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关键词:脂肪酶;固定化方法;生物柴油;吸附法;共价结合法;交联法
中图分类号:Q814 文献标识码:A 文章编号:1009-2374(2011)36-0078-02
一、脂肪酶及固定化脂肪酶研究现状
(一)脂肪酶简介
脂肪酶又称三酰基甘油酰基水解酶,是一类可以催化甘油三酯合成和分解的酶的总称,普遍存在于动、植物和微生物中,是一种专一、高效的生物催化剂。工业化的脂肪酶主要有动物脂肪酶(主要来动物的胰脏)和微生物脂肪酶。
(二)固定化脂肪酶研究现状
固定化酶是在1971年美国Henniker New Hampshire举行的酶工程会议上首次提出的,定义为酶用物理或化学方法固定在空间的一个特定区域保存酶的催化活性并且可以重复和连续使用。
早在20世纪90年代末,日本大坂政科技研究所对固定化脂肪酶催化转酯化植物油脂做了大量研究,并进行了初步工业化设计。利用丹麦诺维信(Novozymes)公司生产的固定化假丝酵母脂肪酶Novozym435,Y. Shimada等成功利用三步法(即每次分别加入1/3计量的甲醇)在30℃下反应48h,转化率达97.3%。
近几年,将酶固定化,使反应后酶可回收和多次重复利用,则有可能降低酶的使用成本,促进酶法合成工艺在酯交换反应制备生物柴油生产中的推广应用,然而在这方面国内仅有少数成功报道。
二、酶的固定化方法
酶的催化作用主要由其活性中心完成,酶蛋白的构象也与酶活性密切相关。因此酶的固定化应尽量在温和条件下进行,以避免酶蛋白的高级结构遭到破坏。
(一)吸附法
利用酶与载体吸附剂之间的非特异性吸附作用,将酶固定在吸附剂上。它分为物理吸附法和离子吸附法。物理吸附作用的因素有:范德华力、氢键、疏水作用和静电作用等。此法的优点是操作简单,处理条件温和,对酶的损害作用小。但同时也存在酶与载体相互作用力弱,酶易脱落等缺点。离子吸附法是酶通过离子键吸附于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。
(二)共价结合法
酶以共价键结合于载体的固定化方法。此法或是先将载体有关基团活化,然后与酶的有关基团发生偶联反应;或是在载体上接上一个双功能试剂,然后将酶偶联上去。活化与偶联的方法多种多样,主要有重氮化法、溴化氰亚胺碳酸基法、芳香烃基化法等。与载体共价结合的酶的功能基团包括氨基、羧基、羟基、酚基等。由于酶与载体结合较牢固,酶不易脱落,稳定性好,在固定化酶的制备方法中此法研究最为活跃和深入。
(三)交联法
利用双功能或多功能试剂,使酶分子之间发生交联,凝集呈网状,而成固定化酶,戊二醛是应用最广的双功能试剂。此外,可用作交联剂的还有双重氨联苯4,4-异硫氰二苯基-2,2-二磺酸、甲苯-2-异氰酸-4-异硫氰酸等。此法与共价结合法一样,也是利用共价键固定酶,不同的是它不使用载体,交联法广泛应用于酶膜和免疫分子膜的制备,操作简单,结合牢固。
(四)包埋法
将酶分子包埋于凝胶的网眼中或半渗透的聚合物膜腔中,以达到固定化酶的方法。包括网格型和微囊型两种,网格和微囊的结构可以防止酶渗出到周围介质中,但底物仍能渗入到网格或微囊内与酶接触。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应,很少改变酶的高级结构,酶活回收率较高,因此可应用于许多酶、微生物和细胞器的固定化。
三、固定化脂肪酶的应用
(一)催化水解反应
油脂水解是将作为基质的油脂制成不均匀状,使之与水良好的接触,并采用催化剂来得到在两相间具有亲合性的化合物。一般认为,脂肪酶能够吸附在水-油两相的界面上,并在此相互作用。
