生物质谱技术与方法

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生物质谱技术与方法范文第1篇

关键词：蛋白质，质谱分析，应用

前言：

蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。

自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。

1．质谱分析的特点

质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。

2．质谱分析的方法

近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。

3．蛋白质的质谱分析

蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。

3.1蛋白质的质谱分析原理

以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。

3.2蛋白质和肽的序列分析

现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrosprayionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDITOFMS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一[5]。目前在欧洲分子生物实验室(EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDITOFMS蛋白质一级结构(序列)谱库，能为解析FAST谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据[6]。3蛋白质的质谱分析方式

质谱用于肽和蛋白质的序列测定主要可以分为三种方法：一种方法叫蛋白图谱(proteinmapping)，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂.第三种方法与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序(laddersequencing)，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。

3.3.1蛋白消化

蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的赖氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。

3.3.2基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(MALDI-TOFMS)[7]

简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比(mass/charge，m/z)来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质(matrix)混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中，样品然后置于激光离子发生器(lasersource)。激光作用于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪(TOFmassanalyzer)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。而此飞行时间同多肽离子的质量/电荷的比值成反比，即质量/电荷之比越高，飞行时间越短。最后，由电脑软件将探测器录得的多肽质量/电荷比值同数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽的质量/电荷比值进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白.此法称为多肽质量指纹分析(peptidemassfin-gerprinting)。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法操作简便，敏感度高，同许多蛋白分离方法相匹配，而且，现有数据库中有充足的关于多肽质量/电荷比值的数据，因此成为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法。

3.3.3电子喷雾电离质谱测量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)[8]

同基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法在固态下完成不同，电子喷雾电离质谱测量法是在液态下完成，而且多肽离子带有多个电荷，由高效液相层析等方法分离的液体多肽混合物，在高压下经过一细针孔。当样本由针孔射出时，喷射成雾状的细小液滴，这些细小液滴包含多肽离子及水份等其他杂质成分。去除这些杂质成分后，多肽离子进入连续质量分析仪(tan-demmassanalyzer)，连续质量分析仪选取某一特定质量/电荷比值的多肽离子，并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离或非电离片段。随后，依质量/电荷比值对电离片段进行分析并汇集成离子谱(ionspectrum)，通过数据库检索，由这些离子谱得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋白鉴定较依据多肽质量指纹进行的蛋白鉴定更准确、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通过蛋白氨基酸序列数据库检索，也可通过核糖核酸数据库检索来进行蛋白鉴定。4．蛋白质质谱分析的应用

1981年首先采用FAB双聚焦质谱测定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，质谱中出现准分子离子[M+1]+=1319强峰。分子量小于6kDa肽或小蛋白质合适用FAB质谱分析，更大分子量的多肽和蛋自质可用MALDI质谱或ESI质谱分析。用MALDI-TOF质谱分析蛋自质最早一例是HillenKramp等[9]于1988年提出用紫外激光以烟酸为基质在TOF谱仪上测出质量数高达60kDa蛋白质，精确度开始只有0.5%，后改进到0.1-0.2%。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质量，也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究[10,11],三条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。近年来，串联质谱分析仪发展迅猛，其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高，大规模数据库和一些分析软件(如:SEQUEST)的应用使得串联质谱分析仪可以进行更大规模的测序工作。目前，利用2D电泳及MS技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析，已经鉴定出1484种蛋白质，包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质[12]；分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分[13]，并利用质谱进行鉴定磷酸化蛋白研究工作[14]及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白(SDNP)的分子结构[15]等。

结束语：

在蛋白质的质谱分析中，质谱的准确性(accuracy)对测定结果有很大影响，因此质谱测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点，这些都非常适合于现在科学研究的需要。我们相信，随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进，蛋白双向电泳的应用[16]以及质谱技术的不断完善，质谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一。

参考文献

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生物质谱技术与方法范文第2篇

    研究中药的作用机制必须清楚中药作用后的物质变化,生物质谱可以用来对中药作用后的相关蛋白等大分子物质进行分析。刘鹏等[v]采用腹腔注射内毒素(LPS)复制内毒素肝损伤模型,清热解毒凉血化疲中药干预,用SELDI-TOF一MS技术分析大鼠血清差异表达蛋白,共获得与芯片结合的11个有效蛋白质峰,各组大鼠的血清内存在的差异表达蛋白,有助于内毒素肝损伤的进一步研究。此项工作需更进一步对产生差异的蛋白进行鉴定,才可揭示此类蛋白在中药干预机制中的意义或作用。

