免疫组织化学技术
前言：想要写出一篇令人眼前一亮的文章吗？我们特意为您整理了5篇免疫组织化学技术范文，相信会为您的写作带来帮助，发现更多的写作思路和灵感。
免疫组织化学技术范文第1篇
关键词免疫组织化学女性生殖道肿瘤应用价值
阴道、外阴、宫体和宫颈等是主要的女性生殖道组成部分一般情况下这些部位所引发的肿瘤其确诊是较为容易的但是由于某些肿瘤在形态学上具有相似的特征而且还有些肿瘤病变的良性和恶性难以判断而运用免疫标记对其进行诊断可以有效的降低误诊的几率免疫组化是一种应用免疫学的基本原理即抗原抗体反应其利用抗原与抗体相结合的特异性利用化学反应使得同位素、荧光素、金属离子和酶等用来对抗体进行标记的显色剂显色从而实现对蛋白质和多肽等组织细胞的内抗原的定量、定性和定位。
资料与方法
11年7～8月对某社区1名已婚女性进行免疫组织化学检查的资料年龄～69岁按年龄将其分为个年龄段记录为A、B、、D四个组别其中66岁17人（9）分为D组。
方法：由妇科医生对后穹隆或宫颈进行刮片用95乙醇固定送病理科HE常规染色操作运用巴氏V级分类法对其进行镜检诊断若查见癌细胞和查见可疑癌细胞的按阳性病例处理阳性病例在内膜和宫颈处取材送免疫组织化学诊断。
结果
本次进行免疫组织化学检查的1名已婚女性中其检出阳性的概率8有1例切片查见为疑似癌细胞经活检证实均为良性病变其中1例判定为宫颈鳞癌9例判定为宫颈上皮非典型增生；例查见为癌细胞：其中有1例慢性宫颈炎和子宫内膜状腺癌；1例子宫内膜增生过长和宫颈鳞癌；1例更年期子宫内膜和宫颈中度非典型增生见表1。
讨论
由于免疫组织化学技术的不断发展以及各种类型的特异性抗体逐渐显现使得多数疑难肿瘤得以确诊单纯依靠HE染色对肿瘤进行病理诊断其中有5～1的病例难以依此做出肯定的形态学诊断但免疫组化在对未分化或低分化肿瘤进行鉴别和诊断时其准确率高达5～75因而免疫组织化学在女性生殖道肿瘤诊断中的应用价值受到越来越多的肯定。
外阴是Paget病常见病发部位。85的外阴Paget病属性为原发性但也有一部分是由其他部位的恶性病变而导致在临床治疗中对外阴Paget病原发或继发的属性判定是十分重要的多数研究表明若外阴Paget病属性为原发性。其细胞表达为AM5、EA和7若表达为PR、HER-、GD-P-15、ER和AR则为阴性。外阴上皮内肿瘤可分为分化型和未分化型近9的外阴上皮内肿瘤为未分化型其病变与HPV感染相关而分化型与HPV感染没有关系后者与浸润性鳞状细胞癌密切相关而前者有可能是多灶性生殖道肿瘤。免疫组化p16和p5可对二者进行区分未分化型p5阴性弥漫性表达p16而分化型与之相反。
女性生殖道宫颈和大部分其他部位的肾管腺体的标记物多为D1D1在宫颈中肾管的残留大部分表达为腔缘阳性而其他类型的良性宫颈腺体病变极少呈类似表达。但是子宫内膜腺癌和宫颈虽然表达阳性的部位非腔缘但是依旧可呈D1表达可看出官颈腺癌D1表达呈阳性的特征并不能当作为中肾管诊断的依据。inhibin、valentine、AR和calretinin等也可以作为在恶性和良性中肾管病变以及中肾管腺体中的呈不同程度表达的标记物而mace、PR和ER一般呈阴性表达。在对良性宫颈腺样病变进行中肾管来源确诊时最具价值的标记物为ER、valentine和Dl的组合在中肾管腺体中valentine和Dl呈阳性表达而ER呈阴性表达。
女性生殖道肿瘤的类型多种多样且形态学重叠多且复杂免疫组织化学在对这些肿瘤进行鉴别诊断和诊断方面具有重要的意义但是由于免疫组织化学在外科病理诊断中只是一种辅助手段常规HE诊断在短期内依旧是无可替代的因而为了得到更准确的诊断结果在对肿瘤进行免疫标记和对免疫组化结果进行评价时一定要与组织形态学相结合。而且目前免疫组化的抗体还未找到具有绝对性的特性因此免疫标记的选用要同时包含有阴性和阳性以帮助对肿瘤进行确诊。
伴随着抗体工程技术和免疫组化技术的不断提高应用于对女性生殖道肿瘤进行鉴别诊断和诊断的免疫标记物越来越多相关医护人员只有不断的加强自身的学习才能对免疫组化抗体彻底的掌握和应用才能对疾病的病理诊断做出科学合理正确的诊断。
参考文献
1孙大治，徐云庆，史蕾，等.新型免疫标记技术研究进展及在免疫检测中的应用[J].中国国境卫生检疫杂志，1，（）：76-78.
