胃蛋白酶

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胃蛋白酶范文第1篇

[关键词]胃蛋白酶原；胃部疾病；临床应用

胃粘膜分泌的胃蛋白酶原1%通过胃粘膜毛细血管进入血液循环，当胃粘膜发生病变，血清中胃蛋白酶原的水平也会发生相应的变化。所以检测血清中胃蛋白酶远的表达水平对监测胃粘膜形态及功能变化有一定意义。

MerinoAM等检测了268例不同肿瘤患者的肿瘤组织中PGII的原位表达[1]，发现除在胃肠组织中表达外，PGII还表达于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等癌组织。从而证实PGII在胃肠外癌组织中的广泛表达，而它与肿瘤发展的关系也逐渐被揭示。

日本、芬兰将胃蛋白酶原作为早筛指标取得了成果，减少了胃癌发病率，近年来国内对胃蛋白酶原临床应用的研究也在不断开展。本文就目前国内外胃蛋白酶原临床应用的进展情况进行综述。

1PG的生理

1.1PG的分类

胃蛋白酶原（PG）是一种具有消化功能的内切蛋白酶前体，属于天冬氨酸蛋白水解酶，是由375个氨基酸组成的单链多肽，其分子量为42KD，在酸性条件下被激活[2]。人胃蛋白酶原可分为两种生化特征和免疫活性不同的胃蛋白酶原亚群：按胃蛋白酶原在琼脂凝胶电泳下的迁移率由快至慢分为PGl-PG7七种同工酶原，其中PGl-PG5有共同的免疫原性，合称PGI（又称PGA）；PG6和PG7迁移率较慢，合称PGII（又称PGC）[3]。

1.2PG的分泌部位与分布。

PGI和PGII在细胞来源及组织内分布各不相同[4-6]，PGI来源由于胃底腺的主细胞和颈粘液细胞分泌，PGII则由全胃腺和远端十二指肠Brunner氏腺分泌，前列腺和胰腺也产生少量PGII，胃粘膜合成的PGII约为总量的25%。只有少量（约1%）PG透过胃粘膜毛细血管进入血循环，血清胃蛋白酶原的浓度可反应胃粘膜的分泌水平，也可反应不同部位胃粘膜的形态和功能。血清中具有PGI和PGII两种形式。在尿中也有PG，但主要为PGI。中也有PG的分布，但只有PGII。PGI在胚胎胃粘膜中高度表达，在胃中幼稚细胞即能分泌一定量的PGI，而PGII最初出现在胚胎后期，约胚胎的第32~36周，是胃粘膜细胞分化成熟，消化功能逐渐完善的标志。不同种的PG的产生似乎与以下几种因素相关：结构基因的数量、个体等位基因的差异及翻译后的修饰[7]。PG连续分泌的最大速率是由其最大合成速率决定的，PG的合成是一个独立连续的使得消化细胞充满颗粒的过程，溢出性分泌是PG分泌的唯一的而且是最基本的形式[8]。

2PG的临床应用

2.1用于胃癌的早期筛查

日本Kitahara等早在1999年以PGI、PGII加胃镜活检普查了5113人[9]，以血清PGI

2.2作为胃癌术后复发的判定指标

胃癌患者全胃切除后血清PG含量作为随访指标，可为胃癌复发提供重要线索。林惠忠等测定了62例胃癌患者和61例健康人的血清PG[15]，发现胃癌患者PG水平明显低于健康人的PG水平，且在早期胃癌即发生改变，进展期胃癌则更低。进一步测定术后患者血清PG，发现手术后PG较术前明显降低。跟踪随访后发现在部分胃切除患者胃癌复发后血清PG无明显变化，而全胃切除患者胃癌复发后PG显著升高。从而证实血清中PG，尤其是PGI、PGI/PGII是监测全胃切除术后复发的良好指标。

2.3用于肠胆反流的诊断

张立魁认为少量的未被活化的胃蛋白酶原经门静脉血液再分泌或直接进入胆道[16]，从而可以在胆汁中检测到。故以核素判断肠胆反流为基础，分析胃蛋白酶原法诊断肠胆反流的可行性。结果，在反流组患者胆汁中PGⅡ的质量浓度低于无反流组，且差异有统计学意义，认为其PGⅡ质量浓度低于无反流组是因为胃酸反流进入胆道，从而分解了胃蛋白酶原。同时参照应用淀粉酶值判断胰胆反流的方法[17]，取PGⅡ26.45μg/L作为判断“T”管引流患者有无肠胆反流的界值，胆汁中PGⅡ质量浓度低于26.45μg/L则认为存在反流。认为使用胃蛋白酶原Ⅱ法判断肠胆反流的阳性率（27.59%）低于核素法（37.93%），操作较为繁杂，不如口服核素法直观，且可靠性稍差，但患者避免暴露于放射性辐射的可能，无痛苦，可以作为观察十二指肠胆道反流的一种选择方法。