    2中药与生物大分子的相互作用

    研究中药化学成分与生物大分子的相互作用可以找到中药与靶分子的作用机制,进一步阐明中药的作用机制。生物质谱的软电离技术可以测得中药小分子与蛋白等大分子相互作用的化学计量比,计算二者之间的结合强度、确定药物的结合位点以及获得反应动力学等多方面的信息。主要有两种思路:(1)通过测定复合物的相对丰度比较中药小分子与蛋白等大分子的相对作用强度;(2)通过比较中药小分子药物浓度加人蛋白等大分子前后的变化来推断两者的相对作用强度,目前,已应用生物质谱测定中药小分子与核酸如DNA、蛋白或多肤等大分子之间相互作用的研究[8]。例如,zhangH等[9]利用Esl一Ms研究了人参皂昔与细胞色素C之间的相互作用,获得K(D)值。郑州大学陈晓岚等[l0一,’]对一些磷酞化修饰的黄酮类中药与溶菌酶和。一乳白蛋白之间的相互作用进行了研究,计算出结合常数,推算出两者的结合力类型。尽管生物质谱为中药小分子与生物大分子之间的相互作用提供了很好的研究手段,但应该看到,由于中药的复杂性以及研究环境与体内有很大的差异,许多研究结果还需要体内实验的验证。

    3中药治疗的蛋白质组学研究

    蛋白质组学是近年医药和生命科学领域研究的热点之一。蛋白质组学的含义是:一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白。蛋白质组学的核心在于大规模地对蛋白质进行综合分析,通过对某种物种、个体、器官、组织或细胞的全部蛋白质性质(包括表达水平、结构、翻译后修饰、细胞内定位、蛋白质相互作用等)的研究,对蛋白质所执行的生理性、病理性生命活动做出最精细、最准确、最本质的阐述[,2]。中药治疗的蛋白质组学研究的基本研究思路是,首先造模,确定造模成功后提取总蛋白质,2一DE电泳技术分离总蛋白建立蛋白质组图谱,用图像分析软件寻找模型组、对照组及中药治疗组各组间差异蛋白点,MALDI一TOF/MS分析差异蛋白点,并结合蛋白质生物信息库,初步鉴定差异蛋白质。在此方面国内学者进行了一些探索[ls一l#],有学者研究了单体人参皂昔对人肺巨细胞癌高转移细胞株蛋白质组的表达的影响,还有报道研究松果菊昔对小鼠帕金森病模型黑质纹状体组织蛋白表达的影响,再如研究中药复方强骨宝1号对去卵巢骨质疏松大鼠皮质骨蛋白质组表达的影响等。以上研究结果找到一些差异蛋白,为中药作用机制的研究提供了依据。

    4代谢组学研究

生物质谱技术与方法范文第3篇

[关键词] 超滤质谱；板蓝根；活性成分；神经氨酸酶抑制活性

[收稿日期] 2013-11-17

[基金项目] 国家自然科学基金项目 （81274078， 81322052， 81303222）

[通信作者] *鄢丹，Tel/Fax：（010）66933325，E-mail： ；*肖小河，E-mail：

板蓝根Isatidis Radix为临床常用中药，主要用于治疗上呼吸道感染等疾病，疗效确切，一般认为与其抗流感病毒药理活性相关[1-4]。由于板蓝根化学成分复杂，药效物质尚不明确，影响了其质量评控水平的提升及临床疗效的稳定发挥。现行药效物质筛选模式（植化分离、药理活性示踪、血清药物化学筛选等）在推动中药药效物质发现的同时，操作繁琐、活性成分易丢失等局限也日益显现[5-7]。因此，有必要探索高通量、灵敏的中药药效物质发现新技术。

超滤质谱技术是将超滤装置与质谱技术结合后形成的一种新方法，主要是利用亲和原理，将含有潜在活性的小分子物质与受体（靶部位如蛋白或酶等）混合，形成受体-配体复合物（采用超滤薄膜除去可能含有的未结合小分子），以有机溶剂处理并释放小分子配体，进一步采用液相-质谱联用技术对其进行鉴定，从而实现活性成分的快速初筛[8]。目前，该技术在先导化合物的发现、配体与受体结合强度以及相关机制等研究方面有较广泛的应用[9-14]。

神经氨酸酶作为抗流感病毒药物的主要作用靶点之一，可协助成熟流感病毒脱离宿主细胞感染新的细胞[15]。板蓝根具有神经氨酸酶抑制活性[16-17]，本研究借助超滤质谱技术筛选板蓝根与神经氨酸酶结合的潜在活性成分，同时配以神经氨酸酶体外活性评价，以期发现板蓝根抗流感病毒可能的药效成分，将为板蓝根质量标准的提升以及中药药效物质的发现提供技术参考。

1 材料

Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters Xevo G2 Qtof质谱仪（美国Waters公司）；自动酶标仪（美国bio-tek公司）；超速离心机（德国Eppendorf 公司）；板蓝根购自安徽，经中国人民第302医院中药研究所肖小河研究员鉴定为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort. 的干燥根；精氨酸（arginine），告依春（goitrin），腺苷（adenosinea）对照品购自中国食品药品检定研究院；2-（N-吗啡啉）-乙磺酸（MES）购自sigma公司，神经氨酸酶（neuraminidase， NA）（human H1N1）购自Sino biological公司；YM-100 超滤膜购自Millipore 公司；神经氨酸酶荧光底物2′-（4-methylumbelliferyl）-D-N-acetylneuraminic acid （MUNANA），奥斯他韦酸（Oseltamivir acid）购自Toronto Research Chemicals Lnc.；甘氨酸购自北京索莱宝科技公司。甲醇和乙酸均为色谱纯（美国Fisher公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 样品制备