免疫组织化学技术范文第2篇
【论文摘要】近年来分子生物学技术以及其它高、新技术在病理领域得到广泛的应用，同样作为体育界的基础研究学科运动人体科学的发展已经不能满足简单的宏观的研究，越来越多的医学检验以及病理学实验技术在运动人体科学广泛应用，尤其是组织病理学技术中定位技术，例如免疫组化、原位杂交等。本文就以上三种病理学常用的定位技术的方法进行综述。
1免疫组织化学实验技术
随着免疫组织化学染色技术的广泛应用，病理学研究产生了划时代的飞跃。免疫组织化学是病理学实验中常用的方法，是在蛋白质水平用各种特异性抗体检测细胞内各种抗原物质。根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术、免疫酶细胞化学技术、免疫铁蛋白技术、免疫金-银细胞化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
1.1免疫组织化学实验步骤免疫组化技术是在组织化学的方法上结合免疫学的理论和技术发展起来的一门新技术。其原理是利用免疫学的核心——抗原体特异性结合的原理，用标记抗体追踪抗原，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等显示一定的颜色，并借助显微镜、荧光显微镜、电镜对其颜色进行观察，以达到检测抗原物的目的[1]。
1.2免疫组化技术的优点免疫组化技术的优点：①特异性强，免疫组化中抗体与组织细胞中的抗原的结合是特异的。如白细胞共同抗原（LCA）显示淋巴细胞成分。②敏感性高，而今，由于抗生物素—生物素（ABC）法和链酶素—过氧化物酶连接（SP）法的出现，使抗体的稀释度(代表敏感度)达到了上千、上万，甚至上亿倍，使免疫组化技术更加可靠。③定位准确，由于抗原抗体的结合是特异的，因而免疫组化技术可在组织和细胞内准确定位，对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，将形态与功能相结合，对疾病进行深入的研究。
2原位杂交实验技术
原位杂交是将组织化学与分子生物学技术结合来检测合定位核酸的技术。它是用一段已知序列的核苷酸片断来检测细胞内是否存在欲检测物质的DNA或RNA，是比免疫组化更加灵敏而深入一个层次的检验方法。根据所选探针和待测靶序列的不同，核酸原位杂交有DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交、RNA-RNA杂交等。
2.1原位杂交技术的应用原位杂交由于不需要从待测组织中提取核酸，可完好的保存组织、细胞的形态结构，将形态学与基因功能活动的变化相结合进行多层面的研究。主要应用：①细胞特异性mRNA转录的定位可用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究；②感染组织病毒DNA/RNA的检测和定位；③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的监测；④基因在染色体上的定位；⑤检测染色体的变化；⑥间期细胞遗传学的研究。
2.2原位杂交技术与免疫组化的比较
2.2.1两者的区别原位杂交与免疫组化染色技术相比较，这两种方法的共同之处均具有定位检测的功能，且均有较高的敏感性和特异性，所不同的是免疫组化染色是用的是抗体，其检测对象是抗原，机制是抗原-抗体的特异性结合，是蛋白质表达水平的检测；原位杂交使用的是探针，遵循碱基互补配对的原则与待测靶序列结合，是DNA或mRNA水平的检测。从实验方法来看，免疫组化染色操作相对简单，成本相对较低，受外界因素的影响相对小；原位杂交技术无论从实验设计上，还是从实际操作上均较免疫组化染色复杂，成本的高低与试剂的种类和来源密切相关。一般而言，直接选用商品化的标记探测和检测试剂盒的实验成本较高；荧光标记探针较非荧光标记探针的成本高，对样本及实验条件的要求较高，也更容易受到外界因素的影响。
