化学发光法

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化学发光法范文第1篇

【摘要】 目的 确定以高锰酸钾亚硫酸钠体系测定氢化可的松的流动注射化学发光分析方法。方法 在酸性条件下，氢化可的松对高锰酸钾亚硫酸钠体系发光反应具有明显的增敏作用。据此，建立了流动注射化学发光测定氢化可的松的分析方法。结果 在优化的实验条件下，氢化可的松质量浓度在1.0×10-9-1.0×10-6g/mL范围内与发光强度呈良好的线性关系，检出限(3R)为4.0×10-10g/mL，对氢化可的松进行11次平行测定，其相对标准偏差为2.2%。结论 本方法应用于注射液中氢化可的松含量的测定，快速、准确、简便，灵敏度高、线性范围宽。

【关键词】 流动注射；化学发光；氢化可的松

Determination of hydrocortisone by flowinjection chemiluminescence

ABSTRACT: Objective To establish a new flowinjection chemiluminescence(CL) method for the determination of hydrocortisone. Methods In H2SO4 solution， hydrocortisone could obviously enhance the chemiluminescence intensity of the reaction of KMnO4Na2SO3 system. Based on this， a new flowinjection CL method for the determination of hydrocortisone was developed. Results There was a good linear relationship between CL intensity and the concentration of hydrocortisone in the range of 1.0×10-9-1.0×10-6g/mL. The detection limit was 4.0×10-10g/mL at a signaltonoise ratio of 3∶1. The RSD of 11 assays was 2.2%. Conclusion This method can be successfully used to determine the quantity of hydrocortisone in injection. It is rapid， accurate， simple， and has high sensitivity and wide linear range.

KEY WORDS: flow injection; chemiluminescence; hydrocortisone

氢化可的松(hydrocortisone， Hd)，又名可的索、皮质醇，是肾上腺分泌的糖皮质激素的一种，其药理作用主要有抗炎、抗过敏和免疫抑制、抗核分裂等。临床上主要用于肾上腺功能不全所引起的疾病、类风湿性关节炎、过敏性皮炎、角膜炎、神经性皮炎、结核性脑膜炎等。目前，测定氢化可的松的方法主要有高效液相色谱法[16]、分光光度法[712]、旋光法[1314]、光谱法[1516]。但这些方法存在灵敏度低和操作繁琐等不足。化学发光分析法由于灵敏度高、分析速度快、方法简便等特点，越来越受到人们的青睐[1719]。范顺利等[20]采用铁氰化钾奎宁发光体系测定氢化可的松，但其灵敏度较低，方法的线性范围和检出限分别为5.0×10-8-5.0×10-5g/mL和2.0×10-8g/mL。本试验发现，在酸性介质中，氢化可的松对高锰酸钾亚硫酸钠体系有明显的增敏作用。据此，建立了氢化可的松的流动注射化学发光新方法。

1 材料与方法

1.1 材料 IFFLDD 流动注射化学发光分析仪系西安瑞迈电子科技有限公司产品。氢化可的松对照品溶液：精密称取氢化可的松对照品(中国药品生物制品检验所提供)0.0100g，用少量乙醇溶解后，用蒸馏水定容于100mL容量瓶中，即得1.0×10-4g/mL储备液，低温避光保存，使用时逐级稀释至所需浓度。亚硫酸钠溶液(5.0×10-2mol/L)：准确称取亚硫酸钠1.5755g，用蒸馏水溶解并定容于250mL容量瓶中，得5.0×10-2mol/L溶液，新鲜配制。高锰酸钾溶液(1.0×10-2mol/L)：准确称取0.1580g KMnO4，用蒸馏水溶解并定容于100mL容量瓶中，得1.0×10-2mol/L储备液，使用时稀释。氢化可的松注射液为山西晋新双鹤药业有限责任公司产品，标示量：10mg/支。试验所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

1.2 方法 流动注射化学发光仪器流路图见图1。流路a、b、c分别用来输送Na2SO3溶液、样品溶液、酸性KMnO4溶液。试验中，样品溶液和KMnO4溶液在三叉管M中混合，再与流路a中的Na2SO3溶液混合，发生化学发光反应，所产生的化学发光信号立即被光电倍增管检测，计算机记录的数据利用IFFLDD型流动注射化学发光分析软件分析。按图1所示装置装好流路，开启蠕动泵，待基线稳定后进行测定，以相对发光强度ΔI进行定量。

图1 流动注射化学发光分析仪流路图（略）

Fig.1 Schematic diagram of the CL flow system for the determination of hydrocortisone

a: Na2SO3 solution; b: Sample solution; c: KMnO4H2SO4 solution; M: Manifold; V: Six way values; P1， P2: Peristaltic pump; F: Flow cell; PMT: Multiplier phototube; HV: High voltage; COM: Computer; W: Waste solution

