化学发光法的基本原理
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化学发光法的基本原理范文第1篇
关键词：石油产品 硫含量 分析方法 比较
在石油化工生产过程中硫的存在可造成设备的腐蚀、催化剂中毒；是导致油品在贮存过程中生成胶质并产生沉淀的主要因素之一，从而影响产品的质量和贮存安定性；另外，油品中的硫在燃烧过程中会生成硫氧化物，造成环境污染，危及人类健康。硫含量的测定方法很多，应用较早的有燃灯法、氧弹法、管式炉燃烧法等，由于此类方法灵敏度低，操作繁琐，耗时太长，已逐渐被微库仑法、X射线荧光光谱法、紫外荧光法替代；对于痕量硫的测定采用微库仑法。
一、各种总硫分析方法的原理
（一）微库仑法
微库仑法的基本原理是油品中各种形态的含硫化合物，在高温含氧气流中转变成二氧化硫，并随气流进入滴定池中。滴定池内装有含KI的电解液，并可通过电解产生三碘离子与进入滴定池的二氧化硫反应，生成三氧化硫和I-，通过计算产生三碘离子所消耗的电量，便可计算样品中的硫含量。
（二）X射线荧光光谱法（XRF）
X射线荧光法又分能量色散X射线荧光光谱法（EDXRF）和波长色散X射线荧光法（WDXRF）。
能量色散X射线荧光法（EDXRF）原理是将样品置于从X射线源发射出来的射线束中，测量激发出来能量为2.3keV的硫Kα特征X射线强度，并将累积计数与预先制定的校准曲线进行比较，从而获得样品的硫含量。[1]
波长色散X射线荧光光谱法（WDXRF）将样品置于X射线光束中，测定0.5373nm的波长下硫Kα谱线强度。将最高强度减去0.5190nm的推荐波长下测得的背景强度，作为净计数率与预先制定的校准曲线进行比较，从而获得样品的硫含量。[2]
在波长色散X射线荧光光谱法的基础上又发展出单波长色散X射线荧光光谱法（MWDXRF）被广泛使用。其原理是具有合适波长可以激发硫K层电子的单色X射线照射在装入样品盒的被测样品上，由硫元素发出的波长为0.5373nm的KαX射线荧光被一个固定单色器收集，收集的硫元素的X射线荧光强度被检测器测量，并用校准方程将其转换成被测样品中硫的含量（mg/Kg）。与传统的波长色散X射线荧光分析技术中所用的多色激发相比，单色X射线激发减少了背景，简化了基体校正，提高了信噪比。该方法可以快速、准确地测定汽油和柴油中的总硫含量。[3]
（三）色谱法
用接有FID检测器的气相色谱仪及硫化学发光检测器（SCD），测定油品中的痕量总硫，气相色谱仪作为样品的进入设备，色谱柱分别与进样器及检测器相连，采用空的毛细管色谱柱是因为只测定样品中的总硫，不需要考虑含硫化合物的类型，待分析含硫化合物从色谱柱馏出后，进入燃烧室，含硫化合物发生下列反应：R-S-----〉SO +H2O+其它碎片。SCD 燃烧器安装在色谱仪的检测器位置上，该燃烧器为双等离子体，用以增强SO 中间体的产生。
燃烧器控制器控制燃烧室温度和流量。真空泵将燃烧产物抽吸到一个低压反应池，同时臭氧发生器通过对Air高压电晕产生的臭氧（只有在反应池压力小于100 torr（SCD）的情况下，高压才会供应给臭氧发生器）也被吸到在低压反应池，一氧化硫（SO）与臭氧发生反应产生的化学发光（发光反应） ：SO + O3 -----> SO2 + O2 + hν （
二、试验部分
（一）仪器
（三）实验步骤
1.色谱法和微库仑法测定重整原料痕量硫
炼油装置重整工艺中，长期存在过量的硫会造成催化剂永久性中毒，重整原料硫含量控制在0.5mg/Kg以下，分析重整原料痕量硫适用的方法有紫外荧光法、色谱法和微库仑法，但由于国产的紫外荧光定硫仪检测限达不到要求，因此在这里就不做比较了。
打开色谱仪，调节合适的仪器测量参数，待仪器稳定后取浓度为0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L的硫标准样品测定生成硫标准曲线。
打开RPA-100型微库仑滴定仪，调节合适的仪器测量参数，待仪器稳定后取浓度为0.5mg/L的硫标准样品对仪器进行校正，使仪器的转化率在90%～110%之间。采用色谱法法和微库仑法测定相同的样品，测试结果见表1。
四、结果与讨论
