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大森林里,大象的力气最大,这不仅是大象自己认为的,而且还是动物们的共识。但是,蚂蚁乐乐不服气了。乐乐到大象那里,对大象说:"听说大象的力气最大,但我不这么认为。我们蚂蚁可以举起比大象举起的更重的东西。“大象一听,十分不高兴,说:”怎么可能呢?蚂蚁那么小,怎么可能举起比大象举起的更重的东西呢?那么让我看看你们是不是真的有那么大的力量吧。“
大象和乐乐来到了象王的王宫。象王走出王宫,听说大象和蚂蚁要比力气,顿时有了兴趣。象王决定举行一场比赛,大象和蚂蚁分别举起象王看谁能举起谁的力气就更大。大象先开始,大象刚开始还非常自信,认为自己能举起象王,可是费了半天劲,象王纹丝不动,没有举起象王。
该蚂蚁举起了。蚂蚁乐乐吹了一个口哨,一下子来了一大群蚂蚁,蚂蚁们排好队,井然有序。蚂蚁们轻而易举地就举起了象王。大象十分吃惊。象王哈哈大笑,宣布蚂蚁的力气更大。象王说:”不要小看小小的蚂蚁,当一群蚂蚁团结一致的时候,就能达到意想不到的奇迹。“
“大众创业、万众创新”,这是时代的主题,几乎所有的创业都是从小微企业起步的。那么,如何让小微企业变得强大?让他们在阳光雨露中茁壮成长?这是企业成长过程中需要破解的难题。
不久以前,创始人空间孵化器首席执行官史蒂文・霍夫曼讲述了美国硅谷的小微初创企业的成立路径,以及他们快速发展的原因。
创业链条可能是失败-尝试-再失败-再尝试
史蒂文・霍夫曼以Founders Space为例,这是一家在美国旧金山和硅谷非常知名的孵化器、加速器。这里有超过300多位导师、顾问和教练分布在全球各地。Founders Space非常关注对小微初创公司的创业教育和培养。
“每一个人、每一个年轻人都可以成为非常成功的创业者,他们成功的原因不是因为他们有创业的空间,他们需要的是成熟的创业家的经验和智慧。”
在过去的五年当中,Founders Space培育和孵化加速了成千上万个创业者,他们大多数都获得了成功。它不仅在美国的硅谷有机构,而且在亚洲、欧洲乃至全球各地都非常知名。《福布斯》杂志把Founders Space评为孵化器第一名。它不仅跟世界各地孵化器有合作,而且与当地政府、高校和企业都有深切的合作关系。它在韩国和日本挑选当地最有含金量的初创公司,把他们带到美国硅谷。
现在,Founders Space看中了孵化排名第一的中国。史蒂文・霍夫曼强调,在全世界,只有两个地方可以诞生超过十亿美金的“独角兽”的地方,一个是美国,一个就是中国。
Founders Space与北京大学创新中心合作,在北京中关村落地,这是它在中国成立的第一家孵化器。Founders Space希望把这个模式在全国拓展开来。“我们会把在美国硅谷旧金山成功的模式搬到中国来,目的不仅是孵化初创公司,还要给年轻人成功的经验和培育课程。”
创业者的成功不仅要有经验,人际关系同样重要。我在硅谷有多年的网络关系,同样与北大有非常好的合作关系,双方强强联合。我们的发展目标是把来自全球最前沿的科技,比如以色列、德国、美国硅谷的技术,带到中国,让创业者可以快速地发展和壮大。
“我有四次创业经历,有三次是由硅谷的孵化基金帮助孵化的。其中几次是取得了非常大的成功,但是也有几次满是挫折,非常艰难。很多创业者问我在成立初创公司的时候,自己应该先做什么?我说他需要有与死神吃饭的勇气,也就是说要有承担失败的承受力。创业是一项充满了风险和不确定性的一项工作,创业者永远不知道他的下一步是顺利还是挫折。但是他必须不断地去往前走,硬着头皮往前走。创业者不能感觉害怕,必须一直保持不断地往前走。”史蒂文・霍夫曼强调。
如果创业是一项很容易的事情,所有人都可能成为亿万富翁。很多人不会选择创业这条路,因为这个太辛苦了。但是这不是问题,大不了从头来过。失败是非常重要的,而且是必须的,如果创业者想成功,首先要尝到失败的滋味。一般而言,创业者获得成功之前可能已经失败了上百次,这是非常重要的。
为什么要在创业的时候讲失败?因为很多人创业只是踩在失败人的肩膀上继续去革命性地去探索新的产品,完善它,取得新的成功。抄袭、复制非常容易,这也是很多人正在做的事情。
在硅谷,创新不是直接地照搬、拷贝、复制,而是不断地去失败、尝试,再失败,再尝试,经过多次这样的经历后,创业者才能知道什么才是成功的。“如果一个人真的想成为一个成功的创业者,他首先要告诉自己不要害怕失败。如果他是一个胆小害怕失败的人,就永远不会成为一个成功的创业者。”
天生的天才也要有一群庞大的执行者
创业者要在开始创业前,制定自己的计划。“在硅谷,我们做的计划从来不会做超过五年以上的计划。这个世界变化非常快,你可能永远不知道一年甚至两年之后世界会变成什么样。所以,我们从来不做长期规划,只做短期规划,例如三个月的计划。但是,制定三个月的计划过程中,创业者可能会做几次更改,正是因为创业者的工作不断地尝试和失败,他计划才会不断地更新。如果创业者从年初做一个计划,到年尾从来没有变过,这不是一个好的计划。如果一个人做一年的计划,中间丝毫没有改变过,要么是创业者特别幸运,要么创业者是一个墨守成规,不会创新的人。”
如果创业者想成为一个成功的创业者,首先就要做他自己。创业者不能做他的能力达不到的事情,每个人擅长的地方不一样,有的人擅长做销售,有的人擅长做计划,有的人擅长出创意,就让擅长的人做他擅长的事情。没有一个人可以做所有的事情,一定要找到自己最擅长的点,创业者要知晓自己的优势所在,然后去发挥它,然后组建一个团队,让那些人做自己擅长的事情。
如果创业者是一个做策略、做计划性的人的话,他可以找一些细节性强、有执行性的工作。“我看到很多企业家的失败,是因为他们非常努力地在做一些他们根本不擅长的事情。如果他真的不擅长的话,就应该放弃,让真正擅长的人帮创业者一起完成,反而是最节约时间和节约成本的做法。”