2.1.1 供试品溶液制备 取板蓝根药材粉末（过3号筛）约5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加水50 mL，称定质量，加热回流1 h，放至室温，加水补足质量，滤过；取续滤液25 mL，浓缩至15 mL，放冷，加乙醇20 mL，静置使沉淀，离心，过滤；另取60%乙醇10 mL洗涤沉淀过滤器，合并上清液及滤液，浓缩至近干，加水溶解定容于5 mL量瓶中，过0.22 μm微孔滤膜，样品用于超滤实验和体外酶活性实验分析。

2.1.2 对照品溶液制备 告依春对照品用甲醇配成质量浓度为2 g·L-1的储备液；精氨酸对照品用甲醇配成质量浓度为10 g·L-1的储备液；腺苷对照品用甲醇配成质量浓度为10 g·L-1的储备液。

2.1.3 参照物溶液制备 取奥司他韦酸适量，精密称定，加水制成每1 mL含50 ng的溶液，按等比级数1∶0.5稀释成4个不同浓度的参照物溶液。

2.1.4 缓冲液制备 称取MES 0.64 g， CaCl2 0.044 g溶于100 mL 超纯水中，配成浓度为32.5 mmol·L-1 MES，4 mmol·L-1CaCl2的缓冲溶液，并用氢氧化钠调节pH至6.5。

2.1.5 终止液制备 取甘氨酸1.5 g，加25%乙醇溶解，氢氧化钠试液调pH至10.7，即得。

2.2 色谱与质谱条件

2.2.1 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm， 1.7 μm），柱温25 ℃，流速0.4 mL·min-1。流动相水（A）-甲醇（B）二元梯度洗脱，具体梯度为0～3 min，95%～50% A；3～10 min，50%～30% A；10～15 min，30%～0% A；15～18 min，0%～0% A；18～21 min，95%～95% A。

2.2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），采用正离子扫描检测；脱溶剂气流量800 L·h-1，脱溶剂温度350 ℃，锥孔气流量50 L·h-1，离子源温度120 ℃，毛细管电压正离子扫描3 200 V，负离子扫描2 700 V，锥孔电压35 V，微通道板电压3 500 V，碰撞能6 V，碰撞气氩气，碰撞室压力小于0.28 Pa。质谱扫描范围50～1 200。

2.3 超滤实验

分别吸取一定量板蓝根提取物溶液和神经氨酸酶溶液加至pH 6.5的缓冲溶液中，随后置37 ℃水浴中反应30 min后，吸取一定量转移至截留相对分子质量为100的YM-100 型超滤管中，8 500 r·min-1离心5 min，滤膜加缓冲溶液（pH 6.5）离心清洗3次，洗去未结合成分。再向滤膜中加入适量的50%甲醇，8 500 r·min-1离心7 min 释放结合配体，重复3次，收集洗脱液，冷冻干燥后加50%甲醇500 μL溶解，用于LC-MS分析。为了排除由于超滤膜对小分子的吸附作用而产生的假阳性结果，每次实验前均进行空白实验，即同法处理不加NA的药材溶液[17]。

2.4 神经氨酸酶活性实验

采用课题组已建立的神经氨酸酶（NA）活性检测法[16，18]表征药物抗流感病毒的作用强度。反应在96孔板荧光酶标板中进行，首先加入稀释的神经氨酸酶25 μL和供试品溶液25 μL，室温下作用30 min后加底物MUNANA 50 μL 37 ℃孵育60 min后加入终止液MES（0.1 mol·L-1甘氨酸，以25%乙醇配制，10%氢氧化钠溶液调pH 10.7）200 μL终止反应。测定荧光强度值，设置激发波长355 nm，发射波长460 nm，检测温度37 ℃。为便于活性比较，同时设样品测试组（NA + 样品 + MUNANA），背景对照组（样品+ MUNANA，缓冲液补足至相同体积），空白荧光组（MUNANA，用缓冲液和样品溶剂补充至相同体积），酶活性对照组（NA + MUNANA，反应终止后再加入同体积样品溶液），每组设6个复孔。

3 结果

3.1 超滤质谱筛选抑制神经氨酸酶活性成分

采用超滤质谱技术，通过比较对照组（超滤不加酶）、对照品组、药材原液组（不超滤不加酶）和实验组（超滤加酶）中成分的差异，并结合基峰总离子流色谱图（图1）和提取离子流色谱图（图2）筛选与神经氨酸酶有相互作用的成分，结果共筛选鉴定出3个可与NA结合的化合物，分别为精氨酸、告依春和腺苷。在本实验条件下，实验组（超滤加酶）色谱图主要集中在4 min内。

由图2可知，板蓝根药材提取离子流图中精氨酸、告依春、腺苷的保留时间分别为0.344，0.455，0.491 min。Q-TOF-MS给出的准分子离子峰分别为精氨酸m/z 175.119 0，告依春m/z 130.033 2，腺苷m/z 268.104 6，分别与对照品精氨酸、告依春、腺苷比对，具有相同的保留时间、准分子离子峰，由此可以确认上述3种化合物分别为精氨酸、告依春、腺

