苗组，大大增加了避孕效应。尽管其避孕效应具有可逆性，但同时也会造成缩小，因此对的生精功能会有一定程度的影响。然而这仍是对融合蛋白避孕疫苗构建的大胆尝试，为探索开发安全、高效、可逆的男性免疫性避孕疫苗新途径打下了坚实的实验基础。

5Eppin与糖尿病、肥胖症的关系

糖尿病、肥胖症等对男性生育力的影响正越来越受到大家的关注，它们造成的激素改变和新陈代谢紊乱会对男性生育力构成一定的危害，而且现在糖尿病和肥胖症的发病年龄越来越小，因此越来越多的人的生育力在生育年龄之前已经受到负面的影响。最近一项研究表明体重指数（BMI）对男性生育力的影响仅次于年龄。采用差异凝胶电泳方法对糖尿病患者、肥胖人群和正常人群的Eppin蛋白质组进行分析识别，对数据结果进行对比分析，证实了糖尿病患者和肥胖人群与正常人群之间的Eppin蛋白质组在表达程度上存在显著性差异[12～17]。

6结语

综上所述，Eppin基因和蛋白对质量有重要的影响，进而影响男性生育，但对其具体的分子机制报道的较少，下一步应着重对其机制方面进行研究。中抗Eppin抗体的检测或许能成为一种研究男性免疫性不育机制的无创的方法，不仅改善了不育症患者的特异性诊疗，拓宽了患者的辅助诊断指标，同时也为男性免疫性避孕疫苗的研发提供了一定的实验和临床研究基础。

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蛋白酶抑制剂范文第2篇

【关键词】 构建； 原核表达； 水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂

［Abstract］ Objective: To construct the prokaryotic expression vector of LDTI gene and express LDTI protein in E.coli［BL21(DE3)］.Methods： A 141 bp fragment of the LDTI gene was amplified by PCR technique from the template of the plasmid containing LDTI gene， then it was cloned into T vector.After amplified and digested with restricted enzyme， the target fragment was subcloned into plasmid pET28a， the recombinant plasmid was transferred into E.coli Jm109.The fragment was identified by restricted enzyme and nucleotide sequencing.The recombinant expression plasmid containing LDTI gene was transformed into E.coli BL21(DE3) and the target protein expression was induced by isopropylBDthiogalactopyranoside(IPTG) and confirmed by TricineSDSPAGE and Western blot. Results： The recombinant plasmid of pET28aLDTI was obtained by PCR and identified by sequencing.The target protein was expressed abundantly in E.coli BL21(DE3) and the yield of LDTI protein was accounted for approximately 15% of germ proteins after one hour′s induction by 0.7 mmol/L IPTG at 33℃. Conclusion： pET28aLDTI was successfully constructed and can highly express objective protein in BL21(DE3)， which will further help to the bioactivity of LDTI studying.

［Key words］ construction; prokaryotic expression; leech derived tryptase inhibitor

类胰蛋白酶抑制剂（tryptase inhibitor，TPI）属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，具有稳定肥大细胞的作用［1］，对于肥大细胞介导的变态反应性疾病如哮喘、变应性鼻炎等有潜在的治疗作用。类胰蛋白酶是肥大细胞分泌的最丰富的介质之一，在多种疾病的进程中起到诱导作用［2］。类胰蛋白酶抑制剂通过抑制类胰蛋白酶活性来达到治疗疾病的目的。研究证实［3］，水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂与人β类胰蛋白酶具有高度亲和力并以此抑制其活性。我们运用DNA重组技术，构建了水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂原核表达质粒，通过双酶切以及核酸序列分析进行分析鉴定后将其转化入大肠埃希菌BL21（DE3）中，使其在原核系统中高效表达，为下一步分析LDTI蛋白的特性与功能奠定了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 酶及主要试剂 DNA 标准参照物、Taq酶、T4连接酶、Hind Ⅲ和NdeⅠ购自TaKaRa公司，凝胶纯化试剂盒，质粒小量提取试剂盒购自Qiagen公司，TRICINE及低分子量蛋白质标准品购自Sigma公司，蛋白质印迹一抗为抗HIS Tag的鼠单克隆抗体（IgG1），购自Novagen公司。其他常用试剂为国产或进口分析纯试剂。