2.4作为胃肠外疾病的监测手段

2.4.1卵巢癌

RojoJV，MerinoAM等检测了72例上皮细胞卵巢癌患者癌组织中PGII的表达[18]，发现19例PGII表达阳性，与临床病理特点无明显相关性，而在血清CA125水平低于35U/ml的PGII阳性患者比其他患者有一个较好的预后。

2.4.2前列腺癌

DiazM，RodriguezJC等研究了24例接受抗雄激素治疗伴有骨转移的原发性前列腺癌患者的组织PGII表达[19]，其中12例（42.8%）PGII表达阳性，进一步调查预后发现PGII的表达与长期预后有显著相关性。从而得出结论PGII可以作为一个有用的激素相关性前列腺癌预后的生物学标记。

2.4.3乳腺癌

VizosoF，SanchzLM等测定了243例乳腺癌患者肿瘤组织中胃蛋白酶原的表达[20]，其中113例表达阳性，且高分化的癌组织PGII表达显著高于低分化的癌组织。经过48.5月的预后调查发现癌组织中PGII的低表达预示着良好的无复发预后和整体预后，从而得出结论PGII的表达较低可以提示患者的早期复发和不良的预后。

2.4.5葡萄膜黑色素瘤

AlvarezML等研究了22葡萄膜黑色素瘤组织中PGII的表达[21]，其中11例PGII表达阳性，其在伴有巩膜侵犯的患者组织中的PGII表达阳性的几率高于无巩膜侵犯者，PGII的表达与较差的预后有显著的相关性。

3小结：

综上所述，现今胃蛋白酶原研究主要集中于将其用于胃癌前期病变的早期筛查。此种血清学检测是更为简便、经济、安全、和有效的方法，已逐渐被接受为一种筛查方法，但目前很多临床研究测定其筛查界值结果各异，虽然作为胃癌筛查指标目前应用较多的界值为PGI

胃蛋白酶原与胃肠疾病、胃肠疾病外其它疾病的相关性也有一定的研究，但目前尚不成熟。随着胃蛋白酶原检测方法的进步及不同胃部疾病胃蛋白酶原表达情况的深入研究，有待于进一步探讨不同胃部疾病及胃部疾病的不同证型患者胃蛋白酶原的表达情况，并界定最佳界值，以其使胃蛋白酶原不仅仅用于胃癌的早期筛查，而是进一步用于胃部疾病的诊断，并通过胃蛋白酶原水平判断胃部疾病的具体病变部位。

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胃蛋白酶范文第2篇

[关键词] 慢性胃部病变；血清胃蛋白酶原；变化；糜烂性胃炎

[中图分类号] R573 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）09-211-04

Clinical study on changes of serum pepsinogen in patients with chronic gastric diseases

WANG Mingnan HUANG Deqiu WU Shaolin OU Yongguang XIE Xinkun

Department of Laboratory， Zhaoqing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhaoqing 526020， China

[Abstract] Objective To discuss changes of serum pepsinogen in patients with chronic gastric diseases. Methods 216 cases with chronic gastric diseases from Jan 2014 to Dec 2016 were selected as subjects， among them， 54 cases of superficial gastritis， 30 cases of erosive gastritis， 44 cases of atrophic gastritis， 36 cases of gastric ulcer， 40 cases of duodenal ulcer， 12 cases of gastric cancer. PGⅠ， PGⅡ and PGⅠ/ PGⅡ levels of difference groups were compared， and PGⅠ， PGⅡ and PGⅠ/ PGⅡ levels of Hp+ and Hp- patients were compared. Results PGⅠ levels of erosive gastritis， gastric ulcer， duodenal ulcer were higher than those of control group， and atrophic gastritis and gastric cancer was lower than those of control group， which showed significant difference（P

胃蛋白酶范文第3篇

【关键词】 小儿增食灵合剂；胃蛋白酶；胃酸：小儿厌食症

小儿厌食症是指食欲减退的一种慢性食欲障碍性疾病，多发于1～6岁小儿，城市发病率高于农村，近年来发病率有增高趋势。以我科张士卿教授治疗小儿厌食症的经验方组方加减的小儿增食灵合剂，通过多年临床观察，具有可靠疗效。为探讨其作用机制，笔者研究了小儿增食灵合剂对厌食症模型大鼠胃蛋白酶活性和胃酸分泌量的影响，现报道如下。

1 材料

1.1 药物及试剂

小儿增食灵合剂由甘肃中医学院附属医院提供，规格：240 mL/瓶；批号：200506；临用时按14.4 g/(kg·d)、7.2 g/(kg·d)分别用蒸馏水配制成相应的水溶液。江中健胃消食片：江中摇曳股份有限公司生产，批号0404003，临用时用蒸馏水制成混悬液，0.576 g/(kg·d)(2 mL)。试剂主要有乙醚、氢氧化钠、盐酸、酚酞、二甲基黄指示剂。