A. 对照组（未加酶组）；B. 对照品组；C. 板蓝根药液组；D. 实验组（加酶组）。

图1 不同组别样品总离子流图

Fig.1 The total ion chromatogram of different groups

苷。对照组和实验组中化合物亦按照上述方法进行确认。

由于色谱峰的积分面积与其相应的浓度成正比，故可以通过超滤前后色谱峰积分面积的变化程度来反映相应化合物与生物靶分子的结合程度。按如下公式进行计算[20]：结合率=（Ae-Ac）/A×100%，其中A为药物原液色谱峰的积分面积，Ae为实验组色谱峰的积分面积，Ac为对照组色谱峰的积分面积。

利用这种计算方法对板蓝根药材中各组分与靶分子的相对结合强度进行计算，3次独立重复实验结果显示精氨酸、告依春、腺苷的结合常数分别为（36.23±1.12）%，（32.54±1.02）%，（9.38±0.47）%（精氨酸>告依春>腺苷）。比较结合常数可以看出，精氨酸和告依春与神经氨酸酶的结合强度较大，提示精氨酸和告依春可能是板蓝根抑制神经氨酸酶的活性成分。

a. 对照组（未加酶）； b. 板蓝根药液组； c. 实验组（加酶组）；1.精氨酸；2.告依春；3.腺苷。

图2 不同成分提取离子色谱图

Fig.2 The extracted ion chromatogram of different compound

3.2 体外神经氨酸酶抑制活性验证实验

采用体外神经氨酸酶活性实验进一步验证超滤质谱初筛实验结果（以NA为阳性药），结果表明，精氨酸、告依春和腺苷超滤质谱的结合常数与体外神经氨酸酶活性检测结果吻合度良好，提示超滤质谱技术在初筛中药活性成分具有高通量、灵敏、准确等优势（图3）。

4 讨论与结论

本研究借助超滤质谱技术，通过比对不同组别板蓝根样品超滤前后成分的变化情况，筛选并鉴定出精氨酸、告依春与神经氨酸酶结合能力显著；进一步以体外神经氨酸酶活性实验验证，发现精氨酸和告依春可能是板蓝根抗流感病毒的活性成分，为板蓝根质量评价指标的选择提供了科学依据，有助于

*腺苷IC50大于500 g·L-1。

图3 初筛成分超滤质谱结合常数与体外活性IC50对比图（n=3）

Fig.3 Comparison of binding degree and IC50of the screening compounds against neuraminidase（n=3）

其质量标准的提升。

与药效成分常规筛选方法相比，超滤质谱技术是基于对药物小分子与其活性发挥关键靶点（蛋白、酶等）相互作用的共识而建立的中药活性成分初筛技术，具有高通量、灵敏、快速等技术优势，适合用于活性成分的早期筛选、活性强度评测以及相关机制初步探索研究。同时，结合中药多成分、多靶点作用特点，深入开展不同关键靶点和体内试验以确认初筛的活性成分将是十分重要而有意义的研究工作。

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Screening bioactive compounds inhibiting influenza virus from Isatidis

Radix by ultrafiltration mass spectrometry

MA Li-na ZHANG Cong-en， YAN Dan， TAN Man-rong， LI Han-bing， ZHANG Le-le， XIONG Yin， XIAO Xiao-he

（1.College of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610075， China；

2. China Military Institute of Chinese Materia Medica， 302 Military Hospital， Beijing 100039， China；

3.College of Pharmacy， He′nan University of Traditional Chinese Medicine， Zhengzhou 450008， China）

[Abstract] In vitro neuraminidase inhibition assays and ultrafiltration liquid chromatography with diodearray detector coupled to time of flight mass spectrometer （UPLC-DAD-TOF-MS） were combined to screen bioactive compounds inhibiting neuraminidase from Isatidis Radix. By comparing the compounds from Isatidis Radix before and after ultrafiltration， we found that arginine， goitrin and adenosinea can bind with neuraminidase， and the binding degree of the three compounds were （36.23±1.12）%， （32.54±1.02）% and （9.38±0.47）%， respectively. The IC50of arginine and goitrin were （1.16±0.02）， （1.20±0.02） g·L-1， respectively. While the IC50of adenosinea was higher than 500 g·L-1. The results showed that arginine and goitrin might be the main compounds with antiviral activity of Isatidis Radix. This study may provide a useful method for the screening of bioactive compounds and quality control of Isatidis Radix.