1.1.2 菌种及质粒 pMD18T载体购自日本TaKaRa公司，含有目的LDTI编码序列的质粒由大连TaKaRa公司合成。大肠埃希菌 JM109，BL21(DE3)及表达载体pET28a为本校张忠芳老师馈赠。

1.1.3 核酸序列分析 由上海英骏公司采用ABI377全自动测序仪器和配套的试剂盒测序。1.2 方 法

1.2.1 引物设计与合成 根据LDTI氨基酸序列推导出目的核酸序列并设计引物，由上海英骏生物技术有限公司合成。上游引物序列：5′GGCATATGAAAAAAGTTTGCGC3′；下游引物序列：5′TAAGCTTTTACGTCGGGCAGGA3′。其中，为了方便克隆操作，在上下游引物中加入了限制性内切酶NdeⅠ，Hind Ⅲ的酶切位点，以便LDTI核酸片段定向克隆于相应的酶切位点上，保证阅读框架的正确性和完整性。此外在限制性内切酶Hind Ⅲ，NdeⅠ酶切位点引入1至2个保护性碱基，以利于酶切反应进行。

1.2.2 LDTI片段扩增 PCR反应体系为：DNA 0.3 μl，Taq酶2 U，10×缓冲液2 μl，dNTP 1.6 μl和引物0.4 μl，加DDW至总体积20 μl。 PCR扩增条件：预变性94℃ 2 min，94℃ 1 min 62℃ 1 min 72℃ 1 min，25个循环，反应结束前72℃延伸10 min。

1.2.3 构建T载体克隆 按照凝胶纯化试剂盒操作流程纯化PCR产物后与T载体连接，转化感受态大肠埃希菌JM109，经过蓝白斑筛选，挑选单个阳性克隆，在100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中过夜生长，提取质粒，进行双酶切和测序鉴定。

1.2.4 构建原核表达载体亚克隆 将T载体克隆双酶切后目的片段及pET28a双酶切后片段经琼脂糖凝胶电泳，回收，按照凝胶纯化试剂盒操作流程纯化PCR产物，将纯化后的两核酸片段16℃连接，过夜。转化感受态细菌JM109，挑取阳性克隆，接种于含100 μg/ml卡那霉素的LB培养基中过夜生长，按照质粒小量抽提试剂盒说明书提取质粒，进行双酶切和测序鉴定。

1.2.5 LDTI蛋白的诱导表达 将重组质粒pET28aLDTI转化BL21(DE3)，挑取单个菌落，接种于3 ml含100 μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养过夜。以1∶50比例取过夜培养物接种于含100 μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养，至其D(600 nm)=0.6时加入IPTG（终浓度0.7 mmol/L）继续培养，分别于1，2，3，5，10 h取1 ml菌液。以不含重组质粒的空白菌培养物和未加IPTG诱导的重组质粒转化细菌培养物为对照。

1.2.6 LDTI重组蛋白的电泳分析与蛋白质印迹鉴定 将细菌培养物1 ml于4 ℃离心收集细菌，加适当的蛋白上样缓冲液，煮沸5 min后进行15％TRICINESDSPAGE，经考马斯亮蓝染色，确定蛋白有无表达。再以蛋白质印迹方法鉴定此蛋白。

2 结 果

2.1 LDTI核酸片段扩增及纯化

将PCR产物进行1.4%琼脂糖凝胶电泳，可见到预期的141 bp大小的目的核酸片段（图1）。

2.2 T载体克隆构建

将纯化的PCR产物与T载体连接后转化感受态大肠埃希菌JM109，对目的片段大量扩增。按照质粒小量抽提试剂盒说明书提取质粒，进行测序鉴定，证实目的片段以正确的序列插入T载体（图2）。

2.3 LDTI核酸片段原核表达载体的亚克隆

将酶切纯化后的目的片段与表达载体pET28a连接，转化感受态大肠埃希菌JM109，获得含有pET28aLDTI重组表达质粒基因工程菌。该重组质粒大小为5.44 kb，经NdeⅠ+Hind Ⅲ双酶切后，切出大小与理论设计可切出大小5.306 kb+0.134 kb基本相符的两条带（图3）。所筛选出的阳性重组质粒经进一步测序证明，所插入的核苷酸序列与目的片段序列完全一致，阅读框架也正确无误（图4）。证实克隆到了全长的LDTI编码序列，且无任何碱基突变，说明pET28aLDTI重组表达质粒构建成功。

