正向遗传学克隆基因的方法
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正向遗传学克隆基因的方法范文第1篇
1 理论分子群体遗传学的发.展简史
经典群体遗传学最早起源于英国数学家哈迪和德国医学家温伯格于1908年提出的遗传平衡定律。以后， 英国数学家费希尔、遗传学家霍尔丹(Haldane JBS)和美国遗传学家赖特(Wright S)等建立了群体遗传学的数学基础及相关计算方法， 从而初步形成了群体遗传学理论体系， 群体遗传学也逐步发展成为一门独立的学科。群体遗传学是研究生物群体的遗传结构和遗传结构变化规律的科学， 它应用数学和统计学的原理和方法研究生物群体中基因频率和基因型频率的变化， 以及影响这些变化的环境选择效应、遗传突变作用、迁移及遗传漂变等因素与遗传结构的关系， 由此来探讨生物进化的机制并为育种工作提供理论基础。从某种意义上来说， 生物进化就是群体遗传结构持续变化和演变的过程， 因此群体遗传学理论在生物进化机制特别是种内进化机制的研究中有着重要作用[1]。
在20世纪60年代以前， 群体遗传学主要还只涉及到群体遗传结构短期的变化， 这是由于人们的寿命与进化时间相比极为短暂， 以至于没有办法探测经过长期进化后群体遗传的遗传变化或者基因的进化变异， 只好简单地用短期变化的延续来推测长期进化的过程。而利用大分子序列特别是DNA序列变异来进行群体遗传学研究后， 人们可以从数量上精确地推知群体的进化演变， 并可检验以往关于长期进化或遗传系统稳定性推论的可靠程度[1]。同时， 对生物群体中同源大分子序列变异式样的研究也使人们开始重新审视达尔文的以“自然选择”为核心的生物进化学说。20世纪60年代末、70年代初， Kimura[2]、King和Jukes[3]相继提出了中性突变的随机漂变学说: 认为多数大分子的进化变异是选择性中性突变随机固定的结果。此后， 分子进化的中性学说得到进一步完善[4]， 如Ohno[5]关于复制在进化中的作用假说: 认为进化的发生主要是重复基因获得了新的功能， 自然选择只不过是保持基因原有功能的机制; 最近Britten[6]甚至推断几乎所有的人类基因都来自于古老的复制事件。尽管中性学说也存在理论和实验方法的缺陷， 但是它为分子进化的非中性检测提供了必要的理论基础[7]。目前， “选择学说”和“中性进化学说”仍然是分子群体遗传学界讨论的焦点。
1971年， Kimura[8]最先明确地提出了分子群体遗传学这一新的学说。其后， Nei从理论上对分子群体遗传学进行了比较系统的阐述。1975年， Watterson[9]估算了基于替代模型下的DNA多态性的参数Theta(θ)值和期望方差。1982年， 英国数学家Kingman[10， 11]构建了“溯祖”原理的基本框架， 从而使得以少量的样本来代表整个群体进行群体遗传结构的研究成为可能， 并可以进一步推断影响遗传结构形成的各种演化因素。溯祖原理的“回溯”分析使得对群体进化历史的推测更加合理和可信。1983年， Tajima[12]推导了核甘酸多样度参数Pi(π)的数学期望值和方差值。此后， 随着中性平衡的相关测验方法等的相继提出[13~15]， 分子群体遗传学的理论及分析方法日趋完善[16]。
近20年来， 在分子群体遗传学的基础上， 又衍生出一些新兴学科分支， 如分子系统地理学(molecular phylogeography)等。系统地理学的概念于1987年由Avise提出， 其强调的是一个物种的基因系谱当前地理分布方式的历史成因[17]， 同时对物种扩散、迁移等微进化历史等进行有效的推测[18]。
2 实验植物分子群体遗传研究内容及进展
基于DNA序列变异检测手段的实验分子群体遗传学研究始于1983年， 以Kreitman[19]发表的“黑腹果蝇的乙醇脱氢酶基因位点的核苷酸多态性”一文为标志。以植物为研究对象的实验分子群体遗传学论文最早发表于20世纪90年代初期[20， 21]， 但是由于当时DNA测序费用昂贵等原因， 植物分子群体遗传学最初发展比较缓慢， 随着DNA测序逐渐成为实验室常规的实验技术之一以及基于溯祖理论的各种计算机软件分析程序的开发和应用， 实验分子群体遗传学近10年来得到了迅速的发展， 相关研究论文逐年增多， 研究的植物对象主要集中在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.)及重要的农作物如玉米(Zea mays L.)、大麦(Hordeum vulgare L.)， 水稻(Orazy sativa L.)、高粱(Sorghum bicolor L.)、向日葵(Helianthus annuus L.)等上[16]。其研究内容涵盖了群体遗传结构(同源DNA分化式样)、各种进化力量如突变， 重组， 连锁不平衡、选择等对遗传结构的影响、群体内基因进化方式(中性或者适应性进化)、群体间的遗传分化及基因流等。同时， 通过对栽培物种与野生祖先种或野生近缘种的DNA多态性比较研究， 分子群体遗传学在研究作物驯化的遗传学原因及结果等也取得了重要的进展， 如作物驯化的遗传瓶颈， 人工选择对“驯化基因”核苷酸多态性的选择性清除(selective sweep)作用等等。
2.1 植物基因或基因组DNA多态性
分子群体遗传学的研究基础是DNA序列变异。同源DNA序列的遗传分化程度是衡量群体遗传结构的主要指标， 其分化式样则是理解群体遗传结构产生和维持的进化内在驱动力诸如遗传突变、重组、基因转换的前提。随着DNA测序越来越快捷便利及分子生物学技术的飞速发展， 越来越多的全基因组序列或者基因序列的测序结果被发表， 基因在物种或群体中的DNA多态性式样也越来越多地被阐明。
植物中， 对拟南芥和玉米基因组的DNA多态性的调查最为系统， 研究报道也较多。例如， Nordborg等[22]对96个样本组成的拟南芥群体中的876个同源基因片段(0.48 Mbp)的序列单核苷酸多态性进行了调查， 共检测到17 000多个SNP， 大约平均每30 bp就存在1个SNP位点。而Schmid等[23]的研究结果显示: 拟南芥基因组核甘酸多态性平均为0.007( W)。Tenaillon等[24]对22个玉米植株的1号染色体上21个基因共14 420 bp序列的分析结果显示玉米具有较高的DNA多态性(1SNP/27.6 bp、 =0.0096)。Ching等[25]研究显示: 36份玉米优系的18个基因位点的非编码区平均核苷酸多态性为1SNP/31 bp， 编码区平均为1SNP/124 bp， 位点缺矢和插入则主要出现在非编码区。此外， 其他物种如向日葵、马铃薯(Solanum tuberosum)、高粱、火矩松(Pinus taeda L.)、花旗松(Douglas fir)等[26～30]中部分基因位点的DNA多态性也得到调查， 结果表明不同的物种的DNA多态性存在较大的差异。
繁育方式是显著影响植物基因组的DNA多态性重要因素之一。通常来说， 自交物种往往比异交物种的遗传多态性低， 这已经被一些亲缘关系相近但繁育方式不同的物种如Lycopersicon属植物和Leavenworthia属植物的种间比较研究所证实[31， 32]。但是在拟南芥属中则不然， Savolainen等[33]比较了不同繁育方式的两个近缘种Arabidopsis thaliana(自交种)和Arabidopsis lyrata(异交种)的乙醇脱氢酶基因(Alcohol Dehydrogenase)的核苷酸多态性， 结果发现A. thaliana的核苷酸多态性参数Pi值为0.0069， 远高于A. lyrata的核苷酸多态性(Pi=0.0038)。
2.2 连锁不平衡
不同位点的等位基因在遗传上不总是独立的， 其连锁不平衡程度在构建遗传图谱进行分子育种及图位克隆等方面具有重要的参考价值。Rafalski和Morgante等[34]在比较玉米和人类群体的连锁不平衡和重组的异同时对连锁不平衡的影响因素做了全面的阐述， 这些因素包括繁育系统、重组率、群体遗传隔离、居群亚结构、选择作用、群体大小、遗传突变率、基因组重排以及其他随机因素等。物种的繁育系统对连锁不平衡程度具有决定性的影响， 通常来说， 自交物种的连锁不平衡水平较高， 而异交物种的连锁不平衡水平相对较低。但是也有例外， 如野生大麦属于自交物种， 然而它的连锁不平衡水平极低[35~37]。
拟南芥是典型的自交植物， 研究表明: 拟南芥组基因大多数位点的连锁不平衡存在于15～25 kb左右的基因组距离内[22]， 但是在特定位点如控制开花时间的基因及邻接区域， 连锁不平衡达到250 kb的距离[38]。拟南芥基因组高度变异区段同样具有较强的连锁不平衡[39]。这些研究结果说明拟南芥非常适合构建连锁图谱， 因为用少量的样本就可以组成一个有效的作图群体。除拟南芥外， 其它自交物种大多表现出较高的连锁不平衡水平， 如大豆的连锁不平衡大于50 kb[40]; 栽培高粱的连锁不平衡大于15 kb[41]; 水稻的Xa位点连锁不平衡可以达到100 kb以上[42]。