史蒂文・霍夫曼说,“我每年会见成百上千的企业家,我发现他们总是在做一些不擅长的事情,这点也是他们失败很重要的一点,有很多企业家总是说服自己去做他们根本不擅长的事情。他们应该让真正擅长的人来做适合这些方面的工作。”
创业者要建立自己的团队,哪怕他是一个天生的天才,一个人也不可能完成十亿美金以上的工作。十亿以上规模的工作量是由来自不同领域的优秀的人才团队一起来完成的。马云非常优秀,他是个天才,但是他现在的成就不是壮大自己就能够完成的,他背后有一个非常优秀的团队。这也适用于Facebook的扎克伯格,创新团队就需要有创意的新人来帮创业者一起完成工作。
“创业者需要有三位不同杰出的人士。其中一个人非常懂得商业运作,懂得销售,懂得公司管理。创业者还需要有一类技术型人才,他可能有点儿像书呆子,不擅长跟人打交道,但他在技术上非常棒。第三位是个疯狂的人,他每天有很多新鲜的想法,刚开始很多人不理解他,但是创业者需要一类每天有新奇创新想法的人。如果创业者想他的企业成功,这三位不同的杰出人士都需要在他的团队里,他们三个是三种完全不同的人,把他们组合在一起,将会迸发出神奇的力量。也许这个团队可以从三人变成两人,也可以从三人扩展成五人,但是不要刚开始人数一定不要太多,尤其是公司核心团队成员,要小而精。”
如果公司里有庞大的系统和执行体系,创业者可以仔细观察自己体系当中有哪些可以改善的地方,哪些地方可以做得更好,这就是公司自己的创新。在承诺之前先做大,当你想成为一个创业者你就要“快”。当今社会,没有任何一个商业模式可以在很长时间内被大家认可,这个世界每天都在发生日新月异的变化。当创业者产生一个绝好的想法时,就要以最快的速度去发展它,而不要延迟半步。如果创业者发现一个很好的机会,可能需要一百人来完成,但此时他只有五到十人的团队时,也不要迟疑,先抓住机会再说,人数的问题事后再商量。
颠覆与叛逆合作与分享
当创业的浪潮席卷而来,创业者建立初创公司之时,他需要强大的力量来支撑自己。创业很像是在冲浪,创业者每次冲浪的时候都会有风浪席卷而来,他需要做的就是逆着风浪继续前行。如果他想成为独角兽公司,就需要踩上最大的浪,因为最大的浪才能把他送到最远的地方。这个风浪可能瞬间就被淹没了,局势随时都会变化,创业者要抓住机会。现在,社会呈现的一个大的浪潮是物联网、大数据、人工智能、大健康和金融科技。不仅是美国硅谷,全球都在争抢这些机会。这个浪潮正从美国席卷全世界。
创业的浪潮来得如此猛烈,创业者应该如何应对?史蒂文・霍夫曼认为,创业者要有非常丰富的想象力,还要拥有强大的力量,能够获得非常多的资金来支持这些技术的发展。如今,媒体非常关注知名投资家会在哪些行业投资?当很多投资者投将钱放在某一个行业之时,这个行业会借助媒体的渲染,快速地发展。创业者不用担心团队的人多和少,只要选了正确的领域和投资人,他的企业也会像脸书和苹果一样快速向前发展。
如果创业者所在的领域并不在上述那些范围内,他可能觉得现在创业会非常地艰难。这时,创业者应该转型到主旋律上面,会更加容易。“有一个公司,曾经在硅谷发展地非常迅猛,但是很快就衰弱下来了,因为他所做的并不是目前主流领域。做事情要顺势而为,不要背道而驰,否则会让创业者花费很多的时间和精力,而且往往得不到自己想要的结果。”史蒂文・霍夫曼认为创业者要时刻关注世界大的发展潮流。
“创业者不用每天迸发出很多新鲜的想法,只要是正确的想法就够了。”哪怕创业者只有很少的钱,哪怕只拥有很小的团队,只要创业者有正确的想法,就不会阻碍创业者今后的成长。创业者不要一上来就说他需要五千万美金这样的想法。因为创业者可能会因为去筹集五千万美金,反而会阻碍自己的想法和发展。
如果创业者的想法与其他人一样,就不是创新。创业者要仔细想想每天做的商业和工作当中的每一项,有哪些可以改进,哪些可以去掉,哪些可以让他更好地发展,这就是创新。例如,创业者每天都会看一下自己的工作安排,细到每一个细节,他可以问自己这样的事情是否必须要这样做,可不可以让他以更高的效率或者投入更少的钱去做,加入新科技,让创业者更好地发展,这些都是创新。当创业者静下心来想这些事情的时候,就会想到很多的新想法。
“要想改变世界,我们最缺乏什么样的创新,创新的关注点在什么地方?我看到一种颠覆的力量和叛逆的精神。”硅谷投资人吴军强调。
做颠覆式创新的原因很简单,在一个现有的组织结构,不管是经济体、学校、公司里面,只要定好一个游戏规则,一定是自发地就往山顶走。颠覆和叛逆是硅谷最成功的经验。
吴军认为,叛逆的力量造就了硅谷长盛不衰的原因。18世纪是西班牙大帆船的时代,它不但是海上的霸主,也是高科技的产品,后来小的蒸汽船战胜了大帆船,机械技术大爆发,大帆船很难从机械进步中获得优势,结果这个颠覆就完成了。今天大帆船退出了历史舞台。到了信息时代,60、70年代世界上最了不起的计算机公司都是IBM,当时市值占到美国GDP的3%,现在连1%都占不到了。微软颠覆了IBM。
颠覆式创新,首先来自于外部,然后会出现低品质、高风险、低利润、窄众市场的商品,这是一个很重要的特征。颠覆式创新有一个共同的特点,蒸汽船利用机械的进步,微软的东西利用摩尔定律,Google 能利用互联网,利用现有的技术很快的进行超越。所谓的颠覆式创新不是把现有的行业完全取代掉,而恰恰是以合作的形式。并不是所有传统产业都做互联网,而恰恰是借助互联网的平台成为一个新公司、新产业,这是“互联网+”所要做的一件事情。
“回顾过去50年,世界经济发展的定律是摩尔定律。我们现有的行业要加上新技术,产生新行业,这是现有行业加上技术,才能最快速的带动全球经济增长。这就是合作经济。我们只有把资源拿出来分享,拿出来重复利用,才能使真正的全球经济变得更加绿色,效率更加高,这是未来创业创新将来发展的一个方向。”
