反向遗传学研究方法

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反向遗传学研究方法范文第1篇

这本教材由最近一次的流感大流行开始引出了目前流感研究中有待解决的问题，例如，病毒起源、传播、发病机制、疾病的严重程度等。本教材还涵盖了多领域最新流感研究进展，包括基因组学、能够识别病毒毒力的反向遗传学、1918年西班牙流感病毒株的分析重建等。

本书共分为8章：1.流感绪论，叙述了人类流感病毒以及流感大暴发的历史。2.流感病毒的结构与复制，分别讲述了流感病毒的结构、装配过程、基因组、病毒的复制、病毒编码蛋白、甲流乙流的质子通道、宿主与病毒功能的调控、流感病毒复制和PB1F2的结构和功能、发病机制等。3.流感病毒的进化与生态学，分别通过感染不同宿主的流感病毒详述了其变异及进化知识；4.流行病调查；5-6.详述了流感的免疫学，详细介绍了先天免疫、抗体介导免疫、细胞介导免疫、免疫原性、流感疫苗、动物流感防控、流感疫苗生产；7.临床与抗药性方面的知识，包括致病机制、临床表现、最新的抗药性研究、流感病毒模型的构建；8.介绍了最近一次H7N9暴发的情况和研究进展。

本书不仅详细形象地阐述了流行性感冒的历史、流感病毒的病原学、流行病学以及实验室诊断技术基础，更突出流感病毒研究的最新进展、成果以及国际关注的热点问题。本书的写作深入浅出、通俗易懂，力求既能涵盖全面的流感基础知识，又能反映现阶段流感研究的发展水平。

本书作为全面介绍流行性感冒的专业教材，既满足各高等学校医学类、生物类、生物工程类学科本科教学的需求，同时也满足不同层次和其他相关专业研究生的教学需要。

马雪征，硕士，助理研究员

反向遗传学研究方法范文第2篇

反向遗传技术为在DNA水平上对RNA病毒进行研究和操作提供了极为方便有用的工具。本研究构建了EV71全长cDNA克隆,并将体外转录得到的RNA转染RD细胞,成功获得拯救病毒,为进一步研究EV71病毒基因功能、基因变异与病毒毒力关系、基因疫苗等研究以及防控该病奠定良好的基础。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1毒株与细胞

EV71病毒株FJ08149是2008年从一手足口病病例疱疹液分离获得,经鉴定为EV71 C4基因亚型。RD细胞由中国疾病预防控制中心脊灰实验室惠赠。

1.1.2主要试剂

长片段扩增Primescript RT-PCR Kit购自Takara公司;PCR-XL- TOPO TA载体 购自Invitrogen公司;RiboMAXTM LargeScale RNA Production Systems-T7 购自Promega 公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit、Transfection reagent和RNeasy Mini kit 购自Qiagen公司;EV71单克隆抗体购自Chemicon公司;FITC标记的二抗购自Dako公司。

1.2 引物设计与合成

根据FJ08149株的序列和酶切位点,设计了一对引物,上游引物 EV71-5T7在其5'引入T7启动子序列及NotI酶切位点,下游引物EV71-3RM在其5'端引入52个Poly(T)及MluI酶切位点。由Takara公司合成。

1.3 RT-PCR扩增基因片段

按照QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂说明提取病毒RNA,最后用适量无RNA酶的双蒸水溶解。根据长片段Primescript RT-PCR Kit说明书,先以EV71-3RM为反转录引物,在42℃反应1小时反转录全长cDNA,然后利用Takara Ex Taq HS进行基因组全长扩增,PCR反应条件为:95℃预变性3 min;98℃ 10sec , 68℃ 9min,40个循环;72℃ 10min。反应产物在0.7%琼脂糖中电泳进行检验。

1.4 全长cDNA 的构建与鉴定

RT-PCR扩增产物经电泳后纯化,以TA克隆方法将带有T7启动子识别序列的基因组全长连入TOPO-XL-PCR载体中,用MluI和NotI酶切鉴定是否插入目的片段。

1.5 体外转录与转染RD细胞

用MluⅠ和NotI将有目的片段插入的质粒进行双酶切线性化,纯化后按照T7体外转录试剂盒说明在体外转录出RNA,用RNeasy mini kit(Qiagen)试剂盒进行RNA纯化后,加30ul无RNA酶的双蒸水洗脱, 定量。按照Transfection reagent说明书要求把RNA转染到培养于6孔细胞板RD细胞中, RNA含量为2μg/孔。转染后每天观察细胞,待细胞病变(CPE)达到75%及以上或观察7天后,收获细胞进行鉴定与传代。

1.6 拯救病毒的鉴定

1.6.1 RT-PCR鉴定及VP1序列测定

用EV71-S(5’-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3’)和EV71-A(5’-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3’)诊断引物对拯救病毒进行鉴定。应用EV71-F(5’-GCAGCCCAAAAGAACT

TCAC-3’)和EV71-R (5’-AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC -3’)扩增包括VP1全长在内的1082bp产物,并进行序列测定分析。

1.6.2间接免疫荧光试验鉴定

CPE达到75%及以上或观察7天后,收集细胞及上清,2500rpm离心10min,取细胞沉淀用无菌PBS洗2次后,重悬细胞沉淀,滴加到荧光片,用丙酮将其固定,蒸镏水清洗1次后加入EV71单克隆抗体,37℃湿盒中孵育1 h,PBS 洗涤3次。加入用1∶6000伊文斯兰以1∶40 稀释的FITC标记的兔抗鼠二抗,37℃湿盒中孵育1h,PBS洗涤3 次后甘油封孔,镜检。

