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1. 1 非疾病干扰因素的影响
1. 1. 1 个体生理差异 不同年龄及不同年龄段以及性别、种族、体质等因素的差异, 影响相关指标的临床检验结果。新生儿体液免疫调节能力欠缺、身体器官发育尚未完全成熟, RBC、Hb、WBC、Hct、TBIL等指标明显高于正常成人;男女体内性激素不同, 相关项目检验结果也不一, 男性RBC、Hb、TBIL、TG等较女性高, 女性HDL、TC、ESR、Ret、Cu2+等明显比男性高;黑人CK、ApoAⅠ等高于白人;单纯肥胖者TC、TG、ApoB、LDL-C、GLU、γ- GT、CysC水平较正常人高。
1. 1. 2 应激生理反应 妊娠妇女胎儿生长发育所需, 在孕激素和胎盘产生激素影响下, 各系统出现适应性生理反应:WBC、T3、TSH、TG、Cu2+、ESR升高, TP、Alb、Fe2+、TF减低;凝血因子活性增强, 凝血系统功能亢进, Fg含量高, PT和APTT缩短。剧烈运动后白细胞可上升2~4倍。冷热水浴、疼痛、情感等刺激, 患者情绪处于紧张、恐惧或兴奋状态, RBC、Hb、WBC、K+、Na+、Ca2+、AKP、GLU、AST、TBIL、Uri等可出现一过性增高。过度饥饿, GLU、TP降低, 尿酮升高。
1. 1. 3 饮食、生活习性影响 餐后, K+、Na+、Ca2+、ACT、GLU、AST、TBIL、Uri等都会不同程度的增高;摄食动物血或内脏, 可干扰大便隐血试验, 出现假阳性。长期饮酒者, 可使Uri、ACT、γ- GT增高;吸烟WBC和CoHb高、HDL低;吸毒者, 吸食大麻K+、Na+、Cl-、INS升高, 注射或吸食海洛因可使TC、K+、Pco偏高。
1. 1. 4 标本采集因素的影响 标本采集时间、、数量、部位、环境等因素的差异, 也可干扰临床检验结果的准确性。昼夜循环交替、生理节律如女性月经周期等不同变化, 某些指标检验结果不同:K+在23:00~1:00时最低, 14:00~16:00时最高;RBC、WBC凌晨安静状态下最低, 下午最高, RBC日内变化达4%, WBC则相差2倍;尿胆原夜间和上午少, 午后增加, 14:00~16:00时达到高峰。采集不同, 检验结果也有差别, 卧位血浆总量较直立位增加12%, 立位采血时TP、ALB、ALP、ALT明显高于卧位;性蛋白尿:直立时出现蛋白尿, 平卧后消失。抗凝血的质量决定抗凝血检测结果准确性, 抗凝血的质量则取决于采血量与抗凝剂的比例, 如EDTA抗凝血血细胞分析, 采血量少, 抗凝剂过剩, 导致粒细胞和血小板肿胀、破坏, 采血量过多, 抗凝不充分, 则微血块阻塞分析仪计数孔;凝血功能检查如抗凝不充分, 可造成APTT假性延长。
1. 1. 5 药物因素 药物对临床检验结果的影响显而易见。使用抗生素后进行血液微生物培养, 则血循环中的药物可抑制细菌的生长, 干扰细菌培养的阳性检出率。大量服用维生素C, 可使血GLU、Uri、TG、Cr降低, 尿GLU、Hb、TBIL、NIT假阴性。输注胰岛素或高渗糖, 促使K+转移细胞内, 导致血K+检验结果偏低。
1. 1. 6 医护人员的影响 临床检验结果是否真实可靠, 检验分析前的标本质量成为决定性关键, 医护人员是标本质量的主导, 对检测项目的选择及其标本要求必须有充分的认识, 同时, 做好患者解释工作, 否则, 对标本注意事项要求向患者告知不到位, 势必影响检验结果的真实性和可比性, 如空腹采血应禁食12 h, 严禁早上体育运动锻炼后采集血样, 血糖、血脂等检测前3 d不能进食高油脂、高糖量食物;尿标本收集饮水要求;大便隐血试验禁食动物血、内脏或含铁食物3 d;检查前禁欲3 d;痰液培养应留取清晨漱口后深部第一口痰;药物疗效结果复查应在同一时段采样等。
1. 2 检验分析中影响因素
1. 2. 1 检验技术人员 临床检验医学日新月异, 朝操作自动化、方法标准化、技术现代化、试剂商品化、计量单位国际化、质量控制全程化、生物安全制度化方向发展, 医学检验技术人员技术合格性和规范性, 是临床检验结果的质量保证。检验人员的实际工作经验、工作态度和工作责任心, 对仪器设备规范操作规程、保养和维护以及评价能力, 开展室内和室间质量控制以及分析判断失控原因的水平等均可导致检验结果的偏离。
1. 2. 2 标本时效性 离体标本各组份的稳定性有一定的时效性, 久置则消耗或消失, 结果失去临床意义。如活体病原生物微丝幼、滴虫、阿米巴滋养体等检查, 标本久置, 可致病原生物死亡漏诊;标本久置则使活力降低而误诊;尿MB、URO接触空气就被氧化消耗甚至消失;尿糖和脑脊液、胸腹水等各种体液标本的葡萄糖检测, 标本放置时间越长, 则因细菌对糖的利用和酵解, 使结果偏低。
1. 2. 3 仪器设备性能和试剂稳定性 仪器设备正常运行、性能稳定, 试剂效用稳定, 是检验结果重复性和特异性的根本保障。
1. 2. 4 室内质控和室间质评 室内质量控制简称室内质控, 开展室内质控是监测检验方法、仪器设备、试剂、操作过程和操作环境等稳定性的重要举措和保障, 也是确保检验结果准确性的风向标。室间质评即实验室间质量评价, 参加室间质评可评价和验证检验结果的可信性和准确性, 确保结果与其他单位结果可比性和一致性, 达到与兄弟单位结果互认, 造福患者。
1. 3 检验分析后影响因素 结果审核与复查 是医学检验质量保证的最后一道防线, 往往由于检验人员对先进仪器设备的依赖和迷信, 容易疏忽, 出错报告, 如对全自动血液分析仪的异常结果没能按人工复查规则进行复查, 就草率出报告等。
2 临床医学检验前的质量控制措施
