基因治疗的策略

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基因治疗的策略范文第1篇

【关键词】肝内胆管结石；病因；治疗策略

1肝内胆管结石的病因

1.1肝内胆管的先天性变异肝内胆管结石的形成主要是因为肝内胆管的先天性变异或畸形，变异的胆管近端狭窄而出现远端扩张并存，变异的胆管可以分布在一个肝叶或肝段，也可以同时存在多个肝叶或肝段的跳跃性变异，一般多分布在左肝外叶和右肝后叶，狭窄胆管使胆汁引流不通畅，而远端胆管扩张使胆汁出现淤积，淤积胆汁感染引起结石形成。大量的文献报道肝内胆管结石时，胆流存在细菌感染，这些细菌以肠道菌群为主。肝内胆管的狭窄胆汁淤积是感染的重要原因，同时感染又加重肝内胆管狭窄，狭窄与感染总是与肝内胆管结石伴生。

1.2胆汁的流体力学因素肝内胆管结石在临床上一般多分布在左肝外叶和右肝后叶，这跟肝内胆管在引流胆汁过程的胆汁流体力学分布有关，左肝外叶及右肝后叶的胆汁经过肝内胆管流出过程需要一定压力克服重力影响，使胆汁的流出变得更加困难，从解剖学因素看，这些部位的胆汁流出常常需克服3-5cmH20的重力影响。

1.3其他因素临床上部分病人有家族聚居现象和很容易出现反复复发的特点，家族的聚居现象提示可能有共同的致病基因或致病因素，反复复发也提示生活习惯，生活环境可能是否是致病的因素之一，这些现象还有待进一步研究。

2肝内胆管结石的综合治疗

肝内胆管结石的治疗尽管疗效尚不十分令人满意，但近年来随着医疗技术及器械的发展也取得了长足的进步。但肝内胆管结石的综合治疗与个体化治疗方案大大地推进了肝内胆管结石的治疗进展。

2.1解除病灶肝内胆管结石的致病因素主要是肝内胆管的变异与胆汁的淤积感染，所以肝内胆管是结石形成的土壤，去除致病的胆管是其中最重要的治疗方法。根据肝内胆管结石治疗的十二字方针即“去除病灶，取尽结石，通畅引流”的原则，去除病灶是根本，通过近几十年肝胆外科的发展，对肝脏的解剖学研究也更加精细，肝叶与肝段的切除变得更加安全可靠。据报道肝内胆管结石合并胆管癌的发生率约为4-11%[1]，大多数学者认为结石对胆管的长期刺激也是引起胆管癌的病因。所以，病灶切除后既根除了结石复发的土壤，同时病灶发生恶性病变也起到预防控制的效果[2]。作者认为肝脏切除后经残肝断面与胆总管会师冲洗是必要的一环，它一方面可以确定肝内胆管的通畅程度，同时还减少了结石残渣的残留。三是降低了感染的几率；临床上依据结石的分布部位及分布范围，有时部分结石病灶很难以彻底清除，或清除病灶弊大于利，所以不必要强行清除，如经肝表面切开取石，U管使用等。病灶的清除应遵循安全，有效，彻底的次序。

2.2术中取石器械的使用术中“B”超，术中胆管造影及术中胆道镜，液电碎石仪等的使用在肝内胆管结石手术过程中对结石的分布部位及分布范围做到了更客观，更精确的把握。对手术具有重要的指导意义。尤其是术中胆道镜的使用使残留结石的几率大为降低[3]。这对不能够完全切除病灶的胆管在取尽结石方面得以顺利完成。还可以术后经“T”管窦道取石。对降低胆道残石率有重要意义[4]。经胆道镜对狭窄的胆管进行扩张，使狭窄的胆管得以暂时解除狭窄，其远期效果值得期待。

2.3胆肠吻合的应用近年来，随着胆管功能性解剖的深入研究，胆肠吻合的指征逐渐严格。胆肠吻合在肝内胆管结石的应用应该在肝内胆管狭窄已经解除后，肝门胆管成型的基础上使用[5]。作者认为盲目使用胆肠吻合不仅无助于结石的自然排出，而且会引起反流性胆管炎。反流性胆管炎又造成肝内胆管的狭窄，感染促进结石形成，许多报道胆肠吻合术后病人出现反复感染，同时结石复发率也有明显增加。但胆肠吻合对胆管下段狭窄引起的肝内胆管病变有确切的治疗意义。

3结果

肝内胆管结石（Intrahepatic cholelithiasis，IHL）是指左右肝管分叉部以上的结石，是肝胆外科的常见病。目前治疗方式多种多样，治疗原则以祛除病灶，取尽结石，通畅引流为肝胆外科医生共识，但以其结石残留与复发率高尤其是复杂的IHL成为肝胆外科的治疗难题。近年来，随着医学技术及器械的不断改进，IHL的综合治疗与个体化治疗的理念越来越突出，HIL的残留与复发已经得到了有效的降低。