“以小见大”而非“求大求全”
在硅谷,为什么那些只有三个人的初创公司可以打败上亿美金的大公司?就是因为小有小的好处,小团队的勇气更大,哪怕失败了也不怕从头再来。但是大公司害怕失败,它没有勇气像小公司一样从头再来。小公司的价值链比大公司强很多,他们采取全球免费。所以,很多小团队获得了巨大的成功,变成了大公司。
很多创业者在创业初期想的就是筹钱,不要只想一味的筹钱,商业的真正成功并不是拿到越多的钱就越成功,而在于创业者的创新之处。很多人在创业初期很幸运地拿到大量资金,但是反而这些资金会阻碍他创新的脚步。比如创业者会安于享乐,急速扩建他的团队,这些都是阻挡他去创新。很多年轻人创业初期非常幸运拿到500、1000万美金,可是他们完全没有想清楚自己做什么,自己的市场策略是什么,拿到这么多钱反而让他们加速失败。很多年轻人拿到这些钱之后想到的第一个做法是扩张自己的队伍、租办公室、给自己购很多不需要的东西,完全没有商业模式来支撑他的公司。商业模式最终是支撑创业者是否成功的重要因素。
“如果创业者跟扎克伯格或比尔盖茨一起吃饭,他就会非常快乐地找到创业的想法。他们见过很多创业者说自己只有500万美元,这些人只知道怎么花这些钱让自己的公司快速成长。但是很多成功人士在创业初期可能都没有500万美元,可是后来一样成功了。可以成功的想法,每天有成千上百万个,不要认为只是选那些初期就需要500万美元、5000万美元的主意才能成功,可以选一些小投入的领域开始创业。我见过一个很硅谷创业成功的公司,最初团队只有五个人,没有多少创业资金。他们从大数据分析开始,慢慢找到投资人,拿到钱,使企业快速发展起来了。”
很多O2O模式很快就消失了,很多人失败了,就是因为他们太快地拿到了初期资金,但是他们根本没有想清楚接下来怎么去扩大自己的业务。由此看来,拥有大量的钱对没有完全成长的创业者来讲,不全都是好事,反而有时候会阻碍创业者。
究竟什么是有效的创业方法?
那就是从小处开始着手,不要特别宏伟的目标。世界上很多非常大的创新都来自于非常小的事件,比如美国推特,这个程序在一周之内就可以写出来,只是一个非常小的想法。YouTube也是源于一个非常小的想法,创业者想把它做成在线视频相亲网站,后来发现人们并不喜欢通过视频约会或者相亲,所以改变成上传视频的网站,这是YouTube慢慢发展起来的原因。扎克伯格是脸书创始人,他在哈佛大学校友录上只看到每个人的照片,就想怎么让哈佛大学校友能够互相之间认识呢?所以做出了Facebook。例如,打车软件Uber,初期是一个很小的公司,Uber并没有去买很多的车来支撑他的打车体系,只是提供了中间的桥梁,APP来连接司机和打车的人。
大树下,蚂蚁收获了一颗米粒。米粒重达88毫克,是这只蚂蚁体重的4倍。
河岸边,大象收割了一筐香草,约10公斤,重量不足象之半腿。
骄阳似火,蚂蚁吃力地驮着米粒,一步一步地爬行,那速度可笑煞蜗牛、气死乌龟。
【摘要】 目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对拟血管性痴呆(VD)小鼠学习记忆的影响及其机制。方法 清醒小鼠反复脑缺血再灌注法建立VD动物模型;造模后给予bFGF干预治疗;采用跳台法、避暗法及Morris水迷宫检测小鼠的学习记忆能力,用荧光分光光度法检测脑组织5羟色胺(5HT)和多巴胺(DA)含量,HE染色观察病理形态学变化。结果 bFGF组小鼠学习记忆能力提高(P<0.01);海马5HT和DA含量增加(P<0.05,P<0.01)。结论 bFGF通过调节脑神经递质5HT和DA含量改善拟VD小鼠学习记忆能力。
【关键词】 碱性成纤维细胞生长因子;血管性痴呆;学习记忆;5羟色胺;多巴胺
有研究认为65岁以上的脑卒中幸存者中,大约1/3于发病后3个月内出现血管性痴呆(VD)〔1〕。在我国,VD可能是老年期痴呆中最常见的形式〔2〕。但其发病的确切病理机制尚不明了,临床干预手段缺乏特异性〔3〕。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是神经营养因子的一种,对神经元的存活、生长发育、分化、再生和功能维持具有不可替代的调节作用〔4〕。大量的研究已肯定其对神经保护的作用〔5,6〕。而bFGF对VD引起的单胺类递质改变的研究未见报道。为此,本实验在制备VD模型小鼠的基础上采用bFGF进行干预治疗,并检测VD小鼠学习记忆能力、海马5羟色胺(5HT)和多巴胺(DA)含量,旨在探讨bFGF治疗VD的可能机制,为临床治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物与试剂
昆明种小鼠,体重(30.0±3.12)g,雌雄兼用,由长春高新区医学实验动物研究中心提供,合格证号:SCXK(吉)20072008。bFGF注射液由Peprotech提供。DA、5HT均由Sigma公司提供。
1.2 动物模型制备及治疗方法
将动物随机分为正常组、假手术组、VD模型组(简称“模型组”),bFGF干预组(简称“bFGF组”)。参照文献采用清醒小鼠反复脑缺血再灌注法建立VD动物模型〔7〕。清醒小鼠仰位固定,行颈部切口,分离双侧颈总动脉,穿线备用。模型组和bFGF组固定拉紧丝线阻断血流,10 min后松线使血液再灌注20 min,如此反复3次。假手术组只分离双侧颈总动脉,套丝线扣,但不阻断血流。术后每日肌注青霉素0.2万U,连续3 d。bFGF组给予bFGF 100 μg/kg溶于生理盐水腹腔注射,于手术后首次即刻给药,以后每日1次,连用7 d〔8〕。正常组、假手术组、模型组给予等体积生理盐水腹腔注射,每日1次,连续注射7 d。
1.3 跳台实验