与大多数自交物种相比， 异交物种的连锁不平衡程度则要低得多。例如， 玉米的1号染色体的体连锁不平衡衰退十分迅速，大约200 bp距离就变得十分微弱[24]， 但是在特定的玉米群体如遗传狭窄的群体或者特定基因位点如受到人工选择的位点， 连锁不平衡水平会有所增强[43~46]。野生向日葵中， 连锁不平衡超过200 bp的距离就很难检测到(r=0.10)， 而栽培向日葵群体连锁不平衡程度则可能够达到约1 100 bp的距离(r=0.10)[26]。马铃薯的连锁不平衡在短距离内下降迅速(1 kb降到r2=0.2左右)， 但在1Kb以外下降却十分缓慢(10 cM降到r2=0.1)[27]。此外， 异交繁育类型的森林树种如火矩松、花旗松等同样显示出低水平的连锁不平衡[30， 31]。
转贴于 2.3 基因组重组对DNA多态性的影响
基因组的遗传重组是指二倍体或者多倍体植物或者动物减数分裂时发生的同源染色体之间的交换或者转换[47]。它通过打破遗传连锁而影响群体的DNA多态性式样， 其在基因组具点发生的概率与该位点的结构有很大的关系， 基因组上往往存在重组热点区域， 如玉米的bronze(bz)位点， 其重组率高于基因组平均水平100倍以上[48]; 并且重组主要发生在染色体上的基因区域， 而不是基因间隔区[49， 50]。同时， 在基因密度高的染色体区段比基因密度低的染色体区段发生重组的频率也要高得多[41， 51]; 在不同的物种中， 基因组重组率平均水平也有很大的差异。如大麦群体基因组的重组率为 =7～8×10–3 [52]，高于拟南芥( =2×10–4)40倍[27]， 但只有玉米( =12～14×10–3)的一半左右[24]。
目前有很多关于重组和DNA多态性之间的相关关系的研究， 但是没有得到一致的结论。部分研究显示重组对DNA多态性具有较强的影响。如Tenaillon等[24]研究显示玉米1号染色体的DNA多态性高低与重组率具有较高的相关性(r=0.65， P=0.007)， 野生玉米群体、大麦及野生番茄也都存在同样的现象[52~54]。而在拟南芥中， 重组对DNA多态性的贡献率就非常低[22]。Schmid等[23]用大量的基因位点对拟南芥群体的核苷酸多态性进行调查后发现: 重组率与核苷酸多态性相关关系不显著; Wright等[55]调查了拟南芥1号和2号染色体的6个自然群体序列变异式样， 结果显示， 在着丝粒附近重组被抑制的染色体区域， 核苷酸多态性并没有随之降低。说明了拟南芥基因组的重组率与DNA多态性并没有必然的相关关系。Baudry等[31]对番茄属内5个种进行了比较研究， 结果也显示重组对种群间的DNA多态性的影响也不明显。
2.4 基因进化方式(中性进化或适应性进化)
分子群体遗传学有两种关于分子进化的观点: 一种是新达尔文主义的自然选择学说， 认为在适应性进化过程中， 自然选择在分子进化起重要作用， 突变起着次要的作用。新达尔文主义的主要观点包括: 任何自然群体中经常均存在足够的遗传变异， 以对付任何选择压力; 就功能来说， 突变是随机的; 进化几乎完全取决于环境变化和自然选择; 一个自然群体的遗传结构往往对它生存的环境处于或者接近于最适合状态; 在环境没有发生改变的情况下， 新突变均是有害的[56]。另一种是日本学者Kimura为代表的中性学说， 认为在分子水平上， 种内的遗传变异(蛋白质或者DNA序列多态性)为选择中性或者近中性， 种内的遗传结构通过注入突变和随机漂变之间的平衡来维持， 生物的进化则是通过选择性突变的随机固定(有限群体的随机样本漂移)来实现， 即认为遗传漂变是进化的主要原因， 选择不占主导地位[2~4]。这两种学说， 在实验植物分子群体遗传学的研究中都能得到一定的支持。
对植物基因在种内进化方式的研究主要集中在拟南芥菜、玉米、大麦等农作物及少数森林树种。Wright和Gaut[16]对2005以前发表的相关文章进行详细的统计， 结果显示: 拟南芥中大约有30%的基因表现为适应性进化; 玉米中大约有24%的基因表现为非中性进化; 大麦的9个基因中， 有4个受到了选择作用的影响。
选择作用主要包括正向选择、平衡选择、背景选择及稳定选择， 它们单独或者联合对特定基因的进化方式产生影响。如花旗松中的控制木材质量和冷硬性状的基因[30]、火炬松的耐旱基因[29]、欧洲山杨(European aspen)的食草动物诱导的蛋白酶抑制基因(Herbivore-induced Protease Inhibitor)等[57]， 经检测在各自的群体受到了正向选择、平衡选择、背景选择单独或者多重影响。植物抗性基因(R基因)是研究得比较深入的一类基因， 大部分研究结果显示抗性基因具有高度的多态性， 并经受了复杂的选择作用[58]。Liu和Burke[26]对栽培大麦和野生大麦群体中9个基因在调查显示其中的8个基因受到稳定选择。Simko等[27]对47份马铃薯66个基因位点调查表明， 大部分基因位点在马铃薯群体进化过程中受到了直接选择或者分化选择作用。以上对不同物种的不同基因位点的研究都强调了分子进化的非中性的结果， 这说明选择在基因的进化过程中具有非常重要的作用; 另一方面， 中性进化的结果报道较少， 或被有意或者无意地忽略， 事实上即使在强调选择作用的研究文献中， 仍然有相当一部分基因表现为中性进化， 说明在种内微观进化的过程中， 选择作用和中性漂变作用可能单独或者联合影响了物种内不同的基因位点， 共同促进了物种的进化。
2.5 群体遗传分化
分子群体遗传学一个重要的研究内容是阐明物种不同群体之间甚至不同物种群体之间(通常近缘种， 如栽培种及其近缘种或祖先野生种)遗传结构的差异即遗传分化， 并推测形成这种差异的原因， 从而使人能够更好地理解种群动态。
植物种内不同群体间遗传分化的研究案例有很多， 典型的有: (1)拟南芥全球范围内的遗传分化。Kawabe和Miyashita[59]利用碱性几丁质酶A(ChiA)、碱性几丁质酶B(ChiB)及乙醇脱氢酶(Ahd)3个基因对拟南芥进行群体亚结构的分析， 结果只有ChiB显示出一定的群体亚结构， 而ChiA、Ahd的系统学聚类与样本地理来源之间没有表现出任何相关关系，这样的结果暗示了拟南芥近期在全球范围内经历了迅速扩张。Aguade[60]和Mauricio等[61]分别用不同的基因、Schmid等[23]用多基因位点进行的拟南芥分子群体遗传学研究也支持同样的结论。(2)森林树种的遗传分化。Ingvarsson等[62]发现欧洲山杨的日长诱导发芽的侯选基因(phyB)变异方式呈现出纬度渐变方式， 表明欧洲山杨出现了明显的适应性分化; Ingvarsson等[63]对多个基因单倍型地理格局分布的研究同样发现欧洲杨具有明显的地理遗传分化。但是研究表明花旗松(Pseudotsuga menziesii)[30]、火炬松(Pinus taeda)[29]、圆球柳杉(Cryptomeria japonica)等[64]等物种没有发生明显遗传多样性的地理分化。
植物不同物种间遗传分化的研究主要集中对在栽培种及其野生近缘种的DNA多态性的比较上。由于早期的驯化瓶颈及人工选择繁育等遗传漂变作用结果[65]。栽培物种的遗传多样性通常都低于他们的野生祖先种。Hamblin等[28]利用AFLP结果筛选得到基因片段的DNA多态性， 对栽培高粱(S. bicolor)和野生高粱(S. propinquum)进行了比较研究， 结果表明: 野生高粱的平均核苷酸多态性大约为0.012( )，大约是栽培高粱的4倍。Liu等[26]的研究显示: 野生向日葵中， 核苷酸多态性达到0.0128( )、0.0144( W)，显著高于栽培向日葵的0.0056( )、0.0072( W)。Eyre-Walker等[66]对栽培和野生玉米Adh1基因大约1 400 bp的序列研究表明: 栽培玉米的遗传多样性大约只有野生玉米种(Zea mays subsp. parviglumis)的75%。Hyten等[67]的研究显示野大豆的平均核苷酸多态性为0.0217( )、0.0235( W)， 地方种则分别为0.0143( )、0.0115( W)，大约为野大豆的66%( )和49%( )。以上结果充分反应了栽培物种驯化过程中曾遭受过瓶颈效应。
3 分子系统地理学