2 结果与讨论

本实验用1.0 × 106 g/mL氢化可的松对照品溶液进行条件优化。

2.1 仪器参数的优化 流路的选择：考察了不同流路对化学发光强度的影响。由于b、c管路无区别，所以只考虑a管路的情况。当a管路分别为 Na2SO3溶液、酸性KMnO4溶液和样品溶液，b、c管路为其他二者时，2.0×10-4mol/L KMnO41.0×10-2mol/L Na2SO31.0×10-6g/mL Hd中的相对发光强度分别为255、42、2。因此，当采用如图1所示流路时，氢化可的松的相对化学发光强度最大，且信号稳定。故本文选择此流路进行分析。流路参数的选择：蠕动泵转速、采样管长和阀池距都会影响反应混合液进入检测器的时间，从而影响检测器对发光信号的检测。本试验选择流通管内径为0.8mm。结果表明，当蠕动泵主泵转速为30r/min，副泵转速为35r/min，采样管长为10cm，阀池距为10cm时，测定具有最大的信噪比。

2.2 实验条件的优化 反应介质及其浓度的选择：分别考察了以HCl、HNO3、HAc、H2SO4、H3PO4和NaOH为反应介质的发光强度。在这些介质中，2.0×10-4 mol/L KMnO41.0×10-2mol/L Na2SO31.0×10-6g/mL氢化可的松的相对发光强度分别为2、8、15、136、109和1。H2SO4介质中化学发光信号最大，且信号稳定。因此，该实验选择H2SO4为反应介质。试验观察到，当H2SO4存在于Na2SO3中时，其浓度对发光无影响。所以选择将H2SO4加入KMnO4中，对H2SO4在0.01-0.5mol/L浓度范围进行了考察。试验表明，化学发光信号随着H2SO4浓度的增加而增加，当H2SO4浓度超过0.1mol/L时，发光信号随H2SO4浓度变化很小。考虑到发光信号的稳定性及H2SO4对管路的腐蚀性，我们选择0.1mol/L的H2SO4为最佳浓度。氧化剂的选择：试验对高锰酸钾、高碘酸钾、高氯酸钾、重铬酸钾等氧化剂做了考察，观察到在KMnO4中化学发光信号最大，而在其他氧化剂中几乎无化学发光。因此，试验选择KMnO4作为氧化剂。考察了KMnO4在1.0×10-4-8.0×10-4mol/L浓度内对发光信号的影响。试验表明，随着KMnO4浓度的不断增加，相对化学发光强度也不断增大；当浓度增加到2.0×10-4 mol/L时，相对化学发光强度出现最大值；当浓度大于这一数值时，由于KMnO4本身颜色加深，产生内滤效应使化学发光强度降低。因而，实验中所选的KMnO4浓度为2.0×10-4mol/L。Na2SO3浓度的选择：考察了5.0×10-3-0.1mol/L范围内不同浓度Na2SO3对化学发光强度的影响。结果表明，随着Na2SO3浓度的不断增加，相对化学发光强度也不断增大，当Na2SO3浓度超过1.0×10-2mol/L时，相对发光强度随浓度的增大变化不大。因此，试验中选择1.0×10-2mol/L作为Na2SO3的最佳浓度。

2.3 标准曲线、精密度及检出限 在优化的最佳实验条件下按图1所示装置装好流路，对氢化可的松的对照品溶液进行逐级稀释并测定分析，以相对发光强度ΔI(即样品的化学发光强度减去空白的强度)对浓度做图。结果表明，在1.0×10-9g/mL-1.0×10-6g/mL范围内发光强度与药物浓度呈良好的线性关系。对浓度为1.0×10-6g/mL的氢化可的松进行11次平行测定，其相对标准偏差(relative standard deviation， RSD)为2.2%。计算得氢化可的松的检出限为4.0×10-10g/mL。为了提高检测的精密度，标准曲线分段绘制，其相关线性参数见表1。

表1 氢化可的松的标准曲线及其参数（略）

Table 1 Parameters for calibration curve and detection limit of hydrocortisone（略）

ΔI: relative CL intensity; C (concentration): ng/mL

2.4 干扰实验 在1.0×10-6g/mL的氢化可的松对照品溶液中，对实验中可能存在的辅料以及干扰物质进行分析。结果表明在相对误差为±5%条件下，1000倍的K+、Ca2+、Cl-、NO-3；200倍的Mg2+、Zn2+、CO2-3；100倍的抗坏血酸、EDTA；10倍的葡萄糖、乳糖、蔗糖不干扰测定。