小鼠置跳台仪中,适应环境3 min后,底部栅板通电,记录小鼠跳上平台的时间(反应期)和5 min内小鼠遭受的电击数(错误次数)作为学习成绩;24 h后将小鼠放于平台上,底部栅板通电,记录小鼠跳下平台的时间(潜伏期)及5 min内的错误次数,作为记忆成绩。电压36 V,反应期、潜伏期指标以秒(s)为单位。测验时若小鼠停留在台上超出5 min,将其取下放入箱内,尾对平台,给予电刺激,记录潜伏期。
1.4 避暗法
将小鼠放入明室中,在箱内自由活动3 min。3 min内不进入暗室者剔除(预选时不通电)。1 h后正式进行学习训练,记录小鼠进入暗室遭受电击所需时间为潜伏期,并记录5 min内遭电击次数(错误次数)作为学习成绩;24 h后重复上述过程,记录潜伏期和错误次数作为记忆成绩。电压为36 V,潜伏期指标以秒(s)为单位。
1.5 Morris水迷宫实验
1 w后进行Morris水迷宫实验测试。采用Morris水迷宫图像分析系统,在直径80 cm圆形水池中设一低于水面1 cm透明站台,水温(25±2)℃,行为测试在安静环境内进行6 d。前5 d进行定位航行实验,将小鼠从东、南、西、北4个入水点背对站台轻轻放入水池,同时开始记录小鼠自入水到找到平台所需时间即逃避到平台上的潜伏期,每次间隔30 s。4次潜伏期时间的平均值作为当日最终潜伏期时间作最后统计。如果小鼠在120 s内未找到平台,其潜伏期按120 s计算。第6天进行空间探索实验,将水迷宫中的平台撤出,小鼠从平台的对角线处放入,记录小鼠在平台所在象限的时间即穿越有效区的时间和120 s内穿越平台的次数。
1.6 5HT和DA的检测
将小鼠迅速断头、取脑,放入预先冰冷的生理盐水中,去除脑膜和血管,分出海马,称重后加入预先冰冷的加入少量酸化正丁醇的玻璃匀浆器中,研磨制成匀浆,4℃ 3 000 r/min离心15 min,取上清,用荧光分光光度法测5HT和DA。
1.7 HE染色
水合氯醛麻醉后,迅速剖开胸腔暴露心脏,剪开右心耳,夹持心尖,自心尖左侧剪开左心室,将大隐静脉穿刺针经左心室插入升主动脉,灌注生理盐水,待血色变淡后,继以4%多聚甲醛(4℃)灌注固定,直至动物呈僵硬状态。原位静置1 h后取脑,用上述固定液后固定。取视交叉至体组织,常规石蜡包埋,冠状切片,厚度8 μm,进行常规HE染色,程序如下:石蜡切片常规脱蜡下行至蒸馏水中待染;切片置苏木素染液5 min,自来水洗去多余的染料;切片放入盐酸酒精中数秒钟,水洗;切片入氨水溶液中至细胞核变蓝;将返蓝的切片充分水洗,去掉碱性物质,然后入1%伊红水溶液中5 min,洗去多余的伊红;显微镜下观察核浆染色对比清晰后梯度酒精脱水、封片。光镜下观察病理形态学变化。
1.8 统计学处理
数据表达采用x±s,采用t检验比较分析。应用SPSS11.0软件进行统计学处理。
2 结果
2.1 bFGF对拟VD小鼠跳台实验的影响
与正常组比较,假手术组小鼠学习训练和记忆测试中的各项指标相近,组间比较无显著性差异(P>0.05);模型组小鼠学习训练中反应期延长(P
2.2 bFGF对拟VD小鼠避暗实验的影响
与正常组比较,假手术组小鼠潜伏期,错误次数无显著性差异(P>0.05);学习训练中,与正常组比较,模型组小鼠潜伏期延长(P
2.3 bFGF对拟VD小鼠Morris水迷宫的影响
定位航行实验:各组小鼠随着训练天数的增加,寻找平台的潜伏期明显缩短。但与正常组比较,假手术组小鼠寻找平台的潜伏期无显著性差异(P>0.05),模型组小鼠寻找平台的潜伏期显著延长(P<0.05,P<0.01);与模型组小鼠比较,bFGF组小鼠寻找平台的潜伏期显著缩短(P<0.01)。空间探索实验:与正常组比较,假手术组小鼠穿越有效区时间以及穿越平台的次数无显著性差异(P>0.05),模型组小鼠穿越有效区时间明显缩短(P<0.01),穿越平台的次数减少(P<0.01);与模型组小鼠比较,bFGF组小鼠穿越有效区的时间延长(P<0.05),穿过平台的次数增多(P<0.01)。见表3。表3 bFGF对拟VD小鼠寻找平台潜伏期及空间探索实验的影响(略)
2.4 bFGF对拟VD小鼠DA和5HT的影响
与正常组比较,假手术组小鼠海马组织5HT和DA含量无显著性差异(P>0.05),模型组小鼠脑海马组织5HT和DA含量明显低于正常组(P
2.5 海马组织CA1区HE染色观察
正常组:小鼠海马 CA1 区锥体细胞核大而圆,核仁明显,细胞排列较致密整齐,锥体细胞可见多层。假手术组:与正常组无明显差别。VD 模型组:小鼠海马 CA1 区锥体细胞稀疏,层次不清楚;有部分细胞缺失;有的细胞旁有空染区,出现核固缩、胞质浓染、胞体变小。bFGF组:小鼠海马组织 CA1 区锥体细胞排列尚整齐,层次尚清楚;较少见核固缩现象。
3 讨论
脑血管病所致脑组织反复缺血再灌注和长期慢性脑灌注不足是VD的主要原因〔9〕。本实验首选采用清醒小鼠反复结扎双侧颈总动脉的方法建立VD模型。目前多用Morris水迷宫检验空间学习能力和参考记忆力,跳台实验和避暗实验作为一次性训练被动回避式条件反射方法,能够比较客观地反映动物经过一次电击刺激后记忆获得和巩固情况。本研究通过跳台实验、避暗实验和Morris水迷宫实验证明模型小鼠的被动回避反应能力和空间分辨能力均下降,学习、记忆功能明显受损,同时光镜下观察模型组小鼠脑组织海马CA1区出现病理形态学的改变,均说明此模型是较为理想的VD动物模型。bFGF组学习记忆能力明显高于模型组,表明bFGF能够明显改善VD小鼠的智能。在VD的发病中,神经递质的改变对疾病的发展程度及预后相当重要。已有资料表明,VD发病过程中大脑海马的神经递质明显减少,尤其是单胺类神经递质减少与VD的智力下降密切相关。多数学者认为中枢神经系统缺血期间单胺的合成及降解均受抑制,同时神经末梢突触对单胺的贮存和重摄取功能也几乎丧失,这就使缺血前已合成的神经递质大量释放进入细胞间隙,最后这些递质一部分被降解,一部分被带入脑脊液及血液中,致使脑组织中递质含量下降。也有学者认为缺血早期神经元受到缺血的刺激,对神经递质的合成及释放增加,随着神经元破坏加重,其合成及释放又被抑制。本实验中VD小鼠脑组织海马区DA、5HT含量明显下降,这与其学习记忆能力下降基本一致〔10〕,bFGF组海马组织5HT和DA含量明显提高。本研究显示,bFGF可以通过上调海马组织5HT和DA含量改善VD小鼠学习记忆能力,其具体机制尚待进一步研究。