(二)催化醇解反应
油脂的醇解反应,亦即油脂的甘油解反应。脂肪酶催化甘油解反应主要是利用三甘酯来制备单甘酯和双甘酯,通过加入特定的脂肪酶和控制反应条件可以获得不同量的单甘酯和双甘酯。
(三)催化酯化反应
脂肪酶可在水溶液中催化油脂的水解反应,也可在有机介质中催化酯化反应。张军等研究比较了14种不同来源的脂肪酶催化油酸油醇酯的合成,其中假丝酵母1619脂肪酶酯化能力最强,探讨了以硅藻土为载体固定化假丝酵母1619脂肪酶催化油酸油醇酯合成的最适条件,反应中去水,可使终酯化率提高到99%。
(四)催化转酯反应
天然脂肪酶的功能是使三甘油酯进行催化水解反应,但与许多其他的生物过程一样是可以转换的,脂肪酶在非水介质或无溶剂体系中也能催化酯的转酯化反应。
四、固定化脂肪酶催化剂在生物柴油上的应用
(一)生物柴油的制备方法
生物柴油是长碳链脂肪酸单酰酯类物质,主要是甲醇或乙醇等短碳链醇和脂肪酸或者甘油三酯经过酯化或者酯交换来生产。目前,合成生物柴油的主要方法是转酯化法,即动、植物油脂与短链脂肪醇在酸、碱或酶催化剂、或超临界条件下发生转酯化反应,生成相应的脂肪酸单酯和甘油,再经洗涤干燥处理即得相应产品生物柴油。
(二)固定化脂肪酶在制备生物柴油上的应用
酶法催化合成生物柴油,对原料品质没有特别要求。酶法不仅可以催化精炼的动植物油,同时也可以催化酸值较高且有一定水分含量的餐饮废油转化成生物柴油。酶法反应具有条件温和,副产品分离工艺较为简单,废水少,设备要求低等优点,日益受到人们的重视。刘志强等采用分步加醇脂肪酶催化菜籽油制备乙酯生物柴油,在醇油摩尔比5∶1,催化剂加入量10wt.%(油重),正己烷加入量15wt.%(油重)反应温度40℃,反应时间30h,甲醇分三次加入的条件下,最终测得酯交换转化率达93%。
近几年,随着石油资源的逐渐枯竭和公众环保意识的增强,可再生的绿色环保型燃料――生物柴油,受到许多国家的重视。化学法合成生物柴油的技术已经比较成熟,并且已经有了广泛的应用,但化学法合成生物柴油存在工艺复杂、醇消耗量过大,产物不易回收,环境污染大等缺点。而酶法制备生物柴油具有反应条件温和、醇用量小、产物易收集、对环境污染小等优点,固定化技术的运用为实现生物柴油工业化生产迈出了坚实的一步,其许多方面的优点都优于游离酶技术,但时至今日工业化实例仍然很少,最主要的原因是廉价、制备方法简单、活化效果好的固定化载体尚未找到。目前还只处在工艺探索阶段,但酶法合成生物柴油由于其特有的优点,一定有良好的工业化应用前景。
参考文献
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关键词:微藻 污水净化 生物柴油
引言
在化石燃料日益枯竭、环境污染逐渐威胁人类生存的今天,清洁的可再生能源开发成为各国研究的重点。生物质能是绿色植物通过光合作用将太阳能转化为化学能而贮存在生物质内部的能量,它是世界各国都在重点研究开发的可再生能源之一。生物柴油作为较成功的替代型燃油,目前在世界各国得到了大力发展,已成为国际上发展最快、应用最广的环保型可再生能源。然而,制约生物柴油产业化生产的主要问题是成本高,据统计生物质柴油制备成本中75%是原料成本。因此,寻求充足而廉价的原料供应及提高转化率从而降低生产成本是生物质柴油能否实用化的关键。微藻作为最低等的、自养的放氧植物,种类繁多、分布广泛。研究发现,部分微藻中含有相当可观的油脂类物质,可以直接提取微藻油,可用来生产生物柴油。与其他油料作物相比,利用微藻培养生产生物柴油占地面积最小,还可利用滩涂地、荒废地等非耕地,不会对粮食作物的生产造成威胁。因此,利用污水培养能源微藻,在净化水质的同时实现清洁能源生产,缓解人类面临的水资源短缺和环境污染问题具有重要的现实意义。