2.4 LDTI重组蛋白的诱导表达以及鉴定

将重组质粒pET28aLDTI转化BL21(DE3)， IPTG（终浓度0.7 mmol/L）继续培养，分别于1，2，3，5，10 h取1 ml菌液进行检测。pET28aLDTI在诱导1 h后即可见到蛋白高效表达，占总蛋白的15%左右，在分子量约6.8 kD处有一特异性带出现，与预期LDTI重组蛋白分子质量相符合。随着诱导时间延长，未见蛋白表达量明显增加（图5）。

M：蛋白分子质量标准；L1：BL21(DE3)空白菌；L2：pET28aLDTI转化BL21(DE3)未经IPTG诱导；L3～7：pET28aLDTI转化BL21(DE3)经IPTG诱导，t=1，2，3，5，10 h；L8：蛋白质印迹鉴定结果

3 讨 论

变态反应性疾病是危害人类健康的一大类疾病，其发病率在西方约占总人口45%，并有逐年上升的趋势［4］。肥大细胞在变态反应性疾病的发病机制中起重要作用，其作为变态反应性炎症的一个重要起始效应细胞已被人们广泛接受［5］，其含量最多的分泌性介质类胰蛋白酶是近年来研究的重点。类胰蛋白酶已经被发现与多种疾病有关［6］，几乎是专一性地由肥大细胞分泌，可以作为肥大细胞及其活化的特异性标志［7］，因此其抑制剂很有希望成为一类新的抗炎药物。对类胰蛋白酶抑制剂的研究也成为近10年来肥大细胞研究领域的热点之一。研究表明，类胰蛋白酶抑制剂可降低哮喘患者对吸入性过敏原的哮喘样反应［8］，也有望成为治疗纤维变性疾病如原因不明的肺纤维变性疾病或者硬皮病以及炎症性肠病的一个新药［9］。

目前国内尚无关于重组水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂基因工程的报道。本研究应用所设计的上游引物NdeⅠ酶切位点及下游引物Hind Ⅲ酶切位点，将编码LDTI氨基酸序列的核酸片段定向连接到质粒pET28a的相应位点，保证了插入片段方向的正确性。然后以含有LDTI目的序列的质粒为模板进行PCR扩增，获得了126 bp大小的目的片段LDTI全编码区，首次构建了重组质粒pET28aLDTI亚克隆，经过双酶切以及测序，证实获得了pET28aLDTI重组质粒，而后以IPTG诱导，使其在大肠埃希菌中得到表达。由于目的蛋白分子量较小，本实验应用15％TRICINESDSPAGE 进行小肽电泳，经考马斯亮蓝染色以及蛋白质印迹方法检测、鉴定蛋白表达，最终获得了大小约为6.8 kD的明显特异性目的蛋白条带。LDTI蛋白的成功表达为进一步研究LDTI蛋白的特性与功能奠定了良好的基础。

（本文图2，图4见彩色插图）

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蛋白酶抑制剂范文第3篇

【关键词】半胱氨酸蛋白酶抑制剂C;测定方法;临床应用

血半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（Cystatin C 又名胱抑素C）是目前发现的对组织蛋白酶B抑制作用最强的物质，其生物学功能主要是调节半胱氨酸蛋白酶活性。因其分子量小，能自由通过肾小球滤过膜，几乎完全被肾小管重吸收且不被分泌，能很好的替代肌酐而成为一种新的反映GFR的理想标志物。随着科学家对胱抑素C的深入研究，发现其不仅在肾脏疾病方面有临床价值，而且还揭示了它与肝脏疾病、糖尿病、肿瘤等具有一定的相关性。现就其在临床疾病中的研究进展概述如下。

1血半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的结构和特性

1961年Clausen 于脑脊液中发现一种物质，因它与哺乳动物胱蛋白A 和胱蛋白B 的结构及活性相似，当时被称为胱蛋白C 。1985 年cystatin C 首次被报道可作为评估GFR 的指标，称为半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 。其最重要的生理功能是调节半胱氨酸蛋白酶活性[1]。

