核酸检测方法

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核酸检测方法范文第1篇

关键词 λ核酸外切酶；G-四链体/血红素DNA酶；化学发光；DNA

1 引 言

DNA是生物体遗传信息的载体[1]，构建快速、灵敏、高选择性的生物分析新方法用于低丰度的DNA序列的检测在临床诊断、基因筛选、食品和环境监测、国土安全等方面起着至关重要的作用[2，3]。近年来，信号放大已经成为提高DNA检测灵敏度的重要手段，如采用纳米材料作为信号放大的标记物、采用聚合酶链反应（PCR）或者滚环扩增（RCA）等核酸扩增技术等。虽然这些方法大大提高了检测的灵敏度，但是也存在操作繁琐、费时、价格昂贵、易出现假阳性信号等缺陷[4，5]。使用限制性内切酶进行信号放大的方法，较以往的信号放大方法更为简单、快速，但是由于限制性内切酶只能针对特定的DNA序列，在实际应用中存在一定的局限性[6，7]。因此，发展快速、灵敏的DNA测定新方法具有重要的理论和实际意义[8]。

λ核酸外切酶（Lambda exonuclease，λexo）是一种高持续性核酸外切酶，能够催化双链DNA分子自5′磷酸末端3′方向逐步水解，并释放出5′-单核苷酸，进而将双链DNA变成单链DNA[9，10]。λexo在核酸重组、复制、分型、基因修复以及分子克隆等方面起着至关重要的作用，已成为研究基因组成、功能及表达的重要工具之一。此外，许多研究者将λexo的独特性质应用于核酸探针的信号放大技术，以实现核酸、蛋白质等生物分子的超灵敏检测[11～14]。但是这些方法大多需要对核酸探针进行荧光标记，过程复杂且成本较高。

G-四链体/血红素 DNA酶（G-Quadruplexes/hemin DNAzyme）是一种具有催化性能的人工模拟酶，由富含鸟嘌呤碱基的核酸分子与血红素结合，形成稳定的G-四链体结构，表现出类似于辣根过氧化物酶的活性，能够催化H2O2氧化2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）产生颜色变化或者催化H2O2氧化鲁米诺（Luminol）产生化学发光[15～17]，在生化分析领域已经引起研究者的广泛关注[18]。

化学发光（Chemiluminescence， CL）分析由于不需要激发光源，避免了背景光和杂散光的干扰，大大提高了信噪比，具有灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、仪器设备简单等优势，目前已广泛应用于免疫分析、临床检验、环境检测、物质分析等领域[19～22]。本研究采用3条核酸链构建DNA夹心结构，使用λexo进行目标DNA的辅助放大，建立了新型化学发光传感器，成功实现了DNA检测。本方法具有操作简单、灵敏度高、特异性好等优势，可用于实际样品分析。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LS-55型发光光度计（美国Perkin-Elmer公司）；PHSJ-4A型pH计（上海精密科学仪器有限公司）。

所有DN段均由上海生工生物有限公司提供（序列见表1）。Luminol、H2O2（国药上海试剂公司）；血红素（Hemin）、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）购于美国Sigma公司；λ核酸外切酶（Lambda exonuclease，λexo）、10×λexo反应缓冲液（0.67 mol/L Glycine-KOH（pH 9.4，25℃），0.02 mol/L MgCl2，500 μg/mL BSA）购于美国New England Biolabs公司。其它试剂均为国产分析纯，实验用水为18.2 MΩ・cm的超纯水。2.5 × 102 mol/L HEPES-NH4OH缓冲液（pH=7.4/8.0/8.5/9.0/9.5/10.0），含0.05%（w/V）Triton X-100，1%（V/V）DMSO，2.0×102 mol/L KCl和0.2 mol/L NaCl。

2.2 实验方法

2.2.1 DNA的检测 将浓度均为1.0×105 mol/L的Auxiliary DNA、Phosphate-DNA、Hairpin DNA溶液以及不同浓度的Target DNA在95℃下加热10 min，再自然冷却到室温。

取出20 μL不同浓度的Target DNA与10 μL Auxiliary DNA、10 μL Phosphate-DNA，在37℃杂交2 h；杂交完成后，加入5 μL λexo （2 U/μL）及5 μL 10 × λexo反应缓冲液，在37℃下温育30 min。随后，将上述混合溶液加热到75℃，保持10 min，再冷却至37℃，孵育1 h；加入10 μL Hairpin DNA，在37℃孵育30 min，再向上述混合溶液中加入20 μL Hemin（终浓度为2.0×107 mol/L）及820 μL HEPES-NH4OH缓冲溶液，充分混匀后，在室温下孵育1 h，保证Hemin与打开的Hhairpin DNA充分反应，形成稳定的G-Quadruplexes/hemin DNAzyme结构。最后，依次将50 μL Luminol（终浓度为1.0×103 mol/L）、50 μL H2O2（终浓度为3.0×102 mol/L）加入到上述溶液中，在室温下立即测量样品的CL光谱。

