回交的遗传学效应

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回交的遗传学效应范文第1篇

关键词：水稻；耐盐性；QTL；克隆；分子育种

中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）05-0050-03

Abstract：Salt stress is one of the main environmental constraints for the losses of rice yield. In this paper，we introduced the mechanisms of rice salt-tolerance by the following three aspects. We also briefly presented the three methods for identifying rice salt-tolerance，which specifically refer to biological and agronomic salt resistance，as well as the response of in vitro cells to salt stress. Then we summarized the progresses of mining salt-resistance rice germplasm resources，mapping the QTLs conferring salt-tolerance，cloning slat-tolerant genes of importance and breeding salt-tolerant rice varieties. Finally，we discussed the prospects of rice salt-tolerant mechanism research and their applications in practice，which might provide an important reference for further studies of salt-tolerance in rice.

Key words：Rice；Salt-tolerance；QTL；Genetics and breeding

土壤盐碱化是特定区域影响水稻生产稳定发展的主要限制因素[1]，水稻在盐碱地种植一般都会减产，严重时甚至不能正常生长。我国盐碱土地约有2 000万hm2[2]，通过合理的水土管理和化学改良措施可以减轻盐害对水稻的影响，但其见效慢且难以实现。因此，培育耐盐水稻品种，深入开展水稻耐盐性遗传研究，进一步改良水稻的耐盐性，是确保我国盐碱稻作区粮食安全生产的有效途径之一。本文对水稻耐盐的遗传基础、遗传机制、耐盐性QTL鉴定和重要基因的克隆以及耐盐水稻的选育进行了综述和展望，为进一步深入开展水稻耐盐性相关研究提供参考。

1 水稻耐盐性遗传基础

水稻的耐盐性遗传基础十分复杂，是受多基因控制的，为典型的数量性状遗传，且受环境影响很大[3]。Jones等[4]研究表明水稻苗期耐盐性是受少数几个基因控制的，以加性效应为主，没有发现上位性互作。Albar等[5]研究表明水稻根长等性状主要表现为显性效应，且遗传力较低，而水稻茎叶干重、根部干重和苗期苗高等主要表现为加性效应为主，遗传力较高。前期研究均认为，水稻耐盐性主要由加性效应和显性效应决定，遗传力较低，受环境影响较大。一般情况，双亲杂交后F1耐盐性介于双亲之间，几乎不发生超亲分离现象。Guo等研究发现，在突变体中存在单基因控制耐盐性遗传的现象[6]。

2 水稻耐盐性遗传机理

耐盐性是指水稻在田间盐分胁迫条件下正常生长和发育的能力。当植物处于高盐条件时，植物不能正常摄取外界的水分，导致植物的生长缓慢，称为渗透效应。同时，当盐离子进入呼吸链，盐离子在叶片细胞中大量积累时，从而导致植物的生长延缓，称谓盐胁迫的离子效应[7]。水稻对盐胁迫时反应主要包括：保护细胞膜、积累大分子蛋白、渗透调节和离子的区隔化等。

3 水稻耐盐性的分子基础

3.1 水稻耐盐性的QTL鉴定 近年来，随着生物技术的的快速发展，为水稻耐盐性基因的挖掘和研究提供了良好的契机。利用分子标记技术，目前鉴定的水稻耐盐QTL已有70多个，分布于水稻12条染色体上，定位耐盐性较多QTL的位于水稻第1、2、6和7号染色体上。Zang等利用回交导入系群体共鉴定了13个影响水稻耐盐性的QTL[8]。汪斌等鉴定了1个耐盐突变体，通过分子标记技术，将该基因定位在遗传距离约2.3cM区域内[9]。Zhang等利用分离群体将1个耐盐相关QTL定位在水稻第7染色体上[10]。林鸿宣等将一个与幼苗存活天数相关的QTL定位在水稻第5染色体上[11]。龚继明利用构建的DH群体检测到1个主效QTL和7个微效QTL[12]。Lin等利用F2∶3群体，鉴定11个影响8个耐盐相关性状的QTL[13]。顾兴友等通过构建的BC1群体，鉴定了12个影响成熟期耐盐性QTL，4个苗期耐盐性QTL[14]。Prasad等鉴定了7个耐盐性的QTL[15]。汪斌等利用构建的重组自交系群体鉴定了13个耐盐相关的QTL[16]。Koyama等鉴定了11个与耐盐性有关的QTL[17]。孙勇等利用构建的回交导入系群体鉴定了23个水稻苗期耐盐相关性状QTL[18]。Lee等利鉴定了2个耐盐性的QTL[19]。