分子系统地理学是在分子群体遗传学的基础上， 衍生出的新学科分支。早在20世纪的60年代， Malecot[68]就发现了基因的同一性随地理距离增加而减少的现象; 1975年Nei的《分子群体遗传学和进化》一书中也提到在描述群体的遗传结构时要重视基因或者基因型的地理分布[1]; 1987年Avise等[17]提出了系统地理学概念。在植物方面， 分子地理系统学研究取得很多重要的成果。如对第四世纪冰期植物避难所的推测及冰期后物种的扩散及重新定居等历史事件的阐释， 其中最为典型的研究是对欧洲大陆冰期植物避难所的确定及冰期后植物的重新定居欧洲大陆的历史事件的重现。如欧洲的栎属植物的cpDNA的单倍型的地理分布格局表明， 栎属植物冰期避难所位于巴尔干半岛、伊比利亚岛和意大利亚平宁半岛， 现今的分布格局是由于不同冰期避难所迁出形成的[69]。King和Ferris[70]推测欧洲北部的大部分欧洲桤木种群是从喀尔巴阡山脉这个冰期避难所迁移后演化形成的。Sinclair等[71， 72]推测欧洲赤松在第四纪冰期时的避难所可能是在爱尔兰岛或者在法国的西部。此外， 分子系统地理学在阐明了一些栽培作物的驯化历史事件如驯化发生的次数及驯化起源地等方面也取得了重要的进展。如Olsen等[73]对木薯(Manihot esculenta)单拷贝核基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)在木薯群体中单倍型的地理分布方式深入调查后推测: 栽培木薯起源于亚马逊河流域南部边界区域。Caicedo等[74]利用核基因果实液泡转化酶(fruit vacuolar invertase)的序列变异阐明了栽培番茄(Lycopersicon esculentum)的野生近缘种(Solanum pimpinellifolium )的种群扩张历史， 基因变异的地理分布方式表明栽培番茄起源于秘鲁北部， 然后逐步向太平洋岸边扩张。Londo等[75]利用一个叶绿体基因和两个核基因的变异对两个亚洲的栽培籼、粳亚种及其近缘野生种进行了系统地理学研究， 阐明了籼、粳稻分别起源于不同的亚洲野生稻(O. rufipogon)群体， 其中籼稻起源于喜马拉雅山脉的南部的印度东部、缅甸、泰国一带， 而粳稻则驯化于中国南部， 等等。
正向遗传学克隆基因的方法范文第2篇
将从温室中取材的同一无性系小黑杨(Populussimonii×P．nigra)枝条进行水培，于人工气候室中培养，昼/夜温度为26℃/22℃，光照16h/d，光照强度175μmol/(m2•s)，相对湿度约75%。生长40d左右，长出新的根和叶片，将其分成两组，一组作为对照于正常条件下培养，另一组用200mmol/LNaCl进行胁迫处理，分别在胁迫开始时(第0天)和胁迫后的第1、2、4、6、8天中取小黑杨的根、茎、叶，每组重复3次，用蒸馏水清洗，拭干后置于液氮中，于－70℃中保存备用。烟草品种为SR－1(Nicotianataba-cumL．cv．PetitHavanaSR－1)。用SDS法［14］分别提取小黑杨根、茎、叶中的RNA，用SYBRPremixExTaq试剂盒(购于大连宝生物工程有限公司)进行实时定量PCR(Real－timePCR)［15，16］。以胁迫后第2天的小黑杨叶片RNA为模板，根据PsnRZF基因的序列信息(GW672596)设计引物进行5’/3’克隆，方法见5’/3’RACEKit，2ndGeneration(Roche)。将PsnRZF基因连接到植物表达载体pROKⅡ35S启动子后，用农杆菌介导法对烟草进行遗传转化［17］，对转化植株进行RT－PCR的检测，分别检测非转基因和转基因烟草在正常生长和NaCl胁迫状态下的POD活性、SOD活性、MDA含量［18］，使用SPAD－502叶绿素仪测定样本叶绿素相对含量的变化情况。所得数据利用SPSS11．0统计软件进行单因素方差分析Duncan检验［19］。
2结果与讨论
2．1小黑杨环锌指蛋白基因全长
cDNA的克隆采用5’/3’RACE(rapidamplificationofcDNAends)的方法扩增PsnRZF基因的5’/3’端，3’RACE得到一条630bp的条带(图1)，5’RACE得到一条404bp的片段(图2)，经电子拼接获得带有PolyA的全长cDNA序列为1061bp。采用NCBI中的ORF程序显示5’非翻译区为184bp，3’非翻译区为82bp，开放读码框为795bp，编码264个氨基酸。用NCBI的保守功能区域(conserveddomains)分析程序预测基因的保守区，结果表明该基因编码产物属于环锌指蛋白超家族，保守区位于第58～104氨基酸。
2．2NaCl胁迫下小黑杨环锌指蛋白基因的表达分析
为研究小黑杨环锌指蛋白基因在盐胁迫下的应答，用Real－timePCR检测NaCl胁迫前后PsnRZF基因在根、茎、叶中表达的结果(图3)表明:在正常生长状态下，PsnRZF基因在根、茎、叶中均表达。在NaCl胁迫条件下，PsnRZF基因表达量在根、茎、叶中均升高，此基因在根中表达量变化并不显著。随着胁迫时间的延长，PsnRZF基因在茎和叶中的表达量逐渐升高。此基因在叶中表达量的变化最为明显，在胁迫后第2天和第4天显著高于对照(P＜0．05)，在胁迫后的第6天，此基因的相对表达量达到最高，极显著地高于对照(P＜0．01)。胁迫后的第4、6、8天，PsnRZF基因在茎中的相对表达量显著高于对照(P＜0．05)。小黑杨PsnRZF基因在不同器官中表达量变化存在差异，这可能是由于此基因编码的环锌指蛋白参与的很多生理反应主要是在叶中进行，如光呼吸，所以PsnRZF基因在叶中的表达量变化最为明显。随着NaCl胁迫时间的延长，PsnRZF基因的表达量也随之升高，说明盐胁迫影响了该基因的表达，PsnRZF可能在盐胁迫应答过程中发挥作用。植物在逆境胁迫时，体内会积累很多物质，如信号分子ABA，有研究表明环锌指蛋白可能参与ABA介导的信号转导过程。随着盐胁迫时间的延长，体内信号分子不断积累，PsnRZF基因表达量升高，作为信号受体的PsnRZF数目增多，PsnRZF作为信号受体与信号分子互作，从而调控盐应答基因的表达。但小黑杨环锌指蛋白(PsnRZF)与哪类信号分子互作，以及这种互作调控哪些基因的表达都有待进一步研究。
2．3小黑杨环锌指蛋白基因功能验证
本研究利用正向遗传学的方法来研究小黑杨环锌指蛋白基因(PsnRZF)的功能。将PsnRZF基因连接到植物表达载体pROKⅡ35S启动子后，用农杆菌介导法导入烟草，使其在烟草中过量表达，检测过量表达的PsnRZF基因对植物产生的影响，从而确定其功能。对转基因烟草的分子检测已经证明，PsnRZF基因已经导入烟草中，并在转录水平表达(图4)。通过表型观察发现，转基因烟草与非转基因烟草并无差别。正常生长条件下，多数转基因烟草的叶绿素含量低于非转基因烟草(图5)，转基因烟草MDA含量却高于非转基因烟草(图6)。这说明在正常生长条件下，PsnRZF基因的过量表达对植物体是有害的，这种伤害可能与氧化胁迫相关，导致膜脂的过氧化，因此转基因植株MDA含量高于非转基因植株。在盐胁迫下，非转基因植株SOD和POD活性迅速增强(图7、8)，有效清除活性氧。但非转基因烟草MDA含量仍高于正常条件下的水平，说明盐胁迫对非转基因烟草膜脂造成了伤害;而盐胁迫下转基因烟草MDA含量却低于正常条件下的水平，这说明环锌指蛋白对盐胁迫下的膜脂氧化有一定的抑制作用或参与膜脂过氧化后的修复。盐胁迫后，小黑杨环锌指蛋白发挥了与正常生长条件下不同的功能。环锌指蛋白具有E3泛素连接酶的活性，在正常生长与盐胁迫下，环锌指蛋白可能对不同的蛋白质进行泛素化修饰，从而执行不同功能［20］。
3结论
克隆获得小黑杨环锌指蛋白基因cDNA序列，全长1061bp，属于环锌指蛋白超家族基因。PsnRZF基因在不同器官中表达量变化存在差异，在叶中的表达量最高，其次为茎，在根中的表达量最低;在胁迫条件下，茎和叶中表达量呈现先逐渐升高后降低的变化趋势，而在根中，该基因表达量的变化不显著。在正常生长条件下，PsnRZF基因的过量表达可导致植物膜脂氧化程度增强;但在盐胁迫条件下，PsnRZF基因的过量表达可以缓解膜脂的过氧化作用。
4展望
正向遗传学克隆基因的方法范文第3篇
【关键词】 X-连锁无丙种球蛋白血症（XLA）；Burton酪氨酸激酶（BTK）；诊断；治疗
【Abstract】 X-linked agammaglobulinemia（XLA ）belongs to the primary immunodeficiency disease（PID），which calls Bruton disease.Recently，it can not generate immune globulin，because of the mutation of the Bruton’s agammaglobulinemia tyrosine kinase （BTK） gene，which leads to developmental disorder of the B cell.This article reviews the genetic characters，mutation analysis，molecular pathogenic mechanism and therapy of the BKT gene.
