高效液相色谱
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高效液相色谱范文第1篇
[中图分类号] R927[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）08（a）-028-02
Generality of HPLC
ZHANG Jian-hong,CHEN You-sheng
(Department of Pharmacy, Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangzhou 510520，China)
[Abstract] This paper summarizes the advantages, disadvantages, types, applications and foreground of HPLC
[Key words] HPLC; Advantage;Application;Disadvantage;Foreground
高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)是利用高压输液泵驱使流动相通过装填固定相的色谱柱，按照固液相之间的分配机制对混合物进行分离的方法。
1高效液相色谱法具有的优点
与其他谱法相比具有以下优点：①高分离率(应用10 μm以下规则均匀的极细颗粒为固定相，所以传质阻抗小，柱效高,一般在1×103~5×105 n/m)；②高速(采用2×103~3×104 kPa的高压输液泵输送液体流动相，使其具有高流速,数分钟至几十分钟可完成试样分析)；③自动化操作，重复性高；④高效相色谱柱可反复使用；⑤高灵敏度(广泛使用了高灵敏检测器,只需要试样10-7~10-2 g)。
2高效液相色谱法分类
高效液相色谱法按照分离机制可分为以下4种：
2.1液-液分配色谱法（liquid-liquid chromatography)
LLC根据流动相和固定相的极性不同又可分为，①正向LLC：流动相极性固定相极性，极性大的组分先流出色谱柱，适合非极性物质分离。
理论上应不相溶的固定相和流动相，实际上仍有少量微量固定相溶解，并且机械冲击作用也会导致固定相流失，从而使柱的分离效率和选择性降低, 目前主要采用化学键合固定相(即通过固定相的有机基团与载体（硅胶）表面的游离羟基发生化学反应，从而使固定相与载体键合起来)来克服这一问题。
2.2液-固吸附色谱法（liquid-solid adsorption chromatogramphy）
在吸附色谱中，组分分子和流动相分子对吸附剂（固定相）表面产生竞争性吸附，利用组分和固定相吸附力的不同而分离。
2.3离子交换色谱法(ion exchange chromatography)
离子交换剂上可解离的离子与流动相中组分离子进行可逆的离子交换，利用试样中不同组分与离子交换剂具有不同的亲和力而将它们分离的方法。
2.4空间排阻色谱法（凝胶色谱法）
试样中分子量大小不同的组分进入凝胶柱时，组分分子渗入微孔的程度不同，大分子直接从间隙中越过，首先出柱，分子越小，进入微孔越深，保留值越大，溶剂分子通常最小，最后流出。主要用来分离高分子化合物，如蛋白质、多糖等。
3高效液相色谱法的应用
HPLC已成为应用最为广泛和有效的分离分析手段，应用非常广泛，目前，HPLC在医药、生化、天然产物主要成分的分析、食品分析、环境分析等方面都有广泛的用途：
3.1医药方面
广泛用于药物的分离、分析、定量等[1-3]。
3.1.1药物合成的分离精制在药物合成反应中，作为人工合成药物的精制手段，用于除去少量杂质，特别是那些异构体的分离。值得提出的是，药物中R-型和S-型的光学异构体具有不同的生理作用。为了研究药物的作用机制，需要拆分光学异构体(即对映体)，这是很困难的工作，而高效液相色谱在这方面显示了独特的长处。利用不同类型的手性固定相与对映体能生成稳定性不同的非对映异构体，从而达到分离目的。
3.1.2天然产物的分离分析天然产物的组分非常复杂，例如中草药等，用高效液相色谱法进行分离分析，具有简单快速的特点。
3.2在生命科学中的应用[4,5]
其在生化领域的应用主要集中于两个方面：①低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇等的分离和测定。②高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定。 过去对这些生物大分子的分离主要依赖于等速电泳、经典离子交换色谱等技术，但都有一定的局限性，远远不能满足生物化学研究的需要。因为在生化领域中经常要求从复杂的混合物基质，如培养基、发酵液、体液、组织中对感兴趣的物质进行有效而又特异的分离，通常要求检测限达ng级或pg级，或pmol，fmol，并要求重复性好、快速、自动检测；制备分离、回收率高且不失活。在这些方面，HPLC具有明显的优势。
3.3食品方面[6-8]
高效液相色谱法已经被广泛应用于下面二个领域：①食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等；②食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂（合成色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等；③食品污染物分析：霉菌毒素（黄曲霉毒素、黄杆菌毒素、大肠杆菌毒素等）、微量元素、多环芳烃等。
3.4环境分析方面[9]
在对大气中污染物的成分分析，废水、废汽和汽车尾气中有害组分的分析中，高效液相色谱法发挥着很大的作用。
3.5农业方面[10]
在农业的发展中，高效液相色谱也发挥着很大的作用。它主要用来对各种农作物中营养成分进行分析，特别是对多糖、脂肪酸、蛋白质等分析都是极为有效的方法。
4 高效液相色谱法存在的问题
4.1涡流扩散（Eddy diffusion）
流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流速就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。
4.2分子扩散（Molecular diffusion）
分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。
4.3质量转移（Mass transfer）