2.5 样品分析 取氢化可的松注射液10支，精密量取相当于50mg的氢化可的松，用蒸馏水定容于50mL容量瓶中，配成1.0×10-3g/mL的待测溶液。精密吸取上述溶液适量，加水稀释至工作曲线线性范围内，按图1所示流路进行测定，并采用标准加入法进行回收率试验，测定结果见表2。同时与药典[21]方法做对比，测定结果见表3。

表2 氢化可的松的回收率试验（略）

Table 2 Determination results of recovery test

表3 氢化可的松注射液中氢化可的松含量的测定（略）

Table 3 Determination results of hydrocortisone in pharmaceutical injections

2.6 发光机理探讨 氢化可的松对KMnO4Na2SO3发光反应具有增敏作用，参考文献[22]和实验资料，我们认为该体系化学发光反应的实质是在酸性条件下氢化可的松首先受到高锰酸钾的氧化生成大量活泼的单线态氧1O2(1Δg)，1O2(1Δg)再迅速与Na2SO3反应生成S2O2-6，S2O2-6随后分解为SO*2，SO*2回到基态的SO2时产生强烈的化学发光。由此可以推断，高锰酸钾亚硫酸钠氢化可的松体系的发光体可能为激发态的二氧化硫，整个机理可以表示为：MnO-4+Hd+H+ 1O2(1Δg)+Mn(Ⅱ-Ⅳ)+产物1O2(1Δg) + Na2SO3 S2O2-6S2O2-6 SO2-4+ SO*2SO*2 SO2+ hν

转贴于 【参考文献】

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化学发光法范文第2篇

【关键词】 化学发光； 流动注射分析； 氨苄西林钠

ABSTRACT Objective To establish a chemiluminescence (CL) method for the determination of ampicillin sodium. Method It was found that the light emission produced by the oxidation of luminol by postassium periodate in the basic medium was enhanced by ampicillin sodium. A new， simple and rapid method has been developed for the determination of ampicillin sodium. Results In the optimum conditions， CL intensities are proportional to the concentrations of ampicillin sodium in the 0.01～10μg/ml range. The limit of detection is 3.0ng/ml and the relative standard deviation (RSD) is 1.4 % for 1.0μg/ml (n=11). Conclusion The method has been applied to the determination of ampicillin sodium in the commercial preparations， injection， and chemical product with satisfactory results.

KEY WORDS Chemiluminescence; Flow-injection analysis; Ampicillin sodium

氨苄西林钠具有广谱抗菌作用，可用于治疗肺炎、支气管炎、肠胃炎、白痢、霍乱、伤寒及皮肤感染等。目前中国药典采用高效液相色谱法［1］测定氨苄西林含量，此外氨苄西林钠的含量测定还有紫外吸收分光光度法［2，3］、荧光法［4，5］等。本文报道一种化学发光法测定氨苄西林钠含量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

IFFLD-型流动注射化学发光仪(西安瑞迈电子设备有限公司)。U-4100紫外-可见-近红外分光光度计(日立，日本)；F-4500荧光分光光度计(日立，日本)。

氨苄西林钠标准溶液(500μg/ml)：准确称取50mg氨苄西林钠标准品(中国药品生物制品检定所)，溶解于100ml的容量瓶中，用二次蒸馏水稀释至刻度配成储备液，需要时用二次蒸馏水稀释至所需浓度；高碘酸钾(1.0×10-2mol/L)：准确称取0.5750g用二次蒸馏水配成储备液；鲁米诺：用0.01mol/L的氢氧化钠溶液配成0.01mol/L储备液，需要时稀释至所需刻度；其余试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

按图1所示，将高碘酸钾溶液和鲁米诺溶液在d点汇合后再与注入载流中的氨苄西林钠在e点汇合，

a：二次蒸馏水；b：4.0×10-5mol/L高碘酸钾；

c：4.0×10-5mol/L鲁米诺；S：样品；P1、P2：蠕动泵；

V：注射阀；F：流通池；W：废液；D：光电倍增管；

PC：个人电脑；d、e：d和e汇合点

图1

测定氨苄西林钠的流动注射装置示意图

氨苄西林钠对化学发光产生强烈的增强作用，实验参数由IFFM-D型流动注射分析仪设定。

标准曲线的绘制：准确移取一定体积的氨苄西林钠标准储备液(500μg/ml)于一系列25ml具塞比色管中，配制成浓度为0.01～10μg/ml系列溶液。按照图1装置装好流路，开启蠕动泵，待基线稳定后进样进行测定，以峰高定量。