1.2实验动物

选断乳后1周龄的健康SD大鼠50只（甘肃中医学院动物实验中心提供），质量（60±10）g，雌雄各半。合格证书：SCXK（甘）2004－007－0001515。

2方法

2.1动物分组

将50只大鼠适应性喂养1周后，依据数字随机表法分为5组，每组10只。A组：空白对照组。B组：模型对照组。C组：阳性对照组。D组：小儿增食灵合剂小剂量组，简称小剂量组。E组：小儿增食灵合剂大剂量组，简称大剂量组。

2.2模型的建立与给药

所有动物在同一条件下喂养（室温20~24 ℃，相对湿度50 % ）。 A组以常规饲料喂养，其余4组用特制饲料喂养。特制饲料采用鱼肉松、奶粉、玉米粉、黄豆粉、白糖、鲜鸡蛋、鲜肥肉按照1∶1∶1∶2∶1∶1.8∶2比例混匀［1］ ，捏成饼干状，每块约20 g，晾干，4 ℃冷藏备用。所有动物均单笼饲养，自由进食饮水，共饲养5周。每日记录进食量及身体质量的变化，以造模大鼠摄食量平均下降20 %~30 %为模型成功标准,或身体质量低于对照组10 %~15 %为造模成功［2］ 。造模成功1周后，各组开始灌胃。A组和B组每日灌服等体积蒸馏水，D组和E组灌服相应剂量的小儿增食灵合剂水溶液2 mL，C组每日灌服江中健胃消食片混悬液2 mL。各组大鼠均每日灌胃1次，连续灌胃15 d。

2.3标本的采集

所有大鼠禁食禁水48 h，用乙醚麻醉大鼠，备皮，常规消毒皮肤，于剑突下沿腹白线开一2.5 cm切口，提起胃，在幽门与十二指肠结合部用缝线结扎。各组分别于十二指肠注入生理盐水，剂量为0.01 mL/g。缝合创口后放回笼中，术后禁食禁水，5 h后断颈处死动物，取出胃，收集胃液于刻度离心管，以2500 r/min离心15 min，吸取上清液进行胃液分析［3］ 。

2.4检测方法［4-6］

2.4.1大鼠胃蛋白酶活性的检测

采用Mett法测定胃蛋白酶活性。先用内径2 mm、长10 cm的毛细玻璃管吸满鸡蛋清（纱布过滤），然后放于70 ℃热水中使蛋白凝固，制成蛋白管取出备用（实验当天制备）。准确吸取胃上清液1 mL于试管中，并加入15 mL的盐酸（0.05 mol/L），放进两根蛋白管作为平行样。试管封口后放进37 ℃恒温箱保存，24 h取出两根蛋白管，测量其四端透明部分的长度（mm），求平均值。公式如下：

胃蛋白酶活性单位（U/mL）=四端蛋白管透明部分长度均值2×16

2.4.2大鼠胃酸分泌量的测定

取清晰胃液2 mL，置于小烧杯中，加入二甲基黄指示剂和酚酞指示剂各3滴，混匀，呈樱红色，于小烧杯下衬一白纸。用微量滴定管徐徐滴入0.02 mmol/L NaOH标准溶液，随滴随摇，直至樱红色消失，开始出现橙黄色时，记录NaOH溶液的消耗量，即为游离酸度终点量，继续用0.02 mmol/L NaOH标准溶液滴定，至出现酚酞的红色（微红色不退），记录NaOH溶液的消耗量与上所用之和即为总酸度终点量，按下式计算游离酸和总酸度：

游离酸（mmol/L）=游离酸度终点量×10

总酸度(mmol/L)=总酸度终点量×10

2.5统计学处理

所有数据均采用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS11.5统计软件处理，各指标组间根据方差齐性采用多因素方差分析。

3 结果

3.1 各组实验大鼠摄食量变化比较

实验结果表明，造模第1～7 d，B组大鼠日平均进食量低于A组20.1 %左右，第7～21 d，B组大鼠日平均进食量低于A组24.5 %，经统计学处理均有显著性差异。见表1。

表1各组大鼠日平均进食量比较 （±s，g）组别n第1 d第7 d第14 d第21 d第27 d第33 d A106.80±1.1311.90±1.6914.99±1.6715.38±1.2115.37±1.3415.60±1.49 B106.78±0.789.54±0.8811.20±0.9511.58±0.9511.13±1.7711.36±0.70 C106.16±0.949.51±0.6511.12±1.0112.57±0.9313.82±0.5514.35±0.62 D106.10±0.609.46±0.9511.06±0.6012.60±1.0614.08±1.0315.04±1.28 E106.29±0.949.50±1.1711.49±0.8212.36±1.3914.10±0.4914.45±1.35 注：与A组比较 P?0.05 ,P?0.01；与B组比较 P?0.05, P?0.01