2.2.2免疫组化与原位杂交双标技术双标技术是在同一张组织切片上标记两种不同的抗体或同时应用两种不同的检测手段，如免疫组化和原位杂交技术，在不同层次来检测同一细胞上某些物质的表达是否有相关性的一种实验方法。与传统的单项检测相比，双标记具有无可比拟的优越性，可以克服由于切片间各种差异而引起的时间或空间的样本误差。实验方法上先进行原位杂交会减少免疫组化过程中对待测DNA或RNA的破坏或影响，一般目前均推荐先进行原位杂交后进行免疫组化标记[2，3]。具体的操作跟单纯的免疫组化和原位杂交各自的方法一致。需要注意的问题就是：①所用的实验设备必须经DEPC水浸泡或200℃烤箱过夜，操作时须带口罩及手套；②当杂交步骤完成后，切片必须认真浸泡及长时间洗涤至少超过30min。③作免疫组化的各步骤时间均须适当延长，以增加抗原抗体间的结合，杨青春等人研究发现每个步骤均延长2～3倍时间。④免疫组化显色后不需要用苏木精复染，以免遮盖核信号。
参考文献
[1]纪小龙，施作霖.诊断免疫组织化学[M].北京：军事医学科学出版社，1997.5.
免疫组织化学技术范文第3篇
[关键词]鼻咽癌；中期因子；免疫组织化学
[中图分类号]R739.6 [文献标识码]A [文章编号]1672-4208(2010)13-0011-04
中期因子(Midkine，MK)是一种新的肝素性结合生长分化因子，MK最初被描述为在胎儿与新生儿发育过程中的调节因子，后来逐渐发现MK具有与肿瘤发生有关的生物学活性，包括促细胞转化、促有丝分裂、抗细胞凋亡、生血管作用、增强纤维蛋白溶解和趋化作用等。近年研究发现MK在从原位癌到进展期恶性肿瘤组织中均高表达，而周围的正常组织表达量极少，显示了其与肿瘤的发生和生长有密切关系。目前，MK在诸多肿瘤中的表达已有报道，但在鼻咽癌中的表达国内外尚未见报道。本研究旨在通过免疫组织化学方法检测鼻咽癌组织中MK的表达情况，并进一步探讨其相关临床意义。
1 资料与方法
1.1 临床资料 随机抽取泰安市中心医院2006年4月～2009年6月，临床及病理学确诊的鼻咽癌病理标本44例，男性34例，女性10例，年龄22～60岁，平均年龄41岁，全部为低分化鳞癌，术前均无放射治疗、化学治疗及其他抗癌治疗史，并参考2003版美国肿瘤联合会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)关于鼻咽癌TNM分期方法进行临床分期，TNN分期：T1：4例，T2：14例，r13：22例，T4：4例；N0：6例，N1：7例，N2：17例，N3：14例；M0：41例，M1：3例；临床分期：I期2例，Ⅱ期11例，Ⅲ期17例，Ⅳ期14例。另选14例慢性鼻咽炎黏膜组织作对照研究。
1.2 主要试剂 兔抗人MK多克隆抗体购自武汉博士德公司，SP－9000通用型试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 方法 将鼻咽癌病理组织常规石蜡包埋的蜡块作连续切片，分别作HE染色、MK免疫组织化学S－P法染色。各组织切片常规脱蜡及水化后，依次按说明书完成免疫组织化学染色各步骤，由同一技术人员使用同一批号试剂完成免疫组织化学染色。SP法免疫组织染色流程均设对照作为质量控制，用购买的MK肝癌阳性片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4 结果判断 显微镜下观察，以细胞膜和(或)细胞质中出现清晰棕黄色颗粒作为阳性判断标准，结果以阳性细胞数所占百分比表示，即光镜(400×)下随机选取10个视野，每个视野计数100个细胞，阳性细胞数25％为强阳性(++)，阳性率(％)=(弱阳性例数+强阳性例数)÷总例数×100％。
1.5 统计学方法 利用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，NK与鼻咽癌临床病理因素之间的分析采用行X列表的X2检验。
2 结果
2.1 免疫组织化学染色结果 MK在鼻咽癌中呈高表达，在44例鼻咽癌组织中，15例为阴性，29例为阳性，阳性表达率为65.91％，其中14例为弱阳性，15例为强阳性。在14例鼻咽炎黏膜组织中，仅有1例呈弱阳性表达，阳性表达率为7.14％，二者差异有统计学意义(P
2.2 MK表达与鼻咽癌患者临床病理的关系MK的表达与鼻咽癌的癌组织浸润深度有相关性，(T1+T2)与(113+T4)组间MK阳性率差异有统计学意义(P
3 讨论