生物质谱技术与方法范文第4篇

【摘要】 目的对8种化湿药挥发油成分进行定性、定量分析，并比较挥发性成分的异同。方法在运用气相色谱-质谱(GC/MS)技术的基础上采用HELP（直观推导式演进特征投影法）对产生的二维色谱-质谱数据进行解析，对组分进行定性和相对定量分析。结果鉴定出相对共有成分达60余种，8种药材挥发性成分中均含有桉叶油醇(Eucalyptol，0.01%～82.41%)和环氧石竹烯(Caryophyllene oxide，0.02%～5.5%)。结论8种化湿药挥发油共有成分大多数为萜类化合物及其衍生物，但其含量存在较大差异。

【关键词】 挥发油; 气相色谱-质谱; 直观推导式演进特征投影法

Abstract:ObjectiveTo detect chemical components of the volatile oil in eight samples of damp dispersing herbs. MethodsGas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) with heuristic latent projections (HELP) method， and overall volume integration method were used. ResultsMore than 60 relatively common components were identified. Eucalyptol(relative content tr～82.41%) and Caryophyllene oxide（0.02%～5.5%） are the common main compounds of the eight plants. ConclusionThere is a lot differences in the chemical compounds among the eight damp dispersing herbs， Terpenes and their derivatives are the main components， and also in percentages on many levels.

Key words:Volatile oil; GC/MS; Heuristic Evolving Latent Projection (HELP)

凡功能化除湿浊，醒悦脾胃的药物，称为化湿药(damp dispersing herbs)。化湿药［1］大多气味芳香，故又称为“芳香化湿药”。化湿药主要适用于湿困脾胃、身体倦怠、脘腹胀闷等症。此外，对湿温、暑温诸症亦有治疗作用。本文选取了常用的8种化湿药如藿香、草果、苍术、佩兰、厚朴、白豆蔻、草豆蔻、砂仁，采用水蒸气蒸馏法分别提取挥发油，利用气相色谱-质谱(GC/MS)检测，运用（直观推导式演进特征投影法）(HELP)方法对产生的二维色谱-质谱数据进行解析，得到各组分的纯色谱曲线和质谱，根据其保留时间和质谱，在质谱库中进行检索，对组分进行定性和相对定量分析。

1 仪器与药品

仪器为日本岛津QP2010型气相色谱-质谱联用仪(检索用NIST107版质谱库)。8种药品均购于湖南长沙市老百姓大药房，均经过刘韶副教授鉴定。

2 方法

2.1 挥发性成分的提取取原药材样品各40 g，粉碎后按以上顺序编号为A1至A8备用。根据《中国药典》（2005年版）［2］中的标准方法提取挥发油。

2.2 挥发性成分的测定条件

色谱条件色谱柱：DB-23（30 m×0.25 μm×0.25 mm）；载气：氦气（99.999%），柱流量：1.0 ml/min；柱前压：53.6 kPa；柱初温：50℃，程序升温4℃/min至终温230℃。

质谱条件型号：QP2010；电离方式：标准EI电离；电离能：70eV；离子源温度：200℃；接口温度：250℃；汽化室温度：250℃；扫描间隔：0.2 s/scan；倍增电压：0.75 kV；扫描范围m/z：30～500 amu。

3 结果

按照上述的分析条件，得到了编号为A1～A8的8种样品的总离子流图（见图1），用岛津仪器工作站的质谱图库进行检索，设定相似度匹配的阈值为85%，对相似度匹配未能确定的重叠色谱峰利用HELP（直观推导式演进特征投影法）［3，4］方法进行解析。表1 供试品编号及来源（略）

以藿香为例，图1含其总离子流图，用HELP法对整个二维数据进行逐段解析可知，总离子图中的许多色谱峰是重叠峰，甚至一些看似纯的色谱峰也是混合组分的重叠峰，可见利用化学计量学方法的必要性。下面以5 310～5 400（22.70～22.99 min）保留段的色谱峰为例具体介绍一下HELP的详细解析过程。见图2～3。

将解析得到的纯色谱图在NIST107版质谱库找出对应的标准质谱，得到的标准质谱和组分质谱见图5，最终确定这5个组分分别是7-亚甲基－2，4，4-三甲基－2-乙烯基－双环［4.3.0］壬烷，(A，相似度为92.37%)；1α，4aα，8aα-7-甲基-4-甲烯基-1-异丙基-1，2，3，4，4a， 5，6，8a-八氢萘，(B，相似度为95.13%)；4(14)，11-桉叶二烯，(C，相似度为97.71%)；雅槛蓝烯，(D，相似度为92.35%)；杜松烯，(E，相似度为94.85%)。按照上述过程，可逐步解析其他保留段的组分并进行质谱检索。

常规的GC/MS检测一般是用峰面积归一化来定量，而且对重叠峰只能做近似处理，本研究中各组分的相对含量是利用分辨得到的各组分的纯色谱曲线和质谱，采用总体积积分法［6］作的定量分析。对8个植物挥发油样品进行了GC/MS定型鉴别后，选择了A1～A8共同的鉴出组分，其名称和相对含量见表2。表2 8种化湿药的共有组分及其相对含量（略）

tr代表有该种物质，但是含量很低，未能定量。 nd代表未能检测到该物质

4 讨论

由表2可以看出，这8种化湿药植物的共有挥发油组分包括脂肪族化合物、芳香族化合物、萜类衍生物等。萜类化合物是存在于植物界的一大类化合物，具有多种生物活性，并且是多种中药的主要活性成分。8种药材挥发油的共有组分中，含醇类化合物12个，醛类及酮类各1个，酚类3个，醚类4个，酯类7个，无氧单萜和倍半萜类化合物分别为10个和23个。