参考文献

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基因治疗的策略范文第2篇

摘 要 目的：探讨锁骨骨折术后感染的原因及防治方法。方法：2003年1月-2013年1月收治锁骨骨折术后发生感染患者52例，分别采用钢板、弹性髓内钉、克斯针、螺钉或钢丝固定，对其感染原因分析，得出防治方法。对锁骨骨折术后感染病灶行彻底清创，负压或灌洗引流，及时拆除内固定，必要时更换外固定，皮瓣覆盖创面等治疗。结果：通过病灶清除、负压或灌洗引流、拆除内固定、更换固定方式、皮瓣覆盖创面等治疗，感染均得到控制，平均拔管时间23天。结论：锁骨骨折手术后感染原因较多，应积极预防，早期发现，及时行病灶清创、引流、拆除内固定、更换固定方式及皮瓣覆盖创面等治疗方法，及时控制感染。

关键词 锁骨骨折 感染 清创 灌洗

Analysis of the causes of infection after internal fixation of clavicular fractures and treatment strategy

Zheng Shuichang，Zhang Shaoan，Wei Xinjun，Cheng Feng

The Second Affiliated Hospital of Luohe Medical College，Henan 462300

Abstract Objective：To explore the causes of infection after clavicular fracture operation and prevention methods.Methods：52 cases with infection after clavicular fractures operation were selected from January 2003 to January 2013.They were treated respectively with steel plate，intramedullary nail，screw，needle，or wire fixation.We analyzed the cause of infection to find the control methods.Infection lesions after clavicular fractures operation underwent debridement，negative pressure or irrigation drainage，and the timely removal of internal fixation，when necessary，we gave the replacement of external fixation and flap to cover the wound treatment and other treatment.Results：With debridement，negative pressure or irrigation drainage，removal of internal fixation，the replacement of external fixation and flap to cover the wound treatment and other treatment，the infection were all controlled，and the average time was 23 days.Conclusion：After the clavicular fracture operation，infection is more.We should give active prevention and early detection，and timely treatment of debridement，negative pressure or irrigation drainage，removal of internal fixation，the replacement of external fixation and flap to cover the wound treatment and other treatment to control infection in time.

Key words Fracture of the clavicle；Infection；Debridement；Irrigation

锁骨骨折是一种很常见的骨折，发生率较高，约占全身骨折的6%。锁骨骨折的治疗观点目前尚未统一。绝大多数锁骨骨折的患者可通过非手术治疗痊愈，功能满意；但是，由于非手术治疗有较高的骨不连和畸形率的发生[1]，近年来一些学者提出积极的治疗观点，对于不稳定性锁骨骨折主张手术治疗。而锁骨骨折术后感染、骨不连等手术并发症在临床工作中也不少见，术后感染一般处理起来比较困难，预后不佳。

资料与方法

收治锁骨骨折术后患者52例，男30例，女22例，年龄14～65岁，平均37.5岁，骨折类型：开放性骨折38例，闭合性骨折13例，血友病合并骨折1例。骨折部位：锁骨远1/3骨折20例，中1/3骨折26例，近1/3骨折6例。致伤原因：车祸25例，坠跌伤12例，重物直接撞伤6例，碾挫伤5例，机器绞伤4例。细菌学检查结果：金黄色葡萄球菌30例，绿脓杆菌8例，表皮葡萄球菌4例，不动杆菌3例，大肠埃希菌1例，肺炎克雷伯菌1例，阴沟杆菌3例，无细菌生长2例。

治疗方法：采用臂丛麻醉，仰卧位，患侧肩胛下垫枕，沿以往的手术切口将病灶打开，使病灶内的脓腔充分暴露出来。脓腔暴露后，先取少量标本进行细菌学检查，然后对病灶进行彻底清创，务必使脓腔中的坏死组织和骨片彻底清除，以促进术后的愈合和康复。然后使用双氧水、0.9%氯化钠注射液对病灶进行反复的冲洗，以达到彻底消毒和清洗的目的，在这个过程中要注意不要损伤到重要的血管和神经，以免影响患者术后的功能恢复。在彻底清创后，如果在病灶部位有因为骨片缺如而不稳定的组织，则可以使用单边微型外固定器对其进行固定，但是在固定的过程中要注意避开感染的骨断端以及周边的重要的血管和神经。稀松缝合创缘，关闭伤口。在本研究中，有5例患者在对病灶进行充分扩创后，存在关闭困难，其中3例患者采用皮肤减张，然后可以将伤口顺利缝合，2例患者采用的是皮瓣转移术。对于所有的患者，在手术完成后，本就病情的不同，其病灶部位均使用不同的引流方式进行引流。在手术后，发现6例患者出现伤口不同程度的裂开，并且形成窦道，经过积极的处理后，伤口均闭合。拔管时应达到以下标准：在引流管内，没有脓液继续被引流出，或者对脓腔进行冲洗，其流出液清亮，对患者进行相关的辅助检查，其WBC、血沉、体温恢复正常，并且连续3次细菌学检查均为阴性，才可以拔出引流管。

结 果

在本研究中，所有患者的感染症状均得到了有效的控制，治疗效果较为理想。52例患者中，拔管时间10～35天，平均23天。除6例拔管后切口局部出现炎性反应经换药治愈，其余46例患者都达到了Ⅰ期愈合。手术后，对所有患者进行术后随访，时间3个月～8年。在随访的过程中，发现有8例患者出现骨折畸形愈合，6例患者出现骨不连，在给予患者手术矫正、植骨内固定等治疗后，达到了良好的治疗效果。