【Key words】 XLA；BTK；diagnosis；therapy
X连锁无丙种球蛋白血症（X-linked agammaglobulinemia，XLA），又称Bruton无丙种球蛋白血症，是最早发现的人类原发性免疫缺陷病（primary immunodeficiency disease，PID）之一，Bruton（1952年）首次报道。患者临床上以反复细菌感染为特征，血清中各类免疫球蛋白明显降低或缺乏，对抗原刺激不能产生抗体应答，血循环中B淋巴细胞减少，淋巴结及淋巴组织缺乏生发中心和淋巴滤泡，骨髓中无浆细胞，但前B淋巴细胞数量正常，T淋巴细胞数量及功能正常。典型病例为出生后半年左右开始反复化脓感染（如肺炎链球菌或嗜血流感杆菌）或迟至幼年发病，患者体内缺少成熟B细胞，基本上不能自主产生免疫球蛋白，必须依靠免疫替代疗法维持体液免疫水平。该病严重危害患者健康，危及患者生命。80%～90%［1］临床诊断病例可检出相关致病基因BTK发生突变，而其他10%～20%［1］的病人存在其他问题，有研究显示常染色体编码Igφ［2，3］、μHC［4］和LC的基因存在突变。
1 BTK的遗传学特性大多数PID的遗传形式已经明确，几乎均为单基因遗传，多数为常染色体隐性遗传，其次为X连锁隐性和常染色体显性遗传。大多数情况男性发病，女性携带，但也有男性携带者不发病的报道。60%的PID突变基因的DNA序列已被克隆，突变位点（包括突变基因定位的染色体节段和基因位点）和突变形式（单个核苷酸缺失、替代、插入、移码突变、无义或错义突变等）也已确定［5］。在WHO PID专家委员会的指导下，成立了有关疾病基因库，记录登记全球范围的PID基因突变及其类型。多基因遗传性PID的确定较困难，至今尚无确切的报道。
1.1 BTK的蛋白结构 BTK蛋白为B细胞信号传递系统中的重要蛋白，属于非受体型蛋白酪氨酸激酶Tec家族的一员，该家族的成员还包括TEC、ITK/TSK/EMT和BMX。Tec家族蛋白酪氨酸激酶包括5个不同的结构区段（见图1），从N末端起为PH（pleckstrin homology；PH）段，约有120个氨基酸，TH（Tec homology；TH）段约有60～80个氨基酸SH3（Src homology3;SH3）段约有60个氨基酸，SH2段约100个氨基酸，激酶催化段约280个氨基酸［6］。
图1 BTK蛋白的组成（从N端开始）包括5个区域：PH、TH、SH3、SH2和激酶区。
注：图上边的数字代表各段的氨基酸长度，图下边的数字代表不同的外显子及其相应的位置。
BTK蛋白的空间结构多数已测明，包括PH区、TH区的前半部、SH3区和激酶催化区［7］，SH2区的结构可借用其他蛋白激酶的类似结构进行研究。这些三维空间结构可用于分析突变造成的蛋白空间结构的改变。
1.2 BTK基因的分子结构及其突变分析 在20世纪80年代，多位学者应用DNA多态性标志分析的方法，成功地将XLA的缺陷基因定位于X染色体中部（Xq21.3-22）的2cm区域内［8］。Vetrie等用定位克隆方法在XLA病变基因区内分离鉴定了一个新的基因，该基因表达于正常人各期B淋巴细胞，在XLA患者中发生突变，故认为是XLA的致病基因。Tsukada等也找到XLA的KD致病基因。BTK基因全长37.5kb，含有19个外显子，除第一外显子外，其余18个编码BTK蛋白的659个氨基酸，分子量为76KD［9］。cDNA含有2560个核苷酸，有一个编码659个氨基酸多肽的开放阅读框架，起始密码子在核苷酸第133位置上，在起始位置上游的15个密码子处阅读框架闭合。根据国际研究小组BTK突变分析，迄今已经在471个家族544个XLA病人中发现了BTK基因341个独立存在的碱基置换、插入或缺失，其中有13个大段缺失和2个大段插入。突变不仅存在于19个外显子，还涉及内含子和启动区域。其中，发生频率最高的是错义突变，其次是无义突变和拼接位点突变。错义突变主要发生在三联体密码子的前两位。外显子8和9的185~287位没有错义突变，这些位点可能不易突变或是功能上不重要。33%的替代累及CPG双核苷酸，这是目前认为的最常见的突变热点［10］，而突变高频位点R520也属于CPG突变［6］。编码外显子蛋白突变的区域［11］（见表1）。表1 编码外显子蛋白突变的区域
2 BTK的分子致病机制BTK属于非受体酪氨酸蛋白激酶，该类激酶广泛参与细胞信号传导，影响细胞的存活、增殖和分化，BTK是B细胞发育成熟的关键因素。正常人除T细胞和浆细胞外均有BTK表达，而BTK基因突变只影响B细胞的数量，这说明BTK在B细胞的生长发育过程中起着至关重要的作用。目前对BTK参与细胞信号传导研究比较清楚的是BCR交联介导的信号传导途径。其过程简述如下：BCR交联激活Pl-3激酶并产生一定数量的Pl-3，4，5-risphosphate与膜结合，Pl-3，4，5-risphosphate与BTK的SH3段作用使其定位于细胞膜。然后，BTK经过两步活化：首先BTK激酶段Y551位磷酸化（很可能是与Lyn作用），接着是SH3段Y223位的自身磷酸化。活化后的BTK与B细胞衔接蛋白（BLNK）结合并激活phospholipase C -γy（PLC-γ），导致钙离子通道打开，胞外钙离子内流。该信号传导途径最终导致细胞增生加强和转录的变化。此模式仅限于以B细胞受体交联作为刺激信号，至于前B细胞受体交联是否也引起相同的信号传导目前还缺乏证据［1，12］。该信号传导途径受FcRⅡB和SHIP（ SH2-containing inositol-5-phosphatase）磷酸酶介导的另一途径制约，通过水解Pl-3，4，5-risphosphate和Ins（1，3，4，5）-etraphosphate关闭钙离子内流通道［13］。BTK不仅可以由BCR和FCR介导激活，也可以通过其他很多受体激活，包括G-protein-coupled receptors（ GPCR）、IL-3、IL-5和IL-6，另外，CD19和单克隆抗体的交联也可激活BTK［13］，近年来研究表明，CD40也是B细胞发育过程中的重要受体，传递刺激信号影响细胞存活、生长和分化。与BCR介导的BTK活化途径相似，CD40的交联也可激活BTK。CD40和BCR可能是B细胞发育过程中不同阶段激活BTK的信号传递通路。但也有研究提示CD40不通过BTK也可提高NFKB和JNK的水平，是独立于BTK的信号传导通路［14～16］。BTK在细胞内与很多分子相互作用，共同构成了一种微环境，在信号传导的过程中起着重要的作用。这些分子分别与BTK的不同区段相互作用，其中与PH段作用的分子研究得很多，R28附近区域与PIP3、IP4、PKCβⅠ、BP-135、F-ac-tin、STAT3和Fas作用。PH- TH区域与Gαq和Gβ双体作用;SH3与c-Cb1、WASp、Vav和sab作用;SH2与磷酸化的BLNK作用。另外，SH3与TH在BTK分子内作用，抑制BTK的活性。在BCR交联介导的信号传导途径中，Syk和BLNK对BTK的活化起正向调节作用，磷酸化的PKCs、sab和IBTK对BTK的活化有抑制作用。尽管与BTK作用的分子很多，但是它们如何协调地与BTK作用，完成BTK参与的信号传导，机制目前尚不清楚［17，18］。
3 XLA的诊断XLA是一种原发性体液免疫缺陷症，危害着人们的健康。因而，对该症进行产前诊断和女性携带者的鉴定就显得十分重要［19］。为了研究XLA家系女性成员的情况，Fearon等采用了X染色体失活的方法去发现携带状况以及验证B淋巴细胞发育的内在缺陷。根据这一方法用重组DNA探针同时发现RFLP和X染色体基因甲基化。在无携带状态的女性的外周血粒细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞中发现X染色体的随机失活。相反，该症的三个携带者在外周B淋巴细胞两个X染色体中的一个优先失活，但不是T细胞或粒细胞。这一发现强烈地支持XLA是由B淋巴细胞发育的内在缺陷所致的假设。Lovering （1994）等［20］对BTK基因缺失患者DNA分子斑点杂交分析见到了已改变的DNA限制性片段，并对7个患者家庭用已经改变的限制性片段方法对与患者有关的女性携带状况作出诊断。随后，Schuster等［21］报道了对所有19个外显子。包括侧翼内含子边界采用PCR-SSCP方法成功地检测到两例男性患儿BTK的SH2功能区的新突变，并用一个已改变过的第一个引物做PCR扩增突变发生，作出三代中健康女性携带者的鉴定。接着，Hagemann等［22］对一个散发的XLA患儿及家庭的三代成员应用PCR扩增基因组DNA，采用序列分析的方法直接鉴定XLA的基因突变，结果诊断出患儿及其免疫学表现正常的女性携带者。以上这些方法均可应用于产前诊断。这无疑对优生优育是很有意义的。