参考文献
1 周惠成,陈景清,曹中昌,等.Alzheimer病与血管性痴呆的认知及生活功能变化的随访研究〔J〕.山东精神医学,2005;18(2):725.
2 Roman GC.Vascular dementia may be the most common form of dementia in the elderly〔J〕.J Neurol Sci,2002;15(203204):710.
3 Fernandez M,Castro J,Molano A,et al.Prevalence of neuropsychiatric symptoms in Alzheimer's disease and vascular dementia〔J〕.Curr Alzheimer Res,2008;5(1):619.
4 Springer JE.Nerve growth factors in the central nervous system〔J〕.Exp Neurol,1998;102(2):35465.
5 LinD A,Finklestein SP.Basic fibroblast growth factor,a treatment for stroke〔J〕?Neuroscientist,1997;28(3):24750.
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7 岑德意,周兰兰,明 亮,等.清醒小鼠反复脑缺血再灌注法致学习记忆障碍模型的建立〔J〕.中国药理学通报,2000;16(2):2203.
8 杨 琴,胡常林.碱性成纤维细胞生长因子抗局灶性脑缺血/再灌注引发神经细胞凋亡作用的实验研究〔J〕.重庆医科大学学报,2000;25(4):3457.
[主题词]针刺;肥胖;海马/化学;一氧化氮/分析;一氧化氮合酶*
Effects of acupuncture on contents of nitric oxide and nitric oxides ynthase
in the hippocampus in the obese rat
Liu Zhicheng1, Sun Fengmin2, Zhu Miaohua1, et al.
(1.Nanjing University ofTraditional Chinese Medicine and Pharmacology, Jiangsu
210029, China; 2.Nanjing Population Administration College)
ABSTRACT Objective To study effect of acupuncture on the c ontent of
nitric oxide (NO) and the activity of nitric oxide synthase (NOS) in the
hippocampus of the obese rat. Methods The changes of body we ight, body fat,
and content of NO and activity of NOS in the hippocampus befor e and after
acupuncture were observed. Results The body weight, body fat, and the content
of NO and the activity of NOS in the hippocampus all were significantly higher
than those in the normal rat; there were high positive correlation of the levels
of NO and activities of NOS in the hippocampus with the body weight, Lee’s
index; after acupuncture treatment, the marked weight reduction effect was
achieved, and the level of NO and the activity of NOS in the hippocampus de
creased significantly. Conclusion Abnormal levels of NO and a ctivities of NOS
in the hippocampus may be an important factor for obesity; the benign
regulation of acupuncture on the level of NO and the activity of NOS in the
hippocampus is possibly one of the central nervous mechanisms of reducing body
weight.