3.2小儿增食灵合剂对胃蛋白酶活性的影响

实验结果表明，大、小剂量小儿增食灵合剂及江中健胃消食片水溶剂均具有提高胃蛋白酶活性的作用，与A、B两组比较，有非常显著性差异（P?0.01 ）。但D、E两组与C组比较无统计学意义。见表2。

3.3小儿增食灵合剂对胃酸分泌量的影响

实验结果表明，大、小剂量小儿增食灵合剂及江中健胃消食片水溶剂均可使胃游离酸和胃总酸分泌量增加，尤其可显著提高胃游离酸；与A组比较，P<0.05或P<0.01；与B组比较，P<0.01；但D、E组与C组组间比较无统计学意义。见表3。

表2小儿??食灵合剂对胃蛋白酶

活性的影响 （±s）组别n胃蛋白酶活性

（U）A组10855.25±249.14B组10642.00±126.02C组101565.00±321.72D组101750.25±472.80E组102082.75±446.23 注：与A组比较P?0.01；与B组比较P?0.01表3小儿??食灵合剂对胃游离酸和

总酸度的影响 （±s）

组别n游离酸度

（mmol/L）总酸度

（mmol/L）A组1034.61±3.0864.29±9.52B组1033.06±6.6262.86±13.35C组1043.57±4.65 75.50±3.80D组1042.52±5.0875.38±2.39E组1045.73±3.2376.46±5.24 注：与A组比较P?0.05， P?0.01；与B组比较P?0.01

4讨论

导致小儿厌食症发病的病因较多，但大多数学者认为与脾胃失调、纳化失常有关。因此，治疗本病关键在于运脾和胃。小儿增食灵合剂是张士卿教授将厌食症机理与“脾健不在补而贵在运”的指导思想相结合，经过多年临床应用创制而成的。组方中苍术味微苦，芳香悦胃，功能醒脾助运、开郁宽中、疏化水湿，正合脾之习性，故为君药；茯苓性平，作用和缓，可健脾补中，与苍术相配燥湿而不伤脾，补脾而不敛湿，又补中有运，补运结合；槟榔、鸡内金可行气和胃，消食化积；胡黄连善清胃肠湿热；乌梅酸收，可益气开胃，与胡黄连配伍又可助其除疳清热之功；炙甘草益气补中，调和诸药。上述诸药合用，可谓消补并举，标本同治，补而不滞，消导而不伤正，共奏健脾助运、消食醒胃、行气消积之功。

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胃蛋白酶范文第4篇

关键词：微生物；弹性蛋白酶；发酵

中图分类号：Q556+.9文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)01-0050-04

Progress in Microbial Production of Elastase

FANG Shang-ling, HU Jia-jun

（College of Biochemical Engineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China）

弹性蛋白酶（elastase）是一种以分解不溶性弹性蛋白质为特征的广谱蛋白水解酶，主要存在于动物胰脏中，以及皮肤、主动脉、血小板和白血球中。在微生物类群中也广有分布，细菌、放线菌、真菌中都有分泌胞外弹性蛋白酶的报道[1]。弹性蛋白酶可由动物胰脏提取或由微生物发酵制得[2]。由动物提取纯化的弹性蛋白酶是一种肽链内切酶，由240个氨基酸残基组成，相对分子质量为25 900，等电点为pI 9.5[3]。来源不同的微生物弹性蛋白酶都能降解其天然底物――弹性硬蛋白质。同功不同源蛋白酶的特点、性质、相对分子质量和等电点等有所差异，但都是一种广谱的肽链内切酶，具有较广泛的水解特性[4]。

目前，弹性蛋白酶主要作为治疗高脂血症、防治动脉粥样硬化症的生化药物，治疗确切，安全可靠。我国生产弹性蛋白酶主要由猪胰脏提取，原料来源有限制，且酶含量不高，每1 kg鲜胰脏含弹性蛋白酶仅210 000 U，限制了生产的发展。微生物弹性蛋白酶与胰弹性蛋白酶一样，具有较广的水解特性，不但能降解弹性蛋白，而且能分解酪蛋白、明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质，是一种广谱的肽链内切酶。国外，药用弹性蛋白酶有通过动物胰脏提取，也有发酵生产，其效果相似[1]。利用微生物发酵大规模工业化生产弹性蛋白酶不仅能提供足够的治疗用药物酶，也能为开拓该酶其他方面的应用提供充足的酶源。