被分离物质要在流动相与固定相中平衡，这样才能形成较窄的区带。在液相色谱中，溶质分子要在两个液相之间进行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时，转移速度慢，来不及达到平衡流动相就向前移，产生物质的非平衡移动，使区带变宽。
4.4流动相流速
当流速太低时，分子扩散严重。如将理论塔板高度对流速作图，理论塔板高度随流速增加而急速下降，当达到最低值时，流速再加大则质量转移起主要作用，理论塔板高度又加大。在高效液相色谱中，流速稍快影响不大，但在凝胶过滤色谱中，因为物质要渗透到凝胶内部，所以质量转移影响大，流速加大会降低柱效率。
4.5固定相颗粒大小
固定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压力才能使它流动。
5展望
高效液相色谱法虽存在上述不足之处，但由于分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广、组分易回收、样品处理较简单等优点，从而在医药、食品、生化、环境分析等领域还是有着广泛的应用前景。
[参考文献]
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高效液相色谱范文第2篇
【摘要】
目的采用高效液相色谱（HPLC）法测定不同白芍药材中芍药苷含量，确定哪种白芍含芍药苷最高。方法采用色谱柱：Hypersil C18柱（4.6 mm×200 mm，5μm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸水（14：86）；检测：UV 230 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：25℃。结果2年生、10月份采收贮存期短的亳州白芍芍药苷含量最高。结论该方法简便准确可靠、重复性好。
【关键词】 白芍 芍药苷 高效液相色谱 质量
Abstract:ObjectiveTo compare the quality of different Radix Raeoniae Alba with HPLC methods. MethodsThe separation was carried out on Hypersil C18 column（4.6 mm×200 mm，5μm）； the mobile phase was acetonitrile-H2O (acidified to 0.05% with phosphoric acid)（14∶86）；the flow-rate was 1.0mml/min； the column temperature was 25℃. ResultsThere was the highest content of paeoniflorin in Radix Paeoniae Alba of two -year-growing time harvested in October with short storage time.ConclusionThe method is simple， rapid with good reproducibility.
Key words:Radix Paeoniae Alba； Paeontflorin； HPLC； Quality
白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall的干燥根，其主要成分为芍药苷（Paeoniflorin）、芍药内脂苷（Albiflorin）、氧化芍药苷（Oxypaeoniflorin）、苯甲酰芍药苷（Benzoylpaeoniflorin），通称芍药总苷（total glucosides of paeony， TGP）。具有抗炎、抗病毒、解痉镇痛、护肝等多种药理活性。白芍药材及各种制剂均以芍药苷含量为质量控制标准。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪（四元泵、柱温箱、MVD检测器、Agilent1100 色谱工作站）、电子分析天平AE240 （十万分之一，瑞士，METTLER-TOLEDO Co.）、CQ250超声波清洗器（上海超声波仪器厂）、UV-3300（日本日立公司）。
1.2 试药
芍药苷对照品（编号：0900-200102，含量测定用，中国药品生物制品检定所购），白芍药材经江西中医学院药用植物学科组鉴定符合2000年版《中国药典》白芍项下标准。乙腈为色谱纯（Merk Co.），水为双蒸水，其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液制备
精密称取白芍对照品适量，加50%乙醇制成每毫升含60 mg的溶液，摇匀，即得。
2.2 供试品溶液的制备
精密称取本品干燥的粉末0.5 g，置50 ml容量瓶中，精密加入50%乙醇35 ml，超声提取30 min，冷却，加50%乙醇至刻度，摇匀，滤过，再过0.45 μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
2.3 色谱条件
色谱柱： Hypersil C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）（大连Elite公司）；流动相：乙腈-0.05%磷酸水（14∶86）；检测：UV 230 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：25℃。理论塔板数以芍药苷峰计算不得低于2 000。在上述色谱条件下，取对照品溶液、供试品溶液各进样10 μl进行HPLC测定，结果见图1～2。由图中可见供试品中芍药苷与芍药苷对照品峰保留时间一致，并且与样品中其它组分达到了很好的分离。
2.4 线性关系
考察精密称取芍药苷对照品0.024 80 g，置50 ml容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，即得到2.48 mg/ml的芍药苷对照品溶液，从中分别精密吸取0.25，0.5，2.5，5.0，10.0和15.0 ml的对照品溶液，分别置6个25 ml的容量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各10 μl，绘制标准曲线，得回归方程Y=1 809.398 4X+2.213 5，r=0.999 99。
2.5 提取方法的确定