3.2 水稻耐盐性基因的分离和功能解析 水稻耐盐性的性状遗传基础比较复杂，目前分离的耐盐性相关的基因还相对较少。Huang等从通过图位克隆的技术分离了一个水稻耐盐基因DST，基因作为抗逆性的负调控因子，它编码含一个C2H2类型锌指结构域的蛋白质，是一个新型的核转录因子。研究表明，DST作为抗逆性的负调控因子，当其功能缺失时可直接下调过氧化氢代谢相关基因（如过氧化物酶基因）的表达，使清除过氧化氢的能力下降从而增加过氧化氢在保卫细胞中的累积，促使叶片气孔关闭，减少了干旱胁迫下水分的流失和盐胁迫下Na+进入植株体内，从而提高水稻的耐旱性和耐盐性[20]。Hu等从cDNA文库中分离了1个耐盐基因SNAC1，该基因编码一个NAC（NAM，ATAF and CUC）转录因子，它的过表达可以上调与胁迫相关多个基因的表达。过量表达SNAC1的转基因水稻，耐旱性显著提高，同时在营养生长时期水稻的耐旱性和耐盐性显著提高[21]。Cheng等通过反向遗传学的方法克隆了一个耐盐基OsNAP，该基因属于NAC家族成员，过表达该基因后，许多逆境相关基因表达均上调[22]。

4 耐盐水稻的选育

研究者利用常规育种技术，筛选了一些具有耐盐性的种质资源[23]。通过杂交和回交相结合的方法，育成了一系列耐盐性不同的水稻品种，有的已在生产上得到了应用，如特三矮2号和绥粳5号等耐盐品种[24-25]。

5 分析与展望

5.1 开展水稻耐盐性遗传机制研究 植物耐盐机制的研究已开展了数十年，并取得了许多有价值的成果，为植物耐盐分子育种带来了曙光，也为水稻常规育种与分子育种的有机结合提供了可能[23]。虽然有学者认为，水稻的耐盐能力受渗透调节和无机离子的吸收调节，但具体调节遗传机制还不清楚。如在盐分胁迫下，哪些调节因子参与渗透调节中物质的积累？在盐胁迫下，哪些因子参与渗透调节物质的积累？最初的信号感受和传递过程是怎么样的？多个耐盐基因之间是如何互作和调控网络的？[23]。

5.2 加强水稻耐盐基因的鉴定和分离研究 近年来，尽管分离了不少水稻耐盐性QTL，单由于遗传背景的不同和鉴定的QTL之间存在互作，分离的耐盐性状QTL很难直接的应用于水稻品种遗传改良。随着生物信息学和分子生物学的不断发展，将会分离和鉴定更多的水稻耐盐QTL，再通过聚合育种技术，将会培育具有多个耐盐基因的水稻新品种。

5.3 积极开展水稻耐盐碱种质的创新 b定和分离具有强耐盐碱能力的水稻种质显得尤为重要，尤其是野生稻中可能含有优异的抗逆基因，通过分子技术鉴定和分离水稻耐盐相关的基因，再将耐盐基因转入综合性状优良的水稻品种之中，进而培育耐盐性水稻新品种。虽然水稻耐盐性育种研究还面临不少问题，如目前已克隆的水稻内源耐盐基因还相对较少。但随着生物技术的快速发展和分子生物学研究的不断深入，水稻耐盐育种必将不断取得进步。相信在不久的将来，将会有一系列耐盐水稻新品种应用到生产实践当中，这将对缓解中国乃至全球粮食安全问题具有重要意义[23]。

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回交的遗传学效应范文第2篇

（湖北省农业科学院粮食作物研究所，武汉 430064）

摘要：在杂交水稻制种中，高柱头外露率不育系可有效提高杂交种产量，降低生产的单位成本，受到广大种业公司的欢迎。因此，对水稻（Oryza sativa L．）柱头外露率进行研究具有重要的意义和广泛的市场需求。对近年来发表的在水稻柱头外露率的遗传和环境因子，以及高柱头外露率水稻品系育种实践的探索进行了综述。

关键词 ：水稻（Oryza sativa L．）；柱头外露率；QTL

中图分类号：S511；Q75 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）16－3841-03

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.001

收稿日期：2014－12－29

基金项目：湖北省农业科学院青年基金资助项目（2014NKYJJ27）

作者简介：杜雪树（1983－），男，湖北武汉人，助理研究员，硕士，主要从事水稻遗传育种研究，（电话）027－87389224（电子信箱）duxueshu＠163．com。

在杂交水稻制种的长期生产实践中人们发现，使用高柱头外露率的不育系作为母本可以得到更高的杂交种产量。这是因为一方面柱头外露率高的亲本可以克服颖壳对花粉的遮蔽，使柱头获得更大的与花粉接触的面积；另一方面，柱头即使在开花当天没有授粉，但因为柱头外露，其在第二天甚至在以后若干天内仍有授粉的机会，并可能受精结实。田大成［1］的研究表明，柱头外露的颖花其结实率平均为64．0％，而柱头不外露的颖花其结实率平均仅为15．7％，是前者的1／4。而且水稻（Oryza sativa L．）总结实率的55.0％是依靠柱头外露颖花在开花后的几天授粉结实的。此外还有研究认为，柱头外露率高的品种具有更高的柱头活力［2］。因此，越来越多的水稻育种家把高柱头外露率不育系的选育作为重要的研究目标之一。