1微生物来源弹性蛋白酶的国内外研究情况

弹性蛋白酶最初是1949年由Balo等从胰脏中分离纯化出来，并指出其含量水平与动脉粥样硬化症有关。从此对该酶的研究一直很活跃。

1960年Mandl等从牙周病患者的送检样品中首次分离出产胞外弹性蛋白酶的微生物Flavobaterium clastdyticum，并从它的培养液中分离纯化出专一降解弹性蛋白的菌源性弹性蛋白酶。此后从细菌、霉菌、放线菌中相继分离出产酶菌株及其菌源弹性蛋白酶，但初期主要集中于医学微生物病原学的研究。70年代中期以来，日本和前苏联学者对微生物发酵生产弹性蛋白酶进行了大量的研究，并申报了许多专利菌种。其中研究比较详尽的是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa IFO3455）。另外，1974年，Shiio等从自然界取样分离的Flavobacterium immotum 9-35具有很强的弹性蛋白酶分泌能力。后来分离出1株利福平抗性的高产突变株Flavobacterium R-102-87，在以葡萄糖、干酪素为营养源的发酵培养基中，30 ℃振荡培养24 h，酶产量达145U/mL（40 ℃，20 min，使1.0 mg地衣红-弹性蛋白质完全溶解的酶量为1U）。

前苏联学者对放线菌属和曲霉属菌株产弹性蛋白酶研究较多。放线菌属产弹性蛋白酶的代表菌株是Actinomyces rimosus和Actinomyces fradiae119。将Actinomyces rimosus所产的酶纯化并与胰弹性酶比较，发现除相对分子质量较大外，其它性质及水解专一性都与胰源酶十分相似。

真菌中产弹性蛋白酶的高产菌株是曲霉属，前苏联Parksrskyte等选出的弹性蛋白酶高产菌Aspergillus versicolor 837，在以硫酸铵为氮源的马铃薯汁培养基深层液体培养48 h，然后强烈通风培养4 d，培养液积聚大量胞外弹性蛋白酶。

我国对微生物产弹性蛋白酶的研究则少见文献报道，直到上世纪90年代才有颜子颖等[5]关于芳香黄杆菌产弹性蛋白酶菌种筛选、发酵条件研究及酶分离纯化等方面的报道。他们分离的黄杆菌Flavobacterium sp.17-87在30℃，摇瓶培养24 h，弹性蛋白酶产量达120 U/mL，并从中成功地分离出了黄杆菌弹性蛋白酶结晶。

随后，曹军等[6]从不同省区采集的500多个土样中分离得到多株产弹性蛋白酶菌株，主要集中在黄杆菌属和色杆菌属中。经细胞工程技术处理后，黄杆菌属中F-122菌摇瓶发酵产酶能力达到240 U/mL，活力比原始菌株提高了58%。

陈启和等[7]从土壤中也筛选到一株高产弹性蛋白酶的芽孢杆菌（EL3），其酶活达100 U/mL。经过诱变选育、培养基优化等系列研究，获得了大幅度提高酶活性的培养条件。陈丽娟等[8]对枯草芽孢杆菌产弹性酶及提纯工艺进行了较为深入的研究。王娟丽等[9]从土壤中筛选了一株弹性蛋白酶高产菌株Bacillus pseudofirmus EL112，酶活性也达100 U/mL。据hiio等报道，产酶活性达155 U/mL，具备了工业化生产价值。

2微生物产弹性蛋白酶的特征

微生物产生的弹性蛋白酶在结构特征上，具有2个标志性特征：（1）与弹性蛋白质有高亲和力；（2）酶切位点在脂肪族氨基酸羧基参与形成的肽键上。虽然不同来源的弹性蛋白酶的特点、性质、相对分子质量不尽相同，但迄今为止所有分离的弹性蛋白酶最适作用pH均在7.0以上，属于碱性弹性蛋白酶，酸性弹性蛋白酶尚未见报道。与其它的碱性蛋白酶不同，碱性弹性蛋白酶对甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）残基有很高的水解特异性。弹性蛋白中Ala、Gly含量高达55%。这也解释了弹性蛋白酶能高效降解弹性蛋白质的原因。

弹性蛋白酶的水解机制，是首先使弹性蛋白质的结构变疏松并溶解，然后将已溶解的弹性蛋白质降解成可溶的多肽及氨基酸。弹性蛋白质在碱性环境下易变性，结构疏松，有利于弹性蛋白酶对其水解。从嗜碱菌中筛选得到的菌株所产弹性蛋白酶有较高的最适反应pH，其降解弹性蛋白质的酶活性也高。

现已发现的微生物产弹性蛋白酶根据等电点可分为2类：（1）等电点在碱性的弹性蛋白酶，其与底物之间的结合力主要为静电作用力，如芽孢杆菌属（Bacillus）、放线菌属（Actinomyces）、黄杆菌属（Flavobacterium）产的弹性蛋白酶。嗜碱芽孢杆菌Ya-B产的弹性蛋白酶几乎所有正电荷残基都集中在分子表面，这有利于该酶与弹性蛋白质结合。当pH高于弹性蛋白酶的等电点时，弹性蛋白酶失去边面正电荷，与弹性蛋白质的结合率显著下降；（2）等电点在酸性的弹性蛋白酶，其与底物弹性蛋白质之间的结合力主要为疏水作用力，NaCl不能抑制该酶的活性。如：铜绿假单胞菌产的弹性蛋白酶、人胰腺中的弹性蛋白酶、Myxococcus xanthus产的MAP1。Ca2+对保持酶活力，防止酶自身降解必不可少。Micrococcus luteus[8]产生的碱性弹性蛋白酶在Ca2+存在下，在pH6.0～10.5之间、57 ℃以下稳定；EDTA可通过与Ca2+ 结合完全抑制酶活性并导致酶的自溶。