1.6.3拯救病毒效价测定

获得拯救病毒经RD细胞传一代扩增后,与母本病毒同时进行TCID50测定。详细方法及步骤参见《WHO脊髓灰质炎病毒实验室手册》[3]。

1.6.4电镜观察

获得拯救病毒经RD细胞传一代扩增后,反复冻融3 次,4500r/min 离心30 min,取上清浓缩5倍后,以1%加入EV71特异性抗体37 ℃孵育2h后,4℃过夜,10000r/min离心30 min,以PBS重悬沉淀,点样、负染,电镜观察。

2结果

2.1 全长cDNA克隆的构建

利用引物EV71-5T7和EV71-3RM,从FJ08149病毒上清扩增出EV71基因组全长约7.5kb,见图1A(marker不够清晰)。应用TA克隆技术,将EV71基因组全长连接入PCR-XL-TOPO TA载体中,构建重组质粒,经MluI和NotI双酶切鉴定,FJ08149T5和FJ08149T25两个克隆质粒均有目的基因插入,见图1B,目的基因约7.5kb,载体大小为3.5kb。

A: FJ08149株基因组PCR扩增产物

1.RT-PCR扩增后的全基因组产物(7.5kb);2.DNA Marker DL15,000;3. 阴性对照。B: TA 克隆NotI和MluI双酶切鉴定结果;1.DNA Marker DL15,000;2.pFJ149T5;3.pFJ149T25

图1基因组PCR产物及TA克隆酶切鉴定

2.2 体外转录制备感染性RNA

应用MluI和NotI双酶切,从pFJ08149T5和pFJ08149T25克隆质粒中切下含有T7启动子的基因组DNA。并将此片段作为体外转录模板,通过T7 RNA聚合酶系统,体外转录成RNA,经电泳鉴定,转录的RNA达到预期的7.5Kb大小,见图2。

1.RNA Marker RL10,000 2. pFJ08149T5 3.pFJ08149T25

图2体外转录RNA电泳图

2.3 病毒的拯救

转录RNA转染RD细胞后72小时,即可见到典型的肠道病毒CPE,见图3A,CPE呈逐日增多,7天后将转染细胞培养上清以20%比例传代,第3天CPE达到75%以上。对照细胞培养7天均仍保持正常形态,见图3B。

A.转染pFJ08149T5后的RD细胞B. 正常的RD细胞

图 3RNA转染RD后CPE形态

2.4 拯救病毒的鉴定

2.4.1间接免疫荧光鉴定

拯救病毒、拯救病毒传1代后和母本病毒株用EV71单克隆抗体进行免疫荧光检测,均可见到特异性的荧光,见图4A,而细胞对照无荧光产生,见图4B。

图4拯救病毒的间接免疫荧光鉴定

2.4.2RT-PCR鉴定及序列分析

拯救病毒培养上清用EV71-A和EV71-S、EV71-F和EV71-R进行扩增,均得到预期大小的目的片段,约226bp和1082bp,见图5。将VP1全长序列测定分析,拯救病毒与母本病毒891个碱基完全一致。

图5 拯救病毒的RT-PCR鉴定

2.4.3拯救病毒毒力效价测定

将拯救病毒与母本病毒同时进行病毒效价测定,结果pFJ08149T5的效价为105.25TCID50/0.1ml,pFJ08149T25效价为107.25TCID50/0.1mL,母本病毒FJ08149的效价为107.505TCID50/0.1mL。其中pFJ08149T25与母本病毒对细胞的感染力相近,而pFJ08149T5约低100倍。

2.4.4病毒粒子的形态

浓缩后的FJ08149T5拯救病毒与EV71抗体作用后,形成免疫复合物,经负染色,电镜下观察到球形病毒粒子,直径约22nm,见图6。

图6拯救病毒的免疫电镜

3讨论

自1981年Racaniello VR和Baltimore D 首次应用反向遗传学技术成功拯救出脊髓灰质炎病毒(PV)后[4],翻开了RNA病毒研究的新篇章,实现了在DNA水平上研究RNA病毒。通过构建cDNA感染性克隆,应用DNA基因操作方法,如定点突变、重组、缺失和嵌合等手段,研究拯救病毒基因水平的改变对表型的影响,进而达到对病毒基因功能与结构、致病机制、表达调控、分子免疫机理等的全面认识,开发出新型疫苗。日本学者Arita等,于2005年首先构建了EV71标准株BrCr的感染性克隆,然后利用基因置换,引入PV疫苗株(Sabin I)影响温度敏感与病毒毒力的突变位点,在猴子模型上证实了温度敏感的病毒株对猴子毒性减弱[5];2008年,他们又在NOD/SCID鼠模型中证实了几个决定温度敏感的突变位点在神经毒力减弱中起协同作用[6]。2008年以来EV71在中国大陆流行,迫切需要利用本土流行株构建感染性克隆,为研究其致病机理、病毒变异与毒力关系以及疫苗的研究提供技术支持。