1 水稻柱头外露率的影响因子

1．1 花器性状

柱头外露与否取决于柱头与颖花其他器官之间的相对关系。李陶等［3］研究认为，柱头外露率与柱头长、粒长、柱头角度及子房长呈显著正相关，与粒宽呈显著负相关；各花器性状对柱头外露率直接效应的大小依次为柱头角度、子房长、柱头长、粒长、粒宽。Uga等［4］利用亚洲栽培稻Pei－kuh和野生稻W1944构建了一个重组自交系群体，研究发现柱头外露率与柱头长度、花柱长度、花药长度、颖壳的最大张角及内外稃的长厚比呈显著正相关，而与内外稃的厚度则呈显著负相关。其在第5和第10染色体上各定位了一个柱头外露率QTL，即qRES－5和qRES－10。其中与qRES－5相邻的区间同时影响花药长度、内外稃厚度和内外稃的长厚比，而qRES－10所在区间影响着内稃长度。其后Uga等［5］又利用5个遗传群体对花器官的10个性状进行了比较作图，结果表明颖壳的主要性状由少数几个主效QTLs控制，而雌蕊和雄蕊的长度则由多个微效QTLs控制。

Yan等［6］研究了来自USDA水稻核心种质资源库的90份微核心种质，发现柱头单外露率、柱头双外露率和柱头总外露率之间呈显著正相关，且柱头总外露率、柱头单外露率与颖壳长度的相关性分别达到显著和极显著水平。贺立伟［7］以7个两系不育系和7个三系不育系为材料，对它们的花器性状和柱头外露率进行了相关性和通径分析。结果表明，柱头外露率与柱头跨度、颖花长、颖花长宽比和子房长度之间显著相关，其他性状对柱头外露率有影响，但不显著。

1．2 种间差异

栽培稻是由野生稻经过人工驯化而来。在驯化过程中，野生稻的天然异交结实率由100％降至栽培稻的2％～4％。Ying等［8］对2 065份非洲稻种资源的柱头外露情况进行了考察，发现柱头外露率由低到高依次为亚洲栽培稻（1．0％）、杂草型野生稻（20．0％）、巴蒂野生稻（34．8％）、非洲野生稻（54．9％）、长药野生稻（85．7％）、斑点野生稻（100．0％）。李晨等［9］使用栽培稻桂朝2号和江西东乡普通野生稻作为亲本材料，构建了一个BC1群体，从中定位得到2个QTL，分别位于第5和第8染色体上，命名为qPEST－5和qPEST－8，其综合贡献率达到20％以上，增效基因来源于野生稻。

籼稻（Indiea）和粳稻（Japoniea）作为亚洲栽培稻（Oryza sativa L．）的2个主要类型，其在许多形态和生理性状之间存在着显著的差异。许克农等［10］对两用核不育系进行了研究，发现总体上粳型不育系柱头外露率要比籼型高。张戟等［11］为选育一定柱头外露率的粳型不育系，使用籼型广亲和不育系培矮64和一个不具备柱头外露性状的单季晚粳品种杂交，却发现在F2分离群体中粳型群体的柱头外露率低于籼型群体。李文宏等［12］利用极低外露率的粳稻京系17和高柱头外露率的籼稻窄叶青8号作为亲本，构建了一个加倍单倍体群体，在该群体中对控制柱头外露率的QTL进行分析，分别在第2、3染色体上检测到2个控制水稻柱头外露率的QTLs（qPES－2、qPES－3），其增效基因均来源于籼稻窄叶青8号。

1．3 环境因子

在杂交水稻制种过程中，水稻的柱头外露率受外界环境影响较大，可通过合理施肥以及激素处理提高不育系的柱头外露率，从而提高杂种产量。

吕凯等［13］用协早青A、珍汕97A等材料研究了肥料、激素及花调灵等不同施用水平对柱头外露率的影响，发现即使在不缺肥的情况下于水稻幼穗分化五期前使用一定量的氮肥仍可大大提高水稻柱头外露率。在始穗期施用较高浓度的赤霉素，也可使柱头外露率得到一定程度的提高。田大成等［14］的研究表明，通过在水稻抽穗1％后1 d喷施赤霉素可显著提高柱头外露率，但喷施时机不当反而会造成柱头外露率的下降。田大成［15］、朱英国［16］研究认为，赤霉素并不是直接提高柱头外露率，而是通过使不育系茎秆伸长，减轻包颈程度，甚至恢复正常，以增强植株生长势而实现的。喷施赤霉素后，不育系的柱头外露率可以提高15％～20％。

Yu等［17］使用一个包含有186个株系的重组自交系群体在干旱胁迫和非干旱胁迫两个不同条件下进行了2年的研究，通过一个包含有203个SSR标记的连锁图谱，在非干旱胁迫下发现了4个QTLs，干旱胁迫下发现了3个柱头单外露率相关QTLs，分别位于第1、10、12染色体上；发现了4个双柱头外露率相关QTLs。研究发现，在干旱胁迫下水稻的柱头外露率更低。