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微藻生物柴油研究现状
1.1 国外微藻生物柴油研究现状
世界上以发展生物柴油产业为目的进行大规模利用微藻制取生物柴油的研究始于20世纪70年代末。1978年,美国能源部国家可再生能源实验室(NREL)启动了利用微藻生产生物柴油的水生生物种计划项目(Aquatic Spices Program,简称ASP项目),进行从微藻筛选、微藻生化机理分析、工程微藻制备到中试研究。该项目持续到1996年,研究人员经过多年的研究,从美国西部地区和夏威夷采集、分离到了3000株微藻,并从中筛选出300余株具备潜力的产油藻种,对其中生长速度快、油含量高的微藻,进行了中试放大,获得工程微藻,含油量达到40%~60%。从1990年~2000年,日本国际贸易和工业部启动了“地球研究更新技术计划”的项目,利用微藻进行二氧化碳生物固定,并着力开发密闭光合生物反应器技术,通过微藻吸收火力发电厂烟气中的二氧化碳来生产生物质能源,筛选出多株耐受高二氧化碳浓度、生长速度快、能形成高细胞密度的藻种,建立了光合生物反应器的技术平台以及微藻生物质能源开发的技术方案,提出了利用绿藻将二氧化碳转化为石油的设想。
进入21世纪,石油价格的大幅上扬极大的刺激了微藻生物柴油技术的研究。2006年,美国绿色能源科技公司在亚利桑那州建立了可与1040兆瓦电厂烟道气相联接的商业化系统,成功地利用烟道气的二氧化碳,大规模利用光合成培养微藻,并将微藻转化为生物柴油,其产率达到5000~10000加仑/年・英亩。2007年,由美国能源部圣地亚国家实验室联合美国国内多家实验室宣布了由国家能源局支持的“微型曼哈顿计划”,计划在2010年实现微藻制备生物柴油的工业化。同年,Shell公司与美国从事生物燃料业务的HRBiopetroleum公司组建Cellena合资公司,投资70亿美元开展微藻生物柴油技术的研究。美国第二大石油公司Chevron与美国能源部可再生能源实验室协作研究微藻生物柴油技术。美国PetroSunDrilling公司不断完善其开放池系统,计划到2010年达到年产生物柴油500万吨。美国能源局计划在各项技术全面进展的前提下,将微藻产油的成本于2015年降至2~3美元/加仑。2007年,荷兰AlgaeLink公司成功开发出了新型微藻光生物反应器系统。
1.2 国内微藻生物柴油研究现状
随着生物柴油开发的兴起,我国一些科研机构及企业也开始关注产油微藻的研究和开发,在利用微藻制备生物燃料的研究上也取得了很大进展。2004年,清华大学生物技术研究所缪晓玲教授利用异养生长(利用外加的葡萄糖生长)的产油小球藻进行了密闭培养、提油和生物柴油加工研究,在技术上证明是可行的。通过异养转化细胞工程技术获得了高脂含量的异养小球藻细胞,其脂含量高达细胞干重的55%(质量分数),是自养藻细胞的4倍,并利用酸催化醋交换技术一步得到符合ASTM的相关标准的生物柴油。清华大学还开发了微藻异养发酵生产生物柴油技术。通过细胞控制技术获得异养小球藻,其细胞中油脂类化合物大量增加,蛋白质含量下降。实验室研究结果表明与常规制备技术相比,成本下降5~8倍,油脂质量分数达99%以上。