这8种化湿药的挥发性成分中均含有桉叶油醇(Eucalyptol，含量0.01%～82.41%)和环氧石竹烯（Caryophyllene oxide，0.02%～5.5%），且前者为草果、佩兰、草豆蔻挥发性物质的主要成分，含量分别为36.12%，82.41%，27.92%。藿香独有广藿香醇(Patchouli alcohol)，脱氢醋酸(Dehydroacetic Acid）和α-布藜烯(alpha.-bulnesene)，相对含量分别为37.64%，20.55%，13.78%。厚朴独有α-桉叶醇(alpha.-Eudesmol)和β-桉叶醇(beta.- Eudesmol)，相对含量分别为25.84%和34.25%。砂仁挥发性物质中主要成分为樟脑(Camphor)，龙脑(Borneol)，乙酸龙脑酯(Bornyl acetate，)，柠檬烯(D-Limonene)［1］，实验测得砂仁中这几种物质的相对含量分别为21.16%，2.95%，56.47%，8.93%。

检测到的藿香的主要活性成分有广藿香醇(Patchouli alcohol，含量为37.64%)， α-愈创木烯(alpha.- Guaiene，含量为6.37%)，这与文献［7］报道的一致；草豆蔻的主要活性成分有桉叶油醇(Eucalyptol，含量为27.97%)，这与文献［8］报道的一致，但是另一主要成分对聚伞花烯(p-Cymene，含量为13.04%)，未见报道；厚朴的主要化学成分之一β-桉叶醇(beta.-Eudesmol，含量为34.25%)与文献［9］报道的一致，但是另一主要成分α-桉叶醇(alpha.-Eudesmol，含量为25.84%)未见报道。

检测到苍术的主要成分为茅术醇（Hinesol）和苯乙烯基邻二氮苯（4-Styrylpyridazine），含量分别为24.45%和23.79%，成分之一茅脘腹胀闷术醇与文献［10］报道的湖北罗田和英山所产苍术的主要挥发油成分一致，但后者未见报道。检测到白豆蔻的主要挥发油成分除表中列出的香茅醇乙酸酯（Geranyl acetate，含量为5.37%）外，还有含量为9.75%的2-硝基，3，3，5，5-四甲基环己酮（2-nitro-3，3，5，5-tetramethylcyclohexanone）。

近些年来对各种单味中草药的化学成分GC/MS研究较为常见，但大多数只是用仪器自带的工作站根据质谱定性，这种方法对于复杂的色谱峰通常得不到准确的结果，对于噪声较大的小峰也得不到准确结果。利用GC/MS分析法结合化学计量学分辨方法（如HELP）鉴定挥发油化学成分，比单独使用GC/MS法结果更准确、可靠。同时也为进一步研究8味中药的药理药效提供了化学成分的基础。

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生物质谱技术与方法范文第5篇

关键词：电喷雾解吸质谱；离子化

中图分类号：Q63　文献标识码：A　文章编号：1006-431l(2012)02-0326-03

0　引言

从某种程度来讲，质谱技术的发展主要是基于离子源的发展和应用。相当长的一段时间内由于电离技术的制约，质谱方法只能对小分子的分子量进行准确、灵敏的测定。随着电离技术的发展，尤其是ESI和MALDI的出现，大大提高了质谱的测定范围。特别是他们显示在高极性、难挥发和热不稳定性生物大分子分析(如蛋白质和核酸址：的巨大潜力，使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域。

目前。质谱的主要发展方向是大气压质谱(ambiem massspectrometry)，此质谱离子化方法是将样品离子化过程从真空状态转到大气压状态下完成，包括，离子化、离子激活以及离子，分子反应。这一发展避免了传统的质谱分析技术要求真空条件所导致的操作繁杂，样品易发生污染、损失以及引入副反应等缺点。因此，此技术将使质谱技术应用更加广阔。

因此自2003年起，诸多新的质谱技术、分析技术被开发出来，包括即时分析质谱法(Direct Analysis in Real Time，DART)、电喷雾解吸法(Desorption EIectrospray Ionization，DESI)以及电喷雾辅助激光解吸法(Electrospray Assisted Laser Desorpfion Ionization，ELDI)等。这些解吸法都具备在大气压下直接分析的能力，可减少样品前处理步骤，达到增加分析速度的且的。

电喷雾解吸电离是于2004年由Cooks研发出来的新的解吸技术，是一种在大气压条件下MS取样分析的方法。电喷雾解吸离子化是电喷雾离子化(electrospray ionization，ESI)和解吸离子化(desorptlon／ionization，DI)两大离子化技术的结合。因此。DESI既可以分析气体、液体样品，也可以分析固体样品：既可以分析小分子化合物，也可以分析蛋白质及其他生物样品。