3微生物弹性蛋白酶的基因工程和蛋白质工程进展

3.1弹性蛋白酶的基因克隆和表达

采用分子生物学技术克隆目的基因构建工程菌株，是各国微生物学家的研究热点。弹性蛋白酶基因的克隆和表达，可从理论上解释弹性蛋白酶的转录表达及酶学反应机制，并为该酶实现工业化生产打下基础。1987年，胰弹性蛋白酶的基因首次被克隆，并在E.coli LE392中表达成功[10]。Yoda等在E.coli-B.subtilis的穿梭载体pHY300pLK的基础上，构建含弹性蛋白酶基因的质粒，将Bacillus的碱性弹性蛋白酶的基因克隆到B.subltils中得以表达。表达菌产酶为73 U/mL。

Ryuta 等于1989年克隆了嗜碱芽孢杆菌Ya-B的碱性弹性蛋白酶基因（ale）并测得其核苷酸序列，推出其氨基酸序列，从分子机制解释弹性蛋白酶具有高的最适反应pH及高酶活性的原因。该基因共编码378个氨基酸，其中包含27个氨基酸的信号肽及83个氨基酸的前导序列，成熟酶蛋白由268个氨基酸组成。他们将该基因克隆到表达载体，分别转化到E.coli K-12和B.subtilis DB104中，在后者中检测到了目的基因的表达。

Chang等[11]深入研究了该酶的信号肽及前导序列的功能，将ale基因的信号肽及前导序列分别克隆表达。结果表明，弹性蛋白酶Ya-B的正确折叠形成有活性的蛋白酶的过程发生在细胞外，此过程需要分泌于胞外的前导序列的协助。Yeh等[12]将ale基因的起始密码子UUG突变为GUG，AUG，提高了ale在B.subtilis DB104及ale基因缺陷型突变株YaB-DEC中的表达。

黄春基等[13]用PCR扩增及克隆铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶基因。方法是从铜绿假单胞菌培养物中提取染色体DNA，PCR扩增弹性蛋白酶基因成熟蛋白编码区，A-T克隆于pMD18-T载体中，对重组质粒进行酶切和测序鉴定。结果从高GC含量的铜绿假单胞菌染色体DNA中扩增到弹性蛋白酶基因并进行了克隆与鉴定，该研究实现了活性弹性蛋白酶的高效表达。

3.2蛋白质工程改造弹性蛋白酶

Mei等[14]以枯草杆菌弹性蛋白酶BPN、枯草杆菌弹性蛋白酶Carlsberg为模板，用计算机构建了elastase YaB的三维结构模型。对位于S1底物结合口袋两侧的甘氨酸-124（Gly124）、甘氨酸-151（Gly151）定点突变，用带有较大侧链的碱基的结合切割。突变蛋白基因在Bacillus subtilis DB104中表达，突变蛋白G124A，G124V，G151A对相应作用底物表现出比野生型高3～10倍的催化能力。同时，突变蛋白G124A、G124V的作用底物仅限于丙氨酸、甘氨酸，G151A仅限于丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸。

4微生物弹性蛋白酶的分离制备

微生物弹性蛋白酶是胞外酶，且等电点较高，分离纯化较为容易，可用离子交换法提纯。近来，也开始应用亲和吸附层析法[15]。

4.1离子交换法

森原和之等采用弱酸性阳离子交换树脂直接吸附绿脓杆菌IFO 3455发酵液中的弹性蛋白酶，分离该酶并取得成功。Shiio等应用类型法分别从产黄菌R-102-87和Actinomyces rimosus的发酵液中直接分离出弹性蛋白酶成分，从大体积发酵液中浓缩弹性蛋白酶组分十分理想，可达到分离和纯化的目的。

4.2亲和层析法

吴梧桐等以水不溶性弹性硬蛋白酶的天然底物作为亲和吸附剂装柱，应用酶和底物的亲和吸附力进行分离提纯，仅进一步柱层析即获得聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的胰弹性蛋白酶制品。颜子颖等[15]在对产黄菌sp17-87的研究中，应用该法分离出电泳均一纯的弹性蛋白酶。以160目牛颈韧带弹性蛋白质作为亲和吸附剂，纤维素粉为载体按1∶20混合装柱，控制层析条件可使酶与底物结合而不分解底物，从而达到分离该酶的目的。