2. 1 标本质量的保证措施 医患沟通。在检验样本采集前, 医护人员应基于人文关怀的理念, 耐心的与患者及其家属进行沟通和解释, 进一步了解患者病情、生理、心理和情绪变化状况, 将所需检查项的目的、医学决定水平、临床意义、影响检查的因素以及标本采样和自留样本注意事项等告知, 以获取患者及其家属理解、支持与配合, 使其愉快地在安静、平静的状态下接受检查, 确保样本合格、真实, 避免患者准备不恰当, 取样误差影响检测结果而误诊。
2. 2 合格的样品 标本采集时要严格三查七对, 对患者的姓名、性别、年龄、床号、住院号、检验项目、样本类型、取样时间和方式等进行详细的核查和确认。标本采集严格采集时间、、部位、数量和取样方式的要求。如采集血样时, 一般在早上9:00以前, 空腹16 h以内进行, 患者取平躺或坐卧位并保持安静、平静的正常状态, 采样者动作应轻柔, 防止患者情绪波动, 采样时压带脉要
3 临床医学检验中的质量控制措施
3. 1 维护仪器 在临床检验过程中, 仪器的正常运行对于检验结果也起着至关重要的作用。检验人员应经常对仪器设备进行维护和保养, 做到日、周和月保养, 并定期进行仪器校准和性能评价, 以保证仪器功能的正常运行和性能稳定, 一旦仪器出现问题, 就要及时通知供应商进行修理或者更换仪器。同时也要加强检验科医技人员的培训工作, 防止检验工作人员因为对仪器的不熟悉导致人为操作错误, 影响检验结果。
3. 2 检验试剂准备 检验过程中需要用到的检验试剂, 必须保证检测合格, 严格管理检验试剂的时效和保存环境, 启用前应注意试剂的生产日期和防保质期, 防止因为检验试剂发生变质或失效导致检验结果的错误。建立一套完整规范的医学检验试剂使用和保管制度, 确保试剂的安全、效用, 确保医学检验结果的精确和准确。
3. 3 提高医学检验人员的技术水平 现代检验仪器设备高、精、尖, 检测原理多样, 虽操作不难, 但对结果分析和仪器性能判断, 则要求检验人员具备一定的临床理论知识和基本技能, 因此, 应加强检验人员业务学习和技术操作培训, 熟悉仪器检测原理、操作规程、干扰因素、检测结果数据、图形、报警的含义以及调试、保养和维护, 掌握仪器的校准和性能评价, 降低操作失误。
医学检验的工作人员要有强烈的爱心和责任心, 结合自身的技术水平, 能够对患者的疑惑作出合理的解释。医学检验工作人员应主动加强与其他临床科室的联系交流, 了解患者的临床病情, 结合患者的临床症状判断医学检验结果是否准确, 并从中提高自己的检验能力[5]。
3. 4 开展室内质控, 参加室间质评 在对患者标本进行检测之前, 必须进行仪器校准, 开展室内质控, 确定仪器设备性能稳定和各项检验参数在控的情况下, 才能检测患者标本。如失控, 应做好失控记录, 并查找原因和纠正后, 方可继续检测患者样本。注意质控品的日间、批间精密度, 确认检测结果的准确性。
参加室间质评, 根据室间质评加强质量控制管理, 确保检测结果与兄弟单位可比、一致和互认。
4 临床医学检验后的质量控制措施
4. 1 审查检验结果 在临床医学检验技术的发展下, 检验工作逐渐向着自动化发展, 即使越来越趋于自动化, 但是录入患者的基本资料、采样的标号、校准检验仪器、完成检验报告单都需要人力完成, 这就要求在各个环节上的工作人员能够密切配合和担负起自己的责任, 避免某一个环节出错引起整个检验结果的不正确。
4. 2 复查检验结果 检验结果出现异常, 无论是数据或图形, 均不得直接报告, 应按照国际、国内实验室建议的复查标准和设定的复查规则, 进行复检。首先分析密切关联各参数检测结果的因果关系, 如Cl-与Na+, RBC、Hb、Hct与MCV、MCH、MCHC间检验结果的一般规律, 查找异常原因。其次结合临床病情进行相关分析, 如K+偏高或偏低, 应与临床相关科室进行沟通, 了解患者是否存在高钾或低钾血症等。
4. 3 检验报告签收制度 医学检验结果报告完成后, 应该有专门的工作人员将检验报告送去各个科室, 以防在送结果的过程中发生遗漏或弄丢的情况, 各个科室的工作人员也要建立保存检验结果的制度, 以防出现问题, 对检验结果进行调查。
4. 4 加强临床信息反馈, 持续改进 医学检验结果是否准确、真实、可靠, 与临床诊断是否相符, 终将必须接受临床评价。检验人员应按照循证医学的原则, 经常与临床进行信息交流和反馈, 征求意见, 以临床诊断验证检测结果, 及时纠正结果偏倚, 保证检验质量持续改进。
4. 5 正确对待室间质量评价, 及时分析总结质量评价结果 每次室间质量评价都是对实验工作的一次综合考核, 它是实验室精确度的具体反映, 对于室间质量评价回报表要及时组织有关人员学习, 总结经验教训, 并制定出相应的整改措施, 为下一次参加质量评价积累经验, 不断提高检验质量。
【关键词】 投入 角度教学法 问卷调查 临床医学专业 基础化学 教学质量
基础化学是高等医学院校临床医学专业的一门专业基础课,在学时有限的条件下,对教师和学生的压力较大。为了提高教学质量,几年来我全身心投入并采用以角度教学法(即对同一问题从多角度多方面多方位进行思考探讨的教学方法)为主的多种教学法的交叉运用,取得了较好的教学效果。下面结合自己多年的教学实践谈一点认识和体会。
1 全身心投入到教学当中去,是教师获得学生尊重和爱戴的关键所在