讨 论

骨折术后感染的主要原因：①开放性骨折清创不彻底或缺乏软组织覆盖，锁骨为“S”形弯曲长骨，内侧2/3三棱柱形并向前凸，外侧1/3扁平凸向后，全长皮下可触摸到。锁骨的这种解剖特点及骨科医师对开放性骨折软组织损伤程度及伤口污染程度估计不足，是导致术后伤口感染的重要原因之一。整个锁骨的上面仅有一层皮肤和极薄的皮下组织覆盖，皮肤血供较差，易受损伤，特别是直接暴力的损伤。开放的骨折端可直接显露于伤口外面，易发生污染，患者就诊时骨科医师对损伤程度及伤口污染程度认识不足，致使清创不彻底，术后发生伤口感染的机会增加。术中为彻底清创，有的医师盲目扩大清创范围，术后缺乏软组织覆盖而致感染骨外露。本组10例在二次清创时发现创口内遗留外界异物，造成感染。5例清创时发现皮肤或者皮下有坏死，手术切口无法直接缝合，减张或者皮瓣转移后伤口闭合。②骨折内固定方式选择不当。锁骨骨折手术适应证一般有以下几种情况：不能忍受外固定；闭合复位失败；合并血管神经损伤；开放性骨折；陈旧骨折不愈合；锁骨外端骨折；粉碎性骨折，骨折块向下有刺破血管危险等[2]。近年来，随着患者对治疗的要求越来越高和医疗器械和技术的发展，手术指征在逐步放宽。在治疗骨折时，尽量避免干扰骨折周围的软组织环境和骨折块的血运的操作[3]。因此，对于复杂骨折，周围软组织的处理与骨折本身的处理同样重要，治疗措施的选择要以保护软组织为前提[4]。骨外固定符合以上特点，是治疗开放性骨折较为理想的方法，其固定确切、操作简单、创伤小，对骨生长的生物学环境影响小，利于骨折愈合[5]。坚强牢固的骨折内固定忽略对骨组织血运的保护，增加了术后感染率[6]。本组有15例为解剖钢板内固定，术中术者自信清创彻底，创口清洁而采用了钢板内固定，由于对周围软组织的医源性破坏或者止血不彻底，导致骨折和内固定缺乏软组织覆盖，局部组织抗感染能力下降导致继发感染。③手术时机选择不当：本组5例，于开放伤后24小时～3天内行内固定手术治疗，由于污染伤口内已经存在细菌的繁殖，无法彻底清创，导致术后感染进一步加重；3例，局部组织肿胀出血明显，术中钝性分离造成的组织损伤失活，创口内出血又是细菌的良好培养基，利于病菌潜伏和繁殖，术后因组织肿胀，坏死组织无法及时引流，导致感染。④其他因素：本组3例，如未按无菌原则手术，受伤后就诊较晚，抗生素选择不当等。1例因创口内遗留手套破损片，致感染。

锁骨骨折术后感染的预防和治疗：感染的预防：①早期规范彻底清除开放伤口的异物及不健康的失活组织是原则，但不应为了彻底清创而盲目扩大清创范围；清创前后要配合利用广谱抗生素，必要时清创前即应取细菌培养。②选择正确的内固定方式：对清洁伤口，经规范的抗生素及清创后，可以一期行钢板或髓内针内固定，尽量减少对周围软组织的干扰；污染伤口，同样要强调正规严格的抗生素和彻底清创的实施，但是在内固定的选择上，一定要慎重，尽量简化内固定的形式。③闭合性骨折应待肿胀消退后，再考虑内固定治疗。④要严格遵守无菌操作规范，遵循内固定的基本原则，清点物品，严格把关，防止遗留。术中仔细操作，彻底止血，术后放置引流管或引流条，充分引流。骨折术后感染的治疗：①早期及时正规治疗：术后一旦发现有感染征象，并通过穿刺证实为深部感染，即应打开脓腔，进行彻底清创。术中要避免损伤重要的血管、神经，清创前后进行细菌学检查。本组52例清创后放置负压引流或病灶内持续灌洗引流，全身使用敏感抗生素。为改善患者全身体质，增强机体抵抗力，给予适量的维生素及高蛋白。②取出内固定，更换外固定：清创时由于有内固定材料的存在，不能有效清除伤口内坏死组织或污染物，从而使感染不易控制，创面难以闭合。因此，对于骨折内固定术后感染病例，清创时常规要拆除内固定物，对于拆除内固定的骨折，若有骨折的不稳定存在，应行外固定。③皮瓣覆盖创面：感染创面因创口周围炎性增生，血供下降，抗感染能力下降；而皮瓣一般血供丰富、抗感染能力强，能有效地控制感染，修复创面[7]。如创面较小，感染局限，可以考虑局部皮瓣转移覆盖创面；如创面较大，用一般的局部转移皮瓣不能达到修复目的，我们可以考虑附近带蒂转移皮瓣修复。感染控制后若肢体存在骨折畸形愈合、不愈合以及关节功能障碍，则后期行手术矫正、植骨及康复治疗。