本实验对提取溶剂、提取溶剂的浓度、提取时间、提取方法等进行综合考察，最后确定供试品溶液的制备方法为：用50%乙醇超声提取30 min即可。
2.6 精密度实验
精密吸取同一份供试品溶液10 μl，重复进样6次，测定芍药苷峰面积积分值，RSD为0.80%。
2.7 重现性实验
按“供试品溶液的制备”方法，对同一批样品分别制备6份供试品溶液，各吸取10 μl进样测定，测得芍药苷含量RSD为0.72%。
2.8 稳定性实验
取同一份供试品溶液在上述色谱条件下，分别在0，6，12，24，36，72 h各进样10 μl，测定芍药苷峰面积积分值RSD为0.64%。
2.9 回收率实验
采用加样回收测定法。分别精密称取已知含量（芍药苷1.778%）的样品约0.25 g，共6份，分别加入一定量的对照品（浓度为0. 88 mg/ml，精密加入5 ml），按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，进行HPLC测定，测得芍药苷的平均回收率为99.92%，RSD为1.36%；结果见表1。结果表明，本法回收率高。表1 回收率实验结果（略）
2.10 样品含量测定
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl进样测定，结果见表2。表2 13批样品的芍药苷含量测定结果（略）
3 讨论
3.1 不同产地芍药苷含量差异 从芍药苷含量测定结果看，不同产地的白芍芍药苷含量各不相同。其主要成分芍药苷含量以亳州产白芍最高；本实验所用亳州白芍为带皮的根，与文献［1］报道的未去皮白芍药材中芍药苷含量最高相符。
3.2 不同采收期芍药苷量差异从芍药苷含量测定结果看，以四川白芍为例，采收期8月份，9月份，10月份芍药苷含量不同，采收期在10月份芍药苷含量最高，与文献［2］报道的采收期在10月份芍药苷含量最高相符。
3.3 贮存期对芍药苷含量的影响从白芍饮片1（贮存1年）、白芍饮片3（贮存2年）、白芍饮片4（贮存3年）芍药苷含量测定结果看，随贮存期的延长，白芍中芍药苷的含量呈下降趋势，所以白芍的贮存期不宜太长。
3.4 不同生长年限对芍药苷含量的影响不同生长期亳州白芍中芍药苷的含量不同，以2年生者含量最高，随着生长期的延长，芍药苷的含量呈下降趋势。据有关文献报道可能因为生长期长，淀粉含量增加，芍药苷在体内转化分解。这提示合理利用亳州白芍资源，可缩短生长期，增加芍药苷含量，即经济又有效。
总之，根据上述测定结果，可见本法操作简单，重现性好，可作为白芍质量控制的有效方法。
参考文献
［1］施大文，董欣，何婉霞．白芍的品质评价［J］.中药材，1988， 11(4)：39.
高效液相色谱范文第3篇
【关键词】 超高效液相色谱-串联质谱; 玩具; 致癌染料; 致敏染料
simultaneous determination of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs in toys by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometryma qiang，bai hua*，wang chao，zhang qing，ma wei，zhou xin，dong yi-yang，wang bao-lin(chinese academy of inspection and quarantine，beijing 100123)(china agriculture university，beijing 100083)(dongning entry-exist inspection and quarantine bureau，dongning 157200)abstract a comprehensive analytical method based on ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry has been developed for the simultaneous determination of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs(acid red 26，basic red 9，disperse blue 1，acid violet 49，disperse blue 3，solvent yellow 1，dispersed blue 106，disperse orange 3，disperse yellow 3，basic violet 1，basic violet 3，disperse red 1，solvent yellow 3，disperse blue 124，solvent yellow 2 and disperse orange 37).various toy samples，including textile，leather，paper，wood，balloon，modeling clay，limitation tattoo and aqueous liquid，were extracted under ultrasonication.qualitative and quantitative analysis was carried out for the analyte under the mrm mode after the chromatographic separation on waters acquity uplc beh c18(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm) column.the limits of quantitation(loq) for the 16 dyestuffs were in the range of 1.0－8.0 μg/kg.the mean recoveries at the three spiked levels of 5－100 μg/kg were 81.3%－98.6%，with the intra-day precision less than 11% and the inter-day precision less than 14%.the method is accurate，rapid，sensitive，and adapt to the inspection of the 16 dyestuffs in toys.