Cystatin C 是一种非糖基化的碱性蛋白质，由120 个氨基酸组成，相对分子质量是13.36×103 ，等电点为9.3，特点为位于羧基端附近有2 个二硫键。人的cystatin C基因片段位于20 号染色体上，其基因序列在大多数组织中能稳定表达。cystatin C是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族2中的一员。半胱氨酸蛋白酶包括木瓜蛋白酶家族中的组织蛋白酶(主要存在于溶酶体中) 和Ca2+激活蛋白酶家族中的Ca2+激活蛋白(主要存在于细胞质内) 。它们在细胞内肽类和蛋白质代谢特别是胶原代谢中起重要作用。

Cys C的测定方法很多，包括单向免疫扩散法、酶免疫测定法、时间分辨荧光免疫法、放射免疫法、乳胶颗粒增强免疫比浊法等。

2CystatinC的临床应用

2.1Cys C与肾移植:肾脏移植目前已成为治疗终末期肾病最有效的方法，因此肾脏移植手术后移植肾的功能监测成为临床工作之重点。2002年4月在德国马尔堡召开的国际专家会议上[3]，与会专家一致认为，Cys C不受身高、性别、年龄、肌肉量的影响。王盛华等人的研究结果说明：健康人与非肾移植感染患者的Cys C浓度差异无统计学意义，故认为Cys C也不受感染因素影响。该研究还发现，Cys C在肾移植后诊断急性排斥反应时明显优于血清肌酐(serum creatinine，Scr)，即Cys C比Scr提前（2.7±1.8）d升高；与排斥前比较，Cys C升高148.9％，远高于Scr的43.9％。Le Bricon等也曾报道，Cys C在排斥时比Scr升高得更早、更明显。

王盛华等人还发现，肾移植术后Scr缓慢下降，1周左右转阴（低于判断值122umol/L）而Cys C术后3d内迅速下降，尤以第1天为著，可达69.2％，第2天91％的患者即转为阴性（低于判断值1.79mg/L），也有报道肾移植术后Cys C可立即下降（293±1.7）％。Cys C的这一优势在诊断加速性排斥反应时得以发挥优势效果，而Scr虽有升高，但处于术后下降的背景中，不易观察；而Cys C可立即由阴性转为阳性，变化明显。

2.2Cys C与肝脏疾病:Cys C与肝炎、肝硬化、肝癌： Cys C与肝脏疾病的关系少有报道。慢性肝病在发展成为肝硬化或肝癌的过程中，细胞外基质蛋白量的改变是一个非常显著的特征。肿瘤的生长和转移需要对周围基底膜和组织成分的降解。因此，细胞外基质合成与降解的失衡是肝硬化、肝纤维化，甚至肝癌发生的重要因素。有研究表明，基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶组织抑制物（MMPs和TIMPs）是肝病中细胞外基质合成与降解的失衡原因之一。除MMP系统外，其它蛋白酶解系统也参与肝纤维化的形成，例如组织蛋白酶活性升高。国内有相关报道，Cys C在肝脏疾病患者中显著升高，且慢性肝炎、肝硬化和肝癌均有不同幅度的升高变化，推断Cys C与肝病的严重程度相关。

2.3Cys C与糖尿病肾损害:糖尿病肾损害的主要病理改变为肾小球基底膜受损，而作为全部肾功能单位滤过率的总和，GFR是评价肾功能受损的一项好的指标，国内外很多研究都说明Cys C在评价肾损害比Scr要更为灵敏、特异。

尿微量清蛋白对早期糖尿病肾病诊断有重要价值，但最近一些临床研究发现，伴微量清蛋白尿的糖尿病患者仅有30%-45%，在10年内进展到临床糖尿病肾病。有人对23例仅尿mAlb一项为阳性，46例仅Cys C为阳性和其阳性而同时伴尿mAlb为阳性而未进行治疗的糖尿病患者进行跟踪调查测定，6个月内复查上述指标两次，结果发现前者有7例病人两次测定结果转为阴性，后者仅有2例两次测定结果恢复正常，证实单用尿mAlb诊断早期糖尿病肾病存在一定比例的假阳性，而Cys C的特异性较强，血清Cys C联合尿mAlb测定可提高糖尿病早期肾损害诊断的正确率[4]。

2.4Cys C与妊娠高血压综合征:妊娠高血压综合征（简称妊高征）一直是产科的疑难杂症之一。国内有研究显示，血清UA、Cr在中重度妊高征患者中较正常未孕者明显增高（P