参考文献

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基因治疗的策略范文第3篇

原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma，PHC)是常见的恶性肿瘤之一。目前对PHC主要治疗方法有手术治疗、放疗、化疗以及综合治疗等，然而治疗效果并不理想。随着分子生物学和免疫学技术的发展，基因治疗技术在肿瘤的治疗中具有广阔的前景。基因治疗的方式有两类，一类为基因矫正和置换；另一类为基因增补，不去除异常基因，而是通过外源基因的非定点整合，从而补偿缺陷基因的功能，达到治疗目的。本文就原发性肝癌的基因治疗进展综述如下。

1反义基因治疗

肝癌的发生、发展过程中许多癌基因及生长因子的基因产物大量表达，应用反义核酸在转录水平和翻译水平阻断某些基因的异常表达，以期阻断癌细胞内的异常信号传导，使癌细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡，从而抑制肿瘤的生长。反义基因包括反义RNA、反义DNA和核酶3类。根据碱基互补的原理，利用与目标基因特定序列互补的短链核苷酸片段来封闭目标基因表达，或利用核酶与相应的mRNA结合使其降解，均可达到基因治疗的目的。Wang等［1］利用AFP反义寡核苷酸治疗体外和裸鼠的SMMC7721肝癌模型取得了明显的抗癌作用，减少了AFP的表达，抑制SMMC7721细胞的增生。有研究显示［2］，引用反义胰岛素养生长因子(Insulingrowth factor I，IGFI) 寡核苷酸转染人肝癌细胞，发现肝癌细胞的凋亡阳性指数明显增加，并且被转染的癌细胞的CEA和AFP的分泌下降，表明反义IGFI寡核苷酸可以抑制肝癌细胞的增殖、促进分化并诱导肿瘤细胞的凋亡。

2自杀基因治疗

某些病毒、细菌等原核生物含有一类基因，其编码的酶能将原来无毒的药物前体转化为具有细胞毒性的代谢物而杀伤宿主细胞，这类基因称为“自杀基因”。这种特有的转换酶基因-自杀基因导入体内后，利用其产生的酶将无毒或低毒的药物前体转成细胞毒性代谢产物，从而杀死肿瘤细胞。近年来有关此类研究显示出良好的应用前景。目前常用针对肝癌基因治疗的有单纯病毒Ⅰ型胸苷嘧啶激酶/戊环鸟苷系(HSVTK/GCV) 和胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5Fc)等系统。有研究表明［3］，将“自杀基因”单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinease，HSVTK)转染肿瘤组织，则该细胞的HSVTK将前体药Gancyclovir(GCV)转化为对分裂细胞有杀伤作用的代谢产物，特异性杀伤肿瘤细胞，对肝细胞肝癌在体外有一定的疗效。Won等［4］通过单纯疱疹病毒将AFP反转剪接靶RNA构成酶导入肝癌细胞，取代HCC高效表达AFP的RNA残基，结果明显延缓肿瘤细胞生长并降低了细胞中表达AFP的RNA水平。

3免疫基因治疗

免疫基因治疗通过基因重组技术增强机体的抗肿瘤免疫功能而达到治疗肿瘤的目的。目前有基因疫苗免疫治疗、免疫刺激性因子免疫治疗、共刺激分子免疫治疗、活化的淋巴细胞进行过继免疫治疗、DC为基础的免疫治疗。基因疫苗指的是DNA疫苗，即将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。DC是体内最强专职抗原递呈细胞，能有效刺激静息的细胞，诱发初次免疫应答，还具有发动和调节抗肿瘤免疫反应的特性。薛刚等［5］应用IFNγ修饰的DC刺激T淋巴细胞，发现IFNγDC可促进T细胞增殖，并诱导T细胞向Th1分化。IFNγ的修饰可明显增强肝癌细胞抗原负载的DC所活化的T细胞对肝癌细胞的杀伤作用。由于IFNγ的修饰能促进DC成熟，增强DC促进T淋巴细胞增殖的作用，诱导细胞免疫，增强T细胞的细胞毒作用，使T细胞能有效地杀伤肿瘤细胞，将VEGFR和Tie 基因共同转染DC，不仅活化了特异性CTL，还可以阻止肿瘤新生血管生成，从而将肿瘤免疫治疗和抗肿瘤新生血管生成治疗有效结合起来［6］。

4抑癌基因治疗

到目前为止发现的抑癌基因有p53，转甲状腺基因及其他抗癌基因和Nras，Cmyc，Cest2，IGFⅡR以及CSF1等，在所有的抑癌基因中p53基因的突变率较高，它的失活会阻止细胞进入凋亡，从而使之处于持续分裂状态而增加突变及转化的概率。通过恢复或添加肿瘤细胞中失活或缺乏的抑癌基因，恢复抑癌基因的功能，从而抑制肿瘤的生长和转移，常用野生型p53、p16 等。p53基因的突变或者失活不仅使细胞本身周期失调具有致瘤性，并且可以影响细胞对其他凋亡信号如TGF的感受性下降。穆红等［7］使用p53cDNA的真核表达质粒p53pcDNA3对人源性肝癌细胞系HepG2进行转染，采用RNA原位杂交的方法证明了外源p53cDNA在HepG2p53细胞中的转染和转录，成功导入的p53cDNA可诱导HepG2细胞发生凋亡。p16基因也为抑癌基因，原发性肝癌中p16基因也常表现失活，p16基因能阻抑细胞生长于G1S期，但不诱发凋亡。p16启动子甲基化后，肝癌发生概率明显提高，尤其对于HBV感染者。