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4 XLA的治疗研究免疫重建是采用正常细胞或基因片段植入患儿体内，使之发挥功能，以持久地纠正缺陷的基因及其表达产物。1968年使用HLA配型同种异体骨髓移植治疗2例致死性免疫缺陷病获得成功。至今已有近2000例PID患儿接受骨髓移植，总存活率为62%，其中同型合子骨髓移植达79%。无关供体配型骨髓（matched unrelated marrow donor，MUD）移植在近年已很盛行，成功率约为50%，5岁以内接受移植者可达85%［23］。近年开展脐血干细胞移植，存活率为75%。用母体骨髓CD34+干细胞宫内移植（腹腔注射）已有成功的报道［5］。将正常目的基因片段整合到患儿干细胞基因组内（基因转化），随细胞有丝分裂，转化的基因片段能在患儿体内复制而持续存在。理论上讲，凡能通过骨髓移植治愈的疾病均是基因治疗的指针［24］。基因治疗PID的尝试已经历多年，取得一定成效，但尚处于探索和临床验证阶段［25］。Faust等［26］的动物实验是通过免疫球蛋白的增强子和驱动子介导的小鼠BTK cDNA转录至两组免疫缺陷鼠（XLD或BTK-/-鼠）。转入1个拷贝的XLD或BTK-/-鼠经蛋白印迹法检测其BTK达到正常量的25%；而转录2个拷贝者其BTK达到正常量的50%。两组小鼠经检测均有正常数量的脾B细胞，两组小鼠对TNP一蔗聚糖刺激所产生抗体的反应和血清IgM、lgG3水平较正常野生鼠明显减低，但较XID小鼠有所提高。Drabek等［27］通过人类BTK cDNA与鼠主要组织相容性复合体Ⅱ区调节因子的转基因治疗，纠正了BTK缺陷鼠的B细胞功能，并发现转入的基因并不表达于前B细胞以前的分化阶段，此外它在胸腺上皮细胞、活化T细胞、单核细胞上表达，并在其他组织均有低水平表达。经蛋白印迹法检测转基因鼠的脾细胞产物发现，BTK蛋白总含量可达到与野生型鼠相同。这些研究均向我们提供了基因治疗XLA的可能性。此外，Rohrer等［28］通过动物实验证实，应用极少量正常骨髓细胞输注即可通过竞争使XID小鼠获得B系统免疫重建。这项研究推测，即使不成功的基因治疗也可对XLA患者有益，为今后开展人类XLA的基因、细胞治疗提供有利的基础和广阔的前景。总体上说，尽管目前基因治疗离成熟的临床治疗技术还有相当的距离，但经过近10年的临床试验，人们已获得了大量宝贵的临床资料。我们有理由相信，XLA的基因治疗将在不久的将来获得突破性进展。
5 展望尽管80%～90%临床诊断为XLA的病人依靠BTK突变检测确诊为XLA，但是XLA的基因突变位点很多，与临床症状的相关性不强，同一家系中的XLA病人临床表现程度很可能各不相同。即：基因型和临床表型的关系是目前需要研究的课题之一［29］。这涉及到突变基因产物蛋白质的功能、结构稳定性和二维构像［30，31］。这样，通过基因突变及其对蛋白的影响无法预知XLA的病程、复杂程度、B细胞数量和免疫球蛋白的水平。只有彻底明确BTK在B细胞信号传导中的作用机制，才能找到基因突变和临床症状的相关性，完善XLA的基因诊断，并为治疗奠定理论基础［32］。1994年，国际上成立了BTK基因突变分析小组并建立了BTK基因突变数据库（http：//uta.fi/imt/bioinfo/btk base/），为XLA的基因诊断提供了便利的条件。但是数据库中的病源主要来自西方国家、日本和俄罗斯，而国内的BTK基因研究相对处于空白阶段。因此，目前开展BTK基因突变的检测工作应成为国内同类研究的重点，通过建立有效可靠的BTK基因突变筛查方法，研究中国人BTK基因突变的规律。因此，随着对PID认识的深入和检测方法的简化，将会有更多的病例被确诊，不仅可以用常规方法治疗，而且可以做基因分析，同时，建立PID登记网络［33］，也将有助于了解确切的发病率和需要治疗的患者。总之，来自突变基因的BTK蛋白还没有被完全认识，在蛋白质水平这些突变的结果还不清楚。BTK基因突变在XLA发病机制中更详细作用还不清楚，但作为疾病基因，对其基因组结构的研究，将为未来的体细胞基因治疗创造条件。当然，体细胞治疗存在着一定的问题，目前还不能达到此目的，但这是今后研究的一个重要方向，基因治疗无疑是近20年来分子生物学和重组DNA技术迅速发展的一种结果。由于体内大剂量静脉丙种球蛋白的长期替代疗法有不少的副作用，且价格昂贵，不能根本解决问题。若能将缺陷的基因进行原位的修补，基因治疗将是最理想的根治方法。
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正向遗传学克隆基因的方法范文第4篇
【摘要】 目的：建立一种新的MBL基因突变检测方法，并分析反复呼吸道感染儿童中突变频率及发病相关性。方法： PCR扩增MBL基因第一外显子区段，核酸外切酶和碱性磷酸酶降解， 清除PCR产物中残余引物和dNTPs，经引物延伸反应荧光素(R110或TAMRA)标记终止碱基特异性掺入引物的3′末端，测定荧光偏振值判断掺入碱基及突变类型。用所建立方法检测46例反复呼吸道感染(RRTI)患儿和50例健康对照的MBL突变。结果：所建立方法检测MBL突变经测序验证完全正确。在临床RRTI患儿及对照组中发现54位密码子G>A突变，健康儿童中野生纯合型(G/G)39例(78.00%)、杂合型(G/A)8例(16.00%)、纯合突变(A/A)3例(6.00%);RRTI患儿中野生纯合型(G/G)18例(39.13%)、杂合型(G/A)22例(47.83%)、纯合突变(A/A)6例(13.04%);RRTI患儿组A等位基因频率显著高于对照组。患儿和对照组均未检测到52和57位密码子突变。结论：MBL 54G>A突变与RRTI发病风险相关，所建立的MBL基因多态性快速检测方法可用于小儿反复呼吸道感染辅助诊断和高风险人群的筛查。
【关键词】 甘露聚糖结合凝集素;基因突变;反复呼吸道感染;荧光偏振
[ABSTRACT] Objective: To develop a rapid and sensitive method for detecting MBL genetic mutants and evaluate the association with recurrent respiratory tract infections(RRTI)in children. Methods: The MBL exon1 region was amplified by PCR， the nonincorporated primers and excesses dNTPs were removed by enzymatic digestion. The dyeterminator (R110acyC or TAMRAacyT) was incorporated on the 3′end of the primer via template directed dyeterminator incorporation reaction (TDI) and the mutations were determined by fluorescence polarization (FP) assay. The MBL mutants were analyzed among 50 healthy and 46 RRTI children using this new method. Results: The accuracy and sensitivity were evaluated and verified by standard sequencing method. The 54 G>A mutant was found among both healthy and RRTI children. The genotypes among healthy group were: 39 homozygote wildtype G/G (78.00%)， 8 heterozygote G/A (16.00%) and 3 homozygote mutant A/A (6.00%). The genotypes among the RRTI children were: 18 homozygote wildtype G/G (39.13%)， 22 heterozygote G/A (47.83%) and 6 homozygote mutant T/T (13.14%). The frequency of MBL mutation was significant higher in RRTI children than in healthy controls. The 52C>T and 57G>A mutants were not found in both groups. Conclusions: The MBL mutation associates with the risk of RRTI among children. This new MBL genotype can be used to help the diagnosis and screening the high risk children for RRTI.