鼻咽癌是我国高发的恶性肿瘤之一，具有分化程度低、早期转移率高的特点，大部分患者就诊早期就有颈部淋巴结转移，而导致预后不良，其发病机制可能与环境、病毒、遗传等诸方面因素有关，而其生长与转移，则与血管生成等因素密切相关。如能寻找一些能判断其发生、发展及预后的标记物，对于诊断、治疗鼻咽癌必定有积极意义。
MK是一种分泌性蛋白，可以由肿瘤细胞分泌到血清中，可以方便地通过酶联免疫的方法进行检测。Ikematsu等通过ELISA方法检测到70％恶性肿瘤患者的尿液中MK水平明显升高，认为尿中MK水平可能成为大范围肿瘤普查的指标。笔者采用免疫组织化学染色方法，对44例鼻咽癌组织标本进行研究，其结果表明，MK在鼻咽癌中呈高表达，阳性表达率为65.91％，在14例鼻咽炎黏膜组织中，仅1例呈弱阳性表达，阳性率为7.14％，二者差别有统计学意义，这表明MK在鼻咽癌的发生发展中起到一定作用，提示MK可能成为鼻咽癌诊断的标记物之一。
免疫组织化学技术范文第4篇
【摘要】 目的： 应用组织芯片( tissue chip )-组织微阵列( tissue microarray，TMA)技术结合免疫组织化学的方法检测肺鳞癌组织中高迁移率蛋白A1（high mobility group A1，HMGA1)的表达情况，以明确HMGA1蛋白表达与肺鳞癌发生的关系及临床意义。方法: 用组织阵列仪制备组织芯片， 切片后采用免疫组织化学的方法检测组织芯片上25例肺鳞癌肿瘤组织和18例对照组肺组织样本中的HMGA1的表达情况，并分析其表达与各临床病理学参数之间的相关性。结果: HMGA1蛋白在肺鳞癌组和对照组的阳性表达率分别为68.0 % (17/25)、16.7%(3/18) ，两者比较差异具有显著性(P0.05) ，而与淋巴结转移及组织学分级有关(P
【关键词】 肺肿瘤; 免疫组织化学； 组织芯片; 高迁移率蛋白A1
［Abstract］ Objective: To determine the relationship of high mobility group A1 protein (HMGA1) expression with the development of lung squamous cancer， and its clinical significance. Methods: Tissue chip/tissue microarray (TMA) technique combined with immunohistochemistry method was adopted to detect HMGA1 expression in tissue of lung squamous cancer，and the correlation between HMGA1 protein expression and lung squamous cancer. A series of tissue chips were prepared by using tissue-arrayer. Specimens from 25 cases of lung squamous cancer and 18 cases of control lung tissues were detected immunohistochemically on a tissue chip for HMGA1 protein expression and its correlation to clinic pathological paramter was analyzed statistically. Results: Positive rates of HMGA1 protein was 68.0 % ( 17 /25) and 16.7%(3/18) in lung cance and in lung tissue of control group， respectively， and the difference was significant (P
［Key words］ lung neoplasms; immunohistochemistry; tissue chip; high mobility group A1