5微生物弹性蛋白酶的应用

弹性蛋白酶的用途很广，目前由于主要从脏器中提取，产量小，价格高，限制了其应用。

弹性蛋白酶在医药方面主要作为治疗药物：（1）治疗高脂血症；（2）防治动脉粥样硬化；（3）抑制脂肪肝发展；（4）治疗慢性气管炎及其它结缔组织纤维增生性疾病；（5）外用于消除皮肤焦痂、碎屑，用于烧伤患者的治疗以及皮肤溃疡、口腔溃疡等症。由于胰弹性蛋白酶和菌源弹性蛋白酶性质有差别，虽然国外有报道菌源酶可替代胰源酶用作药品，但具体涉及到某一属菌株所产的酶，必须在药理、毒理及药效方面与胰源酶作充分的比较以确保疗效及安全性。

弹性蛋白酶可用于食品工业。许多动、植物蛋白质，特别是一些难以处理和食用的韧带、大动脉血管、筋腱等蛋白质废料都可被其降解，因此在农副产品深加工、高蛋白质食品的制作、罐头加工等方面将会得到广泛应用。

日用化学工业方面，弹性蛋白酶主要用于疗效化妆品的生产。国外近年有报道将弹性蛋白酶加入化妆品，可增进、改善皮肤血液循环，并改善皮肤脂质代谢，增强皮肤、毛发的弹性、柔性，延缓皮肤老化，减少皱纹及色素沉着，还能促进头发生长，防止脱发。研究表明，对呈老化现象的皮肤施以含弹性蛋白酶的化妆品，可明显的赋活皮肤细胞，皮肤角化程度减少，润湿程度增加。同时，应用廉价的微生物弹性蛋白酶将难以处理的动物颈、背韧带等废料制成高级化妆品原料，将大大简化工艺，减低成本，并变废为宝，

综上所述，应用生物工程技术，将有可能提供充足的新酶源。在国外，已经应用基因工程技术构建工程菌生产弹性蛋白酶，胰弹性蛋白酶基因已被克隆并在大肠杆菌392中表达成功。选育合适的菌种应用发酵技术实现大规模工业化生产，具有很好的经济效益和社会效益。

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胃蛋白酶范文第5篇

关键词：弹性蛋白酶；枯草芽孢杆菌；分离；纯化

中图分类号：Q939.97文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)11-0040-03

Approach on Preparative Method of Elastase Produced by Microorganism

FANG Shang-ling, HU Jia- jun , ZHU Nan

（College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068 ,China）

Abstract：Objective To investigate the preparative method of elastase produced by microorganism. Methods A elastase-producing strain of Bacillus subtilis was inoculated into fermentation medium and cultivated on a rotary shaker。The broth was collected by centrifugation. The purification of elastase was achieved by combination methods of (NH4)2S04 fractionation, anion exchange chromatography on DEAE-Sephadex A-25 and gel filtration chromatography on Sephadex G-75. Results Through the purification procedures shown above, the purification multiple of elastase was 33, the recovery rate was up to 12 % and the specific activity was about 528 U/mg.Conclusion The purer elastase can be obtained by this ideal purification technology.

Key words：elastase; Bacillus subtilis; separation; purification

弹性蛋白酶（elastase）是一种以降解不溶性弹性蛋白质为特征的水解酶，此酶属于丝 氨酸蛋白酶，可由动物胰脏提取或由微生物发酵制得。从胰脏提取的弹性蛋白酶价格较高，因此，采用微生物发酵法生产弹性蛋白酶具有广阔的应用前景[1]。本研究以微生物发酵液为原料，采用盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析方法进行弹性蛋白酶纯化，并结合SDS-PAGE对纯化酶进行测定。

1材料

1.1菌种

弹性蛋白酶生产菌株枯草芽孢杆菌B1由本实验室筛选并分离。

1.2试剂

弹性蛋白、刚果红-弹性蛋白（Sigma公司）；K2HPO4（上海恒信化学试剂有限公司）；DEAE-Sephadex A-25，Sephadex G-75（Pharmacia公司）。

1.3仪器

磁力搅拌器（江苏岸头分析仪器厂）；旋转式摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）；可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；电热干燥箱（江苏海门县三和农具厂）。

1.4培养基

发酵培养基（w/v）：干酪素3.0 g，葡萄糖4.0 g，玉米提取液0.2 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO4・7H2O 0.01 g，pH 8.8。115 ℃下灭菌30 min。

种子培养基（w/v）：牛肉膏0.4 g、 蛋白胨0.6 g、酵母膏0.2 g、NaCl 0.5 g，pH 8.8。121 ℃下灭菌20 min。

2方法

2.1丙酮沉淀法提取弹性蛋白酶

发酵液在4 ℃、5 000 r/min条件下离心30 min，去除菌体，上清液置冰浴中。取上清液，加入与上清液等体积的预冷丙酮，充分搅拌后在4℃下静置30 min。4 ℃，5 000 r/min离心30 min，弃上清液，即得酶蛋白粗品。收集后测定酶活性。