由于PV等小RNA病毒的基因组是单股正链RNA分子,裸RNA分子就具有感染性,且基因组较小,如EV71等肠道病毒属仅有7.5Kb大小,无帽子结构。理论上构建其感染性克隆可能较为容易,但在实际操作中仍然面临着不少的困难。首先需获得完整基因组的cDNA序列,先前基本上采取分段扩增后逐步克隆拼接出完整的cDNA序列,操作过程烦琐,且多次克隆、连接也给基因序列突变增加了机率。本研究中通过长片段RT-PCR一次性扩增出全长基因组,一次克隆操作以尽量减少可能引入序列变异。第二,基因组3’端需有足够长的Poly(A)尾,一定长度的Poly(A)对维持基因组稳定性及保证其感染性均有作用[7]。据报道,PV的Poly(A)如果少于20个,RNA的感染性比野生株会低20倍[8]。Sarnow等对3’端Poly(A)组成不同对PV体外转录本感染性影响的研究得到,Poly(A)尾越长其感染性越接近野生株,但非同源聚合序列反而使其感染性降低[7]。本研究设计时利用3’端引物直接带入52个Poly(A)尾和一个MluI酶切位点,达到保证感染性同时可进行线性化的目的。第三,保证基因组忠实性,减少其它非基因组序列引入。本研究直接将T7启动子特异性识别序列通过引物精确加到基因组5’端,并带入NotI酶切位点,转录前通过双酶切,避免将载体序列引入。第四,克隆扩增时如何避免因细菌增殖可能引起的序列变异,导致序列缺失或插入从而导致基因组序列不完整性。在本研究过程中也曾发现过类似的情况,因此采用了28℃、150rpm/min的低温低转速的优化培养条件,这是乙型脑炎病毒等其它感染性克隆构建过程也曾采取的措施[9]。本研究还发现如果基因组正向插入到载体T7启动子下游,不仅细菌增殖缓慢且量少,质粒拷贝数低,且转染也无感染性;而如果基因组以反向插入,则细菌不仅增殖快量大,质粒拷贝数高,且所获得的几株感染性克隆均为此反向插入的。这是否因不同方向插入时,潜在表达的蛋白质不同导致的,有待于进一步深入研究分析。

本研究应用本地分离株成功地构建了中国大陆流行C4基因亚型EV71感染性克隆,转染RD细胞成功获得了拯救病毒,经鉴定与野生株具有相似的遗传特性与生物学性状。此感染性克隆构建成功,可为下游研究提供了技术支持。

参考文献:

[1] Lin TY, Twu SJ, Ho MS, et al .Enterovirus 71 outbreaks, Taiwan: occurrence and recognition. Emerg Infect Dis. 2003,9: 291293.

[2] 省略/n272442/n272530/n272757/appendix/doc7307.doc

[3] 世界卫生组织.脊髓灰质炎实验室手册[R].第4版.中国疾病预防控制中心:北京, 2004:78-96.

[4] Racaniello VR, Baltimore D.Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in Mammalian cells. Science. 1981,214(11):916-919.

[5] Arita M, Shimizu H, Nagata N, et al. Temperature-sensitive mutants of enterovirus 71 show attenuation in cynomolgus monkeys. J Gen Virol. 2005,86:1391-1401.

[6] Arita M, Ami Y, Wakita T, et al. Cooperative effect of the attenuation determinants derived from poliovirus sabin 1 strain is essential for attenuation of enterovirus 71 in the NOD/SCID mouse infection model. J Virol, 2008,82(4):1787-1797.

[7] Sarnow P.Role of 3’-end sequences in infectivity of poliovirus transcripts made in vitro. J Virol, 1989, 63(1):467-470.

反向遗传学研究方法范文第3篇

【关键词】 慢病毒

Construction and identification of lentiviral vector of RNA interference of Smad4 gene

【Abstract】 AIM: To construct a lentiviral vector of RNA interference (RNAi) of Smad4 gene. METHODS: The effective sequence of siRNA targeting Smad4 gene was confirmed in our previous study. The complementary DNA containing both sense and antisense Oligo DNA of the targeting sequence was designed， synthesized and cloned into the pLVTHM vector， which contained H1 promoter and green fluorescent protein (GFP). The resulting lentiviral vector containing Smad4 shRNA was named LVshSmad4， and it was confirmed by PCR and sequencing. 293T cells were cotransfected with lentiviral vector LVshSmad4，pCMVdR8.74 and pMD2G. All virus stocks were produced by calcium phosphatemediated transfection. The titer of virus was tested according to the expression level of GFP. RESULTS: PCR and DNA sequencing demonstrated that the lentivirus RNAi vector of Smad4 (LVshSmad4) producing Smad4 shRNA was constructed successfully. The titer of concentrated virus was 5×1010 pfu/L. CONCLUSION: The lentivirus RNAi vector of Smad4 was constructed successfully.

【Keywords】 RNA interference; Smad4; Neoplasms; Lentivirus

【摘要】 目的：构建Smad4基因RNAi慢病毒载体. 方法：针对已经筛选确定的Smad4基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA，退火形成双链DNA，与经Mlu I和Cla I酶切后的pLVTHM载体［含H1启动子和绿色荧光蛋白（GFP）］连接产生LVshSmad4慢病毒载体，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定. 用LVshSmad4，pCMVdR8.74和pMD2G 3质粒共转染包装细胞293T细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度. 结果：PCR和测序证实，成功构建Smad4 shRNA的慢病毒载体LVshSmad4. 包装慢病毒，浓缩病毒悬液的滴度为5×1010 pfu/L. 结论：成功构建人Smad4基因RNAi慢病毒载体.

【关键词】 RNA干扰；Smad4；肿瘤；慢病毒

0引言

转化生长因子β(TGFβ)Smad信号途径在肿瘤发生机制中发挥重要作用. Smad4（deleted in pancreatic carcinoma locus 4， DPC4）在信号传输途径中处于中枢地位，活化的RSmads与Smad4结合成寡聚物，将TGFβ的信号传递到核内，调节靶基因的转录并诱导下游基因的表达［1］. 近年来，RNA干扰（RNA interference， RNAi）技术的出现，为研究内源性基因功能和信号转导途径提供了强有力的研究工具. 我们在已经获取Smad4基因的RNAi有效靶序列的基础上，设计、构建和鉴定表达Smad4 siRNA的慢病毒载体，为后期研究Smad4基因在肿瘤细胞中的作用机制和基因治疗打下基础.

