医学细胞生物学常用技术
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医学细胞生物学常用技术范文第1篇
《医学细胞生物学》（以下简称为本课程）是细胞生物学在医学领域的渗透和应用，其实验方法已成为基础和临床医学研究不可或缺的技术。对高等医学院校的医学生来说，更应认真和扎实掌握细胞生物学的基础理论和实验方法。我校是一所综合性医学院校，学生层次复杂，有研究生（含硕士、博士）、七年制本科、五年制本科、专科等系列。本文从授课内容、学情特点等方面，归纳总结不同层次学生实验课的教学情况，谈谈在实验教学中如何因材施教，实现教学相长，以期为提高实验课教学质量服务。
1.授课内容
研究生（含硕士、博士）的实验课内容以能反映学科的最新进展为主要内容，同时结合研究生培养要求，选择当前中医药研究中常用的细胞生物学技术作为实验内容，如：细胞的培养、冻存与复苏；DNA的提取；PCR扩增技术等。随着课程改革的推进，将逐渐增加新的内容。在实验操作中，因研究生理论基础较扎实，实验的基本原理略讲，重点讲解和强调实验操作的细节，以提高学生的实验操作能力，力争让学生得到良好的实验结果，为今后的科研打下扎实的基本功。
七年制本科生的实验课开设项目大致同五年制本科生。实验课内容以基础性实验为主，如：普通光学显微镜的结构及使用、细胞形态结构与细胞器的观察、细胞生理活动的观察等。通过这些实验，可以锻炼学生基本的实验操作能力。这部分内容要求学生对实验有完整的了解和认识，亲自动手实践从动物到标本的整个实验过程，目的是进一步培养并提高学生的实验动手能力和分析问题、解决问题的能力。随着课程结构的调整，将逐步增加细胞的培养、冻存与复苏等项目。
专科学生由于课时有限，近几年，本课程理论课时减少，实验课相应地也在缩减，实验课以基础性实验为主。
2.学情特点
研究生（含硕士、博士）经过本科阶段或硕士阶段的学习，当再次接触到《医学细胞生物学》时，表现出很浓厚的兴趣和强烈的操作欲望，尤其是结合自己的专业课题研究，若有涉及该方面内容时，大家都认真思考，主动提问，积极动手操作，课堂气氛活跃。
七年制和五年制本科生整体素质较高，学习态度端正，求知欲强，思维活跃，对本课程兴趣浓厚，操作积极，但是提问的数量和质量较研究生稍差。课堂上，能够在规定的时间内，在老师的指导下完成相关实验操作，实验结果基本在预期范围内。
专科学生在校时间短，相关医学及实验技术基础较差，学习态度没有本科生端正，部分学生未能充分利用课堂时间完成相关实验，而部分学生较认真，能够在老师的指导下基本完成相操作，有两极分化之趋势。
3.小结
基于以上情况分析，在今后的实验课教学中需要注重因材施教以实现教学相长。
首先，注重教学内容的因材施教[1]。根据不同层次、不同专业的人才培养要求，在理论课和实验课设计上，有所选择和取舍。如：在临床专业学生的实验课上，以细胞形态结构与细胞器的观察、细胞生理活动的观察为核心内容。而其他专业，则可以结合自身特色，选择与专业相关的内容讲解和开展实验课。
其次，注重思想教育的因材施教[2]，[3]。根据不同层次学生的思想状态，适当地加以引导和指导。研究生层面，也有一小部分不重视本课程的学生，表现为马马虎虎，做事不认真，实验课老师在教学中就要帮助他们端正学习思想，改变学习态度，注意培养他们良好的科研作风；七年制学生大部分比较认真，每个人都想得到最好的实验结果，学习更多知识，但在实际操作过程中，偶尔会出现因操作失误导致实验失败的，这时，就需要实验老师对学生加以安慰，并不断给予鼓励，帮助其树立信心；五年制学生大都能够按部就班地完成实验，但也有一部分人将实验课视为“放松课”，不遵守课堂纪律，心思没在实验课上，这就要求实验课老师对学生加以督促，正确引导。针对课堂上不同学生的表现，实验老师要注意统领全局，细致观察，做到有的放矢，引导学生，提高他们的学习积极性。
再次，注重教学形式的因材施教。从课堂组织来讲，对不同层次的学生可以采取不同课堂形式，研究生可以采取开放式、创新性实验的形式，结合自己的专业开展实验课；七年制学生实验课可以参照研究生的实验课模式，即在基础性实验的基础上，适当进行创新性实验，在教师指导下，学生分组，自行设计实验并独立完成，鼓励学生多动手操作；五年制本科生在实验课上则主要是进行积极管理，让学生遵循实验室的各项规章制度，保质保量完成实验任务，并鼓励学生多看书、勤思考、积极动手。