2.2.2 化学发光测定

CL测量均使用光程为1 cm的比色池。电压设置为800 V，狭缝宽度设为15 nm，扫描速度为1200 nm/min，测量时关掉LS-55型发光光度计的氙灯，测定样品溶液在425 nm处的相对化学发光强度ΔI（ΔI=I-I0， I0为无Target DNA存在时Luminol的化学发光强度， I为不同浓度的Target DNA存在时Luminol的化学发光强度）。每个样品均平行测定3次。

3 结果与讨论

3.1 实验原理

实验原理如图1所示，本体系包括4种DNA：Target DNA、Phosphate-DNA、Auxiliary DNA、Hairpin DNA。首先，Phosphate-DNA与AuxiliaryDNA及Target DNA进行杂交，形成DNA的复合结构。随后向溶液中加入λexo，由于λexo可作用于5′磷酸化的双链DNA分子，并沿5′-3′方向渐进性催化去除5′单核苷酸，破坏双链DNA结构，同时释放出Auxiliary DNA及Target DNA。释放出的Target DNA可以继续进入下一轮循环，不断产生大量Auxiliary DNA，而Auxiliary DNA可以将Hairpin DNA的茎环结构打开，打开的Hairpin DNA在血红素存在的条件下，可以形成稳定的G-Quadruplexes/HeminDNAzyme结构，表现出类似于过氧化物酶的活性，能够催化H2O2氧化Luminol产生化学发光，并且Luminol产生的相对化学发光强度与目标DNA的浓度在一定范围内成比例，从而可以实现Target DNA的定量分析检测。

3.2 可行性研究

不同条件下的化学发光光谱（图2） 表明，单独的Hemin化学发光强度十分微弱（曲线a）；不加入Target DNA（曲线b）， 或者不加入λexo（曲线c）的情况下，体系的化学发光强度也较弱； 图2 不同体系的化学发光光谱

Fig.2 CL spectra of hemin （a）， phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/λexo/hemin （b）， phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/target DNA/hemin （c） and phosphate-DNA/auxiliary DNA/hairpin DNA/target DNA/λexo/hemin （d and e）. Experimental conditions： 1.0×107 mol/L phosphate-DNA， 1.0×107 mol/L auxiliary DNA， 1.0×107 mol/L hairpin DNA， 5.0×1012 mol/L target DNA（curve d） and 8.0×109 mol/L target DNA（curve c and e）， 2.0×107 mol/L hemin， 10 units lambda exonuclease （λexo）， 1.0×103 mol/L Luminol， 3.0×102 mol/L H2O2加入λexo及Target DNA后，体系的化学发光强度增加，且Target DNA浓度越高，发光强度越高（曲线d和e）。化学发光强度的增加是由于λexo催化水解磷酸化5′末端，释放Target DNA，并不断进入下一循环，产生大量的Auxiliary DNA，可以与Hairpin DNA形成大量的G-Quadruplexes/hemin DNAzyme结构。上述结果表明，本方法可用于Target DNA检测。

3.3 测定条件的优化

3.3.1 λexo用量对体系化学发光强度的影响 由于λexo用量直接影响目标DNA的循环效果，进而影响检测体系的化学发光信号的强弱，因此实验首先考察了λexo用量对体系化学发光强度的影响（图3），结果表明，体系的化学发光强度随着λexo用量的增加而逐渐增强，并且当λexo的用量达到10 units 时，体系的化学发光强度趋于稳定。因此，实验将λexo的最佳用量定为10 units。

3.3.2 pH值对体系化学发光强度的影响 由于体系的化学发光强度与缓冲介质的pH值之间存在一定关系[6，16]，因此考察了不同pH条件对体系化学发光强度的影响。实验结果如图4所示，所用HEPES-NH4OH缓冲溶液使体系pH值从7.4逐渐增加到9.0时，体系的化学发光强度逐渐增强，且在pH=9.0时达到最大值；之后继续增大pH值，体系的化学发光强度逐渐减弱。最终选择pH=9.0的HEPES-NH4OH缓冲溶液作为最佳缓冲条件。