肺癌的生长、浸润和转移是多种因素综合作用的结果， 包含多种原癌基因的激活、抑癌基因的失活和多种细胞因子的结构和功能的异常表达。HMGA1是一种广泛存在于真核生物细胞中非常重要的结构转录因子，它在人体的胚胎发育、肿瘤形成过程中发挥着至关重要作用，近几年研究发现，HMGA1表达与人类肿瘤的发生有关，HMGA1基因被视为癌基因［1］。2007年采用TMA技术结合免疫组织化学的方法检测了25例肺鳞癌肿瘤组织及18例对照组肺组织中HMGA1蛋白的表达，以期验证其在肺鳞癌组织中的表达及与肺鳞癌发生、发展的关系，探讨肺鳞癌发生的分子生物学机制，为肺鳞癌诊治及预后判断标志物奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
实验组来自2002-2004年贵阳医学院附属医院手术切除的肺鳞癌标本25例，男17例，女8例。年龄46～75岁。所有病例术前均未行放、化疗。按照世界卫生组织(WHO)肺及胸膜肿瘤组织学分类，25例均为鳞癌。组织学分级(只限于鳞癌)：Ⅰ级5例，Ⅱ级9例， Ⅲ级11例。有淋巴结转移者18例，无淋巴结转移者7例。对照组18例，包括11例手术切除炎性假瘤病例的肺组织和3例尸检的肺组织，以及4例肺大疱的肺组织。所有标本均经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋。
1. 2 实验方法
1. 2.1 标本处理 取手术切除的肿瘤组织和排除肺肿瘤以外的肺组织标本各1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm，所有标本均以10%中性甲醛固定， 常规石蜡包埋。
1.2.2 组织微阵列的制作 对每一个标本蜡块进行常规病理切片并行HE 染色，由病理科专家在显微镜下标记所需穿取的目的组织。利用美国Beecher组织微阵列仪(Beecher Instruments Inc)依次从受体蜡块上穿取直径为1.0 mm的组织芯头，然后在供体蜡块上根据所标记的位置准确取出所要的组织芯放入受体蜡块的孔中，制作组织微阵列标本蜡块。详细记录每个孔所放组织的编号，每个肺鳞癌和正常组织蜡块分别选取3个点，制成阵列蜡块，然后用切片机将此蜡块作3 μm厚的切片，粘贴于1张由多聚赖氨酸处理过的载玻片上，制成组织芯片，60 ℃ 烤5 h，置于-20 ℃ 冰箱中保存备用。
1.2.3 检测方法 利用免疫组织化学SABC法观察HMGA1表达。HMGA1多克隆抗体购于美国Abcam公司，工作浓度为1∶50，SABC 试剂盒及DAB显色液均为武汉博士德公司产品，按说明书步骤进行。切片常规化蜡下行至水，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min，微波修复，5%BSA封闭液封闭，滴加一抗置于4 ℃冰箱湿盒过夜。次日取出切片，依次加入生物素标记的二抗和过氧化物酶标记的链酶亲和素-生物素-酶复合物（Strept-Avidin-Biotin Complex，SABC），置于37 ℃水浴箱各孵育20 min，DAB显色，苏木素复染，上行，封片观察。
1.3 评定标准
显微镜下对每一个微阵列点进行观察并评分。每个组织取3个点，计数每个点总细胞数和阳性细胞的平均数，阳性细胞率5%为阳性。HMGA1表达阳性表现为在细胞浆和(或)细胞核内着棕黄色。
1.4 统计方法
采用SPSS11.5统计软件行χ2检验，临床病理参数间的比较用Fisher确切概率法检验，P
2 结果
2.1 组织芯片构建图
由图1和图2可见，以免疫组织化学SABC法染色后基本无掉片、移位和扭曲现象，有个别点脱落，但不影响结果的观察。
2.2 HMGA1蛋白在肺鳞癌和对照组肺组织中的表达结果
HMGA1蛋白表达呈棕黄色颗粒，见图3，箭头所指处来源于图2实验组织芯片的一部分，主要于肺鳞癌细胞胞质，极少数在胞核表达。表1可见， HMGA1蛋白在肺鳞癌和对照组肺组织中的阳性表达率分别为68.00% ( 17 /25)、16.67(3/18)，两组之间差异具有显著性(P
2.3 HMGA1蛋白表达与肺鳞癌临床病理参数之间的关系
由表2可见，HMGA1蛋白表达与肺鳞癌的淋巴结转移、分化程度有关（P
3 讨论