keywords ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; toys; carcinogenic dyestuffs; allergenous dyestuffs
1 引言
我国是玩具产品的生产和消费大国，也是国际玩具产品的主要出口国。Www.133229.CoM玩具材料中含有的有毒有害化学物质可通过吞咽、舔食、皮肤接触、眼睛接触、吸入等方式进入体内，从而对儿童的健康安全造成严重危害， 玩具的安全性一直是社会关注的热点问题〖1〗。在染色过程中，染料分子通过吸附、扩散等多种化学或物理处理，从染液转移到被染物上而使之染色〖2〗。目前，已经证实存在多种可诱发人体癌变或引起人体皮肤、黏膜或呼吸道过敏的致癌和致敏染料〖3〗。鉴于致癌和致敏染料的严重危害，许多国家和世界权威组织相继颁布了严格的法规和技术标准进行限制。按照欧洲标准化委员会制订的en 71玩具安全系列标准对玩具化学性能的要求，酸性红26、碱性红9、分散蓝1、酸性紫49、分散蓝3、溶剂黄1、分散蓝106、分散橙3、分散黄3、碱性紫1、碱性紫3、分散红1、溶剂黄3、分散蓝124、溶剂黄2、分散橙37等16种致癌和致敏染料在玩具产品中不得检出〖4〗9噬闹繁曜糘eko-tex standard 1000〖5〗、欧盟2002/371/ec指令〖6〗、我国国家标准《生态纺织品技术要求》〖7〗、环境保护行业标准《环境标志产品技术要求 生态纺织品》〖8〗也分别将酸性红26等染料列为致癌和致敏染料。
目前，检测致癌和致敏染料的方法主要有高效液相色谱法〖9~12〗、离子对色谱法〖13〗、液相色谱-质谱法〖10，11〗和气相色谱-质谱法〖14〗等，但这些方法的灵敏度、选择性和分析通量还存在不足。超高效液相色谱技术与传统的液相色谱技术相比，大幅度改善了液相色谱的分析速度、分离效率、样品通量和灵敏度。超高效液相色谱与串联四极杆质谱联用，能够充分发挥超高效液相色谱的高速、高分离度与串联质谱的高选择性、高灵敏度的优势，采用多反应监测扫描方式可提供特征的母离子及其子离子信息，为目标化合物的定性与定量分析提供了可靠依据。本研究建立了同时测定玩具中16种致癌和致敏染料的超高效液相色谱-串联质谱分析方法，在9 min内完成了16种染料多组分的快速分离检测，为玩具样品的高通量快速检测提供了可靠的分析平台，可应用于玩具的实际检验工作和产品质量控制。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
acquity超高效液相色谱仪、quattro micro api三重四极杆质谱仪、masslynx数据处理系统（美国waters公司）；milli-q超纯水器（美国millipore公司）； kq-600b型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； ms2型漩涡振荡器（德国ika公司）； n-1000型旋转蒸发仪（日本eyela公司），配有bc-55型真空冷却系统（日本yamato公司）； acrodisc ghp双性滤膜（美国pall公司）； 乙腈、甲醇、无水乙醇（hplc级，美国fisher公司）； 乙酸铵（hplc级，美国acros公司）； 实验用水为经milli-q净化系统（0.22 μm过滤膜）过滤的去离子水； 氮气、氩气（>99.999%）； 其它试剂均为分析纯。
酸性红26（纯度84%）、碱性红9（纯度95%）、酸性紫49（纯度96%）、分散蓝3（纯度20%）、碱性紫1（纯度30%）、碱性紫3（纯度80%）、分散蓝124（纯度70%）和溶剂黄2（纯度95%）购自德国dr.ehrenstorfer公司；分散蓝1（纯度30%）、溶剂黄1（纯度99%）、分散蓝106（纯度95%）、分散黄3（纯度30%）、分散红1（纯度95%）、和分散橙37（纯度95%）购自美国sigma公司；分散橙3 (纯度95%)和溶剂黄3 (纯度99%)购自美国acros公司，16种染料的标准物质均为市场上最高纯度标准样品，它们的化学文摘号、染料索引号等参数见附表1（/table/090704.pdf）。
2.2 色谱条件
waters acquity uplc beh c18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（a）和5 mmol/l乙酸铵溶液，ph=5.0（b），梯度洗脱程序：0~2.0 min，28%~40% a；2.0~6.0 min，40% a；6.0~9.0 min，40%~95% a；9.0~9.5 min，95% a；9.5~10.0 min，95%~28% a。流速0.3 ml/min；柱温30 ℃；样品室温度20 ℃；进样量5 μl。
2.3 质谱条件
电喷雾离子源；正离子扫描；毛细管电压4.0 kv；射频透镜电压0.1 v；离子源温度120 ℃；去溶剂气温度350 ℃；去溶剂气流量600 l/h；锥孔气流量50 l/h；光电倍增器电压650 v；碰撞气体为氩气，碰撞气压0.32 pa； 多反应监测（mrm）模式检测，16种染料的质谱分析参数见表1， mrm色谱图见图1。
表1 16种致癌和致敏染料的质谱分析参数（略）
table 1 ms parameters for 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs analysis
图1 16种致癌和致敏染料的mrm色谱图（略）
fig.1 mrm chromatograms of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs
色谱峰编号同表1（the peak numbers are the same as in table 1）.