3.3.3 Luminol浓度对体系发光强度的影响 作为化学发光的底物，Luminol的浓度强烈影响体系的化学发光强度。本研究考察了不同浓度的Luminol对体系化学发光强度的影响，实验结果如图5所示。在0.4～1.0 mmol/L的浓度范围内，随着Luminol浓度的增加，体系的化学发光强度逐渐增强，且在Luminol浓度为1.0×103 mol/L时，发光强度达到最大值；之后继续增大Luminol的浓度，体系的化学发光强度反而呈现下降趋势。因此选择Luminol的最佳浓度为1.0 mmol/L。

3.3.4 H2O2浓度对体系化学发光强度的影响 考察了化学发光的氧化试剂H2O2的浓度对体系化学发光强度的影响示。从图6可见，H2O2浓度在5.0～30 mmol/L范围内，随着H2O2浓度增加，体系的化学发光强度逐渐增强；当H2O2浓度在30～50 mmol/L时，体系的化学发光强度逐渐减弱。为了获得较大的化学发光强度，实验选择H2O2的最佳浓度为30 mmol/L。

3.4 灵敏度的考察

在优化的实验条件下，测定目标 DNA浓度与体系的化学发光强度之间的关系（图7和图8）。从图7可见， Luminol的化学发光强度随着目标DNA浓度的增加而不断增强，并且Luminol的相对化学发光强度ΔI与目标DNA在2.0×1012～8.0×109 mol/L浓度范围内呈现良好的线性关系（图8），检出限为0.7×1013 mol/L（3σ）。与文献报道的方法比较（表2）可见，本方法的灵敏度优于文献报道的光学检测方法， 或与之相当。

3.5 特异性的考察

为考察所建立方法的特异性，选择浓度均为8.0×108 mol/L的随机序列DN段、单碱基错配的DN段， 以及三碱基错配的DN段作为对照样品，与8.0×109 mol/L目标DNA进行分析比较。从图9可见，仅有完全互补的目标DNA存在时，才能使体系的化学发光强度显著增加；相比之下，其它几种DNA的化学发光强度很低。结果表明，构建的化学发光传感器具有很好的特异性，可以区分不同错配的DNA序列。

3.6 实际样品的测定

为了考察所建立的方法检测复杂生物样品的可行性，进行了人血清样品中的标准添加实验。人血清样品稀释100倍进行加标分析。从图10可见，目标DNA在人血清样品中的化学发光强度值与其在缓冲溶液中的化学发光强度值基本一致，表明通过样品稀释可以有效降低复杂样品的基质的影响。结果表明，本方法在复杂生物样品的分析方面具有潜在的应用价值。

4 结 论

本研究发展了一种基于λexo辅助放大和G-Quadruplexes/hemin DNAzyme催化放大的简单、快速的传感新方法，成功实现了目标DNA在缓冲溶液和复杂生物样品中的高灵敏检测。本方法具有独特的优势：与传统的光学分析方法相比，本方法不需要标记任何发光基团，分析成本低；整个检测过程都是在均相溶液中进行，无需经过洗涤、分离等繁琐的操作步骤，简单方便；本方法具有很高的灵敏度和特异性；本方法对目标DNA的检测具有良好的通用性，通过改变Phosphate-DNA的碱基序列很容易应用于其它目标DNA的检测，具有潜在的应用价值。

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核酸检测方法范文第2篇

【关键词】风资源 多尺度 数据融合 大型风电基地

1 引言

风力是风力发电的基础，对风电场风资源分布的有效监测是风电场理论出力评估和预测准确性的保障。过往的风电场中简单利用少量几个测风塔监测整个风电场的风资源情况，在大型风电基地中会导致风电场群内部大部分区域的风资源情况与实际情况存在一定误差，对风电场发电分析造成很大的影响。为解决上述问题，本文提出了风电场风资源多尺度立体监测网络。

为更好地实现对大型风电基地的风资源监测，建立了基于测风塔、风机机头监测系统及雷达的多尺度立体监测系统。

根据侧风塔数据、风机机头数据、雷达测量数据、地形数据、天气数据等环境因素，利用多时空尺度的融合插值等算法，对大型风电基地整体风场进行模拟分析，构建环境因素在实际风机位置点的插值模型。风电基地监测环境构架如图1所示。

2 并行多尺度数据融合

风资源多尺度立体监测系统是一个较简单的分布式检测系统，三种类别的监测节点使用不同的监测方法、原理和装置，所以在集中分析之前会分别对三种类型的监测数据进行预处理，例如数据最优局部处理和融合处理等，以减小多尺度分布式监测系统的性能损失。