我把教学当成最大的乐趣,并义无反顾地投入了巨大的精力。教师全身心投入到教学中去,既是尊重学生的根本体现,也是获得学生尊重的关键所在,学生将这种对教师的信任和尊重转移到所学知识的兴趣和信心上。教师付出的劳动越多,代价越高,说明对学生就越尊重,教师在学生心目中的地位也就越高。从2003年起,我通过自己设计的调查表来收集完全量化的反馈资料,该调查表由“教学态度与教学热情”等23项指标构成,每个指标分五个等级:很满意(5分)、满意(4分)、一般(3分)、不满意(2分)、很不满意(1分)。表格后附书面征求意见及建议,以便让学生提供更具体的看法和意见。每年上完《基础化学》课后向学生发放问卷调查表,学生以无记名方式填表评价。由于我在教学实践中付出了劳动,因而获得了学生较高的评价及普遍的尊敬和爱戴。自己连续两年来对临床医学本科2003级7班和8班,2004级1班和2班共221人所作的调查结果显示,同学们对自己教学态度和热情认为很满意的占95.63%,满意的占4.37%,而认为一般的、不满意和很不满意的各占0%。对自己总评价认为很满意的占79.79%,满意的占20.21%(见表1)。同学们评议说,“黄老师是一位具有现代气息的高素质教师”“自读书以来遇到的最好的老师”“教学责任心极强,对教学的负责和热情几乎到了‘疯狂’的地步”“是一位十分优秀的教师”“敬业精神很强烈”“对教学倾心投入”。自己的教学工作也得到了学院有关领导的首肯和许多教师的称赞,2004年被学院评为首届右江民族医学院模范教师。经过多年的教学实践和对教学理论的探索,自己不但在教学上更加走向成熟,而且也形成了自己独特的教学风格。同学们在给我的书面评价意见中说,“枯燥难懂的内容经过黄老师的组织、分析,就变得通俗易懂了”“你让枯燥的化学变得异常丰富”“讲课很有吸引力”。 表1 2003年与2OO4年临床医学本科生对23项教学效果指标
2 多种教学法的灵活交叉运用,生动活泼,是学生最乐于接受的教学方法
在备课阶段,我阅读了大量的相关参考书,为了活跃课堂气氛,我在备课时就准备好一些幽默的词句和一些有趣的事例,力求讲课生动,富有趣味性和吸引力。从同学们书面反映的信息看,他们给予了较高的评价。他们认为,“教学水平高”“授课一流”“讲课棒极了”“都喜欢听您讲课并认为能听您讲课是一种快乐”“课堂气氛活跃,有幽默感,能激起学生的求知欲,使学生很想听这门课”。同学们还认为该教学法具有启发性,能调动学生学习的积极性。
把抽象的记忆化为具体的记忆,机械记忆即强记对某些内容有时是必要的,但容易遗忘。我们要善于引导学生在理解的基础上记忆,这就是逻辑记忆,尽可能将抽象的记忆化为具体的、有趣的、生动的记忆[1]。例如,运用手势演示,形象地传授知识,以便加强学生的立体概念,大大有利于对内容的理解和记忆。教师在课堂上边讲边作手势,逼真地显现形态和结构,有时可使学生终身难忘。笔者在讲乙二胺四乙酸的结构时这样比喻:整个分子就好象一个人,其中乙二胺如同人的身体,一端N上的两个乙酸基如同人的两只手、另一端N上的两个乙酸基如同人的两条腿。整个分子结构就好象一个人正在做游泳时蛙泳的姿态,学生们听了哄堂大笑,但笑过之后对所讲的乙二胺四乙酸的结构印象极为深刻,并留下永久性的回味。
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结合教学开展科研并通过科研充实和促进教学
在教学过程中,遇到的一些问题有时可为科研立题提供线索。而通过科研工作,教师需查阅大量的文献资料,这就使得教师进一步开拓眼界,丰富自己的学识,从而为讲好自己的专业课打下更为深厚的基础。几年来,我积极进行教学科研活动,写出了《谈备课》《谈科学方法论在医用化学教学中的运用》《如何上好医用化学课的一点体会》《提高药学专业化学实验教学质量方法初探》《民族医学院校化学实验教学改革探索》《全身心投入,提高基础化学教学质量》等,其中,《谈科学方法论在医用化学教学中的运用》获广西优秀高教科研成果三等奖和学院优秀科技成果奖,所发表的论著和成果有的在社会上有较大影响,得到区内、国内本学科专家的高度肯定,认为在医学化学的应用、探索和教学方面起到积极的推动作用,对我区的学术研究提供了参考依据,并被国内同行认可,引起同行专家注意并认为有应用参考价值。2004年我参加学校理论课教学竞赛并荣获二等奖。
此外,学生参与科研活动是医用化学实验训练的继续和延伸,是培养学生综合能力和创新能力的重要途径[2]。现在我们试点实行本科生导师制,即高级职称以上的教师可以面向全校招收一定数量品学兼优的本科生参与科研活动。我们化学专业导师组,均招收一定数量的品学兼优的本科生。同时,近年来,我承担国家级、自治区级、厅级和校级科研课题多项,有一定的经费,利用这一优势,我们积极吸收被录取的优秀本科生在课余时间参加科研实验。通过文献查阅、设计方案、实验研究、撰写论文等探索性工作,培养学生从事科学研究的初步能力和提高他们的综合素质。几年来,学生参与撰写和发表了科学研究论文20篇[3]。学生通过参与科研活动,使科学实验研究能力得到前所未有的大幅度提高,有多篇学生的科研论文在广西大学生化学论文及设计竞赛中获奖。开展大学生的科研活动,培养了大学生的医用化学实验兴趣,反过来又促使大学生重视医用化学实验课而认真学好,同时对教师的实验教学也提出了更高的要求,有力地促进了医用化学实验教学水平的提高。教学和科研相结合,还使教师在科研活动中能面向本学科前沿领域,获得最新信息,丰富教学内容,反过来又能在教学中充实自己的理论基础,在科研工作中有更广阔的思路,从而提高自身素质和教学质量。学生通过参与科研活动,锻炼了科学思维,启发了创新意识,培养了初步的科研能力。表2 2003年与2004年学生对“作风严谨,教书育人”指标的评
4 教书与育人相结合,提高教育效果
充分发挥课堂教学是对学生进行素质教育的主渠道作用,根据教学内容,结合化学史在课堂教学中渗透科学思想方法和思想道德品质的教育。我在课堂教学中注重教书育人,深受学生欢迎。同学们这样评价:“教学中注重渗透思想道德品质的教育,对学生影响很大”、“不但教给我们知识,还教给我们学习和做人的道理”、“是为人师表,教书育人的典范。”从表2的反馈信息更能看出我的教书育人的突出成绩,优良率(很满意+满意)高达97.74%。