微库仑法的操作较麻烦，准备工作主要是回收率的测定，因为油品中各种形态的含硫化合物，在高温含氧气流中不是100%转变成二氧化硫，总有一部分转化为三氧化硫，所以通过测二氧化硫的转化率来了解分析的准确率，所以每次分析前都需用标样调节转化率在90%～110%之间。用色谱法分析总硫操作简单，分析速度快，进样重复性好，线性范围宽，可排好序列，自动进样，大大降低了分析人员的劳动强度，提高了分析的准确度，X射线荧光法直接测量试样，测量过程中不需要与氧反应、燃烧、试样传送或稀释等步骤，无需样品转化，仪器外形小巧，操作简单可靠。X射线荧光法从样品准备到检测可在3～5min内完成，分析时间短，工作效率高。
参考文献
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[2]GB/T 11140-2008 《石油产品硫含量的测定 波长色散X射线荧光光谱法》[S]
化学发光法的基本原理范文第2篇
关键词：免疫PCR 基本原理 灵敏度 PCR种类
中图分类号：R446.6 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2011）18-0071-02
1992年Sano等人将免疫测定技术与聚合酶链反应(PCR)技术结合，创建了一种全新的极其敏感的抗原分子检测技术，即免疫―PCR。该技术正是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，这种灵敏程度使免疫检测技术达到了一个新的高度。现在将免疫―PCR技术研究进展综述如下：
1 免疫―PCR的基本原理
免疫―PCR主要由两部分组成。第一部分是类似于普通酶联免疫吸附试验(ELISA)的抗原抗体反应，第二部分是常规的PCR扩增和电泳检测。免疫―PCR与ELISA的区别就在于ELlSA是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体，用颜色反应来表明阳性或阴性结果，而免疫―PCR则是以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接DNA，并进行电泳检测，因此可由PCR产物的量来反映抗原分子的量。免疫―PCR的关键之处就在于用一个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上，在抗原和DNA之间建立相对应关系，从而将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测。
2 免疫-PCR的灵敏度
Sano T等应用免疫―PCR检测包被在ELISA板上的牛血清白蛋白，比应用碱性磷酸酶染色的ELISA法，在检测灵敏度上大约增加×105，由于PCR的巨大扩增能力和特异性，使得免疫―PCR技术灵敏度高于目前存在的任何抗原检测系统，理论上可检测单分子抗原。人甲状腺刺激素(TSH)是评价甲状腺功能的指标，血标本中正常浓度较低(5×10-12mmol/L，25×10-16mmol/L)，临床一般用放射免疫测定超过了ELISA的检测范围。Hendrickson等用三明治夹心法免疫―PCR检测TSH水平1fg(10-12mmol)。而用夹心法ELISA检测水平[pg(10-16mol)前者灵敏度比后者高3个数量级。
3 免疫―PCR的改进
虽然Sano PP等人构建的免疫―PCR具有极高的灵敏度，但Sano所用的连接分子链亲和素―蛋白A嵌合体还没有商品化，因此限制了他在实际应用中的广泛普及。Ruzicka等人以生物素化的抗体取代Sano免疫―PCR系统中的抗体，用商品化的亲和素代替链亲和素―蛋白A嵌合体作为连接分了构建了一个新的免疫―PCR系统。Ruzicka用此免疫―PCR系统检测小鼠抗载脂蛋白E抗体，可以检测出包被浓度为10fg/ml的E抗体。此外，Sano的免疫―PCR实验流程需要众多的洗涤步骤，使实验过程相当繁琐，并需要大量的操作时间。Zhou等人对此作了改进，他们用生物素化的二抗和游离链亲和素作为连接分子进行免疫-PCR实验，把每个步骤的洗涤次数从原先的7～15次减至3～5次，从而减少了操作时间，但不影响实验结果的准确性。另外，用修饰过的抗原稀释缓冲液代替Sano免疫―PCR中的TBS作为抗原稀释液，它主要把TBS中胍的浓度调到2mmol/L，由此解决了抗原的溶解问题。Zhou检测了人原癌基因ETS，检测浓度可达9.6×1015mmol/L，是常规ELISA的10倍，与Sano的免疫―PCR系统相比，Ruzicka和Zhou所用的方法不需要特殊的试剂，生物素和亲和素(链亲和素)都已商品化，因此在实际操作中得到广泛应用。