2.1 检测级融合并行结构

并行结构分布式监测系统结构如图2所示，当三种类型的监测节点收集到未经处理的原始数据，需在各自的分处理中心作出局部检测判决等处理；最后，监测中心对所有集中后的数据进行融合处理，得到相应的全局数据。

2.2 基于并行结构的数据融合算法

在并行结构局部判决融合处理中，使用贝叶斯假设检验获得极小化系统运行的平均代价R（Γ），其判决规则集合为Γ={γ0，γ1，L，γN}，其中γ0表示融合规则，γ0（g=1，2，L，N）代表局部检测的判决规则。

新的融合估算值基于以前的融合估算以及新的测量值，小波变换被用来连接不同尺度之间的测量数据。该算法对于多尺度数据滤波融合是很有效的。

4 基于多尺度数据的Kriging插值方法

经多尺度数据融合处理，几种采集时间间隔不同、范围不同的数据被融合为相同时间、空间刻度上的数据，并得到插值方法所需要的风资源基础数据。大型风电基地地形较为复杂，Kriging插值在该类三维空间插值分析中得到了广泛的应用。

4.1 时空协方差函数

时空域随机过程满足二阶平稳或固有假设时，其协方差函数可表示为：

式中，U（s，t）表示定义在时空域的随机过程，且U（s，t）∈Rk×T，其中Rk表示k维的欧氏空间，T代表时间；（s，t）为时空场中任意监测节点的位置，s为监测节点空间中的距离，t为时间上的距离。

同时，对应的变差函数可表示为：

实际中多采用简化的样本变差函数，如式（10）所示：

4.2 Kriging插值

Kriging方法假定采样点之间的距离和方向可以反映一些空间相关性，对周围的测量值进行加权分析得出未测量位置的预测，与反距离权重法类似。Kriging插值是一种线性的无偏估计，并且要求估计误差的方差最小。在风资源监测环境中，监测节点的空间位置是三维的，所以监测位置参数可表示为si={xi，yi，zi}，Kriging插值公式为：

式中，U*（s，t）为待测点（s，t）处的插值；λi为相应监测点的加权系数，当然应满足∑λi=1，该参数的计算式为：

5 实验结果

使用上述多尺度插值融合算法，基于某一时刻（2015年1月22日03时10分）雷达监测数据、风机机头处监测数据和测风塔测量数据，对某一样本风电场中的风速分布进行分析，整个风电场中的风速的分布情况如图3所示。从整体上可以看出，风电场上游为强风速区，下游为弱风速区；同时在距离上游一定的距离处，风电场中心的风速明显小于风电场边缘两侧的风速，一般风速差能达到1-2m/s。

选取该时刻该风电场的风场数据对整个风电场中风机尾流效应造成的风速衰减现象进行分析。如图4所示，对该时段整个风电场中所有风机的机头风速从大到小的排列，结果显示风速从上游风机机头风速的8.5 m/s 衰减为下游的3.2 m/s，风速下降率为62.4%。

6 结论

风资源立体监测网络使用多个尺度的监测数据对大型风电基地风资源进行监测，与过往单一的测风塔监测方法相比更能监测风电基地中风电群场内部细节处的风资源分布情况，使风资源监测的精度大大提高。

参考文献

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作者简介

蒋何（1992-），男，四川省人。硕士学位。研究方向为控制科学与工程。

核酸检测方法范文第3篇

关键词：绝缘子；憎水性；稀疏表示；图像识别

中图分类号：TM855 文献标识码：A

与传统电瓷、玻璃绝缘子相比，复合绝缘子因其具有优异的耐污闪性能而在电力系统中被广泛使用.复合绝缘子的憎水性和憎水迁移性是其具有较强耐污闪性能的基础，然而其在运行中因受到紫外线、污秽、电磁场等条件的共同作用会出现老化现象，使得复合绝缘子憎水性下降，严重老化的绝缘子甚至会丧失其憎水性[1-2].因此有必要定期对运行中的复合绝缘子的憎水性进行检测，及时更换憎水性不合格的绝缘子.目前现场测量复合绝缘子憎水性的方法主要为喷水分级法[3]，该方法将复合绝缘子憎水性分为HC1至HC7 7个等级，其操作简单，对检测设备要求低，但完全依赖于人的主观判断，容易引起检测结果的不一致性.