5抗血管生成基因治疗

肿瘤血管生成是肿瘤生长转移的关键步骤，是促血管生成因子和抑制因子作用失衡的结果。肿瘤血管生成是由肿瘤细胞和肿瘤浸润炎症细胞，如巨噬细胞或肥大细胞产生的促血管形成因子所介导的。恶性肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成，为了不断地获得氧和养料，肿瘤细胞就要不断的分泌促血管形成因子，不少细胞因子与肿瘤血管形成密切相关，因此，抑制肿瘤血管形成可以导致肝癌细胞衰退。肿瘤血管生成中最主要的是血管内皮细胞生长因子(VEGF)。有试验表明，用脂质体法转然反义RNA对抗血管内皮生长因子，能够抑制裸鼠的种植性肝癌的生长［8］。

6RNA干扰技术的应用

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，也称为基因沉寂疗法，是利用双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)诱发对宿主细胞特异性RNA转录的抑制，从抑制特异的基因表达的方法。利用 RNAi技术可同时阻断多个癌基因的转录表达，从而有效抑制肿瘤的生长，达到治疗肿瘤的目的。体外RNA干扰技术的主要特点在于其能利用细胞本身的成分，使外源重组干扰片断能持续转录，同时能以一种类似酶促方式对目标mRNA进行切割，从而形成高效、稳定而持久的干扰效应。尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)是一种在肝癌细胞中高表达的蛋白，参与机体的多种生理和病理过程，其表达水平与患者的生存呈负相关。李华等［9］构建针对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因siRNA真核表达载体pLXSNEGFPU6siTERT，以hTERT siRNA逆转录病毒为表达载体，感染HepG2细胞24、48、72 h后，端粒酶活性分别下降了23.84%、58.03%和85.01%( P＜0.05)，感染后24h细胞凋亡29.05%，肝癌细胞生长受到抑制，并存在一定量效和时效关系。除了上述介绍的六种比较经典的基因治疗方法外，近年又出现了一些新的基因治疗方法。有专家设想利用超声/微气泡介导目的基因进入靶组织的靶胞内［1011］，可以达到靶向性、可控性转导基因治疗的目的，有望成为有实用价值的临床基因治疗技术。不同的基因治疗策略联合应用可相互协同，常采用免疫基因和自杀基因的联合治疗［12］，在增强机体抗肿瘤免疫能力同时直接杀伤肿瘤细胞，达到根治肿瘤的目的。

7展望

目前肝癌的基因治疗策略已有很大发展，具有广阔的应用前景，而早期临床证据和临床实验表明，基因作为一种药物有重要的地位，将来的发展方向主要集中在下列几方面：①寻找转染效率高、基因容量高、毒性小的基因治疗载体。近年来，利用超声对比剂微泡作为基因载体并用超声技术处理，提高转染率已取得成功［1315］；②开发基因，实现可调控的基因转染系统，以期提高在肝癌组织中的表达阳性率，进行更加精确的基因治疗；③设计更具靶向性和安全性的基因转运系统，寻找肝癌特异转录调控元件，从而使外源基因能够持续、稳定和特异表达，真正实现肝癌的基因治疗从动物实验转向临床应用，将是肝癌基因治疗的主要研究方向。尽管还存在很多需要解决的问题，但随着分子生物学及相关学科的发展，我们相信肝癌的基因治疗终将会广泛地应用于临床。

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基因治疗的策略范文第4篇

1990年美国首次成功地进行腺苷脱胺酸（ adenosine deam inase， aDA）缺乏的基因治疗（ gene therapy）以来，基因治疗已成为当前生物医学中进展最快的领域之一［1］。基因治疗在脊髓损伤（ spinal cordIn-jury， sCI）后轴突再生中亦可望成为有效的手段之一［2—5］。利用外源基因在靶细胞（包括神经元）中的表达，以改变神经元某些内在特性，从而进一步探索 sCI后神经元的存活能力，再生特性和功能恢复的分子机理，最终为 sCI的治疗探讨新途径是目前治疗 sCI的研究方向。它有助于把 sCI治疗提到一个新的水平。值得我们进一步研究。