2 结果与讨论

2.1 反应动力学

实验表明，该体系的化学发光强度在注射2s内达到最大值，5s后体系发光强度减弱至基线，可见该体系是一个快速化学发光反应。

2.2 参数的选择

实验证实，溶液采用图1所示的进样方式，流动注射仪两个泵的速度均为3.6ml/min(单管)，聚乙烯的内径为0.8mm，进样体积160μl，混合管与三通管之间的管长为8cm，负高压为-650V；增益为×2时，体系具有最大的信噪比。

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2.3 条件的选择

(1)氢氧化钠浓度的影响 氢氧化钠的浓度对高碘酸钾氧化鲁米诺化学发光有明显影响，考查1.0×10-3～8.0×10-2mol/L范围内氢氧化钠溶液与化学发光强度的关系。试验显示，氢氧化钠浓度增大，发光强度也随之增大，但基线也随之升高，故以信噪比(S/N)作为氢氧化钠浓度对化学发光影响的衡量标准。当氢氧化钠的浓度为5.0×10-3mol/L时信噪比最大，故选择该浓度为最佳浓度。

(2)高碘酸钾浓度的影响 高碘酸钾的浓度直接影响化学发光强度。试验显示，随着高碘酸钾浓度增大，化学发光强度和基线也随着升高。当浓度增加到4.0×10-5mol/L时信噪比达最大值，故选择该浓度作为高碘酸钾的最佳浓度。

(3)鲁米诺浓度的影响 在1～120μmol/L的浓度范围内考查鲁米诺浓度对化学发光强度的影响。试验表明，鲁米诺浓度在4.0×10-5mol/L时信噪比最大，故选择该浓度为鲁米诺的最佳浓度。

2.4 体系的分析特性

在选定的试验条件下，测定氨苄西林钠的线性范围为0.01～10μg/ml，回归方程为ΔI=55.652c+5780.42(r=0.9994，n=11)，c的单位为μg/ml，对1.0μg/ml氨苄西林钠进行11次平行测定，其相对标准偏差为1.4%，检出限(3σ)为3.0ng/ml。

2.5 干扰试验

试验了共存物质对测定氨苄西林钠的影响，当氨苄西林钠浓度为1.0μg/ml，干扰水平为±5%时，800倍的淀粉、葡萄糖、CaCl2、NH4Cl、(NH4)2C2O4；600倍的K+、Na+、NO-3、NH+4、尿素、糊精、C2O2-4、Br-、麦芽糖；400倍的Mg2+、EDTA；200倍的CuSO4、FeCl3均不干扰测定。

3 样品分析

精确称取适量的氨苄西林钠粉针剂，用二次蒸馏水溶解至测定线性范围内后按照标准曲线的方法进行测定，结果见表1。

4 机制探讨

试验发现该发光是一个快速发光，从试剂混合到发光达到最大值只需要2s，5s以后降到基线。分别测定鲁米诺-高碘酸钾、氨苄西林钠-高碘酸钾以及鲁米诺-高碘酸钾-氨苄西林钠混合溶液的荧光光谱。结果表明，仅在425nm波长处有一个荧光峰，这是氨基邻苯二甲酸的荧光峰［6］。分别测定鲁米诺、氨苄西林钠以及两者的混合溶液的紫外吸收光谱却没有发现有新的光谱产生，这说明鲁米诺和氨苄西林钠之间没有相互作用而产生新的物质。通过以上实验证明，该体系的化学发光是由氨基邻苯二甲酸离子(鲁米诺的氧化产物)产生的，而不是氨苄西林钠。

分别测定鲁米诺-高碘酸钾和鲁米诺-高碘酸钾-表1

氨苄西林钠粉针剂的测定结果氨苄西林钠的化学发光光谱。结果表明，仅在425nm处有一个发光峰出现(与氨基邻苯二甲酸的最大发光波长相一致)，因此，可以推断出，氨苄西林钠只是增强该体系的化学发光。其反应历程可归纳如下：