1材料和方法

1.1材料采用慢病毒的包装细胞293T细胞株（中科院上海细胞所）、大肠杆菌菌株DH5α，DMEM，胎牛血清、胰蛋白酶（Invotrogen公司）. 慢病毒载体系统（Tronolab公司tronolab.com/lentivectors.php）. 该病毒包装系统由pLVTHM，pCMVdR8.74和pMD2G 3质粒组成，其中pLVTHM含有能持续表达小RNA的元件，同时能表达绿色荧光蛋白（GFP）. pCMVdR8.74和pMD2G含有病毒包装所必须的元件. 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、大量质粒DNA提取试剂盒（Qiagen公司).

1.2方法

1.2.1构建表达shRNA慢病毒载体用Ambion公司的设计软件，设计、合成3对针对Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列. 经分别构建质粒，转染293细胞，据其对Smad4的抑制率，确定有效靶序列：5′GTACTTCATACCATGCCGA3′，（Smad4 mRNA第1848位，GenBank gi：34147555）. 设计并合成（上海吉凯基因化学技术公司）其shRNA的DNA Oligo：5′CGCGTCCCCGTACTTCATACCATGCCGATTCAAGAGA

TCGGCATGGTATGAAGTACTTTTTGGAAAT3′（内含MluI和ClaI酶切位点，下划线所示tronolab.com/lentivectors.php）. 经退火形成双链DNA，与经MluI和ClaI双酶切后的pLVTHM载体连接，转化DH5大肠杆菌，挑取重组阳性克隆行PCR及测序鉴定（上海博亚生物技术有限公司）. PCR鉴定阳性克隆的primer: Up: 5′GTGTCACTAGGCGGGAACAC3′；Down: 5′TTATTCCCATGCGACGGTATC3′.

1.2.2慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，细胞密度为0.5×109/L时，重新接种于25 mL的细胞培养皿，37℃，50 mL/L CO2培养箱内培养，细胞密度达60%～70%时转染. 制备慢病毒包装系统中3种质粒DNA溶液（LVshSmad4 20 μg，pCMVdR8.74 15 μg，pMD2G 7.5 μg），无菌水定容至1800 μL， 再加入CaCl2 (2.5 mol/L) 溶液200 μL，混匀，加入2×BBS缓冲盐溶液2000 μL，室温放置20～30 min. 将DNA磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养12 h后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS 15 mL，轻摇后弃去，重复该步骤3次. 然后每瓶细胞中加入含100 mL/L小牛血清的细胞培养液15 mL，继续培养48 h. 收集转染72 h的293T细胞上清液. 于4℃，4000 g离心10 min；以0.45 μm滤器过滤后置于40 mL超速离心管中，4℃，25 000 r/min离心20 min；而后以冰PBS液重旋病毒沉淀，于4℃溶解过夜. 次日，以10 μL每管分装病毒液置于-70℃冰箱中保存. DMEM培养液重悬293T细胞至5×108/L， 在96孔板每孔中加100 μL重悬细胞. 取6个eppendorf管，每管中加入90 μL预热的OptiMEM培养基， 加10 μL病毒颗粒于第1管，混匀，从第1管取10 μL混合液于下一管，混匀；依次稀释病毒颗粒至第6管；将96孔板中培养基吸出，每孔加45 μL病毒颗粒稀释液，37℃温育8 h后，更换含100 mL/L FBS的培养液继续培养. 倒置荧光显微镜下检测GFP表达量，计算病毒滴度.

转贴于 　　2结果

2．1阳性克隆的PCR鉴定Smad4基因shRNA的寡核苷酸序列，经退火形成双链DNA，与经MluI和ClaI双酶切后的pLVTHM载体连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑取重组阳性克隆，行PCR鉴定阳性克隆. 重组细菌克隆的PCR产物277 bp（插入片段为67 bp），以经双酶切后没有插入片段的pLVTHM空载体PCR产物210 bp为对照（图1），鉴定结果与预期相符. 测序结果表明合成的Smad4 shRNA寡核苷酸链序列插入正确（123~189），此时命名慢病毒重组载体为LVshSmad4(图2).

M：Marker；1：对照；2：重组细菌克隆的PCR产物.

图1PCR鉴定阳性克隆（略）

2．2慢病毒载体的包装及滴度测定提取获得500 μg重组质粒. 将慢病毒包装系统中3种质粒共转染293T细胞，在倒置显微镜下观察各孔中GFP的表达量，病毒滴度为表达GFP的细胞数乘以相应稀释倍数. 测定滴度为5×1010 pfu/L，说明有大量质粒转入293T细胞，病毒成功包装.

3讨论

近年来TGFβSmad信号通路在恶性肿瘤中的研究是肿瘤信号转导领域的一大热点［1］. Smad4扮演抑癌基因的作用［2-4］. 利用Smad4在TGFβSmad通路中的处于中枢环节的机制，沉默敲除或者恢复Smad4，再研究其下游调节基因表达变化和生物学特性的改变，是倍受重视的研究思路［1］. RNAi技术的出现，成了一种新的反向遗传学手段被广泛地应用于基因功能分析、信号转导通路研究和基因治疗. 质粒介导RNAi有一定的局限性，转染率低，基因抑制表达作用弱，持续时间短［2-5］，不适合体内实验. 慢病毒载体是一种复制缺陷型逆转录病毒载体，以HIV1为基础发展而得，具有许多优点，能够转染非分裂期细胞和分裂期细胞，而且病毒的遗传物质能够整合到宿主的基因组，将其用于肿瘤的基因治疗，除比其他病毒载体更具优势外，病毒的VSVG外壳使载体病毒颗粒具有更强的稳定性，慢病毒载体RNAi作用持久，同时扩大了载体感染细胞的范围. 因此慢病毒载体是很有前途的基因治疗载体. 最近，用慢病毒载体介导RNAi的几项体内外研究［6-8］即显示了该技术策略在内源性基因功能研究和基因治疗前沿领域的重大意义.