中国科学院所属相关单位承担过多项国家及省部级微藻育种和生产的研究,培养了一支经验丰富的微藻生物技术研发队伍。在产油微藻的研究方面,目前已有水生生物所、武汉植物园、过程工程研究所、南海海洋所、青岛海洋所等单位开展了选种、育种、大量培养、收集和提油等研究,并积极开展与我国大型石油化工企业的合作,试图开辟适合我国国情的微藻生物柴油产业化道路。目前微藻生物柴油生产正由实验室转向小规模工厂化生产。中国水产科学研究院、中科院海洋研究所等单位于2005年以来,经过2年来的努力,建立了化学法和脂肪酶法生产生物柴油关键技术与工艺路线,生物柴油的纯度达到98%以上,并对海藻油脂的制备进行了研究。此外,山东海洋工程研究院、抚顺石化研究院均已开展微藻利用的探索,在微藻筛选和培育方面进行了深入研究,目前都已取得一定的成果。闵恩泽院士近年来进人绿色化学领域,积极倡导开展微藻生物质燃料的研究,2009年,中石化与中科院的合作项目“微藻生物柴油成套技术”正式启动。阂恩泽院士指出:从微藻转化为生物柴油的过程中,微藻是基础,光反应器是转化关键,要自始至终加强战略研究。中国科学院与中国石化合作开发的微藻生物柴油技术,近期内将要完成小试研究,预计到2015年前后将要实现户外中试装置研发,远期计划将要建设万吨级工业示范装置。
2 利用污水大规模培养微藻生产生物柴油关键技术和方法
2.1 关键技术环节及流程
利用污水大规模培养微藻生产生物柴油技术是一个复杂的系统工程,主要包括能源微藻的筛选与培养技术、藻细胞富集分离与采收技术、藻细胞破碎与油脂提取技术和微藻油脂生物柴油转化技术等四个关键技术环节。
其技术流程如下图所示:
2.2藻株分离与纯化
培养微藻,首先要从天然水体中分离出所需要的“单种”或“克隆”,研究人员根据各自的经验和习惯,创造了各式各样的藻种分离、筛选的方法,最常用的方法有微吸管分离法、水滴分离法、微细吸管法、固体培养基分离法、样品系列稀释法等。
2.2.1微细吸管法
原理:在无菌操作条件下,用极细的微吸管,在显微镜下把目标藻样从一个玻片移到另一个玻片,采用同样的方法反复操作,直到镜检水滴中只有目标单种为止。微吸管分离法容易找到特定的藻种,设备比较简单,但操作技术难度较大,适于分离个体较大或丝状的藻类,如螺旋藻、骨条藻等。
操作过程:在微吸管的顶端套一条长约8cm的医用乳胶管,分离操作时,用手指压紧乳胶管以控制吸取动作。将分离的水样置于载玻片上,在显微镜下把微吸管口对准要分离的藻细胞,放松手指,藻细胞被吸入微吸管;接着把吸出的水滴放在另一载玻片上,显微镜检查水滴中是否只吸到藻细胞,经过如此再反复操作,直至达到单种分离的目的。然后把分离出的藻细胞冲入预先装有培养液的试管内,放在适宜的光照下培养,试管有藻色后镜检,培养为单种的试管,其他不合格的弃掉。
2.2.2水滴分离法
原理:在无菌操作的条件下,把要分离的藻样用微吸管在玻片上滴成大小合适的小水滴,镜检水滴中只有一个要分离的单种,即可冲入试管培养。该分离法的关键是藻样稀释要适宜(稀释至每个水滴约有1―2藻细胞),水滴大小适宜,以在低倍镜下能看到水滴全部或大部分为宜,并且观察要准确、迅速。
操作过程:用小烧杯装稀释的藻样,将微吸管插入藻样中,提取微吸管,让多余的藻液滴出,然后把管口与消毒过的载玻片接触,即有一个小水滴留在载玻片上。一个载玻片滴3―4滴,间隔一定距离,然后在显微镜下观察。若一个水滴中只有一个需要分离的藻细胞(无其他生物混杂),即用移液管吸取培养液把该水滴冲入试管中,试管口塞上棉塞,放在适宜的条件下培养。
2.2.3平板分离法
平板分离法也就是固体培养基分离法,作为微藻分离用的固体培养基,是在常规的液体培养基中加入一定量的琼脂(1.0%-2.0%),并且使其溶解和高温高压灭菌后,通过适当的方法,把要分离的藻样接种在培养基上,通过一定时间的培养,在培养基上长出单个的藻落而达到分离的目的。用琼脂做的固体培养基的分离方法并不适合所有的微藻,大多数的绿藻都可以在这种培养基上生长,从而达到单种分离的目的,但有的微藻在琼脂培养基上生长较差,甚至不能生长。固体培养基分离法工作较繁琐,工作量大,但分离单种成功的几率较高。