(1)氨苄西林钠+溶解氧+氢氧化钠羟(基)氢氧基(和/或过氧化物酸根)+其它反应产物；

(2)鲁米诺+羟(基)氢氧基(和/或过氧化物酸根)+高碘酸钾3-氨基邻苯二甲酸离子*；

(3)3-氨基邻苯二甲酸离子*3-氨基邻苯二甲酸离子+hν(425nm)。

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化学发光法范文第3篇

关键词：化学发光法 丙肝抗体 丙肝病毒核糖核酸定量

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一种常见传染病。据统计，丙肝感染率约为3%，每年约有3.5万人感染[1]。HCV在肝细胞中的定植和复制会逐渐破坏肝脏结构，损害肝脏功能。丙型肝炎主要分为病毒性肝炎、急性病毒性肝炎和慢性病毒性肝炎以及肝硬化。急性病毒性肝炎患者多有无力、恶心、疲软、尿黄等症状；慢性病毒性肝炎主要表现为疲劳和食欲不振，HCV-RNA持续表达为阳性[2]。在过去20～30年，感染丙肝病毒的人群中，有10%～20%的人发展为肝硬化[3]。丙肝具有高度传染性，目前还没有疫苗接种或特殊治疗方法。早期诊断和干预是防止疾病恶化的重要手段。化学发光法具有较高的敏感性和特异性，窗口期短，应用广泛[4]。化学发光法分析利用免疫反应和化学发光的结合来检测大量的物质，具有很高的灵敏度[5]。本研究选取在我院拟行有创检查前，进行感染性疾病初筛的8 773名患者进行化学发光法的丙肝抗体初筛，对其中阳性患者同时进行HCV-RNA的检测，通过整理数据，研究两种方法在丙型肝炎初筛和诊疗中的作用。现报告如下。

资料与方法选取2019年6月-2020年5月拟行有创检查前进行感染性疾病筛查的患者8773例，男5 968例，女6 808例；年龄4～94岁，平均(48.73±4.58)岁。展开临床研究，应用化学发光法初筛丙肝抗体，血清标本均符合规定检测标准，排除其余患病可能。

方法：按照操作规范从患者肘部采静脉血3 mL，置于一次性分离胶采血管内，以3 000 r/min的速度离心10 min，分离血清待检。化学发光法检测丙肝抗体：应用日本希森美康全自动化学发光仪及配套封闭试剂进行检测。根据说明书，发光强度值1.0为临界值，>1.0为丙肝抗体阳性，<1.0为丙肝抗体阴性。丙肝病毒复制量：应用罗氏Z 480荧光PCR检测仪，试剂厂家为上海之江生物，进行HCV-RNA的检测，复制量>103为阳性有传染性，<103表示未检出病毒，为阴性。

统计学处理：数据应用采用EXCEL和spss 22.0软件处理，计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验；P<0.05为差异有统计学意义。

表1 丙肝抗体阳性患者进行HCVRNA的检测结果分析(n)

结果化学发光法检测结果：对8 773例患者进行丙肝抗体检测，化学发光法检出丙肝抗体阳性126例，阳性检出率为1.4%；其中发光强度数值1～5的41例，发光强度数值>5的85例。

荧光PCR检测结果：对126丙肝抗体阳性标本进行荧光PCR的检测，大于103为阳性，有传染性。丙肝抗体阳性标本中，发光强度低值者(数值<5),HCV-RNA阳性的只有2例(4.9%)，发光强度高值者中(数值>5),HCV-RNA阳性有21例(24.75%)。见表1。

讨论丙型肝炎具有较高的可变性和显著的异质性，不同菌株的核苷酸和氨基酸序列存在显著差异[6]。丙型肝炎的发病主要是由HCV感染人体所造成。大多数早期丙型肝炎患者没有明显的临床症状，可能发展为慢性丙型肝炎。不了解自己疾病的患者会延迟疾病的治疗，并可能传播给他人。因此，对丙肝的早期诊断有助于控制疾病并防止疾病的传播[7]。目前血清学检测和分子生物学检测是丙肝病毒感染的主要检测手段，很多医院还在沿用ELISA方法检测。然而，由于HCV基因序列的高变异性，灰色区域结果的可靠性较差，ELISA试剂是筛选试剂，可能产生假阳性和假阴性[8-9]。人们发现，化学发光法测定原理与ELISA相似，检测灵敏度高，操作简便，标记物多，保质期长，无放射性污染[10]。化学发光免疫测定以发光剂为酶的标志物，其纯度、质量、活性和亲和力决定了免疫酶试验的成功[11-12]。同时丙肝有很多隐性感染的情况，患者HCV感染后有10%～40%会自发清除。由于部分经过治疗或者患者自愈后病毒复制减慢或停止，血清中的拷贝数低于最低检出值，而丙肝抗体在体内存在时间长，故可出现丙肝抗体阳性而HCV-RNA阴性情况。尤其在抗体检测的数值较低的阳性值范围内。另外，对于丙肝抗体的确证试验NAT、RIBA，开展的医院很少，如果只是为了确认有没有丙肝抗体会过于费时费力。因为对于一般为了进行有创检查的筛查患者，没有输血史、手术史或者丙肝患者密切接触史，并非丙肝的针对性检查，其抗体浓度的高低，尤其是HCV-RNA阴性患者，对其丙肝抗体数值具体多少，是否需要进行丙肝抗体的确证试验(NAT、RIBA)就显得有些得不偿失了。我们结合HCV-RNA的复制量来判断其是否现正丙肝感染，是否有传染性，是否需要治疗会更有价值。《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》中明确指出HCV核酸阳性是丙肝的确诊依据，丙肝确诊病例应进行抗病毒治疗。HCV-RNA是HCV核心部分，是HCV复制有传染性的直接证据。此次研究中心，我院和大部分综合医院一样，丙肝筛查主要应用于在有创检查前进行感染性疾病筛查患者，并非可疑丙肝感染者，单纯纠结丙肝抗体是否真阳性反而容易忽视患者是否现症感染而耽误其他疾病的诊疗。从实验数据我们也可以看出，在发光强度低值的41例丙肝抗体阳性中，只有2例HCV-RNA阳性，高值的85例中HCV-RNA阳性也仅仅有21例。另外，我们在临床上经常会遇到患者在一家医院检测丙肝抗体弱阳性、HCV-RNA阴性，又来其他医院用其他厂家或者型号机器复检丙肝抗体进行比较的情况。在医学检验领域，由于目前检测手段的局限性，丙肝抗体弱阳性标本在不同仪器中比较，一致性并不是特别理想。究竟是假阳性，还是不同原理的仪器检测窗口期不同，均存在一定争议。所以建议临床医生对于丙肝抗体阳性，尤其是数值较低的弱阳性，在进行下一步诊疗前参考HCV-RNA的情况，不宜对丙肝抗体滴度进行过度关注或重复检测等造成不必要的人力、物力的浪费。