基于目前尚无将RNAi技术应用于肝细胞癌Smad4的研究报道， 我们在筛选出Smad4基因RNAi的有效靶序列后，构建表达shRNA慢病毒载体，以进一步研究沉默Smad4基因对肝癌细胞生物学行为的影响并探讨其机制. 为构建Smad4 shRNA慢病毒载体，购买了病毒包装系统pLVTHM，pCMVdR8.74和pMD2G质粒. 其中，pLVTHM质粒中含有H1启动子，能在宿主细胞中持续表达siRNA，同时该质粒能表达由EF1（Elongation Factor）启动子驱动的GFP，可用于病毒包装时转染效率及感染目的细胞的感染效率的检测. pCMVdR8.74质粒中含有HIV病毒的Gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；Pol基因，编码病毒特异性的酶；Rev基因，编码调节Gag和Pol基因表达的调节因子. pMD2G质粒中含有单纯疱疹病毒来源的VSVg基因，提供病毒包装所需要的衣壳蛋白. 293T细胞是293细胞的一种，作为包装细胞，在包装后产生了高滴度的病毒颗粒，同时表达报告基因. 本结果表明，成功构建了含有GFP报告基因的Smad4基因shRNA慢病毒载体，为进一步研究Smad4基因在肿瘤中的作用机制和动物基因治疗奠定基础.

图2慢病毒重组载体LVshSmad4的测序结果（略）.

【参考文献】

［1］ 季国忠，王学浩. 转化生长因子βSmad信号转导通路在肿瘤发生中的作用［J］. 医学研究生学报， 2005， 18(6):542-545.

［2］ Jazag A， Ijichi H， Kanai F， et al. Smad4 silencing in pancreatic cancer cell lines using stable RNA interference and gene expression profiles induced by transforming growth factorβ［J］. Oncogene， 2005， 24(4):662-671.

［3］ Ijichi H， Otsuka M， Tateishi K， et al. Smad4independent regulation of p21/WAF1 by transforming growth factorbeta［J］. Oncogene， 2004， 23(5): 10043-10051.

［4］ Imamura T， Kanai F， Kawakami T， et al. Proteomic analysis of the TGFbeta signaling pathway in pancreatic carcinoma cells using stable RNA interference to silence Smad4 expression［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2004， 318(1): 289-296.

［5］ 唐红卫，潘阳林，聂勇战，等. Osteopontin特异性siRNA真核表达载体的构建及其在GC9811胃癌细胞中沉默效应的鉴定［J］. 第四军医大学学报， 2005，26(3)：202-205.

［6］ Singer O， Marr RA， Rockenstein E， et al. Targeting BACE1 with siRNAs ameliorates Alzheimer disease neuropathology in a transgenic model ［J］. Nat Neurosci， 2005， 8(10)： 1343-1349.

［7］ Wiznerowicz M， Trono D. Conditional suppression of cellular genes: Lentivirus vectormediated druginducible RNA interference ［J］. J Virol， 2003， 77(16): 8957-8951.

反向遗传学研究方法范文第4篇

1917-1919年

欧洲爆发流感疫症，导致2,000万人死亡(第一次世界大战的死亡人数只是850万人)，是历史上最严重的流感疫症。

1957-1958年

1957年2月在中国贵州爆发(病毒可能是在1956年从苏联传来)，其後散播至世界各地。全球受影响的人数占总人口的10%至30%，但死亡率较1919年的疫症为低，约为总人口的0.25%。

1968-69年

流感从香港开始，全球的死亡人数达70万人，其中美国就占3万多人。

1976年

新泽西一名青年染上猪流感，引致恐慌会爆发新疫症，於是大规模推行疫苗注射。

1986-1993

世界不同地区发生数宗人类染上猪流感的病案。

1997年

香港发生禽流感，原本只影响鸡只的病毒亦令人类患病。香港政府下令层宰150万鸡只。受影响的人数为18人，其中6人死亡。

中国是全球流感高发国家之一，发病情况十分严重。由于流感流行，影响生产、学校停课、医院病人骤增等问题和现象亦屡见不鲜，而且历史上几次流感大流行源于中国，因此，中国的流感监测工作对全球起着举足轻重的作用。

卫生部高度重视流感的监测和防治工作，将流感列为重点防治的传染病之一，加强对流感防治工作的领导，定期研究与部署流感防治工作，组织制定流感防治策略，进一步加大防治力度，目前已在全国31个省开展流感监测工作 。

随着中国经济的发展，人口流动频繁，人口老龄化，流感高危人群比例不断增加，流感的危害及其监测和防治工作的重要性也进一步引起了各级政府的高度重视 。

近年来，在中国，随着人民生活水平的提高，医药卫生条件的改善和医疗保健知识的普及，人民群众对流感的防治，尤其是流感疫苗的使用高度关注，流感疫苗的使用量比以前明显增加。但是，流感疫苗使用不同于其它疫苗，在疫苗种类、接种对象、接种时间等方面都应进行科学的选择。因此，卫生部组织制定了全国性的流感疫苗免疫策略，以指导各地科学、规范、有序地开展流感疫苗接种工作，更大程度地发挥流感疫苗的免疫预防作用，让公众了解关于流感疫苗使用的科学知识 。

目前，我国已建立了全国性流感监测网络，并具备较好的工作基础。我们将继续加强和完善监测网络的工作，使之成为系统、规范、灵敏、有效的监测网络，收集各类监测信息和资料，综合分析，为流感的预防和控制决策提供科学的依据。同时，要逐步开展和加强流感对人群健康的危害和对社会经济的影响及流感疫苗效益等方面的研究。