根据接种方法的不同又可分成划线法、喷雾法。划线法是把接种环在酒精灯上灭菌后,蘸取藻样轻轻在培养基平面上做第一次划线3-4条,把培养皿转动约70°角,并把接种环在酒精灯上灭菌,通过第一次划线区做第二次划线。用同样的方法做第三、第四次划线。由于第一次划线接种环上的藻细胞比较多,在第一划区藻细胞可能密集不能分离开,但通过后面的划线可能分离出单独的藻类群落。喷雾法是首先用把要分离的藻样进行适当的稀释,然后装入消毒过的医用喉头喷雾器中,打开培养皿盖,把藻样喷射到培养基平面上,使藻样在培养基表面上形成分散均匀的一层薄水珠。培养基上接种好之后,放在适宜的光照、温度下进行培养,经过一段时间的培养,在培养基上长出藻类群落,通过显微镜检查后,用纤细的解剖针把单个的目标藻落连同一小块培养基取出,移入装有培养液的试管中培养,待试管中有藻色后镜检,如无其他生物混杂,达到了单种分离的目的。
2.2微藻的规模化培养
2.2.1影响因素
微藻能源利用是以大量的微藻原料的获得为前提的。高密度、高效率、低成本、易放大的培养系统是微藻能源领域的研究重点之一。微藻生长受到非生物因素(包括营养、O2浓度、CO2浓度、光照、温度、pH、盐分、培养液中的有毒成分等)、生物因素(包括真菌、细菌、病毒、及其他生物等的污染)以及操作因素(包括搅拌产生的剪切力、收获方式等)的影响。因此,微藻培养系统的设计,需要充分考虑微藻的生长条件、气候条件(光照、温度、湿度等)、资源情况(土地、水等)、投资成本、运行成本等各种因素。
2.2.2培养方式
目前藻类培养主要包括自养和异养两种方式。微藻的自养培养系统大致可分为两种:即利用开放式户外池塘或封闭式光生物反应器。这两种培养方式的比较如表1所示。开放式户外池塘可以分为跑道式、圆池式和斜坡式等。封闭式光生物反应器包括柱式、管式、板式及一些其它特殊类型。循环跑道式户外池塘是当前微藻商业化养殖最主要的培养系统。
微藻异养培养,可采用传统的发酵装置进行培养,不需要光照,生长速度快,可缩短培养周期。但异养培养微藻不仅不能固定CO2,反而会排放出CO2,还需要外加有机碳源,培养成本高,失去了自养培养的优点,难以在实际生产中获得竞争优势。
2.3微藻的分离采收
微藻采收是微藻规模化培养和工业化应用的重要环节,然而,由于微藻及其培养液的特殊性,传统的固液分离技术都无法直接用于微藻采收。因此,国内外针对微藻的采收一般都先对藻液进行预处理,而后再进行富集分离。
2.3.1藻液预处理
关键词:地沟油;超临界水;水解;混合脂肪酸;管式反应器
1 超临界水的特性
超临界水与普通水在结构形态上不同,是一种介于液体和气体之间的特殊状态,具有液体的特性,同时也具有气体的特性。可作为特殊的溶剂或利用其特殊的物理化学特性,进行特殊的化学反应。主要是水中氢键的变化,伴随着密度、介电常数、电导率、扩散系数、粘度和溶解性能等其它性质的变化,使得超临界水的特性都不同于普通水。超(近)临界水所表现出的极性或非极性溶剂的特性,使得其对有机物的溶解能力增强,使水中的有机反应可以在均相条件下进行。
如上图所示:
水的临界点:温度Tc=647.5K,临界压力Tp=22.05Mpa,临界密度Tρ=322kg/m3
超临界区:温度大于647.5K,压力大于22.05MPa
近临界区:温度大于500K,压力大于13.6MPa
2 油脂超临界水解反应
水解反应是非常重要的有机化学反应。油脂的水解是制造天然脂肪酸和甘油的重要途径。通常是强酸碱作催化剂,在反应釜或水解塔中进行,反应时间很长,反应周期为5~16h,水解率不高,工艺后处理较难,并且酸碱对环境污染很大,对设备耐腐蚀性要求很高。