KEY WORDS Acupuncture; Obesity; Hippocampus/chem; Nitric Oxide/anal; Nitric Oxide Synthase*
针灸治疗单纯性肥胖病及其并发症取得了良好的疗效,与此同时,患者的神经、内分泌、物质代谢等得以改善[1]。本研究以实验性肥胖大鼠为模型,观察针刺对实验性肥胖大鼠海马组织一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的影响,探讨针刺减肥中枢神经的作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验肥胖大鼠模型研制
1月龄刚断乳SD雄性大鼠,体重50~70 g,由总医院实验动物中心提供。参照刘氏提供的实验性肥胖造模方法,略加改进[2]。
1.2 实验步骤
(1)动物分组 以普通全价鼠饲料喂养的大鼠作为正常对照组,简称正常组(6只)。将造模成功的实验性肥胖大鼠随机分为两组,一组不做任何治疗,为模型对照组,简称对照组(6只);另一组给予针刺治疗,为针刺治疗组,简称针刺组(6只)。
(2)治疗方法 分别将针刺组大鼠放入固定器中,取一侧“后三里”(相当于足三里)和“内庭”穴,用32号1寸毫针,分别刺入5 mm和3 mm深,然后接通电针仪(电针综合治疗仪G 6805-Ⅲ型,福建省医疗器械厂生产)采用频率10 Hz,强度1.5 V连续波,每次治疗10分钟,每日1次,连续治 疗14天,左右侧轮换取穴。
(3)实验方法 各组大鼠实验期间均采用普通全价鼠饲料喂养,自由摄食和饮水,每日更换饲料和水。针刺组大鼠给予针刺治疗期间,正常组和对照组大鼠分别每天放入大鼠固定器中适应15分钟,持续14天。实验前后观察大鼠摄食量、饮水量、大小便、体重、体长及Lee’s指数等。实验结束后,禁食过夜,次日断头处死,迅速分离心包、肾周和附睾等部位脂肪,称重并记录;同时迅速分离脑组织置于液氮中保存;次日取出置于冰碟上分离出海马组织,称重后用生理盐水制成海马组织匀浆。
(4)检测方法 海马组织NO和NOS检测方法和试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
1.3 统计学方法
实验数据用SPSS统计软件进行分析,组间比较采用t检验,相关分析采用多元相关分析。
2 结果
2.1 针刺对实验性肥胖大鼠肥胖指标的影响(见表1)
表1可见,肥胖大鼠体重和Lee’s指数均显着高于正常大鼠水平,针刺治疗后,体重和Lee’s指数显着回降,经统计学处理差异具有非常显着性意义。
2.2 实验各组不同部位脂肪量的比较(见表2)
表2显示,对照组三部位脂肪量均显着高于正常组,针刺组三部位脂肪量均低于对照组,经统计学处理差异均具有显着性和非常显着性意义。说明针刺具有减肥作用。
2.3 实验各组大鼠海马组织NO含量和NOS活性的比较(见表3)
表3显示,对照组NO含量和NOS活性均显着高于正常组,针刺组NO含量和NOS活性均明显低于对照组,经统计学处理差异具有显着性和非常显着性意义。
2.4 海马组织NO含量与体重和Lee’s指数的相关分析(见表4)
2.5 海马组织NOS活性与体重和Lee’s指数的相关分析(见表5)
表5所示,海马组织NOS活性与体重和Lee’s指数高度正相关。
3 讨论
海马系边缘叶重要组成部分,其功能比较复杂,主要包括有调节情绪反应、内脏功能、内分 泌激素的合成与释放、学习与记忆、睡眠与觉醒等功能[3]。
神经系统内含有种类繁多的神经信息传递物质,其中非传统的中枢信使――NO是细胞内重要 的信号传导信使。NO是由NOS降解精氨酸产生NO和瓜氨酸。NO以扩散的形式到达并进入靶细胞发挥作用。NO没有专门的储存及释放调节机制,靶细胞上NO的多少直接与NO生成有关,而NO的生成则与NOS的活性密切有关。NOS分布于神经元胞体、末梢、胶质细胞以及内皮细胞。NOS有三种亚型,神经NOS(nNOS)、内皮细胞NOS(eNOS)及诱导型NOS(iNOS)。nNOS和eNOS统称为固有型NOS (cNOS)。cNOS通常以非活性形式存在,当某些信使物质与细胞上相应受体结合引起细胞内Ca2+浓度升高时,cNOS与钙调蛋白结合而迅速激活。一般认为,cNOS主要参与机体内环境调整有关的某些快反应过程,如神经传导、肠蠕动及血管扩张等。大鼠脑组织中神经cNOS只存在于神经元,多集中在大鼠的大脑皮层、海马及纹状体等许多区域中。海马中神经cNOS主要存在于CAI区的中间神经神经元及海马齿状回的颗粒细胞中。NO的生理功能活动不经受体介导,而是直接作用于胞浆的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)使其活化产生cGMP,作用于cGMP依赖性蛋白激酶(PKG),从而发挥生理性兴奋的功能活动。NO参与多个系统的正常生理功能(神经、免疫、心血管、消化和生殖等系统)和异常病理生理活动。
实验资料显示,NO对神经递质具有调节作用。在海马薄片标本上,NO供体羟胺可促进[3H]去甲肾上腺素(NE)及[14C]乙酰胆碱(Ach)的释放,而血红蛋白可阻断羟胺引起的[3H]NE及[14C]Ach 的释放。说明NO参与NE及Ach释放的调节[4]。中枢神经递质中,NE对摄食中枢具有增强作用,导致摄食增加;Ach对摄食的影响随着不同动物有所差异,有关大鼠中枢Ach对摄食中枢的效应报道尚不一致,但是Ach通过边缘系统促进摄食活动,是比较肯定的事实。本实验结果显示,肥胖大鼠海马组织NO含量和NOS活性显着高于正常大鼠,说明肥胖机体海马组织合成释放NO含量和NOS活性显着增加。相关分析显示,肥胖大鼠海马组织NO含量和NOS活性均与体重和Lee’s指数呈高度正相关。说明海马组织NO含量和NOS活性异常升高,可能是通过促进中枢NE和Ach的释放,增加摄食,导致肥胖。已知NO在许多病理过程中的作用是致细胞死亡的毒性反应,在谷氨酸兴奋毒性过程中,NOS在Ca2+超载情况下被激活所产生的NO不走sGC-cGMP-PKG通路,而是经过激活poly ADP-ribose s ynthetase,产生自由基并抑制线粒体产生能量[4~6]。本文所见,海马组织NO含量和NOS活性异常升高,很可能是通过抑制线粒体产生能量,即能量消耗减少,产生肥胖。这一结果与笔者以往实验中肥胖大鼠细胞内线粒体减少相吻合[7]。笔者以往工作证实,肥胖机体存在着糖、脂、水、盐、能量等诸多方面代谢异常及神经内分泌调节异常。针刺治疗后肥胖大鼠体重、Lee’s指数、心包脂肪、肾周脂肪、附睾脂肪出现了显着的回降,说明针刺治疗肥胖可以取得良好的减肥效应;与此同时肥胖大鼠海马组织NO含量和NOS活性水平出现明显回降。提示,肥胖大鼠海马组织NO含量和NOS活性异常,可能是肥胖发病的重要因素之一。针刺对肥胖大鼠海马组织NO含量和NOS活性的良性调整作用,可能是针刺减肥中枢神经作用机制的重要组成部分。