总之，本课程实验教学作为基础医学实验教学中的重要组成部分，如何结合学生特点，顺利完成实验教学任务，培养有创新能力和实践能力的高级专门人才，是值得长期深入研究的一个问题[4]，[5]。我们在实验课教学中坚持因材施教，不仅有利于提高学生自主学习能力、创新能力，强化教学效果，更可以督促教师不断加强和提升综合素质，最终达到教学相长的目的。在今后的教学中，我们将继续努力实践，不断观察，积极进行教学改革，为培养高素质人才服务。
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本文受湖南省中医药科研计划项目资助（课题编号201663）
医学细胞生物学常用技术范文第2篇
医学检验技术专业课程
主干课程：生物化学、医学统计学、分析化学、检验仪器学、生理学、病理学、寄生虫学及检验、微生物学及检验、免疫学及检验、血液学检验、临床生物化学及检验等。
核心课程：组织学与胚胎学、细胞生物学、分子生物学、生物化学、生理学、病理学、医学统计 学、医学免疫学、病原生物学、分析化学、检验仪器学、临床基础检验、临床病原生物学检验、临床 免疫学检验、临床血液学检验、临床生物化学检验、实验室管理学、临床医学概要等。
医学检验技术专业就业方向
本专业学生毕业后可在公安、政法机关、司法鉴定机构和保险公司从事医学检验技术检案鉴定工作。
从事行业：
毕业后主要在制药、医疗、新能源等行业工作，大致如下：
1 制药/生物工程;
2 医疗/护理/卫生;
3 医疗设备/器械;
4 新能源;
5 检测，认证。
从事岗位：
毕业后主要从事检验师、检验技术员、售后工程师等工作，大致如下：
1 检验师;
2 检验技术员;
3 售后工程师;
4 医学检验技术员;
5 技术支持工程师。
培养具有扎实的医学检验专业知识及相关自然科学知识，具有医学检验实践技能和人际交流能力，具有良好的职业道德和人文素养，具有创新、创业精神，能从事医学检验和实验室诊断工作的高等技术应用型医学检验专门人才。
培养技能
医学细胞生物学常用技术范文第3篇
[关键词]体细胞；核移植；克隆；表观遗传重构
[中图分类号]Q819 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）05-40-04
一直以来研究人员普遍认为只有通过卵子和相互结合形成受精卵，随着受精卵的不断分化，最终才能发育成为一个新的生命，但在这个过程中，受精卵细胞同时也将逐渐地失去其发育成为完整后代的能力，把受精卵细胞具备发育成为完整个体的能力称为全能性。体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技术的成功归因于人们对细胞全能性的逐步认识。核移植（NT）就是将动物的体细胞或者早期胚胎卵裂球的细胞核，移植进经去核的发育成熟的卵母细胞的胞质中或受精卵中，得到重构的卵母细胞，然后通过重新激活，恢复其细胞分裂及分化，从而促使其发育成为与供体细胞的基因型完全相同的子代，这一技术也可称为体细胞克隆技术。体细胞核移植技术最早是由德国的胚胎学家Spemann 1938年提出的，他起初提出这个理论，主要是为了研究细胞核全能性的机制以及在胚胎发育的过程中细胞质与细胞核的相互作用机理。直到1952年Briggs和King按照他的理论，首次成功地进行核移植试验，他们首先将非洲爪蟾的卵子去除其细胞核，然后向其中移植进其囊胚细胞核，从而得到了正常的后代。随着胚胎工程技术的不断进步，人们先后以不同动物的胚胎细胞等作为供体，不断成功地培育出了各种克隆动物，如克隆羊、克隆牛、克隆猪、克隆小鼠以及克隆家兔等。其中最具有标志意义的是1997年Roslin、研究所的Wilmut等，首次在世界上报道了他们利用体细胞核移植技术，用成熟绵羊的体细胞（乳腺上皮细胞）作为核供体，成功地克隆出“多莉”羊，一下在全世界掀起了轩然大波。这一实验充分证明了高度分化的体细胞仍然具有全能性，人们可以利用体细胞，通过体细胞移植技术获得基因型与供体细胞基因型基本相同的子代个体。成为了生物学以及遗传学发展史上一个重要的里程碑事件。家兔是生物医学研究中最常用的实验动物之一。利用体细胞核移植技术生产克隆兔子是目前研究的热点，在生物医学领域具有十分诱人的应用前景。而家兔被认为是利用体细胞核移植技术难以成功克隆的哺乳动物之一，直到2002年法国学者Patrick Chesne等用卵丘细胞作为核供体首次成功克隆了家兔，突破了家兔难以成功克隆的关键问题，为扩大家兔在生物医学方面的应用研究提供了方法。应用这项技术，2006年我国学者李善刚博士应用成纤维细胞作为核供体成功地培育出克隆家兔，在此基础上他又进一步将转基因技术与体细胞核移植技术结合起来，成功培育出了表达绿色荧光蛋白的克隆兔，将该项技术推向新的高度。