4 免疫―PCR的种类
多抗原分析物免疫―PCR，就是同时检测多种抗原。放射性同位素、荧光索、酶和化学发光法标记的抗体，已被开发用于多分析物的检测，但来自不同标记的重叠信号和扫描不同信号密度上的困难，使上述方法尚未试用，相对而言，DNA为多分析物区分提供了理想的分子标记。大小不同的DNA分子可以通过电泳准确、定量地区分。Hendrickson等用99个碱基的寡核甘酸标记的HCG抗体、85个碱基寡核苷酸标记的TsII抗体和55个碱基募核苷酸标记，β―Cal抗体同时检测HCC、TSH 、β―Cal3个分析物，而PCR扩增时，3个寡核苷酸应用一对引物，但产物分子质量各为99bp、85bp、55bp，因而各个抗原得以鉴定，Zhou和Hendrickson分别谈到单引物免疫―PCR，所谓单引物免疫―PCR，就是标记抗体的DNA指示分子的两侧翼含相同的引物序列，可用单引物PCR扩增。该法可提高PCR扩增效率，且适于多抗原免疫-PCR。双相免疫―PCR，就是同时检测病原体抗原又检测病体基因的免疫―PCR，其原理就是一对用于扩增某病原体基因的引物，被人工加在标记抗体的DNA marker的两端，使二者共用一对引物，但产物分子量大小不同，达到免疫―PCR在检测抗原的同时，又检测了目的基因。总之，目前而言，免疫―PCR可分为单分析物免疫―PCR、多分析物免疫-PCR、单引物免疫-PCR以及双和免疫-PCR。
5 展望
免疫―PCR作为一种抗原检测系统，同时具有抗原抗体反应的特异性和PCR的高灵敏度，适合于各种微量抗原的检测，并可以直接检测细胞上抗原。预先将抗体和标记DNA偶联，简化了实验操作，并可同时检测多种抗原。而标记物和引物被设计为带有亲和配体，则可用常规ETISA法检测，随着免疫―PCR技术的进一步发展完善，免疫―PCR的功能将得到更充分的发展，新的标记物和引物设计将扩展可检测分析的范围，简化实验的复杂性具有侧链DNA标记物的偶联物能够承担的标记物的检测，产生更准确的结果，相信不久就会有商品化的免疫―PCR试剂盒问世。
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化学发光法的基本原理范文第3篇
【关键词】 梅毒； 慢性传染病； 苍白密螺旋体； 血清学
Research Progress on Gene Recombinant Antigen of Treponema Pallidum （TP） and Its Serology Diagnosis/MO Xian-wen.//Medical Innovation of China，2014，11（28）：141-144
【Abstract】 Syphilis， a chtonic infectious disease， with complicated clinical manifestaion， long course and huge perniciousness， and complete treponema pallidum （TP） is unable to culture in clinical for a long time， which leads hinders in the antigen study based on TP. In latest years， with the constant and deeper study on the TP genes， it reached a big process that the study on related antigens of TP genes. The diagnosis of sphilis is based on serology currently， so it would be helpful for the treatment of syphilis that mastering related serology diagnosis. This paper is a summary about the research progress on gene recombinant antigen of TP and its serology diagnosis.