[KEY WORDS] Mannanbinding lectin;Genetic mutant; Recurrent respiratory tract infections; Fluorescence polarization
甘露聚糖结合凝集素(mannanbinding lectin， MBL)是血浆中的胶原凝集素，其多糖识别结构域与细菌、真菌及寄生虫等表面的甘露糖或N乙酰氨基葡萄糖结合，经MBL结合的丝氨酸蛋白酶1和2(MBL associated serine proteases1/2， MASP1/2)激活补体，或介导免疫调理及炎症反应而激活机体获得性免疫反应[1]。研究发现血浆MBL浓度降低或功能异常导致免疫机能缺陷，增加多种感染性疾病及自身免疫疾病的发病风险[2，3]。
已发现MBL基因突变可影响蛋白表达水平及稳定性，降低血浆MBL浓度。检测MBL基因突变可预测MBL的基础水平和机体的免疫状态，不仅能辅助临床诊断，而且对预测疾病风险及预防有重要的指导价值。
本研究基于模板指导的荧光标记终止子掺入反应-荧光偏振检测(template directed dyeterminator incorporation with fluorescence polarization， TDIFP)原理，建立快速、简便的检测方法，并对46例临床反复呼吸道感染(recurrent respiratory tract infections， RRTI)患儿和50例健康儿童进行检测，比较MBL基因突变频率的差异，发现MBL突变与RRTI患儿发病存在关联性。
1 材料与方法
1.1 基因组DNA提取
依据RRTI诊断标准[4] 收集RRTI患儿46例，其中男性26例，女性20例，平均年龄4.6岁。健康对照组50例，男性25例，女性25例，平均年龄4.5岁。无菌采集外周静脉全血，置EDTA钠抗凝管中，用全血基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa大连公司)，参照使用说明书提取基因组DNA。
1.2 PCR扩增
PCR反应体系25μL，含10×PCR反应缓冲液2.5μL，10mmol/L dNTPs 0.25μL，20mmol/L MgCl2 1.25μL，DMSO 2.5μL，基因组DNA 2μL(50～100ng)，Taq DNA聚合酶1.5U，10μmol/L正反向引物各0.25μL。引物序列分别为PF: 5′TGTCCCTGTTTTCCATCACTCC3′;PR: 5′TGCAGAGACAGAACAGCCCAACA3′。PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共45个循环，随后72℃延伸10min。PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪观察。
1.3 TDIFP检测
PCR产物预处理：采用AcycloPrimerTMFP SNP Detection Kit (PerkinElmer Life Science Co.，美国)所提供试剂并参照其说明书操作。PCR产物分为3组5μL，分别加入2μL Cleanup混合液(包含虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I)，37℃温育1.5h，清除PCR产物中残留引物和dNTPs，之后80℃加热20min灭活消化酶。
TDI反应：各组消化处理后PCR产物7μL，各加入13μL AcycloPrimerFP混合液：含10×TDI反应缓冲液2μL、AcyclopolTM 聚合酶0.05μL、荧光标记终止碱基R110acyCTP和TAMRAacyTTP 1μL，各加入1μL对应的突变检测引物(序列分别为：P52C>T：5′CG GCTT CCCAGGCAAAGATGGG3′; P54G>A：5′GGTTCCCCCTTTTCTCCCTTGGTG3′; P57G>A：5′CAACACTGACCTGGTTCCCCCTTTCT3′)，总反应体系为20μL。掺入反应条件：95℃预变性3min，94℃ 15s， 62℃ 30s，共30个循环。
荧光偏振检测：采用VICTOR2 Multilabel Counter (PerkinElmer Life Science Co，美国)测定反应产物的荧光偏振值，判定掺入荧光标记碱基的类型并判读对应的基因型。
分别选取TDIFP检测为突变或野生纯合型的PCR产物，常规分子生物学操作克隆至T载体pGMTeasy中，转化大肠杆菌、提取质粒、PstI和EcoRI双酶切鉴定正确后送上海生物工程公司测序验证TDIFP检测结果。验证正确的质粒作为检测系统的阳性参比标准品。
1.4 统计学处理
数据采用SPSS 11.5统计软件包进行分析，组间比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 PCR扩增结果
PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳分析显示为214bp大小的特异性条带(图1)，与设计扩增产物相符。
M：DNA分子量标志D2000; 1～4: PCR产物;
5:空白对照(dH2O取代模版DNA)
图1 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物
2.2 TDIFP检测结果
经TDI反应荧光标记终止碱基R110acyCTP
海南医学院学报 Vol.16 No.10 Oct.2010
或TAMRAacyTTP特异性掺入突变检测引物的3′末端，VICTOR2 Multilabel Counter测定其荧光强度并自动计算荧光偏振值(mp)，mp升高与荧光标记碱基的掺入相对应，数值聚集于4个区域(图2)。检测52C>T采用正向引物，C/C纯合子聚集于右下方(R110的mp值高表示掺入R110acyCTP)，T/T纯合子聚集于左上方(TAMRA的mp值高表示掺入TAMRAacyTTP)，C/T杂合子聚集于右上方(R110和TAMRA的mp值均高，表示分别掺入R110acyCTP和TAMRAacyTTP)，左下方为阴性对照(无荧光标记碱基掺入)。检测54G>A和57G>A采用反向SNP引物，G/G纯合子聚集于右下方，A/A纯合子聚集于左上方，G/A杂合子聚集于右上方。依据所测定各样本的mp值，仪器内置的SNP macro Victor384 V4.0软件可自动判定其突变和基因型。
2.3 临床标本检测
采用所建立的方法分别对46例RRTI患儿和50例健康对照儿童检测MBL基因突变，两组中均检测到密码子54突变，抽取部分标本采用测序法验证结果完全一致。
A: 52C>T;B: 54G>A; C: 57G>A
图2 TDIFP检测MBL基因突变
RRTI和对照组密码子54突变分布频率见表1。等位基因的分布符合HardyWeibery平衡，RRTI组54密码子突变(A)等位基因频率(37%)显著高于对照组(14%)(P
3 讨论
由于获得性免疫尚未成熟，小儿更多依赖先天免疫系统。MBL在小儿出生前开始表达，出生后不久即接近成人水平，在先天性免疫中发挥重要作用。血浆MBL水平及功能与感染、自身免疫等疾病的发生及严重程度相关[7，8]，了解MBL基础表达能力及功能对判断免疫状态及病因提供线索，有助于临床诊断和治疗方案的制定。曾报道采用红细胞溶解分析(Haemolytic assays)[9]和补体激活实验[10]测定MBL活性，或用ELISA测定血浆MBL蛋白浓度[11]。这些技术首先存在方法上的局限性，红细胞溶解测定操作繁琐，需要纯化抗体及红细胞等实验材料;ELISA检测中抗MBL抗体优先选择性结合高寡聚体MBL，因而容易低估低寡聚体的浓度。更重要的是血浆MBL水平受多种因素影响，例如在感染或免疫疾病状态下，血浆MBL水平可反应性升高，此时测定MBL水平不能真实反映个体的基础水平和免疫能力。从基因组水平分析其遗传特性，可在一定程度上反映其基础表达水平及稳定性，更好判断其基础免疫状态，尤其对于疾病预测和预防方面具有更大的价值。
大约12%～25%的个体存在MBL基因突变[12，13]，某些突变可导致血清总MBL水平降低[14，15]，免疫功能减弱，增加感染发病风险和严重程度[16]。例如外显子1第52密码子C>T(Arg52Cys)、54密码子G>A(Gly54Asp)、57密码子G>A(Gln57Glu)等突变，引起胶原区域氨基酸置换，干扰蛋白多聚体形成，降低蛋白稳定性并加速降解。Hibberd等[17]对226例英国儿童的研究发现MBL基因突变与脑膜炎发病相关。Nagy等[18]报道携带MBL基因突变儿童衣原体IgG阳性率、反复感染和哮喘发病率均显著高于无基因突变的儿童。在中国汉族人群中发现MBL基因突变导致血浆蛋白水平降低，RRTI发病风险增高两倍[5]。
本研究建立一种新的MBL突变检测方法，所依据基本原理是：溶液中荧光分子旋转速度与分子大小呈反比，大的荧光分子旋转速度减慢，其荧光偏振值则升高。设计3′末端紧邻突变位点的检测引物，TDI反应中加入与野生和突变碱基互补的荧光标记终止碱基，特异性掺入检测探针3′末端，掺入了终止碱基的检测引物比游离荧光标记碱基分子增大20余倍，荧光偏振值也相应增高。通过检测荧光偏振值可直观判断掺入的荧光素标记碱基的类型，从而快速确定样本的基因型。该方法无须分离未结合游离荧光标记碱基，反应溶液可直接进行检测，具有操作简单、灵敏性高、通量高并易于自动化等优势。采用本方法检测临床标本的MBL基因突变，经测序验证正确。对临床RRTI患儿的检测发现54密码子G>A突变，发现RRTI组携带MBL突变频率显著高于健康对照组，等位基因分布频率与文献报道相似[19]。也表明MBL基因突变与补体免疫功能及反复感染相关，支持MBL突变为RRTI的遗传风险因子。