1体细胞核移植的主要方法
具体来讲，体细胞核移植技术主要包括受体细胞的去核、核供体细胞的准备与选择、细胞周期的调控、细胞融合、重组胚胎细胞的激活以及培养等步骤。
1.1受体细胞的选择
在哺乳动物体细胞核移植的实验中，可以作为受体的细胞主要有以下三种：（1）去核的受精卯；（2）去核的MⅡ期成熟卵母细胞；（3）去核的早期胚胎细胞，其中MⅡ期卵母细胞是目前采用较多的核移植受体细胞，因为在这个时期，一方面该细胞体积较大，便于显微操作；另一方面重组胚胎所需要的各种细胞因子在MⅡ卵母细胞质中均存在，而且细胞营养成分充足。在细胞分裂过程中，结合在DNA上的各种细胞因子如转录因子等从DNA螺旋轴上脱离下来，与此同时胞质中的大量重组因子即可与DNA螺旋轴结合，从而促进基因重组的发生。另外一方面，因为选择合适卵龄的卵母细胞作为胞质受体，对体细胞核移植是否能够成功产生巨大的影响，故细胞培养的时间也特别重要，实验中一般多选择培养40～44h，传代4～6代的卵母细胞作为受体细胞。因为大量的实验证明，传代越多重组胚的囊胚率也越多。
1.2受体细胞去核的方法
先要对受体细胞进行去核，才能进行供体核的移植。受体细胞去核必须完全，如果去核不完全，一方面可能导致重组的胚胎细胞染色体形成非整倍体或多倍体从而使克隆直接失败，另一方面也可能使卵母细胞产生异常分裂进而发育受阻甚至可以导致胚胎的早期死亡从而使克隆最终失败。所以是否完全使卵母细胞去核，是保证核移植所形成的新的胚胎细胞能否发育成为正常个体的前提条件。为了减少实验中的干扰因素，可以通过缩短体外操作的时间并快速而准确的去除受体细胞核以避免孤雌发育。大体上受体细胞去核的方法可以分为两种方法，即化学去核法和机械去核法。具体有以下几种操作方法（1）盲吸法：这一方法的优点是不用借助于其他的化学物质，但此法耗费时间较长、易影响细胞质空间结构故对卵母细胞损伤比较严重，所以技术要求较高，不同动物去核率相差也较大，应用较少；（2）半卵法：这个方法是应用特制的卵母细胞切割刀，将卵母细胞切割成为两个半卵，然后丢弃含有极体的那一半半卵细胞，用两个不含极体的半卵细胞与供体细胞核进行融合，构建核移植胚胎。（3）化学试剂去核法：这种方法的原理是利用蔗糖或者脱羰秋水仙碱等化学试剂的作用，使受体细胞能够自行排出第二极体，从而实现去核的目的，但目前还不清楚化学试剂是否对受体细胞造成损伤；（4）挤压法及点压法：此两种方法均是利用固定管固定住细胞，使细胞染色于特定位置，然后挤压透明带，用去核针取出第一极体，再用荧光染料Hoechest33342染色后观察其去核率。点压法是挤压法的改进方法，优点是对卵母细胞胞质的损伤较小，在去核操作的过程中不用更换去核针，节省了时间，有效的提高了去核效率；（5）纺锤体探测技术：此法去除细胞核的方法是将卵母细胞放置于Spindle-view偏振光系统的倒置显微镜下，受体卵母细胞的纺锤体区域较其它部位明亮，从而清楚显示其染色置，而后再用去核针通过显微镜下操作去核，以利于去核的操作准确完全。（6）透明带膨胀辅助去核法：此法是先用去核针吸入适量操作液后稍施正压，使吸入的操作液平缓流出，推进去核管，使透明带逐渐膨胀，然后用去核针将细胞核取出，此法的优点是缩短了去核操作的时间并且显著地提高了去核操作后卵母细胞的生存率。（7）离心去核法：这个方法的原理是根据细胞质的密度小于细胞核，通过离心的方法将没有透明带的细胞核甩向一侧进而脱离卵母细胞。该方法的缺点是必须去除透明带，不利于之后核移植胚胎的发育。
1.3供体细胞选择与核的移植