2 水稻柱头外露的遗传机理研究

2．1 水稻柱头外露的遗传调控

李陶等［3］利用8个不同的亲本进行组合分析柱头外露率，发现不同组合下的基因效应不同。在综合分析了各个组合的遗传效应后，指出水稻柱头外露率是数量性状，亲本杂交后代都呈现出连续变异特征，且柱头外露率主要受显性效应影响，其次是加性效应，上位性效应影响较小。

虽然一般认为水稻柱头外露率仅受核基因控制，不受胞质的影响，但王文明等［18］以珍籼97A（W型）、D汕A（D型）、K青A（K型）为胞质供体构建了3套同核异质系，对影响水稻异交性能的9个性状的质核互作关系进行了分析。结果表明，胞质对柱头总外露率、双外露率同样存在影响；不育胞质比正常胞质提高柱头外露率效果显著；在不育胞质中，K型胞质和D型胞质优于W型胞质。

可以看出，水稻的柱头外露率是典型的数量性状，由多个微效基因共同控制，存在胞质效应，受外界环境影响较大。

2．2 水稻柱头外露率的QTL定位

作为一种重要的数量性状，研究人员利用不同的分离群体，对水稻柱头外露率进行了大量的QTL定位研究。截至2014年4月20日，Gramene网站上共登记柱头外露率相关QTL 7个，分别位于第2、3、5、8染色体上。但从发表的文献来看，实际已定位的QTL不止7个。

李文宏等［12］籼稻窄叶青8号和粳稻京系17构建的加倍单倍体（DH）群体在第2、3染色体上分别定位到控制水稻柱头外露率的QTL：qPES－2和qPES－3；并发现柱头外露率与单柱头外露率的QTL在染色体上的位置相同，控制双柱头外露率的QTL只在第2染色体上检测到。邓应德等［19］用高柱头外露率品种优ⅠB（籼稻）和低柱头外露率品种糯5号（粳稻）构建F2群体，利用该群体检测到了分别位于第2、5、8号染色体上的3个QTLs：qPES－2、qPES－5、qPES－8，其分别解释了表型变异的10．1％、11．1％和9．0％。增效基因均来自于高柱头外露率亲本优ⅠB。冯玲玲等［20］在以高柱头外露率的50S作为母本，低柱头外露率的三系粳稻保持系连B作为父本构建的F2群体中，在第3、9、12染色体上分别检测到qPES－3、qPES－9和qPES－12 3个控制柱头外露率的QTL，其增效基因均来自50S。邓应德等［21］使用柱头外露率差异极显著的Ⅱ－32B和冈46B构建定位群体，利用极端群体法筛选多态性标记，通过单标记分析法分析发现，位于第1染色体上的RM5310、第2染色体上的RM3188、第5染色体上的RM3437和RM31，以及第8染色体上的RM3395，这5个标记与柱头外露率极显著连锁，对该群体柱头外露率的贡献率分别为4．63％、7．09％、13．65％、13．62％和4．83％。其中，位于第5染色体上的RM3437、RM31可能与同一个主效QTL连锁，可用于分子标记辅助选择水稻高柱头外露率的不育系。尹成等［22］利用岳早籼6号和Ⅱ－32B构建的重组自交系，在第1、3、5、6、7、9染色体上共检测到16个控制柱头外露率的QTLs。其中，位于第1染色体RM472－RM12276和第9染色体RM278－RM107两个区段中的QTLs，在2种表型的两年重复数据中均能稳定地检测到。这两个区间中的QTLs对单株头外露率和双柱头外露率的表型变异解释为10．65％～35．72％和6．71％～21．99％ 。截至目前，水稻的12条染色体上均发现了控制柱头外露率的QTL，但都不是主效QTL。

Yan等［6］利用108个SSR标记和1个Indel标记结合田间性状，对USDA的90份微核心种质使用分子标记进行分型及连锁分析，发现4个标记同单柱头外露率相关，6个标记同双柱头外露率相联，5个标记同总柱头外露率有关。其中，位于第1染色体上标记RM5的位点在单柱头外露率和双柱头外露率上均具有重要作用。

3 高柱头外露率不育系的选育

在高柱头外露率不育系的选育实践中，水稻育种家们主要在两个方面进行了尝试。一是利用高柱头外露率种质资源作为供体，通过回交将优良的目标性状转入受体亲本中；二是通过将与有利于提高柱头外露率相关的花器性状聚合，从而获得高柱头外露率的品系。但从多年实践来看，上述两种途径效果均不理想。武小金等［23］研究了不同群体改良方法对水稻柱头外露率的改良效果，认为随机多交有利于微效基因的累加和多个优良性状的聚合，效果较为理想；而单纯的混合选择无法达到上述效果，且效果最差。

分子标记辅助选择是提高选育高柱头外露率品系的有效手段。Miyata等［24］以IR24为供体亲本，Hoshinohikari和Koshihikari为轮回亲本，通过分子标记辅助选择将高柱头外露率QTL qES3导入至Koshihikari背景中。获得的近等基因系与Koshihikari相比，柱头外露率提高了36％。