参考文献

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化学发光法范文第4篇

【关键词】 TPPA;TRUST;电化学发光法;梅毒

梅毒(syphilis)是由苍白(梅毒) 螺旋体引起的慢性、系统性性传播疾病。临床上可有硬下疳、皮疹、发热等症状,严重者可侵犯皮肤、黏膜、骨骼、内赃、心血管、神经系统,危及生命。梅毒绝大多数是通过性途径传播,根据临床表现可分为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒和潜伏梅毒[1]。

目前诊断梅毒主要依靠血清学检验。现在实验室诊断中,有多种梅毒检测方法[2]。本研究回顾性分析梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验(TPPA)、甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)和梅毒螺旋体电化学发光法测定三种血清学检测方法,对不同梅毒患者的血清进行测定,并分析各检测方法的优缺点,为临床选择最佳的梅毒检测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2009年1月至2010年1月我院皮肤科确诊梅毒患者136例,其中男74例,女62例;年龄23~65岁,平均35岁;梅毒患者中一期梅毒65例,二期梅毒53例,三期18例。正常对照组为同期我院正常健康体检者50例。

1.2 试剂与仪器 TPPA试剂购自日本富士公司,TRUST试剂购自上海荣盛生物技术有限公司,梅毒电化学发光试剂购自罗氏公司,检测仪器为罗氏i2000电化学发光分析仪。

1.3 检测方法 TPPA检测采用凝集法,阳性结果做特异性抗体滴度检测;TRUST检测采用凝集法,阳性结果做非特异性抗体滴度检测;电化学发光法检测由仪器完成。所有操作均严格按照说明书要求进行。

1.4 统计学分析 统计学据分析采用SPSS 13.0 软件进行分析,TPPA、TRUST和电化学发光法检测梅毒螺旋体抗体定性检测采用阳性率表示,检测结果比较采用 χ2检验,以P

2 结果

2.1 各检测方法检测梅毒结果见表1。

结果显示TPPA、TRUST和电化学发光法对梅毒特异性抗体定性测定结果差别无统计学意义(χ2=0.386,P=0.984>0.05)。

2.2 TRUST滴度与TPPA滴度相关性分析见表2。

表中可见,TRUST为1:4的梅毒患者TPPA滴度主要在1:80和1:160,占92.9%;而TRUST为1:8的时TPPA多为1:160和1:320,占75.7%。经统计学分析,TRUST和TPPA为显著相关(r=0.81,P

3 讨论

梅毒为乙类传染病,由于其由于病程漫长,在晚期还能给患者的组织器宫造成不可逆的损伤,因此早期诊断和治疗显得极为重要。梅毒特异性抗体是诊断梅毒的重要依据之一。目前,TPPA作为梅毒的确诊实验,其诊断准确度较高。但TPPA实验操作步骤较为繁琐,费时费力难以形成批量操作[3]。TRUST作为筛查梅毒的血清学实验方法,具有操作简便易推广等优点,但由于其检测采用正常牛心肌的心类脂作为抗原,不具有特异性,所以除梅毒患者外,一些非梅毒疾患也可暂时或长期地存在反应素,如麻风、结核、传染性单核细胞增多症、红斑狼疮、类风湿性关节炎、雅司、回归热以及一些发热性疾病。此外,在孕妇、老年人和吸毒者有生物学假阳性反应。电化学发光法采用独特金属鳌合物做标记物,具有高度稳定性;分子量小与免疫物质结合稳定;能轻易地与蛋白、抗原、核酸结合试剂的液体稳定性能好[4]。