目前，国内外一些学者提出了基于绝缘子憎水性图像的智能检测方法，文献[4-5]采用图像预处理去除噪声和杂波，利用方向滤波、自适应滤波等方法提取图像的水珠或者水迹边缘，对水珠特征参数进行统计以后利用K邻近算法进行模式识别，从而确定憎水性等级.这种方法克服了目测的主观性，但是由于图像分割处理中很容易出现过度分割或者欠分割现象而导致分割失败，使得后续的特征值提取失准从而导致分类算法无法进行.如图1所示为运用先进的水平集方法对去噪后憎水性图像进行分割时，出现过分割和欠分割的现象.

本文采用稀疏表示分类算法（Sparse Representation Classification， SRC）对复合绝缘子憎水性图像进行识别与分类.稀疏表示的算法是由Wright等于2009年提出应用于人脸识别领域中的算法[6].在该方法中一个测试样本被所有训练样本稀疏线性表示，然后从中找出对测试样本表示误差最小的一类训练样本.这一研究为稀疏表示在图像识别中的应用开辟了新的方向.本文运用稀疏表示分类算法对复合绝缘子憎水性图像进行分类，通过对稀疏表示系数以及最小残差的计算找出样本库中与测试图像最接近的训练图像，从而判断测试图像所对应复合绝缘子的憎水性等级.

1稀疏表示算法

由于拍摄图片光照条件、拍摄角度、拍摄距离等实际因素的影响，即使是同一等级的水珠图像也会呈现出多种不同的效果，所以在选择训练样本时，要综合考虑各种水珠图像所可能呈现的情况.以HC1级别的憎水性图像为例，此时的复合绝缘子憎水性能较好，喷水后复合绝缘子伞裙表面会呈现出单个独立的水珠.但由于受到拍摄条件的影响，水珠的大小、形状、分布有很大的不同.为了能使训练样本最大限度的代表HC1级别憎水性图像的特征，选取具有不同大小水珠、不同光照条件、水珠分布疏密不一致、以及水珠重心倾斜不同角度的憎水性图像作为训练样本集.对于HC4～HC6级别的憎水性图像，由于这些类别复合绝缘子表面出现了不同程度的污秽，使得拍摄所得水珠图像的背景进一步复杂化，需要考虑背景中污秽的分布以及污秽等级的影响.本文所用到的部分HC1～HC6的训练样本图像如图2所示.

3实验结果统计与分析

3.1可理解性分析

一个分类模型的质量通常由两方面进行评估决定：分类试验的准确率以及该模型的可理解性.图4（a）和（b）给出了同属憎水性等级HC1级的两个测试样本，图4（c）和（f）为利用训练样本库里所有样本图像对测试样本进行稀疏表示所得的两组稀疏表示系数和利用式（6）计算得到的各类表示误差.从图4（c）中可以看出：第1类训练样本所对应的稀疏表示系数明显大于其他几类的稀疏表示系数.这说明训练样本集中第1类样本对稀疏表示的贡献最大，这也在图4（d）表示的各类测试误差中得到了体现.因此我们仅通过图4（c）就可判定测试样本属于第1类，即该憎水性图像所对应的复合绝缘子的憎水性属于HC1级.但是，在对第2个测试样本图像进行测试时，仅根据图4（e）的稀疏表示系数对其憎水性级别进行划分有一定的困难，各个类别所对应的稀疏表示系数变化跨度很大，系数之间大小相近的也很多.此种情况下通过进一步计算该测试图像与稀疏表示各类之间的残差来对测试图像进行分类.由图4（f）可知：第1类训练样本与测试图像之间的残差最小，以此可判定该测试样本属于第1类，即该憎水性图像所对应的复合绝缘子憎水性等级为HC1级.

通过这个例子可以看出，利用稀疏表示对复合绝缘子憎水性图像进行分类时，稀疏表示的系数具有以下两个特点：

1）测试样本所对应类别的训练样本参与该稀疏表示的比例最大.

2）同类测试样本所对应的稀疏表示系数都比较接近.

3.2实验结果分析

据文献[11]，憎水性为HC1～HC2级的复合绝缘子可以继续入网运行，HC3～HC5级时需要进行跟踪监测，HC6～HC7级的复合绝缘子必须退出运行.本文在实验测试阶段将复合绝缘子憎水性试验图像分成继续运行，继续观测，退出运行3大类.将HC1～HC2分为第1类，HC3～HC5分为第2类，HC6～HC7分为第3类.相对应的样本训练集也进行了相应的调整，形成了具备上述3大类共107幅标准憎水性图像的训练样本库即训练样本空间，其中第1类样本40幅，第2类样本30幅，第3类样本37幅.由于第1类样本图像中水珠较多，导致图像情况复杂，故相应增加了第1类样本图像的数量.