2.5Cys C与格林-巴利综合征（Guillain Barre syndrome， GBS）:格林-巴利综合征（Guillain Barre syndrome， GBS）是以周围神经和神经根的脱髓鞘及小血管周围淋巴细胞及巨噬细胞的炎性反应为病理特点的自身免疫性疾病。在发展中国家发病率比较高，其病因和发病机制尚不明确。大量的实验证明，GBS患者脑脊液中存在蛋白质的异常表达，这为我们研究GBS提供了一个独特的窗口。目前，国内外已开始将蛋白质组学技术应用于研究GBS患者脑脊液，从总体水平找到一些与GBS相关联的蛋白质[6]，但是这些蛋白与GBS的关系尚未完全明确。

有研究表明，Cystatin C可作为疼痛的脑脊液生物学标记物，持续的疼痛诱导神经系统Cystatin C的合成与释放］。然而，本实验GBS组中Cystatin C相对于对照组表达明显下调，可能与GBS的主要症状的瘫痪与麻痹影响有关。

2.6Cys C与心血管动脉粥样硬化（AS）:目前基础研究证明动脉粥样硬化（AS）是一种慢性炎症过程，发病机制涉及细胞外基质降解与血管壁重构。

有关专家应用免疫染色法与免疫杂交法发现动脉粥样斑块中cystatin C含量较正常血管减少，而组织蛋白酶S及K却过度表达，认为cystatin C的缺失以及蛋白水解酶与其抑制剂的失平衡可能是AS的发病机制之一。Sukhova等对ApoE-1-小鼠的实验研究结果也直接证明AS形成时cystatin蛋白酶／蛋白酶抑制剂失衡。经研究发现CHD患者血清cystatinC浓度明显低于对照组，表明了CHD患者存在低cystatin C血症，这一结果支持cystatin C的缺失可能是AS的发病机制之一的结论，表明cystatin C对CHD患者可能有一定的保护作用。

3Cys C的临床应用展望

Cystatin C在体内产生速率稳定，影响因素极少， ，测定Cys C对疾病指导诊断及治疗，具有重大的临床意义Cys C在临床上的应用已经不再局限于评价GFR了，它在很多疾病中的关联也越来越明显了。虽然目前的研究结果中还存在着很多的推测，但是随着分子诊断学的发展，很多的难题定会得到解决。同时它将会广泛应用于临床其他指标的评价，其在疾病的发生、发展中势必会发挥越来越大的作用。

参考文献

[1]顾万建， 张春兵. 胱抑素C在心脑血管疾病中的研究进展[J]. 国际检验医学杂志， 2007， 28(12): 1120-1121

[2]许讯辉，邹建洲，丁小强，等.血清光抑素C：一个简便测定肾小球滤过率的标志物[J].中国临床医学，2001，8（3）：240-241

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[4]邱谷， 黄桥林， 陈红梅， 等. 健康人群血清Cystatin C参考值调查及其对糖尿病肾损害诊断的作用[J]. 现代检验医学杂志， 2007， 22(7): 94-95

蛋白酶抑制剂范文第4篇

【关键词】 糖尿病；高血压；肾病；血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C

随着人类生存环境及生活模式的改变，高血压、糖尿病、肿瘤等疾病的发生率不断上升，且可能伴发各种并发症，如肾功能损害。因此，糖尿病肾病及高血压肾病为临床常见病，目前临床用于诊断肾功能损害的方法有Cys C、BUN、Scr检测等实验室检查方法，其中Cys C检测是近些年迅速发展的用于诊断肾功能损害的重要诊断手段[1]。本文通过对我院糖尿病肾病患者、高血压早期肾病患者进行Cys C的检测，并以本院健康体检者体内Cys C水平为对照，探讨研究Cys C的诊断价值。具体叙述如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年3月——2013年1月于我院就诊的糖尿病肾病患者39例，作为糖尿病组，其中男21例，女18例，年龄22-63岁，平均（43.8±11.2）岁，纳入标准符合WHO糖尿病诊断标准。选取同期在我院就诊的早期高血压肾病患者41例，作为高血压组，其中男19例，女22例，年龄22-63岁，平均（43.8±11.2）岁，纳入标准符合WHO高血压诊断标准。对照组为52例健康体检合格者。三组入选者在年龄、性别方面无显著差异。所有入选者均无原发性肾病及慢性肾脏疾病，无其他基础性疾病。