2.2酶的分离纯化

2.2.1pH值对盐析的影响加入65%的硫酸铵作盐析时的沉淀剂，测量不同pH条件下沉淀出酶的活性，确定最适盐析pH值。

2.2.2盐析时硫酸铵最佳浓度的确定发酵液在4 ℃，5 000 r/min条件下离心30 min，去除菌体。冰浴条件下向发酵液中缓慢加入不同量的硫酸铵，盐析液在4 ℃下静置过夜。4 ℃，5 000 r/min离心30 min，分别收集酶蛋白和上清液。将收集的酶蛋白粗品溶于0.02 mol/L、pH 8.0的100 mL Tris-HCl缓冲液中透析，测定酶活性，并确定硫酸铵的最佳盐析浓度。

2.2.3DEAE-Sephadex A-25阴离子交换层析盐析、透析后的酶液采用聚乙二醇浓缩至适当浓度后过离子交换柱。洗脱液检测A280值，吸附的蛋白质用NaCl溶液连续线性洗脱。NaCl浓度0~0.6 mol/L，共800 mL，流速为5 mL/min，每管收集5 mL。分别测定各管A280值和酶活性，合并具有活性的各管溶液，并检测酶液的酶活性。

2.2.4Sephadex G-75凝胶过滤层析[2]收集经过离子交换柱的酶液，用聚乙二醇浓缩至4 mL，加入用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液平衡过的Sephadex G-75凝胶柱中，洗脱并分部收集，流速为5 mL/min，每管收集5 mL，分别检测各管A280值和酶活性。

2.2.5SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）按照Laemmli方法，采用DYY-Ⅲ型垂直板电泳槽进行SDS-PAGE，电泳后的凝胶直接银染或考马斯亮蓝染色。

3结果与讨论

3.1丙酮沉淀法制取弹性蛋白酶的结果

对经丙酮沉淀纯化后的粗酶进行SDS-PAGE凝胶电泳，在相对分子质量32 ×103处有一条单一的蛋白质条带，与文献报道的弹性蛋白酶相对分子质量大小基本一致。结果见图1。

3.2pH值对盐析的影响

酶在等电点或接近等电点时溶解度最低，所以，需要调整发酵液的pH值尽量接近等电点。图2是硫酸铵浓度65 ％时，不同pH条件下弹性蛋白酶酶活性的测定结果。由图2可见，pH4.91时，沉淀所得酶的活性较高，为144.9 U/mL；pH7.1时，沉淀所得酶的活性较低，为128.8 U/mL。因此，在酶分级沉淀的第1步去除杂蛋白质时，将发酵液pH调至7.1，第2步沉淀酶时，可将pH调至4.91。

3.3硫酸铵分段盐析实验结果

透析结束后测酶活性，结果见图3。硫酸铵浓度为65 ％时酶活性较高，可达434.7 U/mL。综合考虑酶的得率和酶活性，应收集硫酸铵浓度30 ％~65 ％之间的沉淀。经过硫酸铵分段盐析，酶活性提高了3.45倍，达到434.7 U/mL。

3.4DEAE-Sephadex A-25阴离子交换层析结果

以洗脱液收集管数为横坐标，蛋白质A280值为左纵坐标，洗脱时NaCl浓度为右纵坐标，绘制的洗脱曲线见图4。由图4可见，NaC1浓度为0.125～0.400 mol/L时洗脱出多个蛋白质峰。表明盐析、透析后的酶液仍含有杂蛋白质。通过洗脱已将多种蛋白质分离开。NaC1浓度高于0.4 mol/L时，基本没有蛋白质洗出。洗脱液第46～63管，有酶活性存在，第55、56管酶的活性最高。NaC1浓度0.154～0.187 mol/L时，即可将弹性蛋白酶洗脱下来。

3.5Sephadex G-75凝胶过滤层析结果

合并经过阴离子交换层析后有活性的收集管内溶液，透析、浓缩后用凝胶过滤层析柱纯化。横坐标为收集管数，纵坐标为A280吸收度值，绘制洗脱曲线，结果见图5。

由图5可见，有2个大的和1个小的蛋白质洗脱峰，大峰没有酶活性，小峰有酶活性。表明经过离子交换层析后的酶液还含有杂蛋白质，且杂蛋白质的量高于酶的量。在收集管26～38号出现弹性蛋白酶的活性峰。

4结论

综上所述，通过盐析，离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析后得到较纯的酶，结果见表1。最终弹性蛋白酶纯化倍数为33倍，酶比活达到528 U/mg，但回收率有待提高。

参考文献

[1]陈丽娟，刘宇峰，夏海华，等. 枯草杆菌产弹性酶及提纯工艺研究[J]. 生物技术，2003，13（1）：20-21.