根据流感监测和其它方面研究的结果，不断对我国流感免疫策略进行修改和完善，以保护人民群众健康，促进社会经济发展。

流感病毒的快速诊断与流感疫情监测的研究

成果简介：该课题研究建立了一套由3种快速诊断方法组成的可用于不同场合进行检测的快速诊断方法，尤其是摇床吸附微量细胞板短期培养法是国内首次报导的一种快速诊断方法。建立了复盖宁波市全市范围的流感监测网络，共检测流感毒株330株，仅2004年就向国家流感中心上送流感毒株250株，其中50株被国家流感中心选送到世界卫生组织作为筛选流感疫苗的备用株。建立了宁波市2002年以来甲3型流感病毒HA1基因变异情况的基因进化树。为宁波市今后的流感病毒防治提供了分子生物学的基础。

所处阶段：成熟应用阶段

完成单位：宁波市疾病预防控制中心

治流感病毒液及其制备方法

成果简介：课题选用名贵中药，采用高科技手段，发明专利产品“治流感病毒液”（对外宣传和检验单为“东方神液”）。特点：见效快；降温快；无副作用；能对付任何流感变异性病毒；预防感冒效果好；可能对“非典”有作用。该产品市场前景非常广阔，据统计全世界63亿人口，平均每人每年患感冒4次。该产品技术成熟，属世界领先水平，先后经湖南、湖北、黑龙江、安徽、福建等省上万人次应用效果确实好，但目前主要问题是：资金缺乏，无法投产。

所处阶段：成熟应用阶段

完成单位：武汉巨英超王高科技有限公司

流感病毒快速检测方法的建立及应用

成果简介：建立了一种敏感、快速的流感病原的诊断方法。首先将病人咽拭子标本接种狗肾传代细胞（MDCK Cell）培养24～48小时，可以使流感病毒在采集标本后立即在细胞内增殖，克服了流感病毒容易在常温下失去繁殖能力，其RNA易降解的缺点。上述短时培养结束后，用流感特异性引物做反转录多聚酶链反应（RT-PCR），进一步检测流感病毒基因，为临床提供快速、特异检测流感病毒基因，确定流感病毒感染与流行的方法。应用上述方法，在流感流行期，快速确定流感病原采取消毒、隔离等措施，防止流感流行，对适合使用疫苗者提供了帮助，取得了巨大的社会效益。

所处阶段：中期阶段

完成单位：中国医科大学

我国马流感病毒不同分离株生物学

成果简介：本项目分离到了青海马流感病毒株并采用病毒分离鉴定、血清学、病理学、动物感染试验、反转录－聚合酶链式反应、核酸序列比较分析等综合性手段，对该病毒株进行了深入的研究，证明该毒株为H_3N_8。经过基因组进行比较研究发现，该毒株与我国香港1992年分离毒株关系密切，血凝素基因核苷酸同源率达94%以上，神经氨酸酶基因同源率达96%以上，白基因核苷酸与欧美等国家的参考毒株同源率达96%以上，其他基因核苷酸的同源性也达90%以上，与1974年北京马流感病毒株和1989年吉林马流感病毒株明显不同。研究表明我国青海省马流感病毒分离株可能从欧洲经由香港传入大陆。同时，又将其与其他两个病毒株进行了比较。建立了该病的诊断方法，进行了疫苗制备的初步试验以及明确了我国马流感病毒在进化系统中的分子生物学地位，为我国防制马流感提供了有效的技术平台。本研究明确了我国马流感病毒间遗传演化关系，建立了马流感HI和琼扩诊断方法，并初步制备了马流感灭活疫苗。

所处阶段：中期阶段

完成单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

成人接种卡介苗（BCG）对流感预防作用的研究

成果简介： 该课题研究通过接种BCG，提高人机体的非特异性免疫力，杀灭或遏制病原体，使流感病毒虽然感染人但不致病。本次研究结果，BCG接种对流感保护率达74.49%。该研究不仅国内，而且国外都未见到这类的研究报道。它是BCG用途的创新，扩大了BCG的使用范围；开创了预防流感的新途径，探索出预防流感的新方法，增加了人类征服流感的一种手段。BCG接种简单易行，保护率高，费用低，时效长，实用性好。BCG一直广泛使用在全球；是生物制品中最安全疫苗。使用范围为全世界；使用对象几乎为全人类。研究中尚未探讨清楚BCG接种后防流感的机理。

所处阶段：成熟应用阶段

完成单位：淮安市疾病预防控制中心

穿琥宁抑制流感病毒诱导狗肾传代细胞凋亡的研究

成果简介： 该研究国内外首次报告穿琥宁有抗HN和乙型流感病毒诱导MDCK细胞凋亡的作用，其作用与病毒唑相似，并从细胞基因调控着手研究病毒的致病机理及穿琥宁的抗病毒作用为临床防治流感提供了新的实验依据，增加了可信度；穿琥宁抑制HN和B型流感病毒诱导MDCK细胞AP的抑制率（IR）与利巴韦林类似，进一步证明穿琥宁是抗流感的良药，对该药在治疗流感领域产生了积极的影响；南昌地区流感由甲型和乙型流感病毒引起，2000年3月发生的流行由甲型流感病毒所致，为制备疫苗和研究流感病毒提供了新的变异毒株；采用鸡胚和狗肾传代细胞（MDCK）分离流感病毒可提高病毒分离的阳性率。

所处阶段：中期阶段

完成单位：江西医学院第四附属医院

H5N3亚型流感病毒细胞培养灭活疫苗的研究

成果简介：H5N3细胞苗的研制填补了禽流感防制的一项空白，该研究居国际先进水平。查新结果表明，利用反向遗传学技术构建全部基因都来自禽流感病毒的重组禽流感细胞疫苗株为国际上首次报道。rH5N3油乳剂灭活细胞苗免疫持续期和对强毒攻击保护性完全达到了鸡胚苗的效果。由于H5N3疫苗株全部基因都来源于禽流感病毒，生物安全程度高于由人－禽流感病毒拯救的重组病毒；保护性抗原基因来自国内最新流行株，因此疫苗株与流行株的抗原匹配性好，免疫效果确实。此外，采用常规的血清学方法就可以进行免疫与野毒感染家禽的鉴别诊断。