HMGA1是Goodwin 等［2］于1973 年在牛胸腺细胞中首次发现的，因其在聚丙烯酰胺凝胶中的高迁移率而得名的一组蛋白。HMGA1有1a和1b 2种蛋白质亚型，二者均属于小分子染色体非组蛋白，都是由HMGA1 mRNA分子转录后经不同剪接而来。不同的是，在1a亚型内部存在11个氨基酸残基。HMGA1广泛参与细胞多种重要的核内生物学功能。在正常情况中，HMGA1在胚胎组织中高表达，在成熟组织和细胞中则不表达或表达量极低。有研究表明，HMGA1在许多人类肿瘤都高度表达［3］。在肝细胞癌及甲状腺、前列腺、子宫颈、结肠直肠、胰腺和卵巢等肿瘤中，HMGA1的含量都显著增加［4］。我们前期应用基因芯片技术对肺鳞癌基因表达的研究也显示HMGA1基因表达显著增加。为了验证基因芯片的研究结果，采用具有高通量、节约试剂、降低实验误差的组织芯片技术，对对照组肺组织及肺鳞癌组织中HMGA1蛋白表达进行免疫组织化学研究，以探讨HMGA1在肺鳞癌发生、发展中可能的生物学意义。结果发现，肺鳞癌组织中HMGA1蛋白的表达阳性率显著高于正常对照组，且与肺鳞癌病人淋巴结转移及分化程度有关，与病人性别及年龄无关。提示HMGA1蛋白可能是肺鳞癌分化及恶性程度的一个进展性指标。
有人用定量RT-PCR的研究方法表明，与对照组的肺组织相比，肺癌组织内的HMGA1a mRNA增加超过75% [5］ 。本实验研究显示HMGA1在正常肺组织中呈低表达， 阳性率仅为16.7 %，而在肺鳞癌组织中表达明显增高， 阳性率高达68.0%，提示检测HMGA1的表达有助于肺鳞癌诊断。另外，研究结果显示，HMGA1蛋白的表达与淋巴结是否转移和分化程度密切相关(P
参考文献
[1] Edberg DD， Bruce JE， Siems WF， et al. In vivo posttranslational modifications of the high mobi-lity group A1a proteins in breast cancer cells of differing metastatic potential[J]. Biochemistry， 2004(36): 11500-11515.
[2] Goodwin GH， Sanders C， Johns EW. A new group of chromatin-associated proteins with a high content of acidic and basic amino acids[J]. Eur J Biochem，1973(1): 14-19.
[3] Edberg DD. In vivo posttranslational modifications of the high mobility group A1a proteins in breast cancer cells of differing metastatic potential[J].Biochemistry，2004(36): 11500-11515.
免疫组织化学技术范文第5篇
【关键词】 骨性关节炎；软骨细胞；Caspase-3；Caspase- 12
骨性关节炎（OA）是一种累及膝关节的慢性、退行性疾病， 在我国OA患病率高达9.56%。骨性关节炎与软骨细胞凋亡密切相关[1]， 并且Caspase-3在其中扮演着重要的角色。内质网应激（ERS）是不同于经典细胞凋亡的通路。ERS能影响软骨细胞的分化， 抑制软骨细胞的合成功能， 但过度的ERS使细胞表达内质网应激蛋白Caspase-12， 介导软骨细胞凋亡。内质网应激触发了一个包括Caspase-12， Caspase-3的特异级联反应。其中Caspase-12为内质网应激的特异性蛋白， 而Caspase-3为所有凋亡通路的最终执行因子。
1 材料与方法
1. 1 材料 健康5月龄Wistar大鼠购自内蒙古大学动物实验中心， 兔抗Caspase-3抗体、兔抗β-tubulin抗体购自碧云天生物技术研究所， 兔抗Caspase-12抗体购自上海生工生物工程有限公司， HRP标记的山羊抗兔IgG购自北京博奥森生物技术有限公司， DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 OA动物模型制作和取材：健康级大鼠采用Hulth改良法手术横断前交叉韧带行OA造模， 左侧为空白对照侧。另选取10只纵行剖开胫骨及股骨， 立即投入100 ml/L中尔马林液， 固定， 脱钙， 浸蜡， 包埋， 制备蜡块， 供HE染色及免疫组织化学染色使用。