由于超临界水对油脂的水解具有很强的反应催化作用--在超(近)临界水中,不使用其他任何催化剂,也能够迅速的发生水解。反应时间为60~100s。油脂的超临界水解反应一般在临界点附近的近临界区和超临界区进行。
本文着重研究在管式反应器中,地沟油在超临界水的作用下,水解制取脂肪酸的最佳工艺条件。
3 工艺流程
(一)地沟油预处理水解粗制混合脂肪酸精馏精制脂肪酸
(二)工艺流程说明
(1)地沟油预处理:由于地沟油酸值较高,且杂质(机械杂质、脂溶性胶质)含量较多,故多采用磷酸脱胶水洗法:在地沟油中添加30%左右的水,加热到85-90℃,开启搅拌,缓慢滴加磷酸至pH值2-3,搅拌20-30分钟后,加入0.5%的工业用盐,再搅拌20分钟后静置分层,将下层废水(含磷脂)排掉。上层清油水解制取粗混合脂肪酸。
(2)地沟油水解:经过预处理后的地沟油和水分别经过流量计,进入混合泵,再经过高压泵进入管式反应器,反应后进入换热器,再经过背压阀,进入旋流膜分离器,分离为水相和油相,水相可以提取甘油,油相为粗混合脂肪酸,粗脂肪酸经过精馏得精制脂肪酸。
4 结果讨论(附表)
(1)反应条件:最佳温度280℃,最佳压力30Mpa,最佳油水比7:3;
(2)水解率:98%;
(3)脂肪酸收率:95%。
5 结论
超(近)临界水与普通有机溶剂相比,有很多突出优点。本文通过超临界态水解原理与连续管式反应器相结合,提出了全新的油脂水解工艺。并且通过超临界管式连续水解反应设备,得到了预期的目标。即反应最佳条件:最佳温度280℃,最佳压力30Mpa,最佳油水比7:3。水解率98%,脂肪酸收率95%。
本工艺环境友好,不产生任何环境污染,并且油脂水解率高,脂肪酸收率大,反应时间短(60~100s)等优点。因此,设备可以小型化连续生产,每天生产一吨脂肪酸的模块化设备为4米×2米×4米。本工艺、设备是地沟油原料工业化的比较适用的工艺。
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(33)紫苏蛋白提取工艺的优化研究 李晓鹏 张志军 李会珍
(36)豆渣蛋白的制备及其性质研究 徐赏 华欲飞 张彩猛
(40)alcalase2.4l酶解核桃分离蛋白制备ace抑制肽的工艺研究 朱振宝 周慧江 易建华
(45)茶籽蛋白的营养价值评价 张新昌 刘芳 宋亚蕊 刘娟
油脂化学
(48)无溶剂体系中酶促合成中碳链甘三酯 马传国 仝莹莹 王向坡 王业涛 柴小超
(52)圆红冬孢酵母发酵玉米秸秆水解液产油脂的研究 刘泽君 张金禄 刘玲 李贞景 陈勉华 王玉荣 李风娟 罗成
(56)微藻油脂生物合成与accase、pepc相关性的研究进展 王琳 余旭亚 赵鹏 徐军伟
油脂化工
(61)从元宝枫油中提取神经酸并制备生物柴油的技术研究 史宣明 陈燕 张骊 夏辉 鲁海龙 孟佳 韩少威
(66)低温脂肪酶酶促酯交换制备生物柴油 张学林 唐湘华 李俊俊 宋拓 慕跃林 许波 杨云娟 黄遵锡
(69)樟树籽仁油合成癸/月桂酰基谷氨酸钠工艺研究 曾哲灵 王林林 郑菲 奚光兴
综合利用
(73)胺甲基化与柱层析法制备高活性天然α-生育酚 李海洋 蒋平平 董玉明 印建国 姚培军
(77)α-亚麻酸不同富集纯化方法的比较 周端 王晓宇 李道明 赵锐洋 高峻岭 王博
(81)米糠蛋白的综合研究进展 朱磊 汪学德 于新国
检测分析
(84)核桃仁碱液去皮过程中营养功能成分动态变化 吴世兰 秦礼康 蒋成刚 张帅
(88)沙枣种子油的理化性质及其清除自由基能力研究 张娜 艾明艳 刘丽 冯华安
骆娜 向进国
应用技术
(92)降低大豆压榨生产成本途径 左青
(94)植物油厂废水处理技术与应用 赵宇 闵芳权