所处阶段：初期阶段

完成单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

我国马流感病毒不同分离株生物学特征的研究

成果简介：本项目分离到了青海马流感病毒株并采用病毒分离鉴定、血清学、病理学、动物感染试验、反转录－聚合酶链式反应、核酸序列比较分析等综合性手段，对该病毒株进行了深入的研究，证明该毒株为H_3N_8。经过基因组进行比较研究发现，该毒株与我国香港1992年分离毒株关系密切，血凝素基因核苷酸同源率达94%以上，神经氨酸酶基因同源率达96%以上，白基因核苷酸与欧美等国家的参考毒株同源率达96%以上，其他基因核苷酸的同源性也达90%以上，与1974年北京马流感病毒株和1989年吉林马流感病毒株明显不同。研究表明我国青海省马流感病毒分离株可能从欧洲经由香港传入大陆。同时，又将其与其他两个病毒株进行了比较。建立了该病的诊断方法，进行了疫苗制备的初步试验以及明确了我国马流感病毒在进化系统中的分子生物学地位，为我国防制马流感提供了有效的技术平台。

所处阶段：中期阶段

完成单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

流感嗜血杆菌培养、鉴定及药物敏感性研究

成果简介：该研究对张家口贫困地区健康人群及呼吸道感染儿童HI携带及感染情况进行了调查研究，并对分离菌株进行生物分型及药物敏感性研究，结果表明：不同年龄健康人群HI带菌率不同；黄连、连翘、金莲花等10种中草药对HI菌株均有不同程度的抑菌作用，且黄连的抑菌作用最强。该研究达国内领先水平。

所处阶段：初期阶段

完成单位： 张家口医学院

天津地区流感病毒分子流行病学和致病性的初步研究

成果简介：本项目首次对天津地区分离的流感病毒进行基因序列分析，从分子水平上了解天津流感病毒的变异特点和规律。首次应用SSCP方法用于流感病毒HA1基因片段点突变的研究，并作为初步筛查流感病毒代表株的方法。比较了甲3亚型“O”相及“D”相毒株、乙型中Victoria与Yamagata系之间致细胞凋亡能力。该研究建立了一套检测病毒的分子生物学实验方法，为我市预防控制流感提供了病毒分子生物学依据，提高了应对卫生突发事件的能力。

所处阶段：成熟应用阶段

完成单位：天津市卫生防病中心

禽H9N2流感病毒感染人的发现及其基因来源的研究

成果简介：禽H9N2毒株能感染人，并能在自然界中发生基因重配，同时重配子能感染人均为国际上首次发现，此发现表明禽流感病毒能直接感染人，也可能原先对人不致病的禽流感病毒，通过基因重配形成了对人致病的重配子。因此上述发现味彻底揭开流感大流行株起源及我国流感多发的原因提供了新的科学依据，证实了禽流感味一种新出现的传染病，为国际反生物恐怖及流感大流行防治策略制定提供了新内容。

所处阶段：中期阶段

完成单位：中国疾病预防控制中心病毒学研究所

抗流感药奥司他韦（二氨基莽草酸酯）合成新工艺

成果简介：该产品是其活性代谢产物的药物前体，其活性代谢产物是强效的选择性的流感病毒神经氨酸酶抑制剂。病毒神经氨酸酶活性对新形成的病毒颗粒从被感染细胞的释放和感染性病毒在人体内进一步传播是关键的。药物的活性代谢产物抑制甲型和乙型流感病毒的神经氨酸酶。体外在很低的毫微克分子浓度即有抑制效应。在体外观察到活性代谢产物抑制流感病毒生长，在体内也观察到其抑制流感病毒的复制和致病性。该产品通过抑制病毒从被感染的细胞中释放，从而减少甲型或乙型流感病毒的传播。以具有莽草酸骨架结构的1-环己烯-4-酮甲酸乙酯为起始原料，经10步反应合成奥司他韦的工艺过程具有新颖性。

所处阶段：初期阶段

完成单位：南京莱因医药科技有限公司

双重实时荧光定量RT-PCR快速检测A、B型流感病毒的研究

成果简介：该研究利用双重实时荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A、B型流感病毒的方法。根据A型流感M基因和B型流感HA基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针，建立、优化单一和双重反应体系后，利用十倍稀释法对已知滴度的流感病毒进行梯度稀释，检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线。结果表明，A型、B型流感病毒双重反应的灵敏度分别为2.56 × 10^(-5)和5.0 × 10^(-5) TCID50，说明双重反应中A、B型的引物、探针、模板之间无相互干扰，具有很好的稳定性和重现性。

所处阶段：成熟应用阶段

完成单位：深圳市疾病预防控制中心

鸭、鹅、猪H5、H7亚型和A型流感病毒通用型抗体检测力法的研究

成果简介：以杆状病毒为表达载体，表达了禽流感病毒的白基因，与流感病毒白具有相同的生物活性。重组病毒表达产物与流感病毒抗血清作免疫琼脂双向扩散试验，均出现明显清晰的沉淀线，与全病毒琼扩抗原出的沉淀线完全吻合。用重组杆状病毒的表达产物制备了A型流感病毒及鸭、蛾、猪H5、H7亚型病毒通用型重组白抗原，H5、H7亚型流感病毒的HI分型抗原和血清。建立了以NP为检测抗原鸭、鹅型禽流感间接ELISA检测方法，以全病毒作为抗原建立了猪流感抗体间接ELISA诊断方法，确立了最佳反应条件和术式。