1.2 方法 所有入选者同时检测Cys C、Scr、BUN。早晨空腹抽取血样，室温条件下静置30min，离心5min（3000r/min），取上层血清，要求4h内测定完毕。收集24h尿液，准确测量尿量，取5ml测定尿液中cr含量。

仪器设备为迈瑞全自动生化仪（BS-400），试剂为广州科方生物技术有限公司生产。Cys C、检测采用的是免疫比浊法，BUN的测定方法为脲酶UV法，Scr的测定方法为氧化酶法。根据体表面积标准化法计算Ccr。

1.3 统计学处理 使用SPSS18.0统计学软件处理数据，计量资料以均数±标准差（χ±s）表示，数据用t检验，组间对比用X2检验，P

蛋白酶抑制剂范文第5篇

[关键词] 慢性阻塞性肺病；黄芪多糖；基质金属蛋白酶-9；金属基质蛋白酶抑制剂-1

[中图分类号] R56 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）01（b）-025-03

Effect of astragalus polysaccharide on the expression of MMP-9 and TIMP-1 in lung tissue of COPD rats

YU Weiwei HUANG Xiaoyan ZHANG Yan XIA Qin

Department of General, Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Hubei Province, Wuhan 430030, China

[Abstract] Objective To observe the influence of astragalus polysaccharide (ASP) on the expression level of MMP-9 and TIMP-1 in lung tissue of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) rats. Methods 40 male Wistar rats were randomly divided into four groups, Normal group, COPD group, ASP group and prednisone group. The model of COPD was established by smoking method combined with endotracheal injection of lipopolysaccharide. After the drugs were administrated for 30 days，the lung function of rats were determined. The lung content of hydroxyproline was detected by biochemicaly method. The protein content of MMP-9 and TIMP-1 was determined semi-quantitatively by immunohistochemical methods. Results The COPD group showed chronic obstructive pulmonary histopathologic change, the lung function decreased, the expression MPO, MMP-9 and TIMP-1 increased, MMP-9/TIMP-1 decreased; after intervention of ASP and prednisone, the pulmonary histopathologic change and the lung function improved, the expression MPO, MMP-9, TIMP-1 and MMP-9/TIMP-1 decreased, there was a negative correlation between FEV0.2/FVC and MMP-9/TIMP-1. Conclusion ASP can effectively inhibit the expression of MMP-9 and TIMP-1, improve the lung function and ECM imbalance of degradation and sedimentary, and delay airway remodeling.

[Key words] Chronic obstructive pulmonary disease； Astragalus polysaccharide；Matrix metalloproteinases-9; Tissue inhibitor of metalloproteinases-1

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是具有呼吸道阻塞特征的慢性支气管炎，其形成过程包括肺泡巨噬细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞增加，激活炎症细胞释放多种介质进一步刺激细胞外基质（ECM）沉积，导致呼吸道狭窄和呼吸道阻力增加。抑制炎性介质的释放和气管的纤维化对防治COPD及其并发症、改善患者的生活质量具有重要意义。近年来，黄芪多糖在多种急、慢性炎症中突出的免疫调节作用引起了人们的关注，本实验拟采用观察黄芪多糖对COPD大鼠肺组织中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、金属基质蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）表达的影响，来进一步探讨黄芪多糖对COPD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

黄芪多糖（四川百利药业有限责任公司，批号：080606）；脂多糖（LPS）（Sigma公司）；香烟（云南红河卷烟厂软乙香烟，尼古丁含量：1.3 mg；焦油含量：14 mg）；强的松片（西安利君沙制药股份有限公司）；羟脯氨酸（MPO）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；MMP-9、TIMP-1抗体（武汉博士德公司）。