一、 sCI基因治疗有关分子生物学基础

基因转移（ gene transrer）是实现基因治疗的关键技术［6］。因此，基因治疗的首要步骤是转导基因的分子构建。一般转导基因由目的基因 cDNA，启动子／增强子和载体三部分组成。目的基因重组时除本身特有的（ cD-NA）序列外，通常还需进行必要的修饰，如转录起始修饰，翻译起始，内含子和聚腺苷酸化信号等的修饰。用于重组的启动子／增强子，一般有三种：强组成型（ strongconstita-tive），管家型（ housekeeping），及组织持异型启动子（ tissuesepcific），其中最常用为第一型［7］。理想的体内基因转移载体要求：转移具有细胞靶向性，导入基因的表达可调控，而且转移的方法简便易行。用于 sCI的基因转移载体主要是逆转录病毒载体（ retroviralvector），即乳腺病毒、莫罗尼小鼠白血病病毒和劳斯肉瘤病毒等。构建转录病毒载体的基本原理是：病毒的长末端重复序列（ longterrminalrepeat， lTR）可以对插入的外源基因进行有效转录，这样先在体外构建反转录病毒前病毒 dNA载体，即酶切去除基因组中的反式作用区域（ gag， polenv基因区域），产生缺陷型的反转录病毒，这种病毒只具有控制感染和整合的序列（即顺式作用区域）。缺陷型病毒载体必须依赖包装细胞提供的蛋白质才能完成包装，产生带有外源基因的伪病毒。它能感染受体细胞，载体 dNA将依靠其 lTR整合入受体细胞染色体基因组，这样外源基因被带入宿主细胞并得以表达［2、3、6、7］。逆转录病毒载体感染率高，最常用于体外间接基因治疗，其缺点是要求靶细胞必须有增殖和分裂特性［8］。此外， cao（1995）［9］等研究用阳离子脂质体直接注入 cNS作基因转移获得成功。但因阳离子脂质体对 cNS有毒性，故目前致力于发展非病毒技术，一种阳离子多聚体一聚乙烯亚胺（ polyetnyl－ enimine）业已用于基因转移［10］。另有 selle［6］（1993）等报道的复制缺陷腺病毒也是一种适用于神经系统的理想载体。

在 sCI治疗中，由于受体细胞要植入脊髓内，因此所用受体细胞应当符合一定的标准［4、6］：①容易获取和繁殖；②移植后能长期存活且能继续分裂和具有活力。③无免疫源性及形成肿瘤的危险。目前已用于 sCI试验有雪旺氏细胞（ schwann cell， sC）和成纤维细胞［2、3、11］。此外，肌母细胞也是具有应用前景的较好受体细胞，研究表明肌母细胞转移至 cNS至少可活6个月，且无肿瘤源性［12］。

基因治疗的实施，有赖于将目的基因准确、高效地转入靶细胞，并使之安全，高效和可控地表达。基因治疗中基因转移的策略主要有两种，即活体外法（ exvivo approach）和在体法（ invivo approach）。活体外法就是在体外先对适当细胞进行遗传修饰，使其表达和分泌特定的重组蛋白，然后将修饰细胞移植入活体神经组织，通过神经递质替代或神经营养因子（ neurotrophic factor， nTF）和／其它治疗因子的引入恢复正常的神经功能。这种方法尤其适于因缺乏 nTF或神经递质前体分子等可扩散物质所致的 cNS疾病。如帕金森氏病（ parkinson＇ s diesease， pD）及 cNS损伤。

在体法是利用适当的重组病毒或化学基因转移载体将目的基因及有治疗作用的重组蛋白直接转移，效率较低，故较少采用。此外，活体外法可采用自体的工程细胞移植，在体外可对高表达细胞克隆进行筛选，有效的控制移植细胞的数量和质量，应用立体定位和成像技术可以将工程细胞十分准确地移植到 cNS特定的区域内，以保证在局部产生高浓度的治疗因子。

二、基因治疗 sCI的现状和展望

基因治疗 sCI尚处于实验探索阶段。目前，主要是采用 nTF基因修饰雪旺氏细胞（ sC）或成纤维细胞后再将其植入鼠的脊髓损伤区，观察其轴突再生的情况［2、3、11］。 tuszyski（1994）［11］将 nGF基因导入培养的 sC内，再将 sC移植到损伤的脊髓，发现 sC在体内能稳定地表达 nGF并促进轴突的再生。同年 tuszynski等［2］利用来源于莫洛氏鼠白血病的逆转录病毒载体，将人的 nGF基因导入鼠成纤维细胞中，再将成纤维细胞移植到半横贯损伤的鼠脊髓中（ t7平面）。1年后成纤维细胞仍能表达 nGF，电镜及免疫组化（ cGRP）检查，发现有大量的脊髓轴突再生（感觉纤维）。1996年， tuszynski等［3］采用同样方法，又将 nGF基因导入成纤维细胞中，并将其移植到半横断损伤的鼠脊髓中（ t7平面），14月后，通过 rT— pCR技术鉴定成纤维细胞仍表达 nGF。电镜、免疫组化（ gFAP、 cHAT、 tH、5— hT， cGRP）检查发现有大量的（感觉和运动）轴突再生。作者在国际上首次构造 po—5＇— flanking介导的21.5KD髓鞘碱性蛋白微基因（暂命名为 pSVPoMcat）的基础上，通过阳离子脂质体导入 sC中，然后再将基因修饰的 sC移植入成鼠半横断损伤脊髓，观察其对 sCI的再生修复作用，现已发现 pSVPoMcat微基因修饰 sC对 sCI后细胞凋亡有抑制作用［13］。

基因治疗的策略范文第5篇

0引言

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis， UC)和克罗恩病(Crohns disease， CD)都属于炎症性肠病(inflammatory bowel disease， IBD)， 其发病可能由感染、遗传、免疫等多种因素相互作用所致. 传统观念认为通过基因转移替代缺陷基因的基因治疗只适用于致病基因明确的疾病， 目前慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病也被纳入了基因治疗的范围，可通过基因转移使机体表达免疫相关蛋白质， 从而下调致病的炎症和免疫反应， 上调保护性反应. 相对于囊性纤维化、重症联合免疫缺陷和肿瘤， IBD的基因治疗尚处于起步阶段. 本文就IBD的基因治疗作一概述.