联系医用化学教学内容,进行有趣的思想品德教育。结合医用化学教学的具体内容,在教学中常以故事的形式,通过介绍化学家的成就和思想,以此来感染激励学生。例如,在讲授电离学说时,讲道:瑞典化学家阿累尼乌斯年青时提出了电离理论,但被当时瑞典社会斥之为“荒唐的小学生”,他在国内得不到支持后很苦闷,后来投书国外诸多名家,觅求知音,其中有门捷列夫、迈尔等。出乎意料的是有的是冷淡的回答,有的竟如石沉大海。最后,由于奥斯特瓦尔德和范特荷莆的热情支持和崇高威望,终于使电离理论闻名遐尔,人们几乎全部接受了这一理论。阿累尼乌斯也因此而获得1903年的诺贝尔化学奖。阿累尼乌斯曾拒绝应聘到国外当教授,甘愿回国到斯德哥尔摩当讲师,后来当了教授、大学校长和诺贝尔研究所的所长[4]。通过这个小故事,教育学生学习阿累尼乌斯勇于探索科学真理,坚定信念和不怕冷嘲热讽及崇高的爱国主义精神。
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通过分析教学效果反馈信息来改进自己的教学工作
我非常注重通过在每次课中、课后及时收集和分析教学效果反馈信息,对量化资料的分析主要包括:①指标得分排序。将23项指标按得分大小排队,以了解本次授课最值得发扬的地方和特别需要注意克服的地方。同时,通过对各年指标顺位的变化了解自己教学能力方面的变化情况。如“板书简明、整齐”指标多年常排在最后一位,从而为自己指明了最薄弱的环节。②各指标各评价等级的人数及构成,即对各指标满意的程度。通过对不同年份同一指标各评议等级人数的差异作秩和检验,可以知道自己教学上某个方面是进步了还是退步了。
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结束语
实践证明,我在教学法的研究上取得了可喜的成绩,教学效果显著。但是,教学是一门艺术,只有不断地实践,不断地总结,才能不断地提高。我决心更加努力,使自己的教学水平得到更大的提高。
【参考文献】
[1] 陆海峰,黄锁义.浅谈提高医用化学课教学质量[J]. 右江民族医学院学报,2002,24(4):630.
[2] 巫光宏,何 平,詹福建,等.生物化学实验教学改革的探讨[J].实验室研究与探索,2003,22(5):23.
关键词:临床医学检验;影响因素;解决措施
临床医学检验是指利于医学检验技术分析人体血液标本中的检验指标及病症因子,通过对比标准值,从而达到诊断病情、判定疗效及观察预后的效果[1]。血液检验作为临床医学检验系统中最常见、最有效及最准确的医学检验之一,为临床诊断疾病而提供依据。在临床医学检验中,血液标本的处理结果,受到多种因素影响,降低临床医学检验的准确性。一些研究表明,在血液标本处理过程中,血液标本的放置时间、离心时间及处理方式均作为临床医学检验质量控制的影响因素。对此,本研究旨在探讨临床医学检验质量控制的影响因素分析及解决措施。
1资料与方法
1.1标本来源:选取我院检验科于2012年3月~2014年12月期间,治疗的86例需要临床医学检验患者作为研究对象,对所有患者均抽取3份血液标本,根据血液标本放置时间、离心时间及处理方式分别采取不同的血液标本处理方式,分为A组、B组及C组。
1.2研究方法:A组患者的新鲜血液标本在取样后30min进行离心、血清分离及进行临床医学检验;B组患者在新鲜血液标本取样后30min进行离心,于4℃环境内进行冷冻保存,24h后进行临床医学检验;C组组患者在在新鲜血液标本取样后,直接置于4℃环境内进行冷冻保存,24h后进行离心、血清分离及进行临床医学检验;分析三组临床医学检验结果与参考值的差异性。
1.3临床医学检验指标:红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白(Hb)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、乳酸脱氢酶(LDH)。1.4数据处理:采用SPSS12.0软件处理实验数据,计量资料使用t检验;计数资料使用χ2检验;P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
A组患者的各项临床医学检验结果与参考值对比,无显著性差异(P>0.05);B组及C组患者的各项临床医学检验结果与参考值对比,均具有显著性差异(P<0.05);B组及C组的血液标本处理方式对临床医学检验结果具有显著性差异(P<0.05),以C组血液标本处理方式的影响程度最大;详情见表1。
3讨论
临床医学检验常用指标对于诊断疾病、判断疗效、指导治疗及评估预后具有多重临床价值。随着血液生化检验技术水平的提高,检测的灵敏度、准确度及特异度均显著提高,临床医学检验质量控制作为提高检验准确性的关键环节。由于血液标本处理方式不同,对RBC、WBC、PLT、Hb、ALP、TBIL、LDH等临床医学检验指标的检验结果均具有差异性[2-3]。本研究中,A组、B组及C组三组患者的血液标本放置时间、离心时间及处理方式均有所不同,对比三组患者的临床医学检验结果与参考值的差异性发现,A组患者的各项临床医学检验结果与参考值对比,无显著性差异;B组及C组患者的各项临床医学检验结果与参考值对比,均具有显著性差异;以C组血液标本处理方式的影响程度最大;提示临床医学检验结果受到血液标本处理方式的影响,随着血液标本处理方式的不规范,临床医学检验结果受到的影响随之增大。由于血液标本处理方式对血液标本的溶血、标本凝固、脂浊均会造成影响,红细胞受损性溶血、标本凝固及脂浊均对血常规检查、凝血象检查、血沉检查的生化检验结果造成影响[4]。对此,在临床医学检验过程中,需严格按照操作规程处理血液标本,设置恰当的离心时间,将血液标本储存在低温下,在规定的放置时间内,完成临床医学检验。综上所述,新鲜血液标本的放置时间、离心时间及处理方式可影响临床医学检验结果;对于未能及时检验的新鲜血液标本,应及时离心及冷冻放置,避免临床医学检验结果与临床疾病诊断有所差异。
参考文献
[1]朱镜飞.临床医学检验质量控制的影响因素探讨及应对措施[J].当代医学,2015,09(19):78-79.