除此以外，DESI同传统的解吸质谱一样，可对样品进行原位分析。但传统的解吸质谱(如，次级离子质谱和基质辅助激光解吸附质谱)分析生物样品都需要在真空条件下进行。只有大气压一基质辅助激光解吸附质谱和AP-激光解吸附质谱是例外，但这些方法不能够进行原位分析，样品必须要根据离子源的位置固定，并且试验过程中不能触动。而DESI能够在自然环境下进行原位分析，因而特别适于与TLC联用。

并且，DESI可以直接、快速分析待测物，而不必经过复杂的样品预处理过程，即使是分析生物样本(如，组织样本)。而在真空状态下，样品预处理过程是必需的。目前，此离子化方式已用于多种化合物的痕量样品分析，如，多肽，蛋白质，核苷酸，内源性物质，药物代谢物，硝基芳香族化合物等。

本文主要是针对电喷雾解吸电离的离子化机制，分析特点以及DESI在各个领域的应用等方面进行综述。

1　DESI的工作原理

电喷雾解吸质谱法与二次离子质谱法(Secondary ion ma88spectrometry，SIMS)很类似，是利用电喷雾产生的带电液滴及离子直接轰击分析物的表面，吸附在表面的待测物受到带电离子的撞击以离子的形式从表面解吸出来，然后通过质谱仪的常压进样口进入质量分析器，所得到的质谱图与ESI极为相似，得到的是单电荷或多电荷的分子离子。

DESI离子化源虽然也利用EsI(Ehctrospray Ionization)。但是这里不是直接利用ESI自身产生的离子进行质谱分析，而是利用某些溶剂(如水和乙醇的混合溶液，有时还可加入酸性或碱性添加剂)形成的ESI射流对样品进行离子化。

DESI的详细流程如下，首先于毛细管上施加一高电压。使其产生电喷雾并形成气相分子离子、离子簇(ionic cluster)、带电液滴等。并提高辅助电喷雾的雾化气体流速，在大气压力下藉由高速的气体加速电喷雾产生的液滴或离子对分析物表面轰击。使分析物解吸附游离出来。喷射物对分析表面的离子解吸附基于静电力和气体压力。解吸附的气相离子通过一个柔韧的金属或绝缘体材料的质谱仪常压离子转移通道传送到远端的质谱分析仪。图1即为DESI离子化示意图。

目前，电喷雾解吸法的解吸机制仍在推测阶段，并未有确切的研究结果可以证实。以下是由Cooks R.G.提出四种可能的解吸机制：

1.1化学溅射机制(Chemical spattering)由电喷雾产生的气相离子由高速气体带动下撞击待分析物表面，气相离子将电子、质子或是其他离子转移至待分析物表面，使得待分析物表面分子带电荷。

DESI是在大气压力下操作，使得气相离子受到空气阻力而使其动能降低，因此并不能同ESI一样，仅通过一次碰撞就可以将分析物由表面轰击出来。而是，在表面积累电荷，当累积到足够的动能，或是当其电荷密度累积到有足够的电荷排斥力时，才能撞击使样品的分子离子由分析物表面解吸出来。

这种解吸过程类似化学离子化，易于发生在分析物分子量较小的情况下。

1.2气相离子化机制(Gas phase ionization)具有挥发性的分析物从表面挥发至空气中形成气相分子，再与空气中由电喷雾产生的气相离子发生质子，电子转移或是离子，分子反应而使分子物形成带电荷离子。

此解吸机制易于发生在具挥发性的有机小分子上。

1.3液滴携带机制(Droplet pick-up)电喷雾产生的带电液滴轰击分析物表面，使分析物表面物质溶于带电液滴之中。液滴因带电液滴的持续高速撞击，产生大量含分析物的带电小液滴。此后，带电小液滴从表面解吸形成气相分子离子的过程，与ESI解吸机制的电荷残留模型(Charge Residue model)及场解吸模型(Fidddesorption model)相似。

此解吸机制适用于带电多电荷的生物大分子。

1.4冲击模型(Shookwave modal)冲击模型的提出是为了解释离子簇碰撞理论(massive cluster impact，MCI)而提出的，以解释大分子化合物形成多电荷离子的现象。此离子亿效应不可能是由于核或电子碰撞产生，冲击模型认为是由于压缩波碰撞产生的。离子簇与样品表面碰撞后迅速崩解产生的压缩波，其碰撞速度超过声速，使大分子化合物形成多电荷离子。

冲击模型使用于蛋白质，多肽类等大分子化合物多电荷离子的

产生。

目前，虽然解吸机制仍没有定论，但是大量实验表明，化学溅射机制和液滴携带机制可能是DESI离子化解吸机制的主导。由于实验中所检测到的离子速度均小于声速，因此冲击波模型还没有被证明。

2　DES J仪器最新进展

2.1 DESI-IMS联用技术离子迁移谱(ion-mobilityspectrometry，IMS)是一种气相环境下电泳技术，它是根据分析物分子质量、电荷和碰撞截面(即大小和形状)来分离和辨别分析物。

目前将IMS技术与ESI和MALDI等离子化技术偶联，并与MS技术联用，已经在蛋白质和多肽分析研究方面取得相当大成功，成为蛋白质组学研究最强有力工具。

利用IMS技术对异构体多肽混合物的气相构象研究结果表明，IMS具有分辨结构上仅存在微小差别的异构体的能力，这是质谱技术所不具备的。因此，ESI-IMS联用技术在大分子结构及构象分析方面显示非常突出的优势。