4 小结

从当前来看，定位的控制水稻柱头外露率的QTL虽然较多，但都是初步定位，且一般对表型的贡献率不超过15％。若要在育种实践中较好地应用这些定位的QTL，一方面要进一步精细定位控制柱头外露率的QTL，另一方面要将多个QTLs聚合在一起，才能产生较为理想的效果。此外，在全球气候变暖的趋势下，水稻抽穗扬花时的高温对柱头外露率的影响愈发显著。所以在今后的工作中，更应重视高温胁迫下柱头外露性状的研究。

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回交的遗传学效应范文第3篇

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目前在黄瓜育种中,广大科研工作者利用生物技术结合常规育种方法,创新了一大批含有优异基因的黄瓜育种材料,培育出多个丰产、优质、多抗品种。生物技术在黄瓜遗传育种上的应用非常广泛,下面介绍在这方面已取得的一些重要进展。

2分子标记技术在黄瓜遗传育种中的应用

2.1黄瓜基因的分子标记

开展基因分子标记研究是进行分子标记辅助选择育种、分离和克隆基因的基础。“十五”期间,我国科研工作者建立了适合黄瓜的RAPD、AFLP和SSR标记的优化反应体系,并对黄瓜的多个基因进行了分子标记。

钱忠英等[2]优化的黄瓜RAPD反应体系为:PCR程序94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,37 ℃复性30 s,72 ℃延伸2 min,循环40周,最后72 ℃延伸7 min为佳;模板DNA的适宜浓度为2.5～5 ng/μL,引物浓度为0.6 mol/μL,dNTPs浓度为0.25 mmol/L,Mg2+浓度为1.875 mmol/L。张桂华等[3]建立了适合黄瓜的AFLP反应体系:在50μL酶切连接体系中,取300 ng基因组DNA进行双酶切和接头连接,然后取4μL酶切连接产物进行预扩增,预扩增产物稀释30倍后,采用“2+3”选择性扩增引物组合用于选择性扩增可以得到很好的扩增效果。葛风伟[4]等摸索了适宜黄瓜的SSR反应体系,认为在25Μl PCR反应体系中,Mg2+的最适浓度为0.2 mmol/L;dNTP最适浓度为0.2 mmol/L;反应体系中Taq聚合酶宜加入1U,引物应加入30 ng;DNA最适浓度为5 ng/μL。另外,刘殿林[5]、张正奇[6]、孙敏[7]等也对黄瓜基因组DNA提取方法和RAPD反应体系进行了探索。

基因分子标记方面,陈劲枫等[8]利用RAPD技术获得了黄瓜全雌性特异的片段B111000。娄群峰等[9]筛选得到了与黄瓜全雌性F基因连锁距离为6.7 cM的AFLP标记TG/CAC234,并将该标记转化为SCAR标记SA166。张桂华等[10]找到2个与白粉病抗病相关基因连锁距离为5.56 cM的AFLP标记,目标片段的大小分别为238 bp和236 bp。张素勤等[11]研究并获得了与控制黄瓜霜霉病和白粉病的感病QTLs均紧密连锁的显性AFLP标记:E25M632-103。该标记从分子水平说明黄瓜霜霉病和白粉病的某个感病QTLs是连锁的。丁国华[12]筛选得到与抗霜霉病基因dm连锁不十分密切的CsRGA3标记。在dm和CsRGA3之间还检测到黄瓜白粉病抗病基因pm的存在,显示了dm和pm存在连锁关系。国艳梅[13]筛选到的AFLP标记E4M6和E5M5,分别与黄瓜营养部分苦味基因Bi连锁,距离15.0 cM;和不苦基因bi连锁,距离18.8 cM。顾兴芳等[14]找到了与黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的两个显性AFLP标记E23M662-101和E25M652-213,与Bt的遗传距离分别为5 cM和4 cM,且位于Bt两侧。Thomas等[15]以WⅡ983G×Strait8的55个F2+代个体和Iudm1×Strait8的90个F2+代为研究群体,从960对RAPD引物产生的135个多态性标记中筛选出5个与黄瓜霜霉病基因(dm)紧密连锁的标记:G14-800、X15-1100、AS5-800、BC519-1100和BC526-1000。

2.2黄瓜遗传图谱的构建与基因定位

1994年,Kennard等[16]以G421×H-19获得的F2+群体为材料,构建了一张总长为766 cM的遗传图谱,该图谱由10个连锁群组成,包含了58个位点标记,2个位点之间的平均距离为(21±8)cM。同时利用种间杂交GY14×PⅡ83967获得F2+群体构建了含有70个位点,10个连锁组群,总长480 cM的连锁图谱。1997年,Serquen等[17]以G421×H219杂交的100个F2+株系为试材利用RAPD技术构建了一个含有80个位点的连锁图谱,包含了77个RAPD标记,3个形态标记,分为9个连锁组群,整合长度628 cM,平均标记间隔7.8 cM。