2.4 标准储备液和工作液的配制
准确称取适量的各染料标准品，用甲醇溶解并定容至100 ml，配制成1000 mg/l标准储备液，于－20 ℃下保存。准确量取各染料标准储备液5 ml，用甲醇定容至100 ml，配制成50 mg/l混合标准储备液。使用时，用甲醇逐级稀释成混合标准工作液，于4 ℃下保存，现用现配。
2.5 样品处理
2.5.1 纺织品、皮革、纸张、木材、气球、造型黏土、贴纸材质玩具材料的处理 取代表性样品，测试试样应从单个样品上的可触及部分移取，同种材料可合并作为同一测试试样，将其剪碎至3 mm×3 mm以下，混匀。准确称取1.0 g试样置于50 ml具塞锥形瓶中，准确加入15 ml无水乙醇，超声提取15 min。将提取液转移至50 ml鸡心瓶中，残渣再加入15 ml无水乙醇提取一次。合并提取液，用旋转蒸发仪于40 ℃水浴减压浓缩至近干，用氮气缓慢吹干后，准确加入1 ml甲醇溶解残渣，过0.20 μm微孔滤膜后，供uplc/ms/ms测定。
2.5.2 可接触液体玩具材料的处理 取代表性样品，测试试样应从单个样品上的可触及部分移取，同种材料可合并作为同一测试试样。准确称取1.0 g试样置于50 ml具塞锥形瓶中，准确加入15 ml无水乙醇，超声提取15 min，将提取液转移至50 ml鸡心瓶中，用旋转蒸发仪于40 ℃水浴减压浓缩至近干，用氮气缓慢吹干后，准确加入1 ml甲醇溶解残渣，过0.20 μm微孔滤膜后，供uplc/ms/ms测定。
3 结果与讨论
3.1 样品处理方法的优化
酸性红26等16种染料的正辛醇/水分配系数（kow）介于－0.83~4.58之间，极性范围分布较宽，各染料均在无水乙醇中有较好的溶解性。因此，选择无水乙醇为提取溶剂。为了减少操作步骤及获得尽可能高的提取率，采用超声提取方式对样品进行提取。考察了不同提取时间（10， 15， 20和25 min）和提取次数（1， 2和3次）的提取效果，确定了最佳的样品处理条件。
3.2 色谱条件的优化
3.2.1 色谱柱的选择 采用亚微米小颗粒填料色谱柱可获得更高的分离度、样品通量和灵敏度。分别考察了具有不同选择性的uplc色谱柱（规格均为50 mm×2.1 mm，1.7 μm）对16种染料的分离效果：c18及c8（直链烷烃）、shield rp18（内嵌有氨基甲酸酯极性基团）、phenyl（苯基连接在c6直链的硅甲基官能团上）、hilic（硅胶基质）、hss t3（三键c18烷基键合）。结果表明，16种染料在acquity uplc beh c18色谱柱上获得了最为理想的分离效果。
3.2.2 流动相的选择 分别考察了反相色谱常用的有机相溶剂（甲醇和乙腈）与不同种类和ph值的挥发性缓冲液组成的流动相体系，如甲醇（或乙腈）-5 mmol/l甲酸铵溶液（ph值分别调节为3.75， 4.00， 4.25， 4.50， 4.75， 5.00， 5.25， 5.50和5.75）、甲醇（或乙腈）-5 mmol/l乙酸铵（ph值分别调节为2.75， 3.00， 3.25， 3.50， 3.75， 4.00， 4.25， 4.50和4.75）、甲醇（或乙腈）-0.1%甲酸溶液等对染料化合物的色谱行为和离子化程度的影响。结果表明，以乙腈-5 mmol/l乙酸铵溶液（ph=5.0）作为流动相时获得了最优的色谱峰形、分离效果和质谱信号响应。进一步比较了乙酸铵缓冲液离子强度的影响，乙酸铵溶液浓度从2 mmol/l变化到10 mmol/l的结果表明，5 mmol/l乙酸铵为最佳添加量。由于上述16种染料包括酸性染料、碱性染料、分散染料、直接染料等类别，化学结构上涵盖了偶氮型、三芳甲烷型、蒽醌型、杂环型等，各染料的化学性质和保留性质相差较大，选择梯度洗脱方式，通过优化流动相梯度洗脱条件实现了16种染料的有效分离。
3.3 质谱条件的优化
在esi+和esi－离子化模式下，分别进行全扫描以选择适当的电离方式和准分子离子峰。实验结果表明，大部分染料在离子源esi+电离方式下，可获得较高丰度的〖m + h〗+母离子。酸性红26、酸性紫49等含钠染料的母离子为〖(m－nna)+(n+1)h〗+，碱性红9、碱性紫1、碱性紫3等含氯染料的母离子为〖m－cl+h〗+，16种染料的二级质谱图见附图1（/fig/090704.pdf）。在确定各染料的母离子后，采用子离子扫描方式进行二级质谱分析，对子离子进行了优化选择，确定定量离子和辅助定性离子，通过优化毛细管电压、一级锥孔电压、二级锥孔电压、射频透镜电压、碰撞能量、质谱分辨率等质谱参数，使每种染料的准分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大。
3.4 uplc/ms/ms与hplc/ms/ms的比较
本研究组曾建立了同时测定玩具中酸性红26等16种致癌和致敏染料的hplc/ms/ms方法，其完成一次样品分析的时间为27 min， 流动相消耗量为27 ml（流速为1.0 ml/min）。而本方法在9 min之内即完成了对16种染料的分析测定，分析时间为hplc/ms/ms方法的1/3，显著提高了样品分析通量，完成一次样品分析的溶剂消耗量仅为2.7 ml，为hplc/ms/ms方法的1/10，提高了分析速度，降低了分析成本，减少了废液产生。
3.5 线性范围和检出限