本研究表明,在不同阶段梅毒患者检测结果中,电化学发光法的检测阳性率最高,其对一、二、三期梅毒患者检测阳性率均达到100%,而TPPA法检测一期梅毒患者阳性率略低于二、二期梅毒患者阳性率;相比之下,TRUST试验阳性率较TPPA和电化学发光法均低。虽然三种检测方法检测结果无统计学意义,但在趋势上,电化学发光法检测阳性率要高于TPPA法和TRUST法。

TRUST和TPPA为临床上最为常用的两种梅毒螺旋体实验室诊断方法。本研究发现,TRUST和TPPA具有良好的相关性。TPPA作为梅毒的确诊实验,与初筛实验TRUST有着较好的相关性。

参考文献

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化学发光法范文第5篇

关键词：丙型肝炎；化学发光法；荧光定量PCR；抗-HCV-IgG；HCV-RNA

Abstract：Objective To investigate the value of hepatitis C diagnosis using Chemoluminescence immunoassay（CLIA）in the detection of anti-HCV-IgG and Real-time fluorescent quantitative PCR（FQ-PCR）in the detection of HCV-RNA.Methods In 106 suspicious clinical serum samples，the anti-HCV-IgG index was detected by CLIA and the HCV-RNA was detected by FQ-PCR.Results The positive rates of HCV-RNA and anti-HCV-IgG were 27.4%（29/106）and 25.5%（27/106）respectively.There were no significant statistical difference between the two methods（P>0.05）and the coincidental rate was 82.8%（24/29）.The positive detection rates of anti-HCV-IgG increased with the elevation of HCV-RNA load.Conclusion CLIA was used to detect anti-HCV-IgG and FQ-PCR in the diagnosis of hepatitis C is not significantly different，but both has some limitations，combined with the can effectively reduce the risk of failure detection used alone，to improve the detection rate，to provide reliable basis for clinical diagnosis of HCV infection.

Key words：HCV；CLIA；Real-time FQ-PCR；anti-HCV-IgG；HCV-RNA

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的传染病，HCV的感染呈世界性分布，已成为严重的世界公共卫生问题，中国属HCV的高发区，平均感染率为3.2%[1-2]。由于目前尚无有效的预防和治疗方法，HCV感染者中有绝大部分（超过80%）发展成慢性感染，其中10%～15%发展为肝纤维化，最终每年有1%～4%成为肝癌[3-4]。因此，及时、准确地对丙型肝炎进行早期诊断、早期治疗显得尤为重要。本文对化学发光法检测抗-HCV-IgG与荧光定量PCR检测HCV-RNA在丙型肝炎诊断中的临床应用进行分析。

1资料与方法

1.1一般资料 收集我院2014年2月～2015年11月106例门诊及住院部HCV感染待查者的血清为研究标本，年龄17～80岁，其中门诊患者88例，住院患者18例，所有病例均排除甲、乙、丁、戊、庚型病毒性肝炎及可能引起肝功能异常的疾病。

1.2标本处理 采用真空采血管抽取被检者清晨空腹静脉血3 ml，室温（22℃～25℃）放置30～60 min后，1500 r/min离心5min，用微量移液器（配无菌带滤芯吸嘴）缓慢吸取上层血清，转移至1.5 ml的无DNA酶、RNA酶的灭菌离心管，编号后用于HCV-RNA检测，其余血清用于抗-HCV-IgG检测。所采集的标本可立即用于测试或保存于-20℃冰箱待测（冻存血清在使用前先室温融化，振荡混匀）。

1.3方法 抗-HCV-IgG抗体的检测采用化学发光法，试剂盒及仪器（Centaur XP全自动化学发光免疫分析仪）由西门子医学诊断产品（上海）有限公司提供；HCV-RNA的检测采用荧光定量PCR技术，试剂盒及仪器（DA-7600）为中山大学达安基因股份有限公司产品，试剂盒的最低检出量为250 IU/ml，线性范围为1.0×103 IU/ml～1.0×107 IU/ml。严格参照试剂盒说明书进行操作。

1.4统计学方法 采用SPSS 13.0进行统计学处理，计数资料采用χ2检验，以P

2结果

2.1抗-HCV-IgG抗体检测结果与HCV-RNA检测结果比较

106例研究对象中，荧光定量PCR检测HCV-RNA判定为阳性结果的共有29例，阳性率为27.4%；CLIA法检测抗-HCV-IgG抗体判定为阳性结果的共有27例，阳性率为25.5%；29例HCV-RNA性标本中抗-HCV-IgG抗体同时阳性的有24例，符合率为82.8%（见表1），另有3例抗-HCV-IgG（+）且HCV-RNA（-）和5例HCV-RNA（+）且抗-HCV-IgG（-），经χ2检验分析，两种方法检测结果的阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 HCV-RNA病毒载量不同区间与抗-HCV-IgG结果比较