实验中可用于核供体的细胞很多，主要有胚胎干细胞（ES细胞）、卵丘细胞、颗粒细胞、支柱细胞、细胞、乳腺细胞、神经细胞以及成纤维细胞等，其中最主要的是两种：一是生殖细胞如卵丘细胞，二是胎儿或成年成纤维细胞。影响核移植成败的一个重要因素是受体与供体细胞的细胞周期同步化发育，早期的研究认为要使体细胞核移植成功必需使供体细胞处于GO期，获得GO期细胞主要是通过两种方法：选择细胞类型或者人工诱导的方法。Inoue等研究人员在小鼠的核移植实验中发现，移植的效率较大的受到供体细胞的细胞类型以及其基因型的影响。近年来许多科研人员通过实验发现把没有经过休眠诱导的处于细胞周期中G1期、G2期以至于M期的细胞作为供体细胞进行核移植也可以获得成功。将供体细胞核移植进入受体细胞的常用方法主要可分为融合法以及注射法两类。其中融合法中目前最常用的是电融合的方法，这是因为电融合的方法具有细胞损害较小、可重复性好而且融合的效果较好等明显的优点，所以逐渐被广大的研究人员所应用。电融合方法的原理是通过细胞在强电场短时间的作用下，使细胞膜产生一过性的击穿，当电流使两个相邻的细胞膜接触的区域发生击穿时，两侧的细胞膜就可以在击穿的瞬间发生接触并融合成为一个细胞。注射法一般分为透明带下注射和胞质内注射。透明带下注射是把整个供核细胞注射至受体细胞卵周隙，这就需要在注射后还需使供体细胞与受体细胞进行融合。胞质内注射一般是用压电一陶瓷微注射系统，直接把供体核注入胞质内。
1.4卵母细胞的激活
因为缺少了受精这一步骤，在以成熟的卵母细胞作为受体的核移植实验中，缺少了自然受精过程中受精卵的激活过程，所以必须进行人工激活核移植后重构的卵母细胞从而促使其进一步分化发育。根据激活时期的不同，可分为移核前激活、移核时激活、移核后激活三种不同的时期。使卵母细胞激活的方法可以分为化学或者物理刺激的方法两类。激活方法目前应用较多的有钙离子载体A23187激活和离子霉素激活、乙醇激活、蛋白质合成抑制剂激活、氯化锶激活、提取物激活、蛋白质磷酸化抑制剂激活以及电脉冲激活、联合激活等。虽然卵母细胞可以被以上的各种化学物质以及物理刺激的方法激活，但是却不可避免地在激活的同时也造成受体细胞一定程度的损害，影响胚胎的发育。所以，是否能够尽快地探索出对卵母细胞损伤较小并且激活效率高的激活方法对体细胞核移植技术最终能否成功尤为重要。
2体细胞核移植技术的应用前景
体细胞核移植技术作为细胞生物学及发育生物学领域取得的最伟大的成就之一，应用前景必然是特别广阔的甚至是我们一时无法估量的！其潜在的经济效益是十分巨大的，随着这项技术的不断发展、逐步完善，必将带来生物学以及医学领域的一场深刻变革。这项技术在生物学方面如在保护濒危动植物物种、新物种的培育、优良畜种培育以及转基因动植物生产方面前景十分广阔。另外，这项技术在医疗卫生领域同样具有巨大的应用潜力和发展前景。尤其在医疗卫生领域，可能为机体损伤修复、器官移植乃至遗传性疾病、老年性疾病的治疗等打下坚实的基础，有着不可估量的作用，所以值得科研人员持续关注并为体细胞核移植技术的不断完善发展付出不懈的努力。
医学细胞生物学常用技术范文第4篇
1 细胞培养的历史沿革
细胞生物学是生命科学的理论基础，也是现代生命科学的前沿科学，而细胞培养是其中的重要部分。细胞培养分为原代培养和传代培养[2]，目前细胞培养技术广泛应用于生物医学各个领域，是分子生物学和实验室生物技术等的核心实验室技术[3]。细胞培养始于20世纪初，1907年，Harrison利用悬滴法将分离自青蛙胚胎的神经细胞种植在青蛙的淋巴液中，首次在体外模拟了细胞的生长活动，为后来开展体外细胞研究开辟了新途径， Harrison也因此被誉为“细胞培养之父”[4]。1910年， Burrows在从Harrison实验室学习了这种技术以后尝试用鸡血浆代替淋巴液培养细胞并获成功。此后，Burrows与其外科医生出身的同事Alexis Carrel进一步致力于哺乳动物组织的培养技术研究。1912年，Alexis Carrel[4]将外科手术严格的无菌技术引入细胞培养并发明了专门的细胞培瓶（Carr-el flask，卡氏培养瓶），显著改良了Harrison所建立的培养技术并将其应用于成年组织细胞和肿瘤细胞的体外培养实践中，由于此研究成果的重大贡献，1912年，Alexis Carrel被授予诺贝尔医学与生理学奖，此后Alexis Carrel在体外成功培养了分离自鸡胚心脏的心肌细胞，并将其一直培养到了1946年，证明了体外细胞不但可以存活而且能传代增殖。1949年，Alan Parks发明了-196℃超低温冻存细胞的技术，成为细胞培养历史上又一次重大的技术进步。此后，抗生素和胰蛋白酶的出现，也极大地促进了细胞培养技术的发展。1952年，GO Gey[4]成功地培养了人类肿瘤组织并建立至今仍使用的HeLa细胞系，使细胞培养发展到人类组织培养阶段。20世纪80年代，以众多细胞系的建立为特点。现在细胞培养基本上渗透到到生命科学的各个领域，随着培养条件的改善，该技术也越来越容易掌握。