2000年,Danin-Poleg等[18]以GY14×PⅡ83967为材料,用SSR标记技术构建了黄瓜的遗传图谱,将14个SSR标记定位到8个连锁组群中,整合图谱总长为783.2 cM,并发现其中有9个标记与甜瓜相同。Bradeen等[19]利用Joinmap软件,以G421×H219的杂交后代群体为研究对象,整合出含有10个连锁群,255个标记,总长为538.6 cM的遗传图谱,平均标记间隔为2.3 cM。又以GY14×PⅡ83967为材料,构建了一张包括了15个连锁组群,197个标记,整合图谱长度为450.1 cM的黄瓜遗传图谱。Park等[20]利用对番木瓜环斑病毒(PRSV-W)和南瓜花叶病毒(ZYMV)敏感的“Straight8”和对PRSV-W、ZYMV有抗性的TMG1(TaichungMouGua)的F6代重组自交系(RLs)为材料,构建了包含353个位点,12个连锁组群的连锁图谱。Fazio等[21]采用G421×H219获得的171个RLs和216个F2+单株构建了包含14个SSR标记、24个SCAR标记、27个AFLP标记、62个RAPD标记、1个SNP标记和3个重要形态学标记(雌性,有限生长和小叶),分为7个连锁组群,总长为706 cM的遗传图谱。Young等[22]以黄瓜抗病毒和感病毒的亲本组成的重组自交系进行AFLP、RAPD、RFLP标记,并构建了353个位点的黄瓜图谱。

“十五”期间,我国科研工作者构建了2张黄瓜遗传图谱,其一是张海英等[23]利用黄瓜重组自交系为作图群体,构建的包含9个连锁组群,共有234个分子标记的连锁图谱,其中包括141个AFLP标记、4个SSR标记和89个RAPD标记,覆盖基因组长度727.5 cM,平均图距3.1 cM。应用该图谱对控制黄瓜耐弱光的数量性状基因(QTL)进行了研究,将影响叶面积增长量的5个QTL分别定位在LG1、LG7和LG9连锁群[24]。其二为李效尊等[25]利用F2+代群体,构建的包含77个SRAP标记和79个RAPD标记的遗传图谱,分属4个大的连锁群和5个小的连锁群,总长度1110.0 cM,平均间距为13.7 cM。并将侧枝基因(lb)定位在一个大的连锁群上,其两侧标记是OP-Q5-1和OP-M-2-2,与lb的间距分别是9.3 cM和15.9 cM;将全雌性基因(f)定位在一个小的连锁群上,其两侧标记是OP-Q5-2和BC151,与f的间距分别是13.8 cM和13.6 cM。

2.3分子标记在黄瓜亲缘关系和遗传多样性上的研究

分子标记技术以其准确性高、速度快、周期短而较多地应用于黄瓜种质亲缘关系分析和种质资源多样性检测方面。利用RAPD标记进行研究的报道有:张海英等[26]分析了华北型与欧洲温室型品种的杂交后代的遗传漂移情况,进行了初步的遗传分析以及F2+个体的基因型分析。刘殿林等[27]分析了39份黄瓜材料的遗传差异,不同材料间的遗传距离(D)在0.0642～0.592之间,并根据遗传距离,按UWPGA法进行了聚类分析。夏立新等[28]计算出黄瓜亲本间分子遗传距离,研究了田间园艺性状与分子遗传距离间各种相关曲线的相关系数。陈劲枫等[29]对黄瓜属的22份材料的亲缘关系进行了研究,聚类分析为2群:CS群(黄瓜、西南野黄瓜及野黄瓜)和CM群(甜瓜、菜瓜、野生小黄瓜及非洲角黄瓜)。庄飞云等[30]也将23份材料按亲缘关系聚类为黄瓜、近缘野生种、种间杂交种和甜瓜亚属种4类。李锡香等[31]分析了66份黄瓜种质基因组DNA,将供试种质分为8个组群。另外,利用RAPD标记可以从分子水平上探测黄瓜亲本自交系与其杂种F1代的遗传差异[32]。

AFLP技术也经常用在亲缘关系和遗传多样性研究上面。王志峰等[33]利用AFLP技术对包括80份山东黄瓜地方品种和24份其他地区品种的遗传亲缘关系进行了研究,聚类分析结果显示:山东黄瓜地方品种与日本品种和欧美品种分属不同类群或亚类群,山东地方品种分为8组,各组内生态类型基本一致。AFLP分析计算出15份密刺类黄瓜品种的遗传距离在0.033～0.686之间,聚类分析分为8类,新泰密刺和山东密刺遗传差异较小,与长春密刺遗传差异较大[34]。李锡香等[35]以8对引物对70份不同来源的野生和栽培黄瓜种质基因组DNA进行AFLP分析,将供试种质聚类为3大种群:西双版纳黄瓜组群、印度野生黄瓜组群和栽培黄瓜组群。Zhuang等[36]用RAPD和SSR分析黄瓜野生种、半野生种的亲缘关系,二者的遗传分析结果具有很高的协调性,二者遗传距离的相关系数为0.94。