【Key words】 Syphilis； Chronic infectious disease； Treponema pallidum； Serology
First-author’s address： Guidong People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Wuzhou 543001， China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.28.048
导致人体感染梅毒的致病菌为苍白螺旋体的亚种-密螺旋体（TP），感染人体的主要致病菌株为Nichols株。梅毒螺旋体的细胞质被3层细胞质外膜包裹着，而暴露于外膜的跨膜蛋白数量较少，但跨膜蛋白在临床中对于梅毒的诊断确诊有着极大的实际价值[1]。在实际的临床操作中，很难对梅毒螺旋体进行体外培养，确诊梅毒的方式由培养梅毒螺旋体替代为利用梅毒螺旋体的重组抗原进行对应的检测。
1 梅毒螺旋体基因重组抗原的研究进展
1.1 Tpr基因家族 Tpr基因家族涵盖了12个蛋白，这12个蛋白按照同源性氨基酸的分类应该属于3个不同的亚型，其中Ⅰ亚型为Tpr C、D、F、I，Ⅱ亚型为Tpr E、G、J，Ⅲ亚型为A、B、H、L、K[2]。在这3个亚型中，在梅毒感染兔的模型中，诱导T细胞以及强烈的抗体反应的为Tpr K，这一实验结果提示着使用Tpr免疫能够有效地减弱梅毒患者损伤后病情的进一步发展。在分子结构学上，对于Tpr家族的Ⅰ亚型而言，其中它们的C端和N端高度相似于F端和N端，特别是在Tpr的C、D两个亚型之间，它们C端结构的相似度高达94%[3]。在对Tpr家族的抗原氨基末端的重组性实验中发现，这些抗原对于感染梅毒患者的损伤的进展有着一定程度的减弱作用，这些重组抗原很可能起着关键作用的阶段为梅毒患者的不完全免疫阶段。
1.2 TpN15、TpN47、TpN17、TmpA 1989年有学者利用兔子的抗体血清成功的筛查出了Tp基因组中的6个重组克隆，且利用Western法以及电泳法成功的筛选出了TpN15、TmpA、TpN17等3个蛋白[4]。在1996年，相应的学者在通过对梅毒螺旋体的结构的进一步研究中发现，他们利用PCR法对梅毒螺旋体内的基因进行了扩增，并将扩增后的基因插入大肠杆菌内进行了表达，结果获得了TpN47、TpN35、TpN44.5、TpN29-35、TpN39等抗原，接下来的ELISA法实验中发现上述抗原中引起抗体滴度最高的为TpN47、TpN17、TpN44.5[5]。在后续的相关实验中，学者重组并成功表达了TpN47的载体pGEX-2T，并成功证实了其具有免疫原性，同时有学者的相关实验还成功的证实了TpN47是一种能够与青霉素进行结合的蛋白，并且发现TpN47与青霉素结合的位点有3个，同时还证实TpN47本身是一种具有锌依赖性的羧肽。有学者通过重叠多肽的方法成功的找出了位于TpN47上的抗原表位[6]。
1.3 TROMP TROMP对于梅毒具有免疫原性，而在TROMPs的表面可能存在着免疫宿主的介导区和致病力决定区，在TROMP的表面上存在着17-kDa、28-kDa、31-kDa、45-kDa、65-kDa。其中存在于TP内膜原生质体复合物中的主要为17-kDa和45-kDa，而存在于外膜的主要为28-kDa、31-KDa以及65-kDa[7]。在天然重组蛋白质中，28-kDa、31-kDa、65-kDa就天然的具有抗原性质，28-kDa主要在外膜中进行表达，并且与跨膜蛋白存在着高度相似的序列，65-kDa其整体数量虽然较少，但是仍然被认定为具有抗原免疫性，而31-kDa被证明具有能够形成微管的能力，从而被间接的证实为跨膜蛋白。目前国外的相应研究已经明确，TP分子本身的免疫反应能够产生高滴度的TP抗体，在上述反应过程中，TROMPs能够诱导产生对应的抗体。在相关的实验中发现，只有自然的TP感染才能够产生真正的血清吞噬作用，而使用灭活的Tp重组抗原并不能够产生真正意义上的血清吞噬作用[8]。在对TROMP1的各项重组实验中可以发现，在电子显微镜下可以明显发现在Tp感染的血清中，TROMP1的表达主要是在重组菌的表面表达，相应的实验还证实对于rTROMP1而言，其定位于E.coil的外膜，并且同时兼有表面抗原性以及微孔体系。