2 根据材料和细胞接触方式的细胞毒性评价方法
依据接触方式，目前常用的评价口腔医疗器械细胞毒性试验方法有以下三种[5]：琼脂扩散试验、滤膜扩散实验、直接接触实验。①琼脂扩散试验（间接接触试验）：适用于固体（包括粉末）和液体等试验材料的检测，通过琼脂糖扩散后来评价材料的非特异性细胞毒性；②滤膜扩散实验（间接接触试验）：适用于固体（包括粉末）和液体等试验材料的检测，通过乙酸纤维素滤膜扩散后评价材料的非特异性细胞毒性；③直接接触实验（包括浸提液试验）：该试验适用于评价固体材料和材料浸提液或液体材料的细胞毒性。
在应用直接接触试验时，体外培养的细胞，失去了身体神经体液的调节和细胞间相互作用的影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，而且其生长受营养条件、生长空间等因素的限制，所以，Hensten 等[6]认为，直接接触法所得的结果不能反映材料在口腔内实际的生物相容性，缺乏准确性。在间接接触试验中，琼脂扩散试验和滤膜扩散实验利用可溶性抗原与相应抗体特异性结合，从而来检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。Murray 等[7]研究表明在间接接触试验中，琼脂或者滤膜作为屏障用于模拟口腔黏膜，能较为真实地反映口腔的环境，但琼脂类材料和牙本质的渗透性还是有很大的区别[8]，故而间接接触试验不能有效地反映牙本质情况，目前的标准体外细胞毒性试验存在一些不足之处，主要原因是试验细胞与试验材料之间没有牙本质屏障[9]。近年来，国内陈志军等[10]利用人工羟基磷灰石陶瓷片模拟牙本质，从而确保牙本质通透性的可控性，为口腔材料体外细胞毒性试验提供了一个高效可靠的评价方法。
3 生物学终点评价细胞毒性的评价形式
生物学终点评价形式包括以下五种：
3.1细胞形态学评价：主要是观察细胞的形态变化，该方法是最早用于检测细胞损伤的方法，通过在显微镜下观察细胞形态的改变，可以判断细胞是否有污染、是否健康以及增殖情况。在显微镜下，通过观察裂解细胞所占的比例来评估细胞毒性级别，Sujata等[11]研究得出细胞形态学评价方法与MTT法等定量细胞毒性法的Perason相关系数为0.9，表明两者具有良好的相关性。目前，该方法仍广泛用于生物材料细胞毒性的评价。
3.2细胞膜性效应评价：主要是从细胞膜的通透性改变方面来鉴别存活细胞与死亡细胞，包括以下两种试验方法。
3.2.1中性红摄取试验（NRU）：1986年，Borenfreund等[12]建立中性红摄取试验，并对多种材料细胞毒性进行评价，表明该试验是快速评价细胞毒性的方法。国际标准ISO已收录该检测方法，经济合作与发展组织（OECD）也于2010年将该方法列为细胞毒性试验预测急性经口毒性试验起始剂量的指导性文件[13]。
3.2.2乳酸脱氢酶释放法（LDH 释放法）：乳酸脱氢酶（LDH）是活细胞胞浆内酶之一，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至细胞外，所以培养基中该酶活性与被裂解的细胞数量成正比，采用全自动生化分析仪直接检测细胞培养板上清液中LDH，可以反映细胞损伤程度。此方法操作简便，灵敏度高，用LDH释放法检测肿瘤患者CIK细胞（细胞因子诱导的杀伤细胞）活力，有助于CIK疗法适应患者的选择及个体疗效观察[14]。
3.3细胞代谢活性评价：该方法是通过检测细胞生物代谢或生物合成功能的改变来了解细胞损伤作用，当前，以活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶作为生物学终点的评价方法可以灵敏地反映材料对细胞的损害程度[15]。主要包括MTT实验和XTT实验。