[2]王翠兰,黄玉双.临床医学检验中质量控制提高的影响因素及措施[J].临床合理用药杂志,2013,6(2):116-116.
[3]孟娟.临床医学检验质量控制的影响因素及应对措施[J].当代医药论丛,2014,13(3):175-176.
【摘要】
目的: 研究人脐血间充质干细胞(MSCs)对异体外周血T淋巴细胞抑制的影响. 方法:分离、扩增脐血MSCs,流式细胞术检测表面标志以鉴定. 取分离培养的脐血MSCs,与经分离的异体淋巴细胞共培养,在植物血凝素(PHA)刺激下,用MTT还原法测定细胞增殖,观察脐血MSCs对PHA刺激的T淋巴细胞转化抑制作用. 采用ELISA检测培养上清中IFNγ和IL4的分泌水平. 结果:脐血MSCs在PHA刺激下可抑制T淋巴细胞增殖,且其培养上清也具有抑制异体淋巴细胞增殖转化能力. ELISA检测7 d共培养上清中IFNγ和IL4两种细胞因子的含量,发现IFNγ分泌水平下调、IL4分泌水平部分上调. 结论:脐血MSCs具有抑制异体淋巴细胞免疫反应,降低移植物抗宿主反应(GVHD)的作用. 具有研究价值和应用潜能.
【关键词】 胎血/细胞学;间质干细胞;外周血T淋巴细胞;植物血凝素类;干扰素Ⅱ型;白细胞介素4
【Abstract】 AIM: To study the effects of human umbilical cord bloodderived mesenchymal stem cells (MSCs) on peripheral blood T lymphocytes. METHODS: MSCs were isolated from normal human umbilical cord blood, cultured in vitro, purified and then identified by examining surface marker with FCM. Lymphocytes were isolated from allogenic peripheral blood and identified with FCM. The MSCs and lymphocytes were cocultured in 96well plates for 72 h. T lymphocyte proliferation was measured by using MTT reduction method and the effect of MSCs on the T lymphocyte transformation stimulated by PHA was observed. On day 7 of coculture, the culture supernatant was collected to detect the expressions of IFNγ and IL4 with ELISA. RESULTS: Human umbilical cord bloodderived MSCs inhibited T lymphocyte proliferation and PHA induced lymphocyte transformation. The secretion of IFNγ in supernatant was significantly downregulated,while the expression of IL4 was partially increased. CONCLUSION: Human umbilical cord bloodderived MSCs can inhibit the immune response of allogenic T lymphocytes and alleviate the grafeversushost diseases.
【Keywords】 fetal blood/cytology; mesenchymal stem cells; peripheral blood Tlymphocytes; phytohemagglutinins; interferon TypeⅡ; interleukin 4;
0 引言
间充质干细胞(mesenchymalstem cell, MSCs) 成为目前倍受关注的一类多能干细胞. 人脐血中除含有丰富的造血干细胞,还存在一类不同于造血干细胞的原始细胞,在合适的条件下可以向成骨细胞和脂肪细胞分化,甚至跨系向神经元细胞分化[1],表现出较强的多向分化潜能. 脐血MSCs可从脐血、胎盘、羊水、脐静脉内皮下层、外周等组织中分离[2-3],与骨髓MSCs相比,脐血MSCs具有来源丰富、取材方便、移植排斥反应轻微和外源性污染少等优点,因而具有更大的研究价值和应用潜能. MSCs除具有支持体外造血、促进体内造血重建功能外,还具有抑制同种异体免疫反应,降低移植物抗宿主反应的作用. 体内实验表明,器官移植时输注MSCs可减轻排斥反应和延长移植物生存时间. 我们试图通过研究人脐血MSCs对异体外周血T淋巴细胞的影响,进一步探讨MSCs的免疫调控机制,为脐血MSCs的应用提供实验依据.
1 材料和方法
1.1 材料
RPMI1640培养基(华美公司);淋巴细胞分离液(华美公司);抗CD13,CD44,CD71,CD166,CD34,CD45,CD3,CD4,CD8荧光抗体(晶美公司).