1.4 Tp0155、Tp0751、Tp0483、Tp0453、Tp92 在1998年的实验中，有学者发现对于Tp92而言，其极有可能是Tp的抗原之一，并通过PET-3a T7载体重组表达了Tp92，通过对表达后的Tp92进行相应的检测发现，Tp92确实具有抗原免疫性[9]。Tp0155、Tp0751、Tp0483、Tp0453都是通过PCR扩增法进行了去除N端信号肽的全长表达，且表达后的这6个蛋白均进行了临床血清学的检测，最后的实验结果显示，对于Tp0155、Tp0751、Tp0483而言，实验的灵敏度为28%～42%之间，而对于Tp0453而言，其中检测的灵敏度和特异度均为100%，Tp92的特异度为97%、灵敏度为98%。其中学者描述了Tp0453的除去两段端肽的结构，但近些年来的实验研究则显示，Tp0453的结构目前与所有已知的外膜蛋白都不相同，Tp0453缺少一种β桶结构，正是因为缺少这种结构，导致Tp0453无法横跨外膜，从而避免暴露于Tp的菌体外膜表面[10]。正是因为Tp0453的这种结构特殊性，有学者认为对于Tp0453极有可能代表一大类的新的细菌外膜蛋白。国内有学者新组了Tp0453并对其进行了临床评价，最后的实验结果显示，Tp0453应该可以被用于ELISA反应[11]。
1.5 Tp4D以及TpN37 在1986年的国外学者的相应实验中就已经证实，对于Tp4D而言，其确实具有抗原免疫性，同时相应的ELISA法也证实，4D的ELISA能够检测到的抗4D特异性抗体为25 ng，且在检测的灵敏度上可以与免疫荧光法相媲美，但是Tp4D的一个重大缺陷就是存在着与地方性梅毒菌种的一个交叉反应[12]。同样在1986年，国外学者使用5.6 kb的TpDNA的重组基因的质粒做出内切酶图谱后，再成功地转入大肠杆菌内进行了表达。利用免疫杂交点的方法对TpN37进行检测时发现，对于梅毒二期的血清检测有效，如果改变检测的方法，利用放免和酶免的方法进行相应的检验，TpN37与所有血清中的抗体都能够发生反应，但唯一的不足是对于阴性对照则没有反应表现出。在兔梅毒模型中，利用兔子血清制作的特异性兔单克隆抗体能够有效地被TpN37抗原，并且TpN37抗原不会与其他的非致病性的螺旋体发生反应，上述实验结果提示对于TpN37而言，其能够有效的作为血清诊断梅毒的有效抗原[13]。
2 梅毒螺旋体基因重组抗原血清学诊断的研究进展
有相应的临床大样本量的实验研究证实，Tp凝血实验的最终结果与利用Tp基因重组抗原的临床快速检测在检测的灵敏度上无显著统计学差异。但Tp单一基因重组抗原对于合并了HIV感染，或者是已经接受了一段时间的抗梅毒治疗的患者，或者是处于潜伏期的梅毒患者而言，其检测的灵敏度会大大下降，而如果使用多基因重组的Tp重组基因抗原，则其检测的整体灵敏度将会大大提高，出现的假阴性的比例会大大减小[14]。
2.1 免疫层析实验的研究进展 利用Tp基因重组的抗原包被膜条测试区时，当抗原中的IgG/IgM与膜条测试区域中的标记的抗人IgG/IgM结合后，结合后的复合物最终层析到膜条测试区与特异抗原结合后所呈现出来的显色标记就为阳性反应标记[15]。在TPHA的评价标准下，有学者将4种不同国家生产的免疫层析试剂盒用来进行评价，结果这4个国家的免疫层析试剂盒的最终检测结果显示，不论是在全血还是在血清检测的敏感性上，都取得了良好的结果，上述的实验结果让人相信在不远的将来，免疫层析实验将有可能取代传统的筛查实验。