3.3.1 MTT试验：MTT试验以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthia-hiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑蓝为基础，通过MTT噻唑蓝作用于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶，生成非水溶性的蓝紫色结晶甲（Formazan）并沉积在细胞中，且MTT结晶形成的量与细胞数成正比。目前该试验作为材料细胞毒性评价方法，实验步骤规范标准化，结果准确，简便快速[16-17]，但是在试验过程的结晶产物，需要用二甲基亚矾（DMSO）溶解后才能测定光吸收值，若是溶解不充分，会影响测定结果，从而使得MTT灵敏度略差，因此，杨晓冉等[18]建议MTT法和中性红摄取试验（NRU）联合使用。
3.3.2 XTT试验：XTT试验在MTT的基础上，省去溶解还原产物结晶的步骤，1988年，Scudiero等[19]首次采用该方法检测细胞增殖。XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷产物，当XTT与电子偶合剂共同使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。该试验方法较MTT 法具有显著优点，已被纳入国际标准ISO10993-5：2009中，但XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用，成本较高。
3.4细胞增殖率评价：主要是观察材料或材料浸提液与细胞接触后细胞生长速度和增殖的变化，主要有克隆形成试验。最早由Tuchiya提出，用克隆形成率（实验组克隆数/对照组克隆数）来评价材料的细胞毒性。Tuchiya等[20]研究表明，克隆形成试验较分子滤过法、琼脂覆盖法、中性红摄取法更为敏感，目前该方法已收录在国际标准ISO 10993-5：2009中。
3.5 DNA合成率检测评价：通过测定有丝分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力，主要有5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）渗入法和胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法。敏感性很高，但重复性略差[21]。
综上所述，评价材料的体细胞毒性的试验方法较多，而由于不同材料接触方式及毒理不一，各试验方法之间又存在很大的敏感差异。因此，Weyermann等[22]提倡在选择试验方法时，必须根据“最接近应用状况”的原则，合理地选择样品与细胞的接触方式和检测生物学终点的评价方法。
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医学细胞生物学常用技术范文第5篇
关键词：细胞凋亡；检测方法；分析评价
细胞凋亡（apoptosis）是细胞在一定的生理或病理状态下，遵循自身的程序，自己结束自己生命的过程。细胞凋亡不受到外部损伤因素直接导致的被动改变而属机体自身的生理活动，是由基因控制的、高度有序的细胞主动死亡过程，即程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）[1]。它贯穿从受精、发育、成熟、衰老的整个生命过程，近年来一直是生命科学和医学领域各专业的研究热点。随着研究细胞凋亡的方法不断涌现和深入，分析手段日趋完善和成熟。现将细胞凋亡检测方法归纳如下。
1 形态学检测