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【摘要】 目的 研究NMDA受体亚单位2A(NR2A)反义寡核苷酸对短暂性脑缺血/再灌注大鼠海马CA1区NR2A及其mRNA表达的影响,探讨其在脑缺血/再灌注诱导的大鼠海马神经元损伤中的可能作用机制。方法 健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组、假手术对照组和缺血/再灌注组。经生理盐水、错义寡核苷酸和反义寡核苷酸预处理后,以四血管阻断法建立短暂性前脑缺血(15 min)再灌注(24 h、48 h和72 h)动物模型。在确定的时间点进行灌注固定、取材、石蜡包埋和组织切片(片厚8 μm),然后行原位杂交和免疫组织化学染色。结果 短暂性脑缺血/再灌注后,大鼠海马CA1区NR2A mRNA的表达显著增加,与对照组相比差异有统计学意义(P
【关键词】 脑缺血;NR2A反义寡核苷酸;NR2A;NR2A mRNA;翻译抑制
Abstract: Objective To investigate the effect of NMDA receptor subunit 2A (NR2A) antisense oligodeoxynucleotides on the expression of NR2A and its mRNA in rat hippocampal CA1 region following transient cerebral ischemia/reperfusion, and to further probe into the possible mechanism of neuronal cell injury induced by cerebral ischemia and reperfusion in rat hippocampus. Methods Healthy male SD rats were randomized into normal control group, sham operation control group and ischemia/reperfusion group. Following pretreatment with saline, missense oligonucleotide and antisense oligonucleotide, the four-vessel occlusion method was employed to establish transient forebrain ischemia (15 min) and reperfusion (24 h, 48 h and 72 h) animal models. In determining time, the rats were anesthetized, and then underwent perfusion fixation, sample preparation, paraffin-embedding and tissue sections (8 μm of slice thickness). The slices were processed by in situ hybridization staining and immunohistochemical staining. Results Following transient cerebral ischemia/reperfusion, the expression of NR2A mRNA significantly increased in CA1 subfield of rat hippocampus (P
Key words: cerebral ischemia; NR2A antisense oligonucleotides; NR2A mRNA; NR2A; translation inhibition
缺血性脑损伤能够诱导谷氨酸释放增加和(或)摄取减少,突触后谷氨酸受体过度刺激,引起Ca2+异常内流而导致胞内钙超载,超载的Ca2+激活其靶酶,造成自由基积累,并形成恶性循环,最终导致神经细胞的损伤和死亡,这就是所谓的谷氨酸兴奋毒性[1-2]。可见,谷氨酸过度激活其受体是缺血性脑损伤的关键环节。N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR, NR)作为离子型谷氨酸受体的主要类型,是一种配基门控的阳离子通道,是引起Ca2+内流而诱导产生兴奋毒性的主要受体[3-4]。构成NMDA受体的亚单位常以受体复合物的形式存在,其中NR2是受体复合物的调节亚单位,不同NR2的参与可以赋予通道复合物以不同的电生理学和药理学特性[5]。尽管已经明确NMDA受体介导的谷氨酸神经兴奋毒性在缺血性脑损伤的众多环节中起着关键性的作用[6-7],但目前有关NMDA受体调节亚单位2A(NR2A)在缺血性脑损伤中的确切作用机制和作用环节仍不明确,关于NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马NR2A及其mRNA表达的影响尚鲜见文献报道。本研究探讨NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马NR2A及其mRNA表达的影响,并探讨其在脑缺血/再灌注诱导的大鼠海马神经元损伤中的可能作用机制,为临床脑血管病的预防和治疗以及研制和开发针对NR2A的特异性新药提供理论基础和形态学依据。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器 NR2A反义寡核苷酸序列:5′-CA GTA GCC CAA TCT GCC CAT-3′,NR2A错义寡核苷酸序列:5′-AT GGG CAG ATT GGG CTA CTG-3′(美国GIBCO)。多克隆羊抗-NR2A(美国Santa Cruz),兔抗山羊IgG抗体(英国Abcam)。原位杂交试剂盒(武汉博士德),浓缩型DAB试剂盒(北京中杉)。石蜡切片机(德国Leica),显微摄影系统(日本奥林巴斯),立体定位仪(日本成茂),图像分析软件(美国Media Cybernetics)。
1.2 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠,体重220~280 g,购自徐州医学院实验动物中心(清洁级,合格证号:苏SYXK2002-0038)。随机分为正常对照组(NC)、假手术对照组(Sham)和缺血/再灌注组(I/R);I/R组又分为I/R 24 h、I/R 48 h和I/R 72 h组。各组动物又分别分为反义组(AS)、错义组(MS)和溶剂组(TE)。每小组的实验动物数皆为5,即n=5。
1.3 给药处理 在脑缺血前3天经侧脑室给药,每天1次。参照Paxinos & Watson所著的《The rat brain in stereotaxic coordinates》选取侧脑室立体定位坐标(以Bregma为参照,后0.8 mm,侧1.5 mm,深3.5 mm)[8]。每次给药量为10 μl(100 μg NR2A反义寡核苷酸溶解在10 μl TE缓冲液中)。错义组与溶剂组分别在相同部位注射相同剂量的错义寡核苷酸和溶剂(TE)。
1.4 模型建立 以改良的四动脉阻断法建立短暂性前脑缺血(15 min)再灌注动物模型[9-10],再灌注时间为24 h、48 h和72 h。Sham组大鼠除不电凝椎动脉和不夹闭双侧颈总动脉外,其他手术过程同I/R组。