分别配制一系列标准工作溶液，在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定，16种染料的线性方程、线性范围和相关系数见表2。以信噪比为10估算定量限（loq），16种染料的定量限为1.0~8.0 μg/kg。
表2 16种致癌和致敏染料的线性方程、线性范围和相关系数（n=3）（略）
table 2 linear equations，linear ranges and correlation coefficients of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs(n=3)
3.6 方法的回收率和精密度
分别称取经测定不含有16种染料的纺织品、皮革、纸张、木材、可接触液体、气球、造型黏土、贴纸等材质的玩具样品1.0 g，分别添加不同浓度标准溶液，每个添加浓度6个平行样，进行添加回收率和精密度实验，用超高效液相色谱-串联四极杆质谱进样测定。在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为81.3%～98.6%。16种染料中代表性物质的回收率和精密度结果见表3，全部结果见附表2（/table/090704.pdf）。在一日内不同时间点和不同日期（5 d内）测定的日内精密度均小于11%； 日间精密度均小于14%。
3.7 样品测定
应用本方法对布绒、皮革、纸制、木制、泥制等不同类型的玩具样品共25件进行了分析测定，均未检出含有致癌和致敏染料。
表3 玩具（纺织品、皮革、纸张）中16种致癌和致敏染料的部分添加回收率结果（n=6）（略）
table 3 results of recovery for 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs in textile，leather and paper samples(n=6)
【参考文献】
1 department of supervision on inspection，general administration of quality supervision，inspection and quarantine of the people’s republic of china(国家质量监督检验检疫总局检验监管司).toy safety testing and regulation(玩具安全测试及法规).beijing(北京)：china standard press(中国标准出版社)，2007： 170
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高效液相色谱范文第4篇
关键字 HPLC；药物；分析
中图分类号R9 文献标识码A 文章编号 1674-6708（2014）112-0182-02
高效液相色谱法是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种快速、高效的新型分离分析技术。，并且可以直接用于分析难挥发、热不稳定及高分子样品，弥补了气相色谱法的弱点，扩大了色谱法的应用范围，高效液相色谱法包括吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法和分子排阻色谱法，其中基于分配机理的高效液相色谱法在药品检验中应用非常广泛的一种仪器分析方法。
1离子色谱法在药物分析中的应用
离子色谱法是美国 Small等人在离子交换色谱法的基础上建立起来的一种离子分离分析液相色谱技术，以其灵敏、快速、精密度高、抗干扰能力强等优点，主要应用于药物及合成中间体的分析、复杂组分中的某一组分鉴定、药物离子的价态及形态分析等方面。
晏菊姣等建立了离子色谱法测定注射用头孢他啶中碳酸钠的含量，钠离子浓度在2mg/L~20mg/L范围内呈良好的线性关系（r=0.9992），平均回收率为100.6% （n=9），测得定量限为0.002mg/L，该方法采用 Ionpac CG12A，CS12A阳离子交换柱，淋洗液为18mmoL/L 甲烷磺酸，CSRS-ULTRA 4mm自动抑制循环模式，抑制电流为60mA。
张伟等采用高效阴离子交换色谱法测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量，采用 IonPac AS11-HC离子交换柱（4mm×250mm），流动相为20mmol/L的 NaOH 溶液，等度洗脱 20min，采用 ASRS 4mm阴离子抑制器，电导检测器，测得枸橼酸离子浓度在 0.1～2.0μg/mL范围内，对照品色谱峰面积与枸橼酸离子浓度呈良好的线性关系，r=0.9990，总平均回收率 97.80%，RSD为0.69%，该方法的检测限为 0.01μg/mL，弥补了《中国药典》三部（2010版）中规定方法的不足之处。
2反相高效色谱法在药物分析中的应用
反相高效色谱法是指流动相极性大于固定相极性的分配色谱法，适用于分离非极性至中等极性的各类分子型物质，应用范围也比正相色谱法更广泛。