所处阶段：成熟应用阶段

完成单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

克感利咽口服液的新药研究及其抗流感病毒的免疫―自由基机理

成果简介：本课题研制了克感利咽口服液（克感液），并从整体水平、器官水平、细胞水平和亚分子水平进行了多层次、多指标的综合研究。肯定了克感液的抗流感病毒作用，并首次提出抗病毒的免疫-自由基机理和中药在抗病毒作用中的重要地位。证明了中药复方克感液可通过调节机体氧化应激水平起到非常重要的治疗流感作用。此外还通过黄嘌呤氧化酶体系发光法和全血吞噬化学发光法，证明了克感利咽口服液具有较强的清除活性氧作用。为克感利咽口服液能降低氧化应激水平并参与抗病毒的免疫－自由基机制提供了可靠的实验依据。

所处阶段：成熟应用阶段

完成单位：中国中医科学院广安门医院/中国中医科学院第二临床医药研究所

我国儿科流感嗜血杆菌性疾病及分离株耐药分子流行病学研究

成果简介： 该研究从建立流感嗜血杆菌b型（Hib）标准化诊断技术和感染菌株分子生物学研究平台入手，引入国外先进培养分离技术、建立多种特异性抗原、抗体检测方法、基因诊断和分型方法，为其感染和耐药的流行病学研究提供有效工具。该项目进行了以人群（合肥市）为基础、前瞻性、小儿化脓性脑膜炎三年流行病学监测，并进行了两次以医院(北京儿童医院)为基础小儿化脓性脑膜炎病原学调查。连续五年对北京、上海、广州三所儿童医院随机选取5059例上呼吸道感染儿童进行Hi鼻咽携带和菌株常用抗生素敏感性监测，并采用分子生物学方法对氨苄青霉素耐药菌株进行耐药机制和基因分型研究。

所处阶段：中期阶段

完成单位：首都医科大学附属北京儿童医院

广州地区呼吸道感染儿童流感嗜血杆菌、肺炎链球菌携菌和耐药监测及分离鉴定方法的研究

成果简介：该研究首次在广州地区进行了连续5年儿童呼吸道感染肺炎链球菌、流感嗜血杆菌耐药监测。首次对流感嗜血杆菌耐药性的季节分布、性别差异、健康儿和上呼吸道感染儿携流感嗜血杆菌和耐药性的比较、耐药表型的分布、多重耐药等方面进行全面、系统地研究,建立了一整套完整的对菌株的保存，复苏的技术。首次用克林霉素纸片法检测广州地区对红霉素耐药的肺炎链球菌中ermB及mefE基因分布，并比较ermB基因与mefE基因对红霉素耐药的肺炎链球菌的耐药性；筛选出广州地区治疗儿童流感嗜血杆菌感染的一线药物以二代头孢菌素和/或青霉素类/克拉维酸为首选，治疗儿童肺炎链球菌感染的一线药物以青霉素/克拉维酸类药物为首选。

所处阶段：成熟应用阶段

完成单位：广州市儿童医院

猪型（H1N1）和马2（H3N8）亚型流感病毒发现的意义及其来源的研究

成果简介：该项目采用现场与实验室相结合，走协作道路，应用了综合性方法，即从一般的生物学至当今国际上先进的分子生物学技术。这样全面系统的研究方式在国内实属罕见，在国际上也属先进之列。不仅使实验结果更加可信和可靠，而且也保证了实验在较高的水平上进行。猪型（H1N1）流感病毒于1930年就已从美国猪群中分离到，而后陆续蔓延到欧洲和亚洲，我国从1976年开始寻找它在猪群中人群中存在的线索，但1991年之前均未能找到它，更未能找到被猪型病毒感染的患者。同样，马2（H3N8）亚型毒株于1963年已从美国迈阿密马群中被发现，而后波及到欧洲和亚洲。

所处阶段：中期阶段

完成单位：中国疾病预防控制中心病毒学研究所

猪流感（H1-H3亚型单价和H1-H3亚型双价）氢氧化铝胶灭活疫苗的研究及应用

成果简介：该项目对分离自中国不同地区、不同亚型SIV流行株的生物学特性进行了研究，筛选出免疫原性好，与全国范围流行的H1N1和H3N2亚型各抗原群均有很好抗原反应性，对鸡胚高滴度适应的流行株作为种毒，接种非免疫鸡胚大量增殖后收取无菌尿囊液，灭活使病毒失去感染和复制能力但保持其良好的免疫原性；含猪流感病毒尿囊液的蛋白质抗原与氢氧化铝胶混合、浓缩，制成的灭活疫苗，可较长期存留在猪体，持续释放抗原并刺激猪内持续产生特异性抗H1N1或（和）H3N2亚型猪流感，保护率高，免疫效果确实，免疫期持续时间长，可有效降低高热、咳嗽、呼吸困难等临床症状，增加平均日增重，显著改善饲料转化率。适用于中国不同地区猪场和猪群对H1N1和H3N2亚型流感的预防和紧急免疫。

所处阶段：成熟应用阶段

完成单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

鸡新城疫－流感－传染性囊病－肾（腺胃）型传支四联油乳油剂灭活苗的研究

成果简介：该课题用新城疫病毒Clone30株和从河北省自行分离的禽流感病毒A/鸡/河北/9901/1/99株、传支病毒肾型S株和腺胃型C株、传染性囊病病毒EBV91株研制成四联油苗，该联苗在4-8℃保存12个月，20-25℃保存3个月不影响免疫效果，用该疫苗免疫15日龄雏鸡后14天保护率达90%以上，免疫期达6个月。该研究达国内领先水平。