1. 2. 2 HE染色观察关节病变：按常规进行HE染色， 光镜下观察软骨层结构， 细胞的排列及基质染色。
1. 2. 3 免疫组织化学染色观察Caspase-3， Caspase-12的表达 采用免疫组织化学SABC法。软骨细胞中胞质染色成棕黄色颗粒的细胞即为阳性， 并进行平均吸光度（A）值分析， 吸光度值与阳性表达程度成反比。
1. 2. 4 Western blot法检测Caspase-3， Caspase-12的表达 参照文献[6]选取每例样品， 进行分离， 湿式电转法转膜， 封闭等操作， 用Caspase-3、Caspase-12的A值与β-Tubulin的A值相比表示其表达的相对水平。
1. 3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件对实验数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料采用χ2检验。P
2 结果
2. 1 关节软骨大体形态观察及评分 软骨标本大体结构观察显示。空白对照侧膝软骨光滑呈半透明乳白色， 模型侧软骨表面粗糙、糜烂、溃疡。
2. 2 软骨组织的组织病理学观察 光镜下观察显示：空白对照侧表层细胞较小， 其长轴平行于软骨表面呈密集排列， 中间层细胞可见“背靠背”双细胞分布， 深层软骨细胞肥大呈团分布；模型侧软骨层变薄， 表层软骨细胞稀疏甚至纤维化变性， 中间层软骨细胞减少， 深层软骨细胞肥大， 变成空泡状。
2. 3 免疫组化检测Caspase-3、Caspase-12的表达
2. 3. 1 Caspase-3在膝OA软骨组织中的表达 空白对照侧软骨细胞Caspase-3阳性表达较少， 位于表层， 少见于中间层， 表达的A值（168.30±5.90）；模型侧软骨细胞全层均有Caspase-3较强的阳性表达， A值（99.05±7.65）， 与空白对照侧比较， 差异有统计学意义（P
2. 3. 2 Caspase-12在膝OA软骨组织的表达 空白对照侧软骨表层偶见Caspase-12阳性表达， 表达的A值（173.75±6.56）；模型侧软骨细胞表层剥脱， 中间层Caspase-12阳性表达增强， A值（115.50±6.31）；与空白对照侧比较， 差异有统计学意义（P
2. 4 Western blot法检测Caspase-3、Caspase-12蛋白的表达 空白对照侧、模型侧软骨细胞中Caspase-3、Caspase-12蛋白的表达， 模型侧表达明显高于空白对照侧， 差异有统计学意义（P
3 讨论
本研究采用免疫组化及Western blot法检测各组软骨细胞中Caspase-3、Caspase-12的阳性表达及变化规律， 结果显示在大鼠OA模型侧关节软骨组织中， Caspase-3、Caspase-12的阳性表达及蛋白表达均高于空白对照侧， 提示在OA的软骨组织中Caspase-3、Caspase-12均被激活， 并参与调控软骨细胞凋亡。空白对照侧中Caspase-12表达极低， 可能在没有异常理化因素刺激的情况下， 内质网通路可能存在于正常的细胞衰老及凋亡中。Cheung等研究发现， Caspase-12缺陷小鼠对ERS诱导的细胞凋亡敏感性下降， 但对其他死亡刺激仍然敏感。证明Caspase-12是ERS激活的， 而非死亡受体或线粒体所介导的凋亡传导信号激活的。这种凋亡信号传导途径最终会导致Caspase-3活化， 提示ERS最后被传到线粒体， 线粒体有可能在这种死亡途径中起综合和放大的作用[2]。
综上所述， 大鼠OA的软骨细胞Caspase-3， Caspase-12均被激活并调控软骨细胞凋亡；在软骨细胞凋亡途径中， 可能包含ERS介导的通路。
参考文献
[1] 周景辉， 吴耀持， 李石胜， 等.鼠类膝骨关节炎模型的评价.中国组织工程研究与临床康复， 2010， 14（33）：6206-6209.