细胞凋亡是形态学名称，其特征性改变包括细胞浆固缩、体积缩小、细胞皱缩以及细胞核致密等。一般认为形态学变化是判断有无细胞凋亡的基础[2]。根据凋亡细胞固有形态特征，人们设计了多种不同的细胞凋亡形态学检测方法，常用的有：普通显微镜观察、荧光显微镜观察、共聚焦激光扫描显微镜观察、透射电子显微镜规察。普通光学显微镜只可以观察到细胞凋亡的大体形态胞膜起泡现象和凋亡小体。但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构，因此用光镜观察难以令人满意。通过电镜可以观察到有典型的凋亡细胞出现，其特征是细胞核体积缩小，染色质浓缩致密，并沿核膜分布形成新月体状，细胞膜微绒毛消失，但细胞浆内的各种细胞器基本正常。凋亡细胞的典型形态改变在透射电镜下能够得到最佳的体现，为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。电镜检测细胞凋亡的缺点是：只能定性，不能定量；样本制作处理过程复杂，设备相对昂贵，对检查者的技术水平要求较高[3-4]。
2 DN段化检测
2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳检测法 细胞凋亡时，DNA在内源性核酸内切酶的作用下.在核小体间被切割成180～200 bp整数倍的单核苷酸片段。DNA裂解是标志细胞最终走向死亡的不可逆的重要过程。正常活细胞的DNA凝胶电泳为一条区带；而当细胞凋亡时，由于DNA被裂解成单核小体和寡聚核小体，电泳时呈现特征性的"阶梯状"（1adder）条带；而坏死细胞的DNA断裂为无特征的杂乱片断，利用此特征，既可确定细胞的凋亡，又可与坏死细胞区别。因此DNA凝胶电泳一度被认为是判定细胞凋亡的金标准之一[5]。这种检测方法简便宜行，成本低。但缺乏定位性特征，灵敏性不高，但在作群体细胞凋亡分析时具有一定意义。本方法被广泛应用于作群体细胞凋亡分析中[6]。
2.2 EILSA法分析组蛋白 细胞凋亡的发生，是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA，产生180bp～200bp或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。此法具有需要设备简单.敏感性高，所需细胞个数少等优点。其缺点是不能精确测定凋亡发生绝对量和提供细胞的组织学定位。试验过程中如果裂解细胞的时间过长可能导致细胞核中的DN段也被计算在内，进而导致结果偏高，因此不同的细胞系需要经过数次摸索才能确定最佳检测条件[7]。
2.3 DN段原位标记法
2.3.1.原位缺口转移（in situ nick-translation，ISNT）技术 细胞发生凋亡时，核酸内切酶在DNA分子中导入切口，DNA多聚酶在切口部位表达外切酶活性，使核苷酸自5'向3'方向切去；同时以切口部位末端核苷酸的3'一OH为引物，利用DNA多聚酶I的聚合活性将未标记的核苷酸用标记的核苷酸进行置换，切口沿DNA分子移动，同时水解5'末端，以修复DNA原位切口平移技术将标记的核苷酸引入凋亡细胞的DNA，据此可检测凋亡细胞。
3 流式细胞仪检测法
流式细胞仪（FCM）是将流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机技术等集为一体，用于细胞定量分析和进行细胞分类研究的工具。此方法系通过荧光素如PI、hoechst 等亲DNA的特性，分析悬浮细胞中DNA 含量的直方图来判断细胞凋亡。①PI 染色法：凋亡细胞经PI 染色、流式细胞仪检测，在正常细胞G1期的峰前增加1个特异性亚二倍体峰（sub-G1峰）俗称"凋亡峰"。通过FCM测定DNA的含量还可以研究凋亡细胞的周期特异性。此方法的优点是可定量检测，灵敏度高。缺点是不能观察S期和G2期凋亡的细胞，不能区别坏死细胞和凋亡细胞。②Hoechst-PI法：此法可克服PI 法的不足。hoechst被活细胞摄取后与DNA结合呈蓝色荧光；PI使坏死细胞呈红色荧光。因此，在直方图上可根据红蓝两种荧光判断3种细胞：正常细胞呈弱蓝、弱红光；凋亡细胞呈强蓝、弱红光；坏死细胞呈弱蓝、强红光[9]。③Annexin V/PI法：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（Ps）迁移至细胞膜外侧。PS发生的变化即外露早于DNA断裂，早于染色质凝集及凋亡小体的形成，外露后成为免疫系统识别的标志，能与高亲和力的钙依赖性的磷脂结合蛋白Annexin V结合，将Annexin V进行荧光素（FITC、PE、ECFP）标记可以检测细胞凋亡，是最敏感的指标之一，但坏死细胞Ps亦暴露于外表使Annexin V结合阳性，因此使用Annexin V这一参数不能区分坏死或凋亡，必须同时结合PI进行凋亡细胞双染后用流式细胞仪即可将凋亡细胞以及坏死细胞区分开来。结果判断正常活细胞Anmxin-V、PI均低染；凋亡细胞Anmedn-V高染、PI低染；坏死细胞Anmxin-V、PI均高染。利用Annexin V/PI法，是目前检测细胞凋亡最理想的方法。