另外,李俊英等[37]发现在不同黄瓜品种的线粒体中存在类质粒分布的差异,其存在有一定随机性,不同品种中的同一种类质粒间具有同源性。

2.4黄瓜基因的克隆与表达

黄瓜基因克隆有多篇报道。康国斌等[38]克隆得到了在黄瓜冷敏型品种低温锻炼异表达基因的cDN段(ccr18),大小为639 bp。在基因组中以单拷贝或低拷贝形式存在。ccr18基因与黄瓜低温锻炼相关,与拟南芥染色体IIIBAC库中的F14P3基因组序列具有88 %的同源性。白吉刚等[39]扩增出黄瓜生长素结合蛋白基因(ABPl)cDN段,大小约为800 bp,该基因在开花前1 d的子房中表达信号较弱,在授粉后2 d、4 d和6 d的幼果中表达增强。丁国华等[40]利用简并引物从黄瓜基因组DNA中分离得到15条同时具有特征保守域结构的NBS类型抗病基因同源序列(RGA),翻译产物与许多抗病蛋白有较高的同源性。

牛林海[41]克隆了黄瓜HMG(high mobility group proteins)基因,并认为该基因是单拷贝,具有组织特异性表达,在根中表达最强。叶青静[42]测定了黄瓜果实组织中的与细胞分裂相关的精氨酸脱羧酶(ADC)基因cDNA序列(约1.83 kb)、与细胞膨大有关的扩张蛋白基因cDNA序列(约786 bp)以及一条酸性转化酶的cDNA全长序列(约2.25 kb)。李志英[43]获得了正常和“花打顶”黄瓜之间的2个差异片段所在基因的全长cDNA序列,分别定名为CUATP和CuADC。“花打顶”植株中CUATP的表达明显减少,而CuADC表达量增加。梅茜[44]构建了黄瓜幼果的cDNA文库,得到139个表达序列标签(ESTs),其中有97条与已知基因高度相似,36条为低度相似序列,在GenBank中未找到匹配同源序列的ESTs为6个。娄群峰[45]从中国弱雌性黄瓜中克隆出了全长为1024 bp的ACC合酶基因,包含6个开放阅读框,不同生态型黄瓜中ACC合酶基因序列保守性很强。不具有性型特异性,但在植株不同部位表达程度存在明显差异。

2.5黄瓜杂种纯度及品种指纹图谱分析

黄瓜种子纯度鉴定的常规方法是根据田间表现性状进行鉴定,后来发展为利用同工酶的方法,但二者都有一定的缺陷。利用分子标记技术鉴定黄瓜种子纯度,可以在苗期甚至种子阶段进行,高效快速、稳定可靠。克服了传统田间检验要根据植株园艺性状进行而导致的费时、费力等缺点。但相关报道比较少。

王和勇[46]研究表明,黄瓜不同组织器官的DNA对RAPD扩增无影响,均可获得一致的指纹图谱,并建立了种子纯度鉴定的RAPD的反应体系。孙敏[47]等通过RAPD标记鉴定和分析了黄瓜品种真实性,也建立了适宜黄瓜种子纯度鉴定的RAPD指纹图谱。金红等[48]研究了抗除草剂基因在黄瓜杂种纯度快速鉴定上的应用,摸索出田间抗性鉴定和室内种子抗性鉴定的除草剂临界浓度,建立了一套在种子发芽阶段或2片真叶期进行黄瓜杂交种纯度鉴定的新技术。

2.6分子技术鉴定黄瓜病害

王惠哲等[49]以感病组织和健康组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,对75份黄瓜病毒病样本进行了检测,结果从感病组织中扩增出与预期的425 bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物;29份材料检测到TMV,检出率达38.67 %。同样的方法,也检测到黄瓜上的西瓜花叶病毒2号(WMV22)[50]。李淑菊等[51]利用RT-PCR对黄瓜病毒毒原种类进行检测。陈洁云等[52]用同样技术明确了ZYMV和CMV是浙江及其周边地区侵染葫芦科植物最主要的病毒种类,夏季CMV普遍发生,ZYMV主要发生在秋季。

3黄瓜组培技术与单倍体和三倍体培养

利用对黄瓜离体组织的培养,通过愈伤组织和胚状体两条途径均可获得再生植株。何晓明等[53]建立了子叶及下胚轴离体培养体系,通过愈伤组织分化出的不定芽获得再生植株。郭德章等[54]将分离纯化的黄瓜子叶原生质体,培养于mKM8p液体培养基中,原生质体可持续分裂至愈伤组织形成。当再生的愈伤组织直径达0.5～1.5 cm时,及时转入改良的MS附加不同生长激素的培养基上诱导分化及再生,结果产生大量体胚并再生成植株。