4结论

测试结果表明：运用稀疏表示分类算法对复合绝缘子憎水性图像进行检测分类具有较高的准确率和可行性.复合绝缘子图像光照情况复杂，水珠分布随机不规则，可见该算法对外界环境的改变具有一定的鲁棒性.与传统的憎水性图像识别分类方法相比，稀疏表示分类算法避开了复杂的图像分割和特征提取过程，大大简化了复合绝缘子憎水性检测步骤.如何通过丰富和优化憎水性图像训练样本库进一步提高算法准确率是今后努力的方向.

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核酸检测方法范文第4篇

关键词：微生物；核酸探针检测法；基因芯片检测法；PCR技术检测法

随着社会的不断进步，人类生活水平的提高，各式各样的食品层出不穷，食品的卫生安全是否达标成为人们热切讨论的话题。为了加强对食品安全的监测和管理，各国的科学家研究出很多食品微生物检验的方法，以求能够及时、准确的检测出食品中微生物的含量。虽然传统的食品微生物检验的方法准确性和灵敏度都很高，可是检验起来较为繁琐，会浪费很多的时间。随着现代科技的进步，微生物学、分子化学、生物化学、生物物理学等领域取长补短研究出了准确率高且检验起来较为简便的食品微生物检验方法。本文就当今运用最为广泛的核酸探针检测法、基因芯片检测法、PCR技术检测法进行了介绍。

1.核算探针检测法

人类和各种生物之所以具有遗传特性是因为体内含有细胞核酸，而DNA和RNA是核酸中唯一具有遗传功能的大分子结构。通常不同的生物中具有遗传特性的核酸片段也是有所不同的。因而不同的微生物含有的核酸片段也有所不同，核酸探针检测法就是利用碱基配对的原理，核酸探针用同位素标记法标记出已知的核苷酸DNA或RN段，使互补的两条核酸单链变成双链。

由于DNA和RNA的基本组成单位有区别，所以核酸探针被分为DNA探针和RNA探针。根据检测的食品的种类不同，通常选取不同的探针进行检测。DNA探针能够和微生物中一大部分遗传基因发生反应，所以它经常被用来检测一些菌属、菌种和菌株；而RNA探针只能和微生物中某一个与其配对的DAN发生反应，它一般被用来检测微生物中某一特定的可能与其配对的菌株。

总而言之核酸探针检测法使用起来比传统的微生物检测更加便捷。而且特异性和灵敏度较高是核酸探针检测法的优点所在。同时核酸探针也具有准确找出微生物组织的化学染色体的功能，核酸探针检测法经常被用来检测食品中具有致病性的微生物含量。虽然它的优点很多可是他也有存在一个重大的缺点。由于不同微生物的基因都有差别，所以要对不同的微生物进行检测就需要多种探针，而且核酸探针检测技术尚未发展成熟，所以不具有一些比较稀有的微生物探针，因此有事食品中的微生物不能完全被检测出来。

2.基因芯片检测法

基因芯片检测法利用寡核苷酸的原理。取微生物的寡核苷酸点样在检测芯片上，提取微生物样品的基因通过PCR技术制作荧光标记探测针，然后放到芯片上的寡核苷酸中，使其进行杂交，最后扫描荧光探针的数量并确定其位置，来判断 被检测的食品中是否含有某种微生物。

基因芯片检测法有三大优点：一是不管是哪一种介质，基因芯片检测法都可以检验出它里面的微生物含量；二是只需要一次实验就可以检测出食品中含有哪种微生物；三是用同一个芯片就能够准确的检测出食品中一种微生物的遗传指标，而且对于复杂的生物群体基因的研究也有重要的作用。与传统的食品微生物检验技术相比，基因芯片检测法有以下三点先进性：第一点是，基因芯片检测法可以一次检验出一种食品中含有的所有微生物，不需要像传统检测技术那样反复进行检测；第二点是，基因芯片检测法比传统检测更加快捷，利用基因芯片检测食品只需要四个小时就能够得出检测的结果，而传统的检测方法要四到七天才能得出结果；第三点是，相对于传统检测方法而言，基因芯片检测法的特异性较强且敏感性高。可是相比于传统检测方法，基因芯片检测法也有以下四点缺点：