4 细胞凋亡相关物质的检测
4.1 酶学检测
4.1.1 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases-3）活性检测 细胞凋亡过程中有许多蛋白酶参与并相互协调以促进凋亡的发生。在凋亡的起始和执行过程中起关键作用的是半胱胺酸天冬氨酸酶（Caspases）。大多数凋亡都涉及Caspase-3的活化，它是关键的凋亡执行分子.Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞浆中，在凋亡早期阶段被激活它通过分解去除DNA酶的一个负调节亚基而问接使之活化，实现了DNA的片段化，最终发生细胞凋亡。常采用荧光分光光度计检测其活性。因活化的Caspase-3能够特异切割DIE2V3D4-X底物，水解D4-X肽键，故设计出荧光物质偶联的短肽Ac_DEVDAMC。短肽被水解后释放出的AMC能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度大小，可测定Caspase-3活性，从而反映Caspase-3的活化度，以判断细胞凋亡程度[10]。
4.1.2 乙酰胆碱酯酶 乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是主要存在于神经系统的一种水解酶，其经典功能是水解神经递质乙酰胆碱从而终止神经冲动的传递[11]。张学军等[12 ]发现乙酰胆碱在细胞凋亡追踪起重要作用，他们以人肺成纤维细胞株、NIH/3T3小鼠、HEL、PC-3和牛肉皮细胞等为材料，用衰老凋亡或化疗药物诱导法诱导细胞凋亡，综合流式细胞术、DNA电泳、形态学及TUNEL等方法检测凋亡细胞，发现各类细胞在正常状态下无AchE活性反应。一旦发生凋亡，均具有AchE活性反应，从而建立了这一检测凋亡细胞的新方法[13]。酶学检测简单、快速、方便，适合大量培养细胞的凋亡检测，但不能定量和定位。
4.2 细胞凋亡相关基因水平的检测 在细胞凋亡时有些基因表达异常，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas蛋白结合受体后形成死亡介导信号复合体（DISC），能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞等靶细胞调亡[14]。Bcl-2和Bcl-XL作为抗凋亡的调节物，它们的表达水平比例决定细胞是凋亡还是存活[15]。现多采用Northern杂交和RT-PCR对它们进行检测，随着近年来荧光定量PCR技术的发展，用定量PCR来检测基因表达水平较前者更快更准确。
总之，目前检测细胞凋亡的方法很多，但都有其自身的优点和局限性。应充分了解各种检测方法的原理及应用范围，根据标本综合选择几种适当的方法进行检测，常可得到较准确结果。在进行细胞凋亡检测的时候，要几种方法进行检测，避免使用单一方法。例如：电镜观察仍是确定凋亡的最具权威的标准.因此在凋亡定量控测之前应先行电镜观察定性；PI染色流式细胞检测法漏检率及错检率均高.不适于凋亡定量观察.但其方法简便、价廉，适用于大批标本的筛选预试验；TUNEL法是目前最常用的凋亡检测技术.为避免坏死细胞的影响，应先用荧光镜检以保证TUNEL染色细胞不存在坏死细胞，否则应另选其它检测方法。
综上所述，只有几种不同的检测方法进行综合检测得到的结果，才能真正的反映细胞发生凋亡的情况，进而准确的对其凋亡进行定性和定量判定。相信伴随着人类对凋亡机制更加深入的了解，操作简单、敏感性高、成本低廉的细胞凋亡检测方法会越来越多，也将对基础细胞生物学，生物医学及临床某些疾病的诊断及治疗产生深远影响。
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