见表2，将HCV-RNA病毒载量分为5个区间（1.0×103～1.0×104 IU/ml、1.0×104～1.0×105 IU/ml、1.0×105～1.0×106 IU/ml、1.0×106～1.0×107 IU/ml、≥1.0×107 IU/ml）。随着HCV-RNA病毒载量增加，抗-HCV-IgG阳性抗体检出率也随之增高，依次为57.1%（4/7），77.8%（7/9），100%（5/5），100%（6/6），100%（2/2），病毒载量相邻区间的抗-HCV-IgG抗体阳性检出率差异无统计学意义（P>0.05）。

3讨论

HCV主要经血液、输血传染，感染后大多数患者症状较轻，有的甚至无症状，但病情呈进行性进展，易发展成肝硬化、肝癌。因此，及时、准确地对丙型肝炎患者进行早期诊断和治疗显得尤为重要。目前，临床上常以抗-HCV抗体和HCV-RNA作为判断患者是否为HCV感染的主要病原学指标。本文研究显示：29例HCV-RNA阳性标本中抗-HCV-IgG抗体同时阳性的有24例，符合率为82.8%，77例HCV-RNA阴性标本中抗-HCV-IgG抗体同时阴性的有74例，符合率为96.1%，提示CLIA法检测抗-HCV-IgG抗体与荧光定量PCR检测HCV-RNA在丙型肝炎诊断中无显著差异。抗-HCV-IgG抗体阳性检出率随HCV-RNA载量增高而升高，且当HCV-RNA载量超过≥1.0×105 IU/ml时，抗-HCV-IgG抗体阳性率检出率达100%，与黄秀琼[5]等报道一致，提示抗-HCV-IgG抗体检测在HCV-RNA浓度较高的标本更易检出。

本文研究结果中，有3例抗-HCV-IgG（+）且HCV-RNA（-）患者。此种类型检测结果提示：患者可能曾经受过HCV病毒的感染，体内的HCV病毒已被清除，处于恢复期，则HCV-RNA检测结果为阴性，而抗-HCV-IgG抗体却在体内持续存在；或者患者处于肝脏疾病晚期，其体内HCV-RNA水平很低甚至无法测出，病毒水平降低可能是由于肝细胞的消耗和广泛的纤维化所致，而非病毒自身的改变[6]；也可能是由于实验操作误差所导致，如血液标本采集后没有及时分离血清或血浆，血液中存在高浓度的蛋白酶和RNA酶，可致待测标本中的RNA降解，造成RNA的丢失，继而HCV-RNA检测出现假阴性结果[7]。故抗-HCV-IgG（+）且HCV-RNA（-）的检测结果仅供参考，建议随访。另有5例HCV-RNA（+）且抗-HCV-IgG（-）患者，该检测结果可能是：由于患者的免疫功能低下或是病毒复制不活跃，未能产生足够检出量的抗体；或患者正处于HCV感染的"窗口期"，人体感染HCV后，其血清一般约在6～12 w后才产生抗-HCV抗体[8]。故单一的抗-HCV-IgG为阴性结果时，并不意味可以排除HCV感染，可能是出现了假阴性结果，而造成漏诊。

CLIA法因其灵敏度高、操作简单、重复性好，且试剂价格低廉、稳定、无放射性污染等优点，已经成为国内、外各大型医院作为抗-HCV常规筛选试验[9]，但由于HCV感染后到抗-HCV阳转前的"窗口期"较长，早期感染者用此法检测易漏诊。HCV-RNA出现较抗-HCV-IgG早，在HCV感染后第1～2 w即可从血液中用荧光定量PCRz测到，具有早期、敏感、特异性强等特点，并且能够检测出患者体内的病毒复制水平，以便确定是否需要进行抗病毒治疗或预测、评价疗效，但慢性丙型肝炎和肝脏疾病晚期患者血清中的HCV-RNA水平很低，且该方法对实验室条件及仪器设备等要求较高，自然界广泛存在的RNA酶，可使RNA降解，导致HCV-RNA检测出现假阴性。综上所述，两者均存在一定的局限性，单独使用上述任意一种检测方法都有漏诊的风险。因此，在临床检测HCV感染时，将两种检测技术联合运用以相互补充，有助于提高检出率，为临床诊断HCV感染提供可靠性依据。

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