1.2 模型的建立、分组与标本处理

健康Wistar雄性大鼠（华中科技大学同济医学院实验动物学部提供）40只，平均体重250~300 g，适应性饲养环境1周后采用随机数字法将动物分为4组：正常对照组、COPD组、黄芪多糖组、强的松组，每组10只。①正常对照组：未作任何干预，每日用1 mL生理盐水灌胃作为对照；②COPD组：第1、16天，气管内注入1 g/L的LPS 200 μL/次，第2~15天和第17~30天将大鼠放入有机玻璃熏箱内被动吸烟，每天熏烟2次，每次20支香烟，时间持续1 h，2次熏烟间隔4 h，每天熏烟前0.5 h以1 mL生理盐水灌胃作为对照；③黄芪多糖组：模型制备方法同COPD组，但每天熏烟前0.5 h以蒸馏水溶解黄芪多糖颗粒灌胃（40 mg/kg）；④强的松组：模型制备方法同COPD组，将强的松片研成粉末，加蒸馏水溶解，熏烟前0.5 h按6 mg/kg灌胃。

1.3 观测指标及方法

1.3.1 取材方法 到第31天时，大鼠经股动脉放血处死，打开胸腔结扎右主支气管，取右下叶部分肺组织待检测羟脯氨酸含量，余右肺组织以10%的中尔马林固定，24 h以后石蜡包埋、切片，常规HE染色镜检。左肺用10%的中尔马林固定20 min，常规脱水，透明，浸蜡包埋，待免疫组化检测。

1.3.2 肺组织中羟脯氨酸含量测定 取大鼠肺组织用匀浆器在冰浴下制成10%匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清，按照羟脯氨酸试剂盒说明书进行操作，考马斯亮蓝法测定肺组织羟脯氨酸蛋白含量。

1.3.3 肺功能检测 处死动物前采用AniRes动物肺功能仪进行大鼠肺功能测定。以3%戊巴比妥钠70 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，气管插管，将大鼠放进体扫描仪内，连接动物肺功能仪，描记一段平静呼吸后，在呼气末以相当于潮气量4倍的气量充气（相当于深呼气），所引起的容积变化经微机处理算出0.2 s用力呼吸量（FEV0.2）、FEV0.2与用力肺活量比值（FEV0.2/FVC）以及吸气阻力（Ri）、呼气阻力（Re）。

1.3.4 肺组织MMP-9和TIMP-1蛋白含量测定 取左肺石蜡切片（6 μm）作免疫组织化学染色（SP法）。免疫组化染色以细胞胞浆中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性反应，每组染色切片随机选取10个视野，经图像扫描测定每组免疫反应阳性信号强度的平均吸光度（A），求出平均值，然后用统计学方法进行半定量分析。

1.4 统计学方法

应用SPSS 13.0软件包进行统计学处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，对相关指标进行Spearman法直线相关分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肺组织病理改变

光镜下观察，正常对照组肺组织结构基本正常，COPD组大鼠肺泡壁增厚，间质内大量炎症细胞浸润，肺泡间隔明显增宽，局部可见代偿性肺气肿，证实造模成功，黄芪多糖组及强的松组肺泡壁增厚较COPD组有所减轻，炎性细胞浸润减少。

2.2 大鼠肺功能水平

与正常对照组比较，COPD组FEV0.2、FEV0.2/FVC均显著减少，Re、Ri显著增大（均P < 0.05）；与COPD组比较，黄芪多糖组和强的松组FEV0.2、FEV0.2/FVC均增多，Re、Ri减少（均P < 0.05），其中强的松组改善最为显著。见表1。

2.3 大鼠肺组织羟脯氨酸含量

COPD组大鼠肺组织羟脯氨酸含量较正常对照组明显增加（P < 0.01）；黄芪多糖和强的松干预后，羟脯氨酸含量明显减少（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

2.4 大鼠肺组织中MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1蛋白水平

COPD组大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1水平较正常对照组明显增加（P < 0.05或P < 0.01）；黄芪多糖和强的松干预后，MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1水平明显降低（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

表2 大鼠肺组织羟脯氨酸、基质金属蛋白酶-9、

金属基质蛋白酶抑制剂-1含量变化（x±s）

注：与正常对照组比较，#P < 0.01，*P < 0.05；与COPD组比较，##P < 0.01，P < 0.05

2.5 相关性分析

正常对照组、COPD组、黄芪组、强的松组肺组织MMP-9/TIMP-1水平与FEV0.2/FVC呈负相关（相关系数r = -0.411、-0.621、-0.684、-0.542，均P < 0.05）。