不少报道对黄瓜组织培养的影响因素做了探讨。侯爱菊等[55]认为外植体类型、基因型及植物生长调节剂对诱导黄瓜直接器官发生有显著影响,子叶节是最佳的外植体类型。杨爱馥等[56]研究认为愈伤组织诱导阶段和胚胎发生阶段分别采用9 %和6 %的蔗糖浓度,可促进体细胞胚胎发生;胚诱导培养基中添加6-BA 0.5 mg/L,以及愈伤组织诱导阶段甘露醇与蔗糖配合使用,可提高体细胞胚胎发生率。梅茜等[57]研究表明,苗龄和ABA是影响子叶分化形成不定芽的显著因素;加入适量的AgNO3可改善黄瓜愈伤组织的质地、促进芽的形成。与曹利仙等[58]试验结果相同。郭德章等[54]认为Ca2+浓度对黄瓜原生质体的稳定和细胞分裂有重要影响。李云等[59]研究后认为赤霉素处理离体黄瓜子叶不能诱导花芽分化,萘乙酸的促进作用不明显,激动素KT1.0诱导花芽分化的频率最高。但周俊辉等[60]认为l/2 MS培养基中附加0.10 mg/L 6-BA能显著提高离体黄瓜子叶的开花率,White培养基中附加2.00 mg/L的KT开花率也有明显提高。相同浓度的L-丙氨酸和L-酪氨酸均明显促进黄瓜子叶开花,而甘氨酸对黄瓜子叶开花则有一定的抑制。

在黄瓜单倍体和多倍体培养方面,杜胜利等[61]在国内首次建立了一整套通过未受房离体培养产生黄瓜单倍体植株的技术体系,再生频率达25 %。雷春等[62]通过射线辐射花粉授粉并结合胚培养从3个基因型中获得了单倍体植株。陈劲枫等[63]研究了异源三倍体黄瓜的离体繁殖的培养基配方最佳的不定芽诱导培养基为:MS + 6-BA 2.2 mg/L和MS + 3.0 mg/L KT + 0.2 mg/L NAA,然后丛生芽在MS + 0.2 mg/L 6-BA的培养基上伸长大约10 d后取整齐一致的芽在1/2 MS + 0.2 mg/L 6-BA培养基上生根。

4黄瓜遗传转化体系建立及基因工程改良

基因工程技术是现代生物技术改良作物品种的关键技术之一,在农业生产中有着广泛的应用前景。可应用于黄瓜上的转基因方法有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法和电激法等,目前以农杆菌介导法为主要方法。近几年来,广大科研工作者研究和建立了黄瓜高效遗传转化体系,并通过农杆菌介导将CMV-CP、CBF3、Cor15A、Chi、Glu、CTB/CS3、RS等基因导入黄瓜基因组。

陈峥等[64]的研究表明,在共培养的菌液中添加乙酰丁香酮,明显提高外植体的愈伤组织诱导率;延长农杆菌与外植体的共浸染时间至40 min,外植体的存活率和出芽率显著提高。姚春娜等[65]试验表明,超声波处理可以明显提高农杆菌对外植体的转化频率。侯爱菊等[66]建立了一套黄瓜遗传转化体系,适宜的选择压力为卡那霉素30 mg/L。金红等[67]也对影响遗传转化体系的因素进行了摸索。于静[68]、孙兰英[69]、赵隽等[70]均认为子叶节是黄瓜遗传转化体系的最佳外植体,最适宜的芽诱导培养基为MS + 6-BA 0.5 mg/L;子叶节预培养1～2 d,在添加6-BA 0.5 mg/L、乙酰丁香酮100μmo1/L,pH 5.2的MS培养基上进行培养,遗传转化效率最高。利用TDZ从子叶节上诱导出再生芽,效果优于BA。

金红等[67]将抗除草剂基因bar导入到黄瓜子叶中,获得落地转化株系。邓小燕等[71]构建成植物表达载体Pbinp-35S-CBF3。通过农杆菌介导转化黄瓜子叶,获得了具有卡那霉素抗性的黄瓜再生植株。张兴国[72]等也将冷cbf3基因和corl5a抗寒基因导入黄瓜基因组,创制出耐寒黄瓜新材料。白吉刚等[73,74]将拟南芥生长素结合蛋白基因转化黄瓜,获得的转基因植株单性结实能力增强。通过黄瓜离体子叶不定芽再生体系,陈丽梅[75]和林建丽[76]已分别将荧光素基因(luc)、ATT1基因和花生白黎芦醇合酶(RS)基因导入黄瓜,获得了阳性转基因植株。柏锡[77]获得了转组织型纤溶酶原激活剂基因的黄瓜植株。张国广[78]将来源于菜豆的几丁质酶(Chi)基因和克隆自烟草的β-1,3-葡聚糖酶(Glu)基因导入3个基因型的黄瓜基因组中。侯爱菊[66]、孙兰英[69]和杨成德[79]也利用农杆菌介导法将菜豆几丁质酶基因导入黄瓜。

5存在问题及展望

黄瓜有7对染色体,染色体组总长度750～1 000 cM,高饱和的分子连锁图应具有7个连锁群。目前构建的遗传图谱相对不饱和,整合后的连锁图谱虽然密度增加,但是不能覆盖整个基因组。被定位到图谱上的分子标记不多,与重要性状紧密连锁的标记就更少。因此,仍需对黄瓜分子标记进行研究,找到与性状紧密连锁的标记,为分子标记辅助育种和基因的定位克隆奠定基础。黄瓜组织培养以二倍体的研究居多,单倍体和多倍体的研究较少,黄瓜单倍体组织培养的技术在国内仍未成熟,黄瓜转基因技术也还停留在研究阶段,与实际应用还有相当差距,今后尚需进一步研究。

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