（1）检测的费用比传统检测法昂贵得多。因为基因芯片检测法需要专门的仪器，而用于检测的仪器价格非常高，这也是基因芯片检测法没有在我国广泛应用的最主要的问题之一。

（2）基因芯片检测法操作起来比较复杂而且非常浪费时间，检测时操作人员要具有较高的专业技术。这也是导致基因芯片检测法不能够被很多人采纳的原因。

（3）基因芯片检测法对实验操作的要求非常严格，因为在对检测的微生物进行放大的过程中，提取出来的样品很容易就会造成污染，从而影响了检测的结果。

（4）在对食品进行检测时，微生物样品制作和标记的过程比较复杂，而且至今为止没有学者提出精确的关于检测样品质量的定义，所以检测结果往往因人而异。

3.PVR技术检测法

3.1 常规PCR技术检测法

常规PCR技术检测法的原理：在含有DNA模板、引物、适当的缓冲液等等溶液的反应混合物中，以热稳定DNA聚合酶为催化剂，来扩增由一对寡核苷酸引物界定的DN段。

3.2 多重PCR技术检测法

多重PCR技术检测法的检测原理与常规PCR技术检测法大致相同。在某一个反应体中添加多于一对的特异性引物，如果反应体中出现特异性与各引物对互补的模板，那么在相同的测验管中就会出现多条现在的DN段。与常规PCR技术检测法相比，多重PCR技术检测法的优点是：在特异性和灵敏性与常规PCR技术检测法相同的条件下，减少了实验步骤和实验试剂的使用，而且一次可以检测食品中多种微生物。可是多重PCR技术检测法也有很多缺点，例如，扩增效率和敏感性低、会出现引物干扰等。

结语：随着社会的高速发展，人们的生活品质也越来越高，同时对食品卫生安全的监督也越来越强。虽然比起传统的检测方法，新兴的检测方法更加快捷，可是检测成本和结果却比不上传统模式。因此，各个学科的研究者们还应该继续努力，对食品的检测方法继续进行优化，让人们都能够吃上低微生物危害的食品。

参考文献

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核酸检测方法范文第5篇

【关键词】环介导等温扩增；副溶血性弧菌属；食源性；检测

【中图分类号】R155 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0555-02

随着生活水平的不断提高，食源性食物的安全越来越受到全社会和政府各级部门的高度重视与关注，而与食源性食物安全相关的微生物检测已成为食品保障的重要措施之一[1]。用LAMP法可以快速、简便、准确的检测出食源性食物中致病性微生物，大大缩短检测时间，提高致病性微生物的检出率，为致病性微生物的分离培养提供指导方向和科学依据。

副溶血性弧菌是引起人类急性胃肠炎和食物中毒的一种重要的食源性致病菌，在海水产品中其感染水平可达80%[2]，在细菌性食物中毒中，由副溶血性弧菌引起的居首位[3]。传统的副溶血性弧菌国标法[4]检测时间长，检出率低，不宜快速出结果。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术[7]是一种新型等温核酸扩增方法，针对靶基因设计4-6条引物，利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件 （60-65 ℃） 保温约 60 分钟，即可完成核酸扩增反应，产物为针对靶基因扩增产生的各种大小的茎环状DNA混合物，副产物为肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀。目前LAMP多侧重于检测方法的建立[8]，用于实际样品检测的研究较少。本实验室参加了国家食品风险安全监测，收集了12类286份食源性食品同时进行副溶血性弧菌国标法和LAMP法的检测对比，探究副溶血性弧菌属LAMP法在食源性食物检测中的实际应用价值，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 DYY-6C型电泳仪 （北京市六一仪器厂） ；凝胶成像仪 （Gel Doc 2000 BIO-RAD） ；DK-8D 电热恒温水槽 （上海精宏） ； Bst DNA 聚合酶 （Biolabs） ；Betaine （Fluka） ；MgSo4 （Sigma） ；SYBR Green I 、SYBR? Safe DNA Gel Stain （invitrogen） ；dNTP（北京天根公司）；通用型核酸提取试剂盒（广州华瑞安生物）；全自动微生物鉴定生化仪（美国BD）。干燥培养基购自广东环凯微生物科技有限公司，显色培养基购自法国CHROMagar公司， API生化鉴定卡购自法国生物梅里埃公司，均在有效期内使用。

1.2 标本来源 本科室2010年6月至12月收集的12类286份（生禽肉26份；生畜肉26份；熟肉制品32份；速冻熟制米面制品16份；速冻米面制品16份；即食非发酵豆制品26份；动物性水产64；沙拉16份；鲜榨果汁16；生食类蔬菜4份；冰激凌16份；婴幼儿配方食品16份）食源性食物标本；阳性控制菌株：副溶血性弧菌（ATCC-17802）。