3 讨论

COPD是一种以进行性的气流阻塞和持续性的炎症过程为特征的疾病，目前认为其病变早期是以炎症细胞浸润为主，后期表现为ECM沉积在气道壁导致细支气管壁的增厚和呼吸道重建[1-2]。ECM的降解和沉积失衡是导致气道壁结构异常构建、肺实质破坏和间质增生的重要原因。基质金属蛋白酶（MMPs）是一组具有相同功能、结构高度同源、依赖锌离子的内肽酶的总称，MMP-9是MMPs家族的重要成员，能降解气道和肺泡的ECM和基底膜，参与其重构和炎细胞趋化，在COPD的发病中占重要地位[3]，TIMPs是MMPs的内源性天然抑制因子，能与MMPs形成1∶1复合体抑制其活性，它有五种亚型，其中TIMP-1是活性最强的一种，能特异性抑制MMP-9的活性，TIMP-1还具有细胞生长因子样作用，能使ECM沉积并抑制其降解，是气道纤维化的标志，反映了呼吸道修复重塑的过程[4]。MMP-9/TIMP-1的平衡是维持ECM正常状态所必须的，一旦平衡打破则出现病理状态，MMP-9/TIMP-1比值升高，表明呼吸道以炎症反应为主，将引起组织破坏，MMP-9/TIMP-1比值下降，表面呼吸道以修复为主，过度降低（尤其是TIMP-1过度升高时）将出现纤维化可能[5]。本试验中，COPD组MMP-9及TIMP-1均较正常组明显升高，MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1水平的升高与COPD肺功能的下降、羟脯氨酸水平的升高有相关性，羟脯氨酸是反应组织纤维化程度的重要指标，上述结果提示MMP-9、TIMP-1在肺组织的损伤及纤维化方面起着重要作用。

COPD属于中医咳嗽、痰饮、喘症的范畴，其病因与外邪入侵和内伤有关，中医理论认为肺主气，朝百脉，乃是气、血、津液汇聚之地，气虚、血淤是COPD形成的重要病理基础[6]，而中药黄芪多糖是传统补气中药，可补气血，去淤散结，有助于气血畅行，目前黄芪多糖在调节免疫方面的作用倍受关注，既往有试验提示黄芪多糖可以抗纤维化[7]，故本试验将黄芪多糖作为干预药物，观察其对肺组织病理、MPO、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表达的影响，并将其与强的松作对比来观测其疗效。试验结果显示：黄芪多糖能使肺泡壁间隔增厚减轻，炎性细胞浸润减少，并能部分改善局灶性肺气肿，肺功能改善，使MPO、MMP-9、TIMP-1表达减少，MMP-9/TIMP-1比值减低，其作用与强的松有类似之处。据此笔者推论：黄芪可能通过降低肺组织羟脯氨酸的水平，抑制肺组织中MMP-9、TIMP-1的含量，降低MMP-9/TIMP-1比值来使ECM的合成和降解趋于平衡，这一作用有助于改善呼吸道的无效重构和肺纤维化程度，因此肺功能得以改善。同时显示，黄芪多糖及强的松对肺功能的改善和MMP-9/TIMP-1的降低呈正相关，与之前MMP-9/TIMP-1比值减低时肺损伤倾向于修复的观点一致，但本试验结果显示，使用黄芪多糖和强的松后，MPO降低，与之前的MMP-9/TIMP-1比值降低肺部病变倾向于修复、有纤维化可能似乎有矛盾，但表2显示，使用黄芪多糖后，MMP-9的减低幅度显著高于TIMP-1，导致MMP-9/TIMP-1降低的主因是MMP-9的减低，提示黄芪多糖可能通过改善MMP-9/TIMP-1的比例来改善肺纤维化。对于黄芪多糖是通过何种途径来影响MMP-9及TIMP-1的表达目前知之甚少，黄芪多糖对肺炎性因子表达的影响亦不清楚，这对进一步理解其作用机制有着重要意义，可作为下一步的研究目标。

目前对抑制MMP-9的表达及减轻肺损伤的药物的研究正成为药理学的研究热点，一系列合成抑制物在动物试验中已发挥明显作用，但也因副作用而受到制约。中药黄芪多糖毒副作用小，整体改善患者病情，本试验进一步证实了其在COPD中的疗效，提示黄芪多糖可能通过影响MMP-9/TIMP-1的比值来促进肺组织的修复。

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