目前已有用正常人血浆MBL重建MBL缺陷儿童免疫调理和噬菌功能的尝试[20]，也有开发凝集素类似物作为HIV等治疗药物的报道[21]，未来MBL功能调节可能成为一种重要的治疗策略。通过MBL基因多态性的快速检测，推断MBL水平及补体免疫状态，对于发现小儿反复感染的病因，以及预测发病风险具有重要的意义。因而所建立的MBL基因突变检测方法在指导临床治疗和疾病预防方面具有应用前景。
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正向遗传学克隆基因的方法范文第5篇
effects of selective cox2 inhibitor on dna repairing after irradiation
xu huiting, yu shiying, xia shu,xiong hua，zhuang liang
cancer center, tongji hospital, tongji medical college, huazhong university of science and technology, wuhan 430030, china
corresponding author: yu shiying,email：syyu@tjn.tjmu.edu.cnabstract：objective to investigate the effects of a selective cox2 inhibitorcelecoxib on dna repairing after xrays irradiation，in order to elucidate the possible mechanism of the radiosensitization of selective cox2 inhibitor.methods human cervical carcinoma cells (hela) were cultured in vitro and exposed to different doses of celecoxib for 48h then with and without radiation（6gy）, flow cytometry subg1fluorescence parameter line was performed to analyze the change of the apoptosis and cell cycle distribution.the dna damage and repair were detected by single cell gel electrophoresis assay.semiquantitative rtpcr and western blot were used to measure the mrna and protein level of ku70 and ku80 in hela cell lines treated with celecoxib.results celecoxib had no effect on the cell cycle distribution of hela cell lines,but it induced apoptosis increasing dependent on celecocib doses.radiationinduced apoptosis was enhanced after hela cells treated with celecoxib (enhancement factor=6.96 at100μmol/l), and the radiationinduced g2/m arrest was markedly decreased by celecoxib〔radiation group(rt): g2/m 32.35%, 100μmol/l celecoxib+rt: g2/m 5.95%〕. the dna damage induced by radiation was not increased,but the dna repair was reduced in hela cells treated with celecoxib (60μmol/l) for 48h, the mrna and protein level of ku70 and ku80 were also significantly decreased( p<0.05). conclusion the results suggest that the possible mechanism of radiosensitization of a selective cox2 inhibitor was related to inhibition of dna repair including reduced g2/m arrest cells and decreased dnapk expression.
key words：cyclooxygenase2; celecoxib; g2m phase; dna repair; radiation damage
环氧化酶（cyclooxygenase，cox）是花生四烯酸生物合成前列腺素(prostaglandin,pg)的限速酶, cox分为cox1型和cox2型。多数恶性肿瘤呈cox2过度表达，且其表达水平与肿瘤的发生、发展、预后与转移有密切的关系。选择性cox2抑制剂不仅具有抗肿瘤活性，在体内外试验[1]和临床试验[2]中还证实其对肿瘤具有放射增敏效应。但其放射增敏机制还不是很清楚，可能与降低pge2水平、促进凋亡、改变细胞周期、抑制dna损伤的修复、抑制血管生成等有关。本文采用人宫颈腺癌hela细胞株，观察选择性cox2抑制剂celecoxib对放射引起的dna损伤修复的影响，旨在进一步阐明选择性cox2抑制剂的放射增敏机制。1 材料与方法
1.1 材料与仪器
宫颈癌hela细胞系由华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤中心实验室冷藏；celecoxib药粉购自安徽森瑞有限公司；碘化丙啶(pi)、 rna酶a(rnase a)购自sigma公司；正常熔点、低熔点琼脂糖（nma，lma）购自gibco公司；rtpcr主要试剂trizol购自上海华舜生物工程有限公司，逆转录试剂盒、taqdna polymerase、dntp mix均系美国fermentas公司产品，dna修复基因ku70、ku80引物由上海赛百胜公司合成；鼠源性单克隆抗体ku70、ku80购自neomarkers公司；fac sort 流式细胞仪(美国becton dickson 公司)。
1.2 细胞培养及处理
对数生长期hela细胞，0.25%胰酶消化分离，常规传代培养于rpmi1640完全培养液中37℃、5%co2培养箱中培养。细胞分为空白组、给药组（celecoxib作用48h）、放射组(6mv x线 6gy) 、药放组（celecoxib作用48h后给予6mv x线 6gy），其中celecoxib再按浓度梯度分为20、40、60、80、100μmol/l组。
1.3 流式细胞仪subg1法检测细胞周期分布及凋亡率
按每孔105个细胞接种于6孔板，待24h后给予不同浓度的celecoxib, 使其终浓度分别为20、40、60、80、100μmol/l，空白组加同等体积的dmso，培养48h后收获细胞并以80%冰乙醇固定，20℃固定过夜。同上另设6个浓度组celecoxib作用48h后予6mv x线6gy照射处理，继续培养24h后收获固定细胞。固定后细胞用pbs洗涤2次,100μl pc缓冲液冰上孵育30min。pbs 洗涤细胞,加10mg/ lpi10μl、50mg/mlrnasea10μl 、pbs500μl室温、暗处进行dna 染色20min。应用流式细胞仪经488nm 激光激发进行检测，应用cellquest 软件(美国becton dickson公司)分析结果。
1.4 单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis assay,scge）检测dna损伤
4组细胞（celecoxib只取60μmol/l组）每组均设平行对照组。将各组细胞消化制备成pbs单细胞悬液（5×105个/ml），并在处理后分别于0、15min、30min、1h、2h时间点收取细胞悬液置冰上。碱性单细胞凝胶电泳法检测dna单链断裂(ssb)：参照singh np [3]的方法，略修改。将上述各时间点收取的细胞在30min内铺入附着于载玻片上的琼脂糖胶内，4℃15min使胶完全凝固。后将胶板浸在碱性细胞裂解液中（2.5m nacl、0.1m edta、1%tritox100、10%dmso）4℃避光作用2h或过夜；将裂解处理后的载玻片用蒸馏水清洗2次，置于解旋液（0.3mol/l naoh）中，4℃避光静置20min。随后将玻片移至盛有新鲜冰冷电泳缓冲液的水平电泳槽中25v，300ma电泳25min。停止电泳后将载玻片转移至中和缓冲液中10min，蒸馏水柔和冲洗2～3遍，略干后滴加浓度为20μg/ml的溴化乙啶50μl/片，盖上盖玻片放在湿盒中，2天内拍照保存。中性单细胞凝胶电泳法检测dna双链断裂（dsb）：制胶同碱性单细胞凝胶电泳法。将制好的胶板置入新配的中性裂解液(2mol pl nacl、30mmol/l edta、1%十二烷基肌氨酸钠、10mmol/l tris、1%triton x100、10%dmso、ph8.2～8.5)中于4℃裂解2h或过夜；0.5%tbe(2mmol/ledta、90mmol/l tris、90mmol/l 硼酸、ph8.2～8.5)浸没漂洗3次,每次1h；在盛有0.5%tbe电泳缓冲液的水平电泳槽中0.6v/cm ，电泳25min；后同碱性单细胞凝胶电泳法。在荧光显微镜下每样本观察100个细胞，用casp comet assay software project对彗星图像进行分析，计算各组彗星的oliver尾矩（oliver tail moment，otm，即尾部dna百分含量×迁移dna中心密度）。