2.2 Tp-ELISA的研究进展 在目前的Tp-ELISA研究中，聚苯乙烯反应板微孔在被Tp重组基因抗原包被，且抗人IgG/IgM在被酶标记的情况下，可以有效的对Tp的IgG/IgM进行检测。在双抗原夹心的ELISA法中，酶和反应板均对Tp重组的酶抗原进行了标记。在利用Tp的3种组合表达蛋白，TpN15、TpN17、TpN47的ELISA检测实验与性病研究实验、荧光密螺旋体抗体吸收试验以及TPHA实验的检测灵敏度、特异度相比，利用Tp的3种组合表达蛋白，TpN15、TpN17、TpN47的ELISA检测实验的对处于不同分期的梅毒患者的检测的灵敏度、特异度均要显著高于其他3种方法。而国外学者在利用重组的TpN17-15-ELSIA法与WB、以及THBA法相比，在对正常人和含有疾病的2950份血清的检测中，TpN17-15-ELSIA法与WB法均未出现交叉反应，而THBA法则出现了交叉反应[16]。而在对Tp多基因嵌合重组抗原与Tp单基因重组抗原的平行检测中发现，Tp多基因嵌合重组抗原检测的灵敏性要显著高于Tp单基因重组抗原，在对双抗原夹心ELISA法与间接ELISA法的比较中，双抗原夹心ELISA法的检测准确性要显著优于间接ELISA法。而目前在投入商业化使用的Tp重组基因的ELSIA法检测试剂盒中，其检测的灵敏度和特异度均为100%。
2.3 快速乳胶凝集试验 在实验的原理上，快速乳胶凝集试验的基本原理与Tp的颗粒凝集试验相似。在临床实验中，有学者利用TpN15、TpN17、TpN47作做为抗原，利用快速乳胶凝集试验法快速检测了1518份随机得来的血清样本，将检测的实验结果同VDRL法的特异度进行检测，并同时期检测99分梅毒血清样本，最后的实验结果显示，快速乳胶凝集试验与VDRL法检测的特异度并无显著的统计学差异[17]。上述的实验结果提示，在梅毒的筛查中可以考虑使用快速乳胶凝集试验。
2.4 CLIA法 CLIA法的中文名称为化学发光免疫分析，其基本原理为将固相抗原设定为Tp基因重组抗原，利用HRP对第二抗原进行标记，同时使用含鲁米诺或者是其对应的增强剂作为示踪剂，通过最后测量其发光数值的方法来进行检测。我国学者通过使用TpN15、TpN17、TpN47作为对应的酶标抗原和固相抗原，成功的建立了基于Tp为双抗原夹心的CLIA法，通过与TRUST、TPPA、TPHA、Tp-ELISA法平行的检测Tp抗体检测分别呈阳性和阴性的血清，结果最后的实验结果显示这4种方法的阳性检测率和阴性检测率均无显著的统计学差异[18]。
2.5 WB法 将Tp的重组基因抗原通过SDS-PAGE通过电印转印到PVDF膜上，再与待检测的血清进行检测后通过酶标记抗人的IgG/IgM。其实验的基本原理为，如果待检测的血清中存在TpN15、TpN17、TpN42、 TpN47、TpN37等抗体，则加酶的底物可以出现反应，并且能够显色。有国外学者将rpN47、rTpNl7、rTpNl5、rTpN42、rTpN37这5种多肽进行重组建立recWB法，并与MHA-Tp以及wclWB对比进行梅毒血清的检测，相应的实验结果显示，在各项综合指标的评价中，recWB法要显著优于wclWB法[19]。
目前部分Tp重组基因的抗原已经应用于临床梅毒的检测中，其中涉及的Tp基因重组的抗原主要为TpN15、TpN17、TpN47，在初期使用的Tp基因重组抗原多为单一基因的抗原，现在则多为多基因嵌合的抗原，虽然对于各期梅毒的检查灵敏度和特异度得到了极大的提高，但是仍然存在着较大的不足，且在实际中对于何种Tp抗原的检测结果更为准确，仍然存在着较大的争议[20]。目前随着免疫学技术的不断进步与发展，已经逐步能够解决难以从Tp中纯化的微量蛋白数量问题，并已经能够对其具体的作用机制展开相应的研究。这也意味着，Tp基因重组抗原应用于梅毒的检测中的前景更为广阔。
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