陈德志等建立同时测定咪达唑仑、硝西泮、地西泮3种药物血药浓度的反相高效液相色谱法，色谱柱为 Symmetry shield RP18 柱（250mm×4.6mm，5.0μm），流动相为甲醇 - 磷酸盐缓冲液（55:45，v/v，pH2.15），咪达唑仑、硝西泮、地西泮质量浓度在 20-4000ng/mL范围内与峰面积呈良好线性关系（r≥0.9996，n=5），回收率98.2%～103.9%之间。
翁水旺等建立反相高效液相色谱法分离测定奥美拉唑肠溶胶囊的含量及有关物质的方法，采用 VARIAN C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，以甲醇 - 水 - 三乙胺 - 磷酸（67:33:0.3:0.12）为流动相，检测波长为302nm，测得奥美拉唑在浓度4.0μg/ml~40.0μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.99999，平均回收率为100.3%，RSD为 0.17%。
钟延霞等建立了反相高效液相色谱法测定吉非替尼的方法，采用Hypersil BDS C18-5μm（250mm×4.6mm）色谱柱，流动相为乙腈-0.15%三氟乙酸（体积比为2∶8），紫外检测波长254nm，吉非替尼的质量为6.824 0μg~34.1200μg时线性关系良好，线性系数为0.99908，加标回收率大于95%，检测底限为20.7248μg。
赵军等建立了反相高效液相色谱法同时分离测定6种临床最常用的头孢菌素(头孢他啶、头孢拉定、头孢氨苄、头孢哌酮、头孢唑林、头孢噻肟)，采用SHIM-PACK VP-ODS色谱柱，以乙腈及0.05mol/L HAC-NaAC缓冲溶液（pH=4.0）组成流动相梯度淋洗，在15min内分离并测定了上述 6 种头孢菌素，6种药物最低检出限均可达到 0.20μg/mL。
3 超高效液相色谱在药物分析中的应用
超高效液相色谱系指一种采用小颗粒填料色谱柱（粒径小于2 μm）和超高压系统（压力大于105 kPa）的新型液相色谱技术，能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，其较大的峰容量和更高的灵敏度更适于中药中多成分的分析。
唐军等建立了一种快速测定血栓通注射液中5种皂苷成分（三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd）含量的方法，应用新型的超高效液相色谱系统，使用1.7μm填料的BEH C18色谱柱（50mm×2.1mm），乙腈-水两相溶剂梯度洗脱，5种皂苷成分在测定的浓度范围内线性关系良好，r＞0.9984，RSD小于3.1%，最低定量限和最低检测限可分别达到0.5ng和0.2ng，平均回收率均大于95.0%。
4 高效液相色谱联用在药物分析中的应用
胡晓玲等建立超高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS）测定健康人血浆中阿托伐他汀浓度，阿托伐他汀浓度在0.385ng/mL~15.400ng/mL线性关系良好，相关系数达0.9974，日内、日间RSD符合方法学要求。
陈吉汉等建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS）测定鸡肉与鸡蛋中 6种他汀类药物残留量。色谱柱为BEH C18，以甲醇-0.1% 甲酸 5mmol 乙酸铵为流动相，梯度洗脱分离，6 种他汀类药物在 1.0～100μg/kg浓度范围内线性良好，r＞0.9910，检出限和定量限分别为 0.1～0.5μg/kg和0.3μg/kg~2.0μg/kg。
王映红等应用高效液相-核磁共振联用技术（LC-NMR）对微量级蛇葡萄根提取物中混合物的各个组分进行分离，并获得1H NMR及COSY谱，通过与此类化合物所建立的氢谱数据库进行比较分析，确定了微克级的天然产物混合物中的主要组分的化学结构及立体结构，使微量天然混合物中的主要组分的化学结构及立体结构得到证实，充分体现了LC-NMR技术的微量、快速的特点。
5 结论
高效液相色谱法选择性高、灵敏度高、分析速度快，并可同时用于有关物质检查与含量测定的特点，成为医药研究的有力工具，在天然药物及复方成药分析，抗生素分析，手性药物分析，临床治疗药物检测等领域均需用到HPLC的不同测定方法。
参考文献
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高效液相色谱范文第5篇
[关键词] 珍;含量测定;高效液相色谱
[中图分类号]R927.2[文献标识码]B [文章编号]1674-4721(2009)07(a)-134-02
珍由珍珠、牛黄、三七、黄芩提取物、冰片、猪胆汁等组成,具有清热解毒,消肿止痛的功效,主要用于咽喉肿痛,疮疡热疖[1]。为了更好地控制其质量,保证临床用药安全有效,本实验采用了HPLC法测定了制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[2-5],方法简便、准确、可靠。
1 仪器与试药
1.1 仪器
岛津LC-2010高效液相色谱仪,Intersil C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)。
1.2 试药