1.2 方法
1.2.1 脐血MSCs的分离和培养无菌条件
取脐带血30 mL,肝素抗凝. 用PBS平衡盐溶液稀释混匀,Percoll淋巴细胞分离液1500 r/min离心20 min,吸取界面单个核细胞,LGDMEM培养液,1000 r/min离心3 min,洗涤2次. 显微镜下记数,按1×106/cm2密度分别接种于25T塑料培养瓶,37℃, 5 mL/L CO2孵箱中培养48 h. 更换培养液,弃去未贴壁的细胞,每3 d半量换液1次. 待细胞达到80%~90%融合,消化、记数. 然后进行传代接种培养,记为P1代. 再传代培养记为P2代,取P3~P5代进行实验.
1.2.2 细胞表面分子测定
取密度为1×109/L单细胞悬液,与抗CD13, CD44, CD71, CD166, CD34, CD45荧光标记抗体室温反应30 min,洗涤、固定,流式细胞仪检测.
1.2.3 外周血T淋巴细胞分离、鉴定
取肝素抗凝新鲜外周血用PBS倍比稀释后,用淋巴细胞分离液(Ficoll,1.077 g/L)分离外周血单个核细胞(PBMC),PBS洗涤2次. 计数后以含200 mL/L FBS的RPMI1640培养基悬浮,调整细胞密度为8×1010/L,将细胞悬液加入自制尼龙棉柱内,平置于37℃温箱中孵育1 h,用预温至37℃的上述培养基冲洗出非黏附细胞即为淋巴细胞. 洗下的悬液离心后重悬于上述培养基中并调整细胞密度至1×109/L. 取1×109/L个细胞用PBS洗涤2次后与抗CD3, CD4, CD8荧光标记抗体室温闭光反应30 min,洗涤、固定,用流式细胞仪检测.
1.2.4 脐血MSCs对异体淋巴细胞的影响
脐血MSCs消化、洗涤、计数后,调整细胞密度为1×l09/L接种于96孔培养板,每孔100 μL,待其贴壁后,以5 μL/孔丝裂霉素处理. 在相应组加入淋巴细胞悬液及植物血凝素(PHA) 5 μL以刺激淋巴细胞转化. 实验分组,A: 淋巴细胞组;B: MSCs+淋巴细胞组:C: MSCs+淋巴细胞+PHA组; D: 淋巴细胞+PHA组. 37℃, 5 mL/L CO2孵箱中培养72 h后,加入MTT 20 μL/孔. 继续孵育4 h,300 r/min离心10 min,弃去孔内培养液. 每孔加入150 μL DMSO,振荡10 min,酶标仪490 nm处读数,抑制T淋巴细胞增殖. 淋巴细胞增殖抑制率(%)=1-(C-B)/(D-A)×100%.
1.2.5 脐血MSCs培养
上清对异体淋巴细胞的影响收集已培养3 d的脐血MSCs培养上清,置于96孔培养板,每孔100 μL. 在相应组加入分离的外周血淋巴细胞悬液100 μL及PHA以刺激淋巴细胞转化. 实验分组,A: 培养上清+淋巴细胞组;B: 培养上清+淋巴细胞+PHA组;C: 淋巴细胞组;D: 淋巴细胞+PHA组. 其他同方法1.4. 正常淋巴细胞增殖抑制率(%)=(C-A)/C×100%;PHA刺激下淋巴细胞增殖抑制率(%)=(D-B)/D×100%.
1.2.6 ELISA定量检测
培养上清中IFNγ和IL4的含量实验步骤按照ELISA检测试剂盒(晶美公司)操作说明进行. 实验组分为: 单独MSCs组; MSCs+淋巴细胞组;单独淋巴细胞组(对照组). 37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养7 d,取培养上清作IFNγ和IL4分泌水平的ELISA检测.
统计学处理: 用SPSS 11.5统计软件对实验结果进行方差分析及两两比较.P
2 结果
2.1 脐血MSCs培养及鉴定原代培养48~72 h后出现贴壁的间充质样细胞,为成纤维样的长梭形细胞. 当细胞生长达80%~90%融合,细胞呈辐射状生长,为脐血源性的MSCs(图1). 流式细胞仪检测结果显示90%细胞稳定地表达CD44, CD71, 相关抗原标记,但不表达造血细胞系的表面标记CD45(图2),这与源于骨髓MSCs的表面抗原标记相一致.
2.2 外周血淋巴细胞分离、鉴定分离后的淋巴细胞,经流式细胞仪检测T细胞所占比例可达70%~82%.
2.3 脐血MSCs对异体淋巴细胞增殖的影响与脐血MSCs共同培养的异体淋巴细胞组与未共同培养组相比,淋巴细胞增殖活性下降,其增殖转化抑制率为56.58%,两者差异具有统计学意义(P
2.4 脐血MSCs培养上清对异体淋巴细胞增殖的影响与脐血MSCs培养上清共同培养后的异体淋巴细胞组与未共同培养组相比较,细胞增殖活性明显下降,两者有统计学意义(P
2.5 培养上清IFNγ和IL4分泌水平的ELISA检测脐血MSCs与淋巴细胞共培养7 d,培养上清中IFNγ分泌水平较单独淋巴细胞组(27.46±2.56 vs 58.03±8.55)下降(P
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3 讨论
目前,对于脐血MSCs的存在及能否传代扩增,仍有较大争议[4]. 而其在体外培养过程中,由于生长周期相对缓慢、原代细胞培养时间较长,成为制约脐血MSCs应用的障碍. 本实验旨在建立和完善脐血MSCs体外分离、培养、扩增体系,观察脐血MSCs对PHA刺激外周血T淋巴细胞抑制作用的影响,为探讨脐血MSCs免疫调节能力提供实验依据.