1.5 灌注固定及切片制备 大鼠常规麻醉,经心-升主动脉插管灌注固定。取含海马的脑块入后固定液(4℃,过夜),然后常规梯度乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋。包埋脑块作连续冠状切片,片厚8 μm,切片分4套,分别进行原位杂交和免疫组织化学染色以及阴性对照染色。
1.6 原位杂交染色 原位杂交按试剂盒说明书和本实验室方法进行[11],主要步骤如下:以3%H2O2灭活内源性过氧化物酶,用3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶消化;预杂交(37℃、3 h)和杂交(41℃、24 h);杂交后洗涤;以5%BSA封闭非特异性结合位点;加生物素化鼠抗地高辛;加SABC-POD;加生物素化POD;以DAB/H2O2显色。阴性对照以0.5 mol/L PBS替代含探针杂交液进行杂交,其余步骤相同。
1.7 免疫组织化学染色 以EDTA抗原修复液行微波修复,加3% H2O2(室温、10 min),水洗,10%兔血清(室温1 h),加一抗(1∶100,以含0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS稀释,4℃,48 h),水洗,加生物素化兔抗山羊IgG(1∶200,37℃,30 min),水洗,加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素液(1∶200,37℃,30 min),水洗,DAB/H2O2显色。阴性对照以一抗稀释液替代一抗,其余步骤相同。
1.8 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两组间比较采用LSD-t检验,以P
2 结 果
2.1 NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马CA1区NR2A mRNA表达的影响 原位杂交结果显示,在I/R 24 h、I/R 48 h和I/R 72 h,大鼠海马CA1区NR2A mRNA的原位杂交强度显著增加,与Sham组相比差异有统计学意义(P
2. 2 NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马CA1区NR2A蛋白质表达的影响 免疫组织化学研究显示,在I/R 24 h、I/R 48 h和I/R 72 h,大鼠海马CA1区NR2A蛋白质的反应强度明显减弱,减弱的幅度依次增加,与Sham组相比,差异有统计学意义(P
3 讨 论
NR2A亚单位实际上也许在谷氨酸兴奋毒性中比NR2B亚单位起到更为关键的作用,已经证明谷氨酸对新生鼠CA1区神经元的易损性很低,但对生后3个月的大鼠却很高,这表明NR2A的表达增加了谷氨酸的兴奋毒性[12-13]。文献报道在脑缺血小鼠模型中选择性敲除NMDA受体ε1(NR2A)亚单位后能够减轻缺血引起的细胞损伤程度,说明NR2A参与了缺血性脑损伤过程[14]。近年关于NR2拮抗剂的研究发现,这类化合物具有一定的亚型选择性,其亲和力排序为:NR2A>NR2B>NR2C>NR2D[15]。Novartis公司研制的化合物NVPAAM077是一种具有较强选择性的竞争性拮抗剂,能选择性阻滞NR2A,该物质对NR2A的选择性较对NR2B的选择性高很多倍[16]。以上研究表明,NR2A在缺血性脑损伤中可能发挥比NR2B更为重要的作用,针对NR2A及其拮抗剂或激动剂的研究将成为热点。目前,NR2A在缺血性脑损伤中的确切作用机制仍不明确,关于NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马NR2A及其mRNA表达的影响尚鲜见文献报道。尽管有小干扰RNA出现,但对于在体研究而言反义寡核苷酸技术仍不失为一种在基因水平进行相关研究的重要方法[17]。既往研究发现,在缺血/再灌注24 h、48 h和72 h,大鼠海马CA1区NR2A mRNA的表达呈明显的增高趋势[18],故本研究选择这3个时间点。本研究综合应用反义技术、动物模型、立体定位注射以及原位杂交和免疫组织化学等方法,研究NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马NR2A及其mRNA表达的影响;探讨其在脑缺血/再灌注诱导的大鼠海马神经元损伤中的可能作用机制,为研制和开发针对NR2A的特异性新药以及临床脑血管疾病的预防和治疗提供理论基础和形态学依据。
研究发现,在脑缺血/再灌注24 h、48 h和72 h,大鼠海马CA1区NR2A mRNA的表达显著增加,且NR2A反义寡核苷酸能够明显抑制这种表达的增加。缺血后调节亚单位NR2A mRNA表达的增加,很有可能在mRNA水平诱导某些凋亡相关基因如Bad、Bax、Fas、caspase和IEGs等的异常表达以及相关激酶如c-jun的异常磷酸化,从而参与脑缺血/再灌注诱导的细胞损伤和死亡[19-20]。NR2A反义寡核苷酸抑制缺血后NR2A mRNA表达的增加,一方面说明这种针对NR2A mRNA的反义寡核苷酸具有特异性和有效性,为探索缺血性脑损伤的反义治疗提供了形态学依据;另一方面间接说明了NR2A反义寡核苷酸特异性阻断缺血后NR2A mRNA的表达很有可能对脑缺血/再灌注诱导的大鼠海马CA1细胞损伤具有重要的神经保护作用。
本研究还发现,在短暂性脑缺血/再灌注24 h、48 h和72 h,大鼠海马CA1区NR2A蛋白质的表达明显减弱且减弱的幅度依次递增;NR2A反义寡核苷酸能够进一步增强这种表达的减弱。这说明NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注后大鼠海马CA1区蛋白质的表达具有显著的抑制作用,进一步证明NR2A反义寡核苷酸作为药物使用的有效性。结合本课题组的既往研究[18,21],有力地证明短暂性脑缺血/再灌注以后在易损伤的大鼠海马CA1区存在转录和翻译不平行即转录增强而翻译抑制现象。文献认为,翻译和转录不平行这一现象不仅是时间依赖性的,而且很可能是细胞特异性的,对缺血高度敏感的易损神经元中存在翻译抑制现象,且该现象往往发生在易损的神经元坏死之前[22-23]。本研究证实了这一论点,不但证明在缺血性脑损伤中存在翻译抑制现象,而且证明NR2A参与了这一过程,提示NR2A在脑缺血/再灌注诱导的神经细胞死亡中发挥极其重要的作用。脑缺血/再灌注过程中,产生转录和翻译不平行这一现象的原因显然与脑缺血时蛋白质的翻译而非转录减弱有关。目前,缺血性脑损伤易损神经元翻译抑制的机制尚不清楚,但在翻译抑制和神经元易损性这一惊人的联系中,前者可能在导致缺血性细胞死亡的级联反应中发挥更为关键的作用[23-24]。本研究提示,如果在缺血性脑损伤的进程中采取适当的方式抑制易损神经元的这种翻译抑制,也许能有效地抑制易损神经元的凋亡和坏死。这也为未来缺血性脑损伤神经保护机制的研究提供了一个新的方向。
以上结果提示,短暂性脑缺血/再灌注后,在大鼠海马CA1区存在转录增强而翻译抑制的现象。NR2A反义寡核苷酸能特异性地抑制NR2A mRNA表达的增加,同时能够增强NR2A蛋白表达的降低。至于NR2A参与翻译抑制的具体机制及其与海马CA1区选择性易损伤以及反义抑制之间的关系,有待从蛋白质组学和基因组学方面做进一步深入研究。
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