1IBD的免疫病理机制和肠干细胞

CD的肠黏膜炎症以1型辅T细胞(Th1)型CD4+淋巴细胞占主导地位， 而UC则主要是由Th2型CD4+淋巴细胞介导的. 尽管CD和UC发生的机制并不完全相同，但最终的肠壁损伤均可归咎于巨噬细胞、粒细胞等炎性细胞及其产生的炎性细胞因子. 一方面， 淋巴细胞、巨噬细胞在肠道局部聚集并释放各种促炎细胞因子， 如TNFα，白细胞介素(IL)6，IL8，IL12，IL18等， 其中多数与疾病活动性呈正相关; 另一方面， 抗炎细胞因子如IL10，IL4，转化生长因子(TGF)β等的分泌相对不足. 这种促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间的失衡促进和加剧了肠壁的炎症反应. 细胞因子失衡可由Th1/Th2细胞比例失衡引起， 又可反馈性地加重Th1/Th2细胞失衡， 形成恶性循环， 因此被视为IBD发病机制中的重要环节. 肠上皮细胞不断更新， 衰老的细胞脱落至肠腔， 新的细胞则由位于肠隐窝底部的干细胞不断补充， 因此位于肠腺底部的干细胞成了基因治疗的最佳靶细胞. 但是肠干细胞缺乏明确的形态学特征或理化特性， 目前还无法与其它肠上皮细胞鉴别， 因此无法直接证明目的基因已成功转移至干细胞. 给予携带目的基因的载体后， 需要对干细胞成功地进行基因修饰， 肠上皮细胞才能持久稳定地表达目的基因. 腺相关病毒(AAV)载体能使肠上皮细胞于口服感染后1 mo内稳定高效地表达目的基因. 予免疫缺陷鼠静脉注射5型重组腺病毒(AD5)载体， 亦发现结肠上皮细胞长时间表达目的基因， 而消化道其他部位目的基因表达阴性. 肠道相关淋巴组织内的免疫细胞无疑是IBD基因治疗中最受关注的靶细胞， 但由于肠道黏膜上皮屏障的存在， 载体不能有效到达固有层. M细胞是存在于黏膜集合淋巴结滤泡顶部上皮中的一种特殊细胞， 其主要功能是将肠腔内抗原和病原体跨上皮转运至上皮下淋巴组织. 可利用M细胞能广泛摄取各种抗原物质的功能，及其与免疫细胞之间的对话方式， 通过M细胞将载体导入黏膜淋巴组织， 从而调节局部黏膜免疫反应和机体的系统免疫反应［1］. 有实验表明AAV载体能感染肠道固有层内细胞， 并使17%～19%的固有层细胞于感染后6 mo内持续表达目的基因.

2目的基因转移至胃肠道组织

实验表明［2］， 阻断小鼠肝动脉和门静脉后， 经眶后静脉丛予重组腺病毒载体， 30 min后恢复肝脏血供， 肠壁血管、血管周围组织和小肠绒毛持续表达目的基因达数周之久. 局部予经包装的质粒、脂质体、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和AAV载体均能将目的基因转导至肠道黏膜，且黏液溶解剂(二硫苏糖醇、N乙酰半胱氨酸)和蛋白酶体调节剂(MG101)能促进转导效率. 上述载体中， 以AAV载体系统的应用前景最广阔. 重组AAV(rAAV)载体去除了所有编码序列， 只保留145 bp的末端重复序列， 不含任何病毒基因， 感染细胞后，前病毒DNA定向整合至19号染色体的AAVS1区域. 在人类基因治疗的常用病毒载体中， rAAV是目前唯一没有引起宿主病理反应的载体［3］. 实验表明， 以AAV载体对空腹大鼠灌胃6 h后， 胃十二指肠和近端空肠固有层细胞开始表达目的基因， 并能持续稳定表达6 mo; 虽然未观察到结肠有目的基因表达， 但是可以推测灌肠能使目的基因被转导至结肠固有层细胞. 此外， 虽然没有直接证据表明AAV载体能感染肠干细胞， 但除固有层外， 肠上皮细胞亦表达目的基因1 mo. AD5是体内实验使用最多的载体， 该载体由于E1缺失造成病毒复制缺陷. 腺病毒载体可高效感染多种靶细胞， 对分裂期细胞和增殖停止期细胞均有很高的导入效率， 这是逆转录病毒载体所不具备的. 据报道， 经十二指肠饲管予大鼠E1缺失的重组腺病毒载体后， 目的基因能有效导入十二指肠、空肠和回肠上皮细胞. 以E1/E3缺失的重组腺病毒载体灌肠后， 结肠上皮细胞能高效表达目的基因. 而且炎症性肠病的基因治疗AD5载体感染IBD患者肠上皮细胞的效率远高于非IBD患者［4］. 但是经消化道予腺病毒载体主要感染的是更新速率很快的肠上皮细胞， 因此AD5载体转导的目的基因在肠道内的表达时间只能维持数天， 为达到治疗IBD的目的， 需反复给药， 同时还要避免机体的免疫反应. 有报道称， 经尾静脉注射重组腺病毒载体后， 免疫缺陷小鼠结肠上皮细胞和隐窝细胞可长时间表达目的基因， 而消化道其他部位无目的基因表达. 该实验结果非常诱人，但由于E1缺失造成病毒复制缺陷， AD5载体不能像逆转录病毒载体一样整合至宿主基因组.