已知脐血MSCs可分泌一些细胞因子,并通过自分泌或旁分泌形式发挥效应[5]. 我们的实验发现,在PHA刺激下,与脐血MSCs共同培养的异体淋巴细胞组与未共同培养组比较,淋巴细胞增殖活性明显下降,其增殖转化抑制率为56.58%. 脐血MSCs究竟是通过细胞间接触直接发挥免疫抑制作用还是通过分泌某些细胞因子而间接对淋巴细胞起抑制作用?为进一步探讨脐血MSCs免疫负调控的作用机制,我们又观察了脐血MSCs培养上清对异体淋巴细胞增殖的影响. 实验结果表明:在无细胞直接接触的情况下,单纯脐血MSCs培养上清对异体淋巴细胞增殖也表现出负调控效应,且此种效应在PHA对淋巴细胞刺激时有所增强(20.47% vs 9.04%),但均较脐血MSCs与淋巴细胞共培养后所表现出的负调控效应(56.58%)低. 本实验结果提示:细胞间的直接接触在脐血MSCs的免疫负调控机制中起主要作用,但分泌的可溶性细胞因子也间接对淋巴细胞发挥抑制作用,且在外源性丝裂原刺激存在的情况下,其抑制作用明显增强.
Th细胞根据分泌细胞因子的种类不同主要分为Th1和Th2[6],而IFNγ和IL4是促进CD4+T细胞分别向Th1和Th2分化的主要细胞因子. 由于Th1主要分泌IL2, IFNα和IFNγ,而Th2主要分泌IL2, IL4和IL10,因此Th1细胞可能诱发GVHD,而Th2细胞不会诱发GVHD,并可能对未经处理T细胞所引起的GVHD具有调节作用,发挥GVL效应[7]. 故Th1和Th2细胞分泌的细胞因子失衡可能是造成GVHD组织损伤的重要原因之一. Aggarwal等[8]发现骨髓MSCs具有抑制Th1分泌IFNγ,增加Th2细胞分泌IL4的能力. 据此推测,骨髓MSCs在下调炎症因子释放的Th1细胞比例、上调抗炎作用的Th2细胞比例的同时,抑制体内巨噬细胞分泌IFNγ,并伴有CLT,NK和LAK细胞功能的降低,减轻由此介导的一系列组织损伤作用,从而降低GVHD的严重程度.
由于脐血MSCs较骨髓MSCs有诸多优越性,如更为原始、分化能力强,因此可能在临床移植应用中使GVHD的发生率更低. 我们通过ELASA定量检测培养上清中细胞因子IFNγ和IL4的含量发现,单独脐血MSCs培养上清中IFNγ低表达或不表达,且IL4的表达较单独外周血淋巴细胞的要高;当脐血MSCs与淋巴细胞共培养时,可显著下调IFNγ的分泌水平、上调IL4的分泌水平. 此结果类似于骨髓MSCs,与习杰英等[9]报道脐血单个核细胞所分泌细胞因子相符. 由此可见,脐血MSCs极具临床应用潜力,在移植过程中可预防和治疗allHSCT术后GVHD的发生,减少移植发病率和死亡率,从而提高受者生活质量和长期存活率.
【参考文献】
[1]侯玲玲,曹华,裴雪涛,等. 人脐血MSC 体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究[J]. 中华血液学杂志,2002, 23:415-419.
[2]Gang EJ, Hong SH, Jeong JA, et al. In vitro mesengenic potential of human umbilical cord bloodderived mesenchymal stem cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 321(1): 102-108.
[3]Yen BL, Huang HI, Chien CC, et al. Isolation of mulipotent cells from human term placenta[J]. Stem Cells, 2005, 23(1): 3-9.
[4]Wexler SA, Donaldson C, DenningKendall P, et al. Adult bonemarrow is a rich source of human mesenchymal stem cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not[J]. Br J Haematol, 2003, 121(2): 368-374.
[5]Tse WT, Pendleton JD, Beyer WM, et al. Suppression of allogeneic Tcell proliferation by human marrow stromal cells; Implications in transplantation[J]. Transplantation, 2003, 75(3): 389-397.
[6]金伯泉. 细胞和分子免疫学[M]. 北京: 科学出版社, 2001: 139-140.
[7]Zeis M, Uharek L, Hartung G, et al. Graftvsleukemia activity and graftvslost disease induced by allogeneic Th1and Th2type CD4+T cell in mice[J]. Hematol J, 2001, 2(2): 136-144.
【关键词】类风湿关节炎; 药物性间质性肾炎; 药学观察
【中图分类号】R532【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2010)012-0026-01
1 病例摘要
患者,女,70岁,因全身多关节肿痛1年,加重伴发热1周为主诉于2009年8月22日入院。既往有高血压病史20多年,平时血压控制水平在150/90mmHg以下。多年未做血生化方面的体检。