1.5 半定量rtpcr
分析给药组（60μmol/l celecoxib作用48h）与空白组hela（只给相当dmso）细胞ku80、ku70 mrna的表达。按试剂说明书完成rna抽提纯化和cdna的合成，以逆转录产物为模板进行pcr扩增。
ku70引物为：5′ctctatcgggaaacaaatgaaccag3′25bp（正向），5′gtatctgcacaatgctgcaacctcc3′25bp（反向），退火温度54℃，扩增产物339bp；ku80引物为：5′tatgctcccaccgaggcacagttga3′25bp（正向），5′actgccttcagccagactggagacg3′25bp（反向），退火温度56℃，扩增产物478bp；βactin引物为：5′cctagaagcatttgcggtgg3′，20bp (正向),5′gagctacgagctgcctgacg3′，20bp （反向），退火温度56℃，扩增产物416bp。pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察并拍照。
1.6 western blot检测
按给药组（60μmol/l celecoxib作用48h）与空白组hela（只给相当dmso）提取细胞总蛋白。具体方法如下：冷的pbs溶液洗3遍，适量细胞裂解液（150mmol/l triscl、0.02%叠氮钠、0.1%sds、100μg/ml pmsf、1μg/ml aprotinin、1%np40、0.5%去氧胆酸钠、150mmol/l nacl）裂解提取总蛋白，用10%的分离胶做sdspage，然后转移至nc膜上，5%脱脂奶tbst室温封闭1h，分别加入一抗4℃孵育过夜，tbst洗涤10min×3次，辣根过氧化物酶二抗室温孵育1.5h， tbst洗涤10min，洗3次，ecl曝光试剂盒曝光底片显影。
1.7 统计学方法
以上实验均重复3次，组间和组内采用t检验和方差分析，数据分析由spss11.0软件完成。
2 结果
2.1 celecoxib与射线单独和联合作用后hela细胞周期及凋亡率的变化 单独 celecoxib作用48h后对hela细胞的周期分布无明显改变，但celecoxib可引起hela 细胞发生剂量依赖性的凋亡，见表1。表1 celecoxib对细胞周期和凋亡率的影响
celecoxib+放射组与单纯放射组相比,可明显提高放射引起的凋亡率，在celecoxib浓度为60、80、100μmol/l时，可分别增强放射诱导的凋亡率达3.18、4.16、6.96倍。同时celecoxib对6gy x线引起的g2/m期阻滞有明显的减弱作用，见图1。
2.2 celecoxib与射线联合作用对hela细胞dna损伤的影响
2.2.1 碱性单细胞凝胶电泳法检测hela细胞ssb如表2所示，空白组与加药组的ssb损伤之间差异无统计学意义（p>0.05），表明适当剂量的celecoxib（60μmol/l）并不引起明显的ssb。药放组与放射组相比，其初始ssb（照射后0min时的ssb）无差异（p>0.05），而药放组照射后各时间点的ssb均高于放射组（p<0.05）；并且放射组的ssb于照射后2h基本修复完全（与空白组相比差异无统计学意义，p>0.05），药放组的ssb修复较慢，至照射后2h仍有明显残留的ssb未修复。
2.2.2 中性单细胞凝胶电泳法检测hela细胞dsb 如表3所示，与ssb的检测结果相似，药放组与放射组相比，其初始dsb也无差异（p>0.05）；而药放组与放射组相比，药放组的dsb修复速度明显低于放射组（p<0.05）, 至照射后2h药放组仍有约37％的残留dsb未修复。
2.3 半定量rtpcr方法检测celecoxib对hela细胞ku70，ku80 mrna表达水平的影响
空白组ku70(1.030±0.066)，ku80(1.335±0.082)mrna表达水平明显高于给药组ku70(0.744±0.066)，ku80(0.596±0.024)mrna表达水平（p<0.05），见图2。
2.4 western blot检测celecoxib对hela细胞ku70和ku80蛋白表达的影响表2 碱性单细胞凝胶电泳法检测hela细胞ssb尾距（otm）rt* ：radiation; n=9；rt+celecoxib组与rt*组的0min相比，p>0.05；rt+celecoxib组与rt*组其余时间点相比，p<0.05；celecoxib组与control组相比，p>0.05表3 中性单细胞凝胶电泳法检测hela细胞dsb尾距（otm） 结果显示宫颈癌hela细胞经60μmol/l celecoxib作用48h后，ku70（0.390±0.058），ku80（0.647±0.120）蛋白表达水平均较空白组ku70(0.785±0.113)，ku80(1.232±0.167)（p<0.05）有明显下调，见图3。
3 讨论
目前已有临床研究表明，放射敏感的肿瘤表达的cox2蛋白水平普遍低于放射抗拒的肿瘤，且cox2蛋白的表达水平与肿瘤的放射敏感性呈正相关[4,5]。体内试验和体外试验早已证明，非甾体消炎药（nsaids）如吲哚美辛（indomethacin）或布洛芬（ibuprofen）可提高肿瘤放射效应。近期研究表明选择性cox2抑制剂的放射增敏效应显著高于非选择性cox抑制剂，如在相同的鼠移植瘤模型中，以肿瘤生长延缓(tumor growth delay，gd) 为评价标准，sc236和吲哚美辛的放射增强因子(enhancement factor, ef)分别为3.64和1.39[1,6]。其放射增敏机制可能与抑制cox2的活性，降低细胞内pge2水平；促放射诱导的凋亡；细胞周期改变和抑制dna损伤修复有关。该实验室曾在体内外实验中证实，celecoxib对宫颈癌hela细胞具有放射增敏作用，并在其小鼠移植瘤模型中证实hela细胞具有高cox2表达[7]。该实验研究了选择性cox2抑制剂celecoxib与放疗结合时对宫颈癌hela细胞dna损伤修复的影响。
3.1 细胞周期与放射敏感
处于不同周期的细胞，对低let射线放射敏感性不同，多数实验提示处于m期和g2期的细胞放射敏感性最高。raju等[8]发现用sc236处理nfsa(一种鼠源肉瘤细胞)也可引起g2/m期细胞的累积（67％），同时 cyclin a、b以及cdk1的表达下调。另外，阻滞pg的合成也可能导致g2/m期细胞的堆积。这说明选择性cox2抑制剂的放射增敏机制可能与细胞周期的再分布有关。但petersen等[9]的研究发现，经sc236处理2天，u251的细胞周期没有明显改变。也就是cox2抑制剂诱导细胞周期阻滞与肿瘤细胞类型或其他未知因素有关。该实验也发现单独celecoxib作用于hela细胞不显著影响细胞周期分布，但可使放射引起的g2/m期阻滞作用明显减弱。见图4。与此类似，park等 [10,11]的研究也发现celecoxib可以显著削弱放射引起的cox2阳性表达细胞的g2/m期阻滞，并认为这种作用与celecoxib阻止cdk1、cdk2的磷酸化有关。
真核细胞受照射后，可以广泛诱导g2期阻滞出现，这在保证细胞的完整性、损伤后细胞的存活和保持细胞的遗传稳定性方面具有重要生物学和遗传学意义。哺乳动物细胞预先用咖啡因[12]（可以解除照射诱导的细胞g2期阻滞）处理后照射，可以使细胞存活率明显下降，这说明辐射诱导的细胞g2期阻滞是机体的一种保护性调节。cyclinb1cdc2复合物的活性状态在g2/m期进程调控中起关键作用， 目前普遍认为，atm/atr激酶chk1/chk2cdc25ccdc2是放射诱导g2/m期阻滞的主要途径。但celecoxib如何影响上述途径，使g2/m期阻滞缺失和凋亡促进的分子机制还有待进一步研究。
3.2 dna修复与放射敏感性
dna是电离射线杀伤细胞的主要靶分子，辐射诱导的dna断裂及修复,与细胞内在放射敏感性有很好的相关性,可为细胞内在放射敏感性的预测指标。细胞受到分割的低剂量放射后，少部分细胞呈亚致死性损伤（sld），在细胞存活曲线上出现亚致死性损伤的累积，表现为存活曲线出现肩部及肩区的dp值（即阈值剂量）。raju等[8]发现用sc236（50um,3天）可消除放射存活曲线上的肩区，并通过分割照射（3gy/次，2次间隔4h）证明单纯放射组（1.4）较sc236＋放射组（1.1）有较高的修复能力。
双链断裂(dsb)是辐射所致细胞死亡的最重要的dna损伤形式，它的修复是通过两种形式的重组修复进行的：同源重组（homologous recombination repair，hr）和非同源末端结合重组（nonhomologous end joining, nhej），前者是低等生物修复形式,而高等生物主要是后者。dna依赖的蛋白激酶(dnapk)是参与nhej的重要分子，在dna损伤修复时，首先由其ku亚基结合损伤dna激活dnapkcs后启动dna损伤修复机制。已经证实,一些哺乳动物辐射敏感细胞系不能进行dsb修复的原因是由于dna依赖的蛋白激酶(dnapk)成分ku的缺失。lim等[13]研究发现cox2抑制剂可以下调ku70,ku80这两种dna修复相关基因的表达。md anderson的raju等[14]的实验也不仅在蛋白水平证明celecoxib抑制ku70的表达，同时证明celecoxib还可降低dnaku的结合活性。
综上所述，cox2 选择性抑制剂celecoxib对肿瘤细胞的放射增敏机制可能与抑制dna损伤修复有关，其作用可能通过减弱细胞周期g2/m检测点（checkpoint）作用和减弱dsb重组修复酶dnapk成分ku的表达得以实现。但celecoxib如何影响细胞周期和dna损伤修复的分子机制还有待进一步研究。
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