翻译后修饰(如磷酸化、糖基化等)是蛋白质调控其活性和功能的重要方式，也是蛋白质组学研究的重要内容，因此分离筛选翻译后修饰的多肽和蛋白质具有重要意义。Ruotolo等利用IMS-MS技术实现了磷酸化多肽快速高通量分离筛选分析。

与ESI相比，DESI是在大气压下操作的，离子源相对简单，都使得DESI更易与离子迁移谱相匹配。CooksR.G.将DESI与IMS-TOF偶联，对细胞色素C和胞壁质酶蛋白进行检测，所得到的质谱图，DESI与ESI结果非常相似，并且，从某种程度上讲，DESI离子化过程更温和，更易于得到蛋白质结构的准确信息。可见，将DESI与IMS偶联具有更大的优势。

DESI-IMS联用技术的发展使得IMS既可以用于小分子分析，还能分析高分子量的生物大分子，再加上IMS本身灵敏度高、分析速度快等优点，它必将会成为在生物领域有潜力的分析方法。

2.2声波喷雾解吸离子化(Desorption sonic spray ionization,DeSSI)声波喷雾解吸离子化(Desorpfion sonic spray ionization，DeSSI)是由DESI衍生出来新的离子化方式，是DESl与声波喷雾离子化(sonic spray ionization，SSI)两种离子化方式的结合。DeSSI设备更加简单，是更软的离子化技术。

与DESI不同之处仅在于，DeSSI利用声波进行喷雾。DeSSI的这个改进，使其与DESI相比具有两大优点：①DESI是利用溶剂进行喷雾，因此要在喷雾毛细管上施加高电压(一般为4KV)，DeSSI不必施加高电压，这而使其与大气压环境能够更好的匹配。②DESI是利用溶剂进行喷雾，喷雾溶剂所产生离子簇必将形成背景噪音。干扰样品的测定。因此，与DESI相比，DeSSI使所得到的质谱图会更加清晰。这些特点都使得DeSSI对于分析小分子量化合物或杂质有很大的优势。

超声波具有很高穿透性，采用超声波喷雾的DeSSI，能够更好的测定样品深层物质，确保分析样品的一致性。尤其对于组织在体分析定量分析非常有利。而且采用超声波喷雾所得到的离子信号也更持久，更有利于检测。

2.3 DESI-imaging影像质谱法(Imaging mass spectrometry)有较长的历史，但在分子领域，尤其是生物分子领域来讲，影像学还属于新生学科，有着广阔的发展前景。

基于MALDI和SIMS的影像质谱法已经成为分析生物组织的组织学切片的有利手段。尽管如此，这些技术存在缺陷：离子化技术要求高真空条件下，并且样品前处理过程中进行的物理，化学处理都有严格的限制。

DESI的特点，使其具有影像质谱法的潜力，可用于样品表面各组分的分布分析(目前其物理分辨率已可达50p,m量级)。Cooks R.G.已采用DESI对在体或离体组织切片直接分析，以确定组织中分析物的分布。Demian等在负离子模式的质谱测定过程中。由去质子化的脂质分子的丰富的二维空间分布，可以得到大鼠大脑组织中冠状缝切面上的脂质的分布。后面的分布情况还显示了大鼠大脑不同的解剖特征。

DESI影像技术是MALDI影像技术的重要补充：MALDI适用于分析蛋白质和多肽，而DESI更适合于类脂。但是DESI-imaging的分辨率较低，尤其是分析细胞内的化合物。为了提高分辨率常采用以下方法：采用nano-Spray，以得到50μtm或更小的样品斑：减小喷雾毛细管内径，由50μm缩小至10μm；增大质谱仪常压进样口的尺寸，以集中反射液滴，离子，以提高信号强度。

2.4微型化DESI另一个重要的发展方向就是微型DESI的研制工作。如何设计出更小的DESI装置而并保持其性能不明显降低，是微型DESI研究领域的主要目标。

由于DESI的整个操作过程是在大气压力下进行的，无需真空系统，仪器装置结构简单，因此它易于微型化。微型化一直是DESI技术发展的一个主要方面。微型DESI所具有的易携带、体积小、能耗低等优点使之特别适合现场分析(如，机场安检以及刑事侦察等)。质谱仪的微小化、商品化，可使用户自己对于环境、健康状况进行检测，为其进入“私人质谱仪”时代奠定基础。

3　展望

几年来，DESI技术的理论和检测技术都已经有了很大的发展，在各个领域的应用也越来越广泛，并开始向性能的改进及小型化方向发展。

虽然，DESI在某些领域的应用已经日趋成熟，但DESI仪器也存在一定的问题，如，对于组织分析，由于体内环境干扰较大，DESI的分辨率较低，尤其是分析细胞内的化合物，因此进行定量分析比较困难。