1.3 食源性食品样品的前增菌 参照国标《食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验》[4]进行处理。

1.4 LAMP检测食源性食品中的副溶血性弧菌 分别取1mL食源性食品标本前增菌液（3%氯化钠碱性蛋白胨水）10000 rpm离心2分钟，弃其上清液后，利用核酸通用提取试剂盒进行核酸提取，再取1μl上清液做待检模板DNA。利用文献[2，6]报道的LAMP检测方法及引物（F3：5'- GGCGATATTGGTGTTTATGGGG -3'，B3：5'- AACGATAAACTGGACCACGG-3'，FIP：5'- GACGACTGGTACTGATCGATAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGG -3'，BIP：5'- CCGGTGAAATTATCGCCACACAAAACCCACCGCCAGG -3'；由上海invitrogen公司合成。）对286份食源性食品标本增菌液DNA进行检测，反应体系（25μl）：FIP、BIP（40 uM）各1.0 μl，F3、B3（10 uM）各0.5 μl，10×Bst DNA Polymerase Buffer 2.5 μl，dNTP Mixture（10 mM） 3.5 μl，Betaine（5 M）5.0 μl，Mgso4（250mM）0.6 μl，Bst DNA 聚合酶 （8 U/μl）1. 0 μl，DNA 模板2μl，加ddH2o 至 25 μl。轻弹混匀后于水箱内65 ℃孵育60 min，80 ℃ 2分钟灭活酶结束LAMP反应。LAMP反应结束后可直接进行肉眼检测：检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；也可将LAMP产物加荧光染料（1000×SYBR Green I）2 μl，1～5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性； 电泳鉴定：1μl扩增产物与0.2μl上样缓冲液混匀后点样于含适量SYBR? Safe DNA Gel Stain的2 %琼脂糖凝胶中，70 V电泳约60～100 min，电泳图片显示为最小片段大于100bp的LAMP特征性梯状条带，结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性；如见最小片段小于100bp的梯状条带，则判断为非特异性扩增，需要重新检测。

1.5 食源性食品中副溶血性弧菌的分离培养鉴定 参照国标《食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验》[8] 进行分离培养鉴定。

1.6 统计学方法 利用Pearson's卡方统计分析结果。

2 结果

2.1 食源性食品中的副溶血性弧菌LAMP检测结果 所有标本增菌液经LAMP法，仅从64份动物性水产标本中检测出副溶血性弧菌阳性菌株44份，阳性率为68.75%。并且可以通过肉眼判断：检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；也可将LAMP产物加荧光染料（1000×SYBR Green I）2 μl，1～5分钟后观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性，见图1。电泳检测结果，凝胶琼脂糖电泳出现最小片段大于100bp的LAMP特征性梯状条带为阳性，结果图2。

2.2食品中的副溶血性弧菌分离培养结果 所有标本经国标法，仅从64份动物性水产标本中分离出副溶血性弧菌阳性菌株33份，阳性率为51.6%。

2.3统计学分析结果 64份动物性水产标本经LAMP法和国标法，两种检测方法皆为阳性数：32份；两种检测方法皆为阴性数：19份；LAMP法阳性，而国标法为阴性数：12份；国标法为阳性，LAMP法为阴性数：1份；经Pearson's卡方统计分析，结果：P

3 讨论

本研究中利用LAMP法对食源性食品标本的前增菌液进行核酸检测，并和平行检测的国标法进行了检出率的比较，结果显示：LAMP法检出率更高，达68.75%，而国标法只有51.6%，两种检测结果经统计学分析，有统计学差异，LAMP法检测阳性率更高。

国标法需要经过增菌、分离、生化鉴定这几个步骤，检出副溶血性弧菌至需要4-7天。LAMP法检测只需要采用前增菌液进行核酸提取后即可开始LAMP扩增试验，在60分钟即可以完成LAMP扩增过程，24 小时内检出副溶血性弧菌属，相比国标法更快速。另外LAMP法还可以利用肉眼判断结果，直观方便，对于生鲜食品的快速检测具有重要的意义。

LAMP法是对副溶血性弧菌属的通用核酸检测，不能进一步鉴定分型和分离菌株，将LAMP法配合国标法进行食源性食品的卫生检测，LAMP检测发现阳性结果后再进行国标法试验来鉴定菌株，可以提高食品卫生检验的效率。

综上所述，在对食源性食物进行检测的过程中，运用LAMP快速检测方法，结合国标法，进行综合判断，可以在最短的时间内取得最准确的检验结果。

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基金项目：

长沙市科技发展项目（K0902167-31）