人参皂苷Rg1对照品(Ⅰ)(供含量测定用,批号:0703-9812)、人参皂苷Rb1对照品(Ⅱ)(供含量测定用,批号:110704-200217)、三七皂苷R1对照品(Ⅲ)(供含量测定用,批号:0745-200006)(中国药品生物制品检定所提供);珍(北京因科瑞斯生物制品研究所提供);乙腈为色谱纯,水为高纯水,其余试剂均为分析纯。
2 定量分析
2.1 色谱条件
Intersil C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱见表1,检测波长203 nm,流速1.5 ml/min,柱温30 ℃,进样量10 μl,理论板数按Ⅲ峰计算应不低于2 000。在该色谱条件下,样品中被测成分能够达到基线分离,保留时间在15 min内,阴性无干扰,色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ对照品适量,加甲醇制成每1 ml含Ⅰ0.55 mg、Ⅱ0.45 mg和Ⅲ0.20 mg的混合溶液,即得。
2.3 供试品溶液的制备
取本品细粉适量(约1.5 g),精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 ml,称定重量,加热回流提取2 h,放冷,用甲醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液25 ml,蒸干,残渣加1%氢氧化钠50 ml,分次溶解并移入分液漏斗中,用水饱和的正丁醇振摇提取5次(分别为30,30,20,20,20 ml),合并正丁醇液,用正丁醇饱和的水洗涤至中性,每次25 ml,正丁醇液另器贮存,合并水液,用水饱和的正丁醇30 ml振摇提取,醇液与上述正丁醇液合并,蒸干,残渣加乙醚5 ml洗涤,弃去乙醚液,残渣挥尽乙醚,加甲醇溶解,并移至10 ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
2.4 阴性样品溶液的制备
按珍处方,除去三七药材,制备阴性对照样品。按“供试品溶液的制备”项制备阴性样品溶液。
2.5 线性关系考察
分别精密称取Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ对照品适量,加甲醇溶解并稀释,制得浓度分别为1.144 mg/ml、0. 948 mg/ml和0.434 mg/ml的对照品溶液。分别精密吸取该溶液1、2、5、7、10 ml,置于10 ml的容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,各进样10 μl,连续进样2次,按上述色谱条件测定峰面积。以对照品进样量(X)为横坐标,色谱峰峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,回归方程见表2。
2.6 精密度试验
取同一批供试品溶液,在上述色谱条件下连续进样5次,各样品峰面积的RSD分别为:Ⅰ1.38%,Ⅱ1.11%,Ⅲ1.96%,表明精密度良好。
2.7 稳定性试验
取同一批供试品溶液,在上述色谱条件下,分别于0,2,4,8,12,24 h测定,各样品在24 h内峰面积的RSD分别为:Ⅰ0.69%,Ⅱ1.00%,Ⅲ1.88%,表明样品在24 h内基本稳定。
2.8 重复性试验
取同一批样品,按拟定的方法平行测定6份,平均含量为Ⅰ8.21 mg/g,Ⅱ7.21 mg/g,Ⅲ1.97 mg/g,RSD分别为:Ⅰ0.82%,Ⅱ1.82%,Ⅲ1.91%,表明该方法的重复性较好。
2.9 加样回收率试验
精密称取已知含量的样品6份,各加入一定量的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,在上述色谱条件下测定,计算回收率,平均回收率分别为Ⅰ96.46%,Ⅱ98.17%,Ⅲ96.27%,RSD分别为:Ⅰ1.01%Ⅱ1.02%,Ⅲ1.06%
2.10 样品测定
取五批样品(批号:20041019、20041122、20050303、20050601、20050605),分别按“供试品溶液的制备”项制备供试品溶液,准确吸取供试液10 μl,在上述色谱条件下测定,总含量(mg/g)分别为5.11、5.14、5.14、5.11、5.16。
3 讨论
3.1 流动相的选择
通过参考有关文献,测定三七中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的流动相多为乙腈-水梯度洗脱。经试验,采用文中流动相,对照品及供试品溶液中各色谱峰均能达到基线分离,效果良好。
3.2 检测波长的选择
取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1对照品,加甲醇分别制成20、30、50 μg/ml的溶液,用紫外可见分光光度仪分别进行200～400 nm波长的扫描,可见人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1均在203 nm处有最大吸收峰,故选择203 nm作为检测波长。
本文提出的 HPLC法能简便、灵敏、准确地测定珍的含量,能满足质量控制需要。
[参考文献]
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