3IBD基因治疗的策略和研究现状

3.1下调促炎细胞因子的表达IL18是一个多功能细胞因子， 结构类似IL1家族， 能活化T淋巴细胞内的核因子(NF)κB和激活蛋白(AP)1， 与IL12诱导的STAT4协同促进T 淋巴细胞表达干扰素(IFN)γ［5］. 此外， IL18还通过上调TNFα，IL6和IL1的表达加剧炎症反应. 以IL18结合蛋白(IL18BP)治疗三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠结肠炎， 可减轻肠道炎症. 鉴于IL18在CD中的重要作用， Wirtz等［6］尝试以IL18为靶点对CD动物模型进行基因治疗. 构建表达IL18反义寡核苷酸的重组腺病毒载体， 予移植CD4+ CD62L+T淋巴细胞形成的CB.17SCID小鼠结肠炎模型灌肠. 蛋白质印迹分析显示表达IL18反义寡核苷酸的重组腺病毒载体能抑制结肠组织产生IL18， 实验组结肠炎的内镜和组织病理学改变均较对照组明显改善. 此外， 该实验还观察到局部给药方式只抑制结肠固有层单核细胞产生IFNγ， 而不影响来源于脾脏的单核细胞.

3.2上调抗炎细胞因子的表达IL10能抑制巨噬细胞活化和分泌IL1α， ILβ， IL6， IL12， IL18和TNFα等细胞因子， 下调人类白细胞抗原(HLA) Ⅱ类分子的表达; 通过影响抗原递逞细胞功能而强烈抑制CD4+ T淋巴细胞的增殖和分泌细胞因子. 此外， 其还能直接抑制T淋巴细胞产生IL2，TNF 和IL5. IL10基因敲除小鼠可自发形成Th1型淋巴细胞介导的结肠炎. IL10对IBD动物模型有效， 对CD患者的临床实验结果却不令人满意， 其原因可能是肠道局部IL10浓度过低， 起不到抑制炎症的作用， 而加大剂量又会伴随严重不良反应; 也可能是因为IL10半衰期太短所致. 一些研究小组尝试以不同的给药方式(灌肠、经静脉和经腹腔) 评估AD5 IL10对IBD动物模型的预防和治疗作用，结果显示AD5 IL10能预防实验性结肠炎的发生; 静脉给药的血IL10浓度显著高于腹腔给药，但并不能显著提高结肠局部IL10浓度; 灌肠给药的结肠局部IL10浓度高于静脉给药［7-10］. 虽然这些研究没有得到预期的结果， 但至少证明以病毒载体表达细胞因子在IBD 基因治疗中是可行的. 与IL10一样， IL4也具有抑制巨噬细胞产生TNFα，IL1等促炎细胞因子的作用. 此外， 作为Th0细胞向Th2细胞分化的主要诱导因子， IL4可调节Th1/Th2细胞平衡，缓解结肠炎症，但有研究［11］显示IL4抗体能下调SAMP1/Yit鼠IFNγ的表达并明显缓解肠道炎症， 而移植分泌IL4的Th细胞可诱导SCID小鼠发生肠炎.

转贴于 因此， IL4在肠道免疫中可能并非仅起抗炎作用， 其在人类IBD中的确切作用尚有待确定. TGFβ作为一种抗炎细胞因子在肠道免疫平衡中发挥重要作用， Kitani等［12］研究了TGFβ1质粒在TNBS 诱导的结肠炎中的作用，结果显示鼻内一次给药可预防和治疗实验性结肠炎， 而腹腔给药无治疗作用. 肠固有层和脾脏持续2 wk表达TGFβ1 mRNA， 并同时出现产生TGFβ1的T淋巴细胞和巨噬细胞， 且并不引起肠道、肺、脾、肝、肾发生纤维化. TGFβ除抗炎作用外， 在组织纤维化， 特别是病理性纤维化中也起重要作用. TGFβ1经蛋白激酶C和细胞外信号调节激酶1/2丝裂原活化蛋白激酶通路促进CD患者肠道成纤维细胞产生纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原和结缔组织生长因子［13］. Vallance等［14］以表达TGFβ1 的重组AD5载体灌肠， 导致小鼠结肠发生纤维化， TNBS诱导的结肠炎恶化并加速肠壁纤维化进程.

4展望

基因治疗为目前无法治愈的疾病提供了希望， 上述临床前试验为IBD的基因治疗勾勒出了诱人的前景. 分子生物学的不断发展将使高效、特异性地下调基因表达成为可能. RNA干扰是一种在生物体内普遍存在的、在RNA水平调节基因表达的方式， 双链RNA能高效、特异性地诱导与之同源的mRNA降解. 有报道称局部给予针对TNFα的小干扰RNA能有效缓解胶原诱导的关节炎症［15］. 综上所述， 虽然IBD的基因治疗研究已取得了令人鼓舞的成绩， 但仍应认识到基因治疗在IBD中尚处于起步阶段， 在应用于临床之前还有很长的路要走.

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