患者1年前无明显诱因出现双手指关节轻度疼痛,晨僵,检查RF阳性,诊断为“类风湿关节炎”,未用药物治疗,症状逐渐减轻。1周前无明显原因出现发热,全身关节肿痛,僵硬,活动受限,在附近诊所静点头孢曲松针治疗1周,效果欠佳,仍然高热,以下午及晚上较甚,T最高39.4℃,给予肌注退烧药(具体不详),体温可降低,但是降低后又会逐渐上升,故来入院诊治。患者发烧时怕冷,无寒战,无咽痛、咳嗽、尿频、尿急及尿痛等症。
入院查体:T39.1℃,P100次/min,BP130/70mmHg,面部潮红,形态肥胖,咽部无充血,双肺呼吸音清,未闻及干湿性罗音。腹部平软,无压痛及反跳痛,双下肢无凹陷性水肿。
实验室及特殊检查:血Rt:WBC18.27×109 /L,N94%,plat390×109 /L。Hb78g/L。血白蛋白32g/L,肾功能示:尿素氮6.3mmol/L,肌酐107.9ummol/L,尿酸292mmol/L.Ccr65ml/min。类风湿因子803.8IU/L,C反应蛋白31.1mm0l/L。血沉:128mm/h。血糖:5.9 mm0l/L。尿微量白蛋白14mg/L,尿Rt:正常。骨髓细胞形态学检查:正常。NAP阳性率98%,积分268.肺SCT示:心肺未见异常。眼底检查未见异常。
2 主要治疗经过和临床药学监护
入院后给予强的松片45mg/d,抗免疫反应,美洛昔康片7.5mg/次,2次/日,消炎止痛治疗,发热消退,体温正常,关节疼痛明显减轻。服强的松片10天后改为30mg/d,并给予甲氨蝶呤片,以有助于减少激素剂量,但患者出现四肢红斑状皮疹,无瘙痒,停用甲氨蝶呤片后皮疹逐渐消失,关节症状好转瞩其出院,复查:血Rt:WBC7.2×109 /L,尿Rt:正常,血沉63mm/h,RF786.5 IU/L,血糖10.4mmol/L,肾功能:尿素氮6.2mmol/L,肌酐87.5ummol/L,尿酸367mmol/L。
患者回家后每月减强的松片5mg。美洛昔康片不变。在减到20mg/日时,患者出现双下肢水肿,关节疼痛加重,又来住院治疗。此次入院检查发现肾功能:尿素氮7.9mmol/L,肌酐147 ummol/L,尿酸354mmol/L,钾3.12mmol/L,钙1.75mmol/L,血糖11.2mmol/L。尿Rt:白细胞(+),镜检:白细胞2~7/HP,血沉49mm/h,RF425.2IU/L。血Rt:Hb87g/L,其余正常。血白蛋白35g/L,ANA(-),ENA多肽酶均(-)。患者诉食欲不振,无尿频、尿急及尿痛等症,给予头孢哌酮感染治疗,速尿针静推,利尿消肿;停用强的松片,改为抗炎作用较强,对钠潴留作用微弱的甲泼尼龙片16mg/日口服,继续服用美洛昔康片7.5mg/次,2次/日,达美康缓释片30mg/日,以降糖治疗。患者双下肢水肿减退,尿Rt正常。给予来氟米特片,以抑制免疫反应,患者又出现四肢红斑状皮疹,仍无瘙痒,停用来氟米特片后,并用肤严宁膏外擦,皮疹逐渐消失。病人突然诉夜尿增多,未重视。住院近1月查:肾功能:尿素氮8.7mmol/L,肌酐228mmol/L, 尿酸367mmol/L,Ccr46ml/min。尿Rt:正常,尿微量白蛋白17mg/L。
给予低蛋白饮食,配合开同片5片/次,3次/日,以提供必需氨基酸并尽量减少氨基氮的摄入。减少美洛昔康片至7.5mg/日,关节疼痛减轻,晨僵消失。皮下注射促红细胞生成素,纠正贫血,口服尿毒清颗粒,排毒通便,静点银杏达莫,改善肾循环。患者经上述治疗血肌酐下降至127ummol/L,血色素91g/L,血沉45mm/h。患者病情好转出院。
3 讨论
患者老年女性,70岁。既往有高血压病史,服用硝苯地平缓释片10mg/d,平时血压在150/90mmHg以下。住院期间出现有糖尿病。临床主要表现为发热,全身关节肿痛,僵硬,活动受限。治疗期间出现有双下肢水肿,夜尿增多等,也出现过血钾偏低。血沉偏快,类风湿因子滴度高。血浆白蛋白正常。肾功能逐渐增高,尿常规正常。患者长期服用有非甾体类消炎止痛药美洛昔康片。非甾体抗炎药几乎都可以引起肾脏功能障碍。据报道非甾体类抗炎药引起的肾功能衰竭占药物性肾衰的37%。目前认为此类药物可以引起肾小球滤过率下降致缺血性肾损害,高血钾及水钠潴留,其次可以诱发肾病综合症和急性间质性肾炎[1]。此病人在类风湿关节炎症状控制后,曾出现过双下肢水肿,当时考虑为激素引起的水钠潴留,未考虑此药引起的,给予速尿以利水消肿。后来发现肾功能出现异常改变,夜尿增多,尿常规正常。所以,药物导致的间质性肾炎可能性大。
患者在住院期间服用免疫抑制剂甲氨蝶呤片和来氟米特片时均出现四肢红斑状皮疹,无瘙痒,停药后皮疹消退。皮疹出现后不久,发现有双下肢水肿,夜尿增多,血钾偏低,无症状性白细胞尿等。药物导致的急性间质性肾炎称为药物过敏性急性间质性肾炎。一般认为与机体超敏反应相关,药物作为半抗原与机体组织蛋白结合后引起免疫反应,引发肾脏损伤。此类病人尿检可见无菌性白细胞尿,也有病人会出现蛋白尿,有肾脏功能急剧恶化的表现。所以本病例过敏性间质性肾炎也不能排除。
4 小结
本病例最后诊断为类风湿关节炎并发药物性间质性肾炎。因药物导致的间质性肾炎的发病机制主要有三种:一是直接作用:系药物毒性发生的最重要机制,药物直接损伤肾细胞,导致肾脏损害,如氨基糖甙类抗生素。二是间接作用:通过影响肾细胞代谢或造成尿路梗阻,导致肾损害,如非甾体类抗炎药抑制肾细胞环氧化酶的活性,使前列腺素合成障碍,引起急性肾功能衰竭及水钠潴留等。三是介导过敏反应:如抗体介导的免疫复合物肾炎及抗肾小球基底膜肾炎等[1]。此病人药物性间质性肾炎就含有第二种和第三种情况。对症处理就是停用或减量相关药物,服用激素治疗。
药物引起的药物性间质性肾炎治疗[2]包括以下三方面:①尽可能去除诱发因素;②充分的支持治疗;③合理使用糖皮质激素和其他免疫抑制剂。去除诱发因素是防治此类疾病的关键。大多数药物诱导的间质性肾炎,停止使用致病药物后其肾功能损害多可逆。对一些由不明药物引起的间质性肾炎患者,应停药或使用其他药物代替以确保致病药被排除。
参考文献
[1] 李晓玫,急性间质性肾炎,郑法雷主编,肾脏病临床与进展,